CN1657612A - 一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法，属于酶制剂技术领域。本发明采用发酵液离心或压滤去除菌体，超滤技术及用或不用乙醇沉淀复溶方法去除小分子杂质和有色物质制得浓缩酶液，浓缩酶液与适当的辅料及保护剂混合后采用喷雾干燥方法可一步制得酶活为50－100U/g的固体MTG产品，最终酶活回收率为60－70％，产品为均匀粉状，具有良好的感官品质和分散溶解性。本发明方法操作简便、高效、费用低廉、极易在工业生产中运用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中提取谷氨酰胺转胺酶，并制备稳定的固体酶制剂的方法，属于酶制剂技术领域。
背景技术
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase EC 2.3.2.13)，全称R-glutaminyl-peptide：aminee γ-glutamyltransferase，简称TG，是一种催化酰基转移反应的转移酶。它可以催化大多数蛋白质的谷氨酰胺残基上的γ-羧酰胺基和赖氨酸残基上的□-氨基之间形成ε-(γ-谷胺酰基)赖氨酸共价键。谷氨酰胺转胺酶可以催化大多数的食品蛋白质分子内或分子间发生交联，蛋白质和氨基酸之间连接，以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，如：酪蛋白、大豆蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白、谷蛋白、禽蛋蛋白等等，很大程度上改善各种蛋白质的结构和功能性质，如营养价值、质地结构、口感、贮存期等，被誉为“21世纪超级粘合剂”。因此广泛被应用于肉制品、乳制品、小麦制品、豆制品及可食膜的制备中。在日本，谷氨酰胺转胺酶已成为食品工业的第二大酶种，其用量仅次于α-淀粉酶。此外谷氨酰胺转胺酶还应用于化妆品工业、制药工业及纺织工业和医学研究领域。
目前报道的生产TG的方法主要有从动植物组织中提取和从微生物发酵法生产两种。源于动植物的谷氨酰胺转胺酶来源稀少，提取工艺复杂，因此这种酶的售价较高，很难用于工业应用。采用微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶(MTG)可以大幅度降低其生产成本，故而是拓宽谷氨酰胺转胺酶应用范围的根本途径。MTG是一种胞外酶，分泌在发酵液中，因此，从发酵液中提取MTG的工艺过程直接影响酶的酶活回收率及生产成本，制备稳定的酶制剂是推动该酶的研究和应用的基础。
MTG是胞外酶，蛋白质的一般提取方法如离心过滤、超滤等过程都适用于此酶。为了获得稳定的酶制剂，需将其制备成固体剂型以增加稳定性。从发酵液中制备固体酶制剂的过程包括提取和干燥两个步骤。目前，冷冻干燥和真空干燥是制备固体酶制剂最常用的方法，但是过程耗能和耗时，干燥后还需经研磨、复配后方可成产品，易引起酶失活，难于工业化生产。因此，在工业规模上如何实现制备高酶活回收率且稳定的MTG酶制剂，具有重要的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用MTG发酵液制备高品质、高得率的酶制剂的方法，制备的MTG以固体粉状的形式作为产品。该法操作简便、高效、费用低廉、易于工业化。
本发明的技术方案：本发明采用谷氨酰胺转胺酶发酵液经离心或压滤去除菌体，使用超滤技术及用或不用乙醇沉淀再酶泥复溶去除小分子杂质和有色物质制得浓缩酶液，浓缩酶液与适当的辅料及保护剂混合后采用喷雾干燥方法可一步制得适用于各种工业应用的MTG固体酶制剂产品。从发酵液中制备固体酶制剂，具体操作工艺为将MTG发酵液经去除菌体、超滤、用或不用乙醇沉淀再酶泥复溶，添加辅料及保护剂，喷雾干燥、成品包装而制得酶活为50-100U/g的固体MTG产品。
