CN1657539A - 人结缔组织生长因子突变体蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人结缔组织生长因子突变体蛋白及其应用，其序列特征为：①具有七个氨基酸的修饰突变，其分别为CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→丝氨酸；第115位的丝氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的丝氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸。同时，本发明在前期研究工作基础上，针对其建立完整的生物学活性检测体系，并进行详细的药效学、药理学、毒理学及药剂学分析，完成该rhCTGF突变体做为创伤治疗用药物的临床前研究，为其最终作为可用于临床的治疗性生物制剂而提供基础。

Description

人结缔组织生长因子突变体蛋白及其应用

                         技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，本发明涉及到对现有的人结缔组织生长因子进行多点突变及相应筛选后得到的突变体蛋白。同时，本发明还涉及所述的突变体蛋白的药学用途。

                         背景技术

结缔组织生长因子(CTGF)是一类属于CCN家族的富含半胱氨酸(Cys)的生长因子，它具有多种生物学活性，包括促进细胞增殖、迁徙、粘附、胞外基质形成以及血管生成活性等功能，并且在某些特定条件下还具有促凋亡活性及抑有丝分裂活性。Bradham等人曾于1991年，在培养的静脉内皮细胞(HUVECs)中，通过用PDGF抗血清与培养物中一个38kDa的多肽分子交联，发现了人类CTGF的同源体，该蛋白由349个氨基酸组成，因其能在体外刺激成纤维细胞的有丝分裂及趋化性，故起名CTGF(Connective tissue growth factor)。本发明人曾成功地克隆到的一个CTGF基因(其5’端非编码区具有特殊的序列，其基因库登记号为A Y395801，中国专利号为ZL01107226.1)

hCTGF基因定位于染色体6q23.1，长度大约为3kb，由5个外显子和4个内含子组成(Fig.1)。外显子I编码一段长度为37个氨基酸的前导信号肽，其中34位的Cys对于CTGF从内质网(ER)到高尔基体(Golgi)的输送是必需的。其余4个外显子分别编码4个执行不同功能的结构域，结构域I为IGFBD区域(insulin-like growth factor binding domain，胰岛素样生长因子结合区域)，该区域与6个经典的IGF结合蛋白(IGFBP1-6)N端半胱氨酸富含区有约32％的一致性，其中的GCGCCXXC基序为IGF结合位点；结构域II为VWC区域(Von Willebrand type C domain)，该区域也可见于Von Willebrand因子、粘蛋白、血小板反应素及胶原蛋白中，可能与寡聚化反应有关，尤其可能与介导CTGF二聚体复合物的形成有关；结构域III为TSP1区域(thrombospondin type 1 repeat domain)，该区域含有一个WSXCSXXCG基序，可能是硫化糖缀合物结合位点，因此该区域可能与细胞粘附有关；结构域IV为CT区域(C-rich domain)，该区域的10个半胱氨酸中的6个形成了半胱氨酸结(cystine knot)，这种结构同样也见于NGF、TGF-β、PDGF中，可能与受体结合活性有关，因此，结构域IV可能同时具有二聚化和受体结合区域。

目前，已在5种哺乳动物(人、小鼠、大鼠、猪、牛)及2种两栖类动物(青蛙及非洲爪蟾)中发现了CTGF的cDNA。编码的CTGF蛋白长度从343-349个氨基酸不等(其中hCTGF为349个氨基酸残基)，其中前22-27残基为信号肽序列。CTGF蛋白序列除信号肽部份外，可达到90％的高度保守性，而在信号肽区域仅有60-65％的同源性。

CTGF可在多种细胞知成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、上皮细胞、软骨细胞、成胶质细胞瘤细胞中表达。当受创伤刺激或某些细胞因子如TGF-β及BMP-2(骨形态蛋白2)的信号刺激时，以即刻早期基因产物形式被迅速合成分泌，作用于多种细胞，以调控细胞周期并作用于胞外基质(ECM)的方式调控细胞的功能，从而促进细胞的增殖和粘附、增强炎性细胞的趋化性^[10-12]。此外，CTGF还可表现为促凋亡活性及抑有丝分裂活性，并可与其它生长因子发挥协同作用。因此，CTGF可以参与多种生理学过程，如血管生成、胚胎发育和分化、骨骼形成/再生、女性子宫及卵巢的功能再生、创伤愈合、肢体再生、器官移植等；另一方面，CTGF的过度表达可能在纤维化过程(尤其是依赖于TGF-β过量刺激的纤维化过程)中具有一定的作用，这些病理过程可能导致某些纤维化疾病的形成。