离心或压滤：将发酵液离心或板框压滤，弃去菌体，得上清液或滤液；
超滤：将上清液或滤液，按照下列条件：0.3MPa、截留分子量为10000或30000的超滤膜超滤，浓缩至5-8倍或3倍，去除小分子杂质和有色物质得浓缩酶液；
乙醇沉淀：将浓缩3倍的超滤液用70％体积比的乙醇缓缓加入超滤浓缩3倍的超滤液中，并不断搅拌，静置沉淀谷氨酰胺转胺酶并离心弃去上清液得酶泥；
酶泥复溶：将乙醇沉淀的酶泥重新溶解于一定量的水中，复溶制得浓缩5-8倍的浓缩酶液；
超滤直接得到的浓缩5-8倍的浓缩酶液不必经过乙醇沉淀和酶泥复溶工序；
添加辅料及保护剂：将超滤直接得到的或经乙醇沉淀酶泥复溶后得到的浓缩5-8倍的浓缩酶液与重量体积比为25％的麦芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇，及重量体积比为0.1-1‰的还原型谷胱甘肽混合；
喷雾干燥：将混合好的浓缩酶液进行喷雾干燥，控制出风温度为60±3℃，进料速度为30mL/min；
包装：即得成品。
本发明的有益效果：本发明采用的过滤去除菌体、使用超滤技术和乙醇沉淀方法去除小分子杂质和有色物质，并添加适当的辅料及保护剂，采用喷雾干燥工艺从发酵液中制备食品级谷氨酰胺转胺酶固体制剂的操作工序，不仅可以在实验室中方便实施，而且极易在工业生产中运用。因为喷雾干燥对浓缩酶液浓缩倍数的要求较高，要求浓缩倍数达到5-8时，工艺才比较合理，所以考虑到生产厂家的超滤浓缩能力，我们采用超滤和乙醇沉淀再酶泥复溶方法对酶进行提取和浓缩，从而不必对超滤浓缩装置过分苛求，并添加辅料及保护剂进行喷雾干燥；本发明的关键点之一是对MTG浓缩液进行喷雾干燥，喷雾干燥提高了MTG的酶活收率，产品酶活为50-100U/g的固体MTG产品，赋予产品良好的感官品质，且具有优良的溶解分散性，整个操作过程都适合大规模的工业化生产。
具体实施方式
实施例1
发酵得到的MTG发酵液，成分分析结果：菌体及其它固形物共20.0g/L；MTG酶活4.17U/mL。将上述发酵液离心去除菌体，取上清液按照下列条件：0.3MPa、截留分子量为10000或30000的超滤膜低温下进行超滤，得到浓缩8倍的浓缩酶液，酶活为28.95U/mL，酶活回收率为86.78％。浓缩酶液与25％的麦芽糊精或水溶性淀粉及0.1‰的还原型谷胱甘肽混合后进行喷雾干燥，干燥条件为出风温度为60±3℃，进料速度为30mL/min即得到干燥的固体酶制剂，此时酶制剂的酶活为103U/g，酶活回收率为89.16％，水分含量为8.30％。总的酶活回收率为70％。MTG为略显咖啡色的均匀粉状，具有良好的分散溶解性。
实施例2
发酵得到的MTG发酵液，成分分析结果：菌体及其它固形物共20.0g/L；MTG酶活4.17U/mL。将上述发酵液离心去除菌体，取上清液按照下列条件：0.3MPa、截留分子量为10000或30000的超滤膜低温下进行超滤，得到浓缩3倍的浓缩酶液，酶活为11.82U/mL，酶活回收率为92.12％，浓缩酶液用70％体积比的乙醇沉淀后离心除去上清液得到酶泥，酶泥复溶后得到体积浓缩5倍的酶液酶活为24.04U/mL。复溶后的浓缩酶液与25％的蔗糖、海藻糖或山梨醇，及1‰的还原型谷胱甘肽混合后进行喷雾干燥，干燥条件为出风温度为60±3℃，进料速度为30mL/min即得到干燥的固体酶制剂，酶活为86.83U/g，此步骤酶活回收率为90.29％，水分含量为7.39％。总的酶活回收率为60％。MTG为乳白色的均匀粉状，具有良好的分散溶解性。
实施例3
发酵得到的MTG发酵液，成分分析结果：菌体及其它固形物共20.0g/L；MTG酶活6.21U/mL。进行超滤浓缩至5倍，其余条件同实施例1。此时酶制剂的酶活为94U/g，酶活回收率为86.25％，水分含量为8.10％。总的酶活回收率为68％。MTG为略显咖啡色的均匀粉状，具有良好的分散溶解性。
对比实施例1
改用乙醇沉淀，离心后的酶泥直接进行冷冻干燥，干燥后的样品再经研磨、过筛、与辅料复配混合后得最终产品。其他操作如去除菌体，超滤去除小分子杂质与有色物质，乙醇沉淀同实施例1。结果：产品最终酶活回收率为66.0％，酶粉颜色呈深咖啡色，在水中的分散溶解性很差。
对比实施例2
改用乙醇沉淀，离心后的酶泥直接进行真空干燥，干燥后的样品再经研磨、过筛、与辅料复配混合后得最终产品。其他操作如去除菌体，超滤去除小分子杂质与有色物质，乙醇沉淀同实施例1。结果：产品最终酶活回收率为54.09％，酶粉颜色呈深咖啡色，在水中的分散溶解性很差。
Claims (5)
1、一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法，其特征是采用谷氨酰胺转胺酶发酵液经过离心或压滤去除菌体，使用超滤技术和用或不用乙醇沉淀再酶泥复溶去除小分子杂质和有色物质制得浓缩酶液，再将浓缩酶液与辅料及保护剂混合后进行喷雾干燥，即可得到谷氨酰胺转胺酶固体酶制剂，具体工艺为：对谷氨酰胺转胺酶发酵液离心或压滤，超滤，用或不用乙醇沉淀再酶泥复溶，添加辅料及保护剂，喷雾干燥，成品包装而制得成品酶制剂；
离心或压滤：将发酵液离心或板框压滤，弃去菌体，得上清液或滤液；
超滤：将上清液或滤液，按照下列条件：0.3MPa、截留分子量为10000或30000的超滤膜超滤，浓缩至5-8倍或3倍，去除小分子杂质和有色物质得浓缩酶液；
乙醇沉淀：将浓缩3倍的超滤液用70％体积比的乙醇缓缓加入超滤浓缩3倍的超滤液中，并不断搅拌，静置沉淀谷氨酰胺转胺酶并离心弃去上清液得酶泥；
酶泥复溶：将乙醇沉淀的酶泥重新溶解于一定量的水中，复溶制得浓缩5-8倍的浓缩酶液；
超滤直接得到的浓缩5-8倍的浓缩酶液不必经过乙醇沉淀和酶泥复溶工序；
添加辅料及保护剂：将超滤直接得到的或经乙醇沉淀酶泥复溶后得到的浓缩5-8倍的浓缩酶液与重量体积比为25％的麦芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇，及重量体积比为0.1-1‰的还原型谷胱甘肽混合；
喷雾干燥：将混合好的浓缩酶液进行喷雾干燥，控制出风温度为60±3℃，进料速度为30mL/min；
包装：即得成品。
2、根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法，其特征是将发酵液处理后的上清液或滤液采用超滤去除小分子杂质和有色物质，并浓缩至5-8倍或浓缩至3倍制得浓缩酶液。
3、根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法，其特征是将超滤浓缩3倍的浓缩酶液经乙醇沉淀再酶泥复溶制备浓缩5-8倍的浓缩酶液，溶剂沉淀所用溶剂是乙醇。
4、根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法，其特征是干燥方法为喷雾干燥。
5、根据权利要求1所述的一种从谷氨酰胺转胺酶发酵液中制备固体酶制剂的方法，其特征是喷雾干燥前，浓缩酶液中所添加的辅料及保护剂为：麦芽糊精、水溶性淀粉、蔗糖、海藻糖或山梨醇，每升浓缩酶液中添加量为250g；及还原型谷胱甘肽，每升浓缩酶液中添加量为0.1-1g。
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