由于CTGF的这些生理学特性及生物学功能，使得CTGF在各类创伤修复，包括外伤修复、软骨形成、角膜再生修复等方面较好的应用潜力。近年来，有关该因子在各类创伤修复等方面已积累了许多资料，从各方面为CTGF做为创伤治疗的细胞因子药物提供了明确的证据，具体体现在：(1)CTGF可以增强血小板的生物学活性，使创伤表面迅速止血；(2)增强巨噬细胞和白细胞的趋化作用，清除伤口内的坏死组织和细菌等；(3)促进创伤表面的毛细血管上皮细胞和平滑肌细胞的生长；(4)促进成纤维细胞分化及活性，并调节创伤部位的纤维修复；(5)在整体上促进和加快创伤组织的修复。

但是，尽管CTGF具有这些生物学活性，但由于其复杂的结构特征及其相关的生物学性质，使得它至今尚未进入临床应用。其具体原因为：第一，人体产生的CTGF分子结构中具有37个半胱氨酸，其极易形成多肽链中的二硫键，从而导致在原核表达系统或真核系统中制备重组CTGF时形成大量的不溶性蛋白包涵体，因此，在制备重组CTGF过程中形成较大的技术障碍，使得CTGF的规模化生产难以实现；第二，目前在有关CTGF的生物学活性研究中，实验表明，其无论以体外人工表达的形式还是体内的自体表达形式，均呈现其生物活性的不稳定性，这表现在CTGF的重组表达蛋白分子活性在组织培养检测体系中无明显的促细胞增殖活性，以及在体内的CTGF分子表达增加时导致某些组织的纤维增生过度；第三，迄今尚无资料介绍有关CTGF或其突变体进行动物药效学的研究，更无有关CTGF或其突变体的药物制剂型或用于灵长类的创伤修复研究及相关的安全性实验。

                       发明内容

本发明的目的是提供一种人结缔组织生长因子突变体蛋白(简称：rhCTGF)。该突变体蛋白是对前述的本发明人已克隆到的结缔组织生长基因进行多点突变，并根据这些突变产物的生物学性质进行相应筛选，挑取具有较高生物学活性和在创伤修复过程中具有较好的促纤维形成及其调节作用的rhCTGF突变体。

同时，本发明的另一个目的是在前期研究工作基础上，针对其建立完整的生物学活性检测体系，并进行详细的药效学、药理学、毒理学及药剂学分析，完成该rhCTGF突变体做为创伤治疗用药物的临床前研究，为其最终作为可用于临床的治疗性生物制剂而提供基础。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

本发明从CTGF分子结构的改变入手，以在一定程度上调整CTGF的生物学性质，即是为将CTGF作为具有临床应用意义的生物制剂而进行的结构改造研究工作。本发明的突变主要集中于结构域II和结构域III，因为这两个结构部位具有CTGF与细胞粘附相关的功能，对其的结构调整，有可能控制CTGF与细胞相关信号分子的结合，从而稳定CTGF的生物学活性，降低CTGF可能引起的纤维增生过度的作用。同时在体外细胞培养体系中，表现较稳定的促细胞增殖作用。

本发明提供了一种人结缔组织生长因子突变体蛋白，其序列特征为：①具有七个氨基酸的修饰突变，其分别为CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→丝氨酸；第115位的丝氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的丝氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；而且②核苷酸序列和人结缔组织生长因子突变体蛋白序列描述如下：

核苷酸序列

1    ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT

49   CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT

97   TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC

145  TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG

193  GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC

241  TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC

289  GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC

337  GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC

385  GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC

433  AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC

481    CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG

529    CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA

577    ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC

625    TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC

673    AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG

721    CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC

769    ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC

817    TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC

865    GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG

913    TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC

961    AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT

1009   GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA

人结缔组织生长因子突变体蛋白序列

1     MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV

51    LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG

101   APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF

151   PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL

201   VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI

251   KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT

301   LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA

本发明人结缔组织生长因子突变体蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)设计了七个氨基酸的修饰突变，其分别为CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→丝氨酸；第115位的丝氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的丝氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；

(2)设计了6对突变引物，使用QuikChange突变试剂盒，对pET-CTGF质粒分别进行突变操作，其引物分别为：

m1：5′_AggTgTAAgCCTCgTgCTggACgg_3′

m2：5′_AgggCCTCTTCTgTgACTTCggCTCC_3′

m3：5′_AgCggAgAgTCCTTCCAgAgCAgC_3′

m4：5′_gTTCgTCTgCCCAgCCCTgAgTgCC_3′

m5：5′_CgggAAATgCTgCgAggAgTgggT_3′

m6：5′_gTgTgACgAACCCAAggACCAAA_3′

(3)依照QuikChange突变试剂盒操作指南将纯化的pET-CTGF质粒40ng与ml引物，正链及其互补链各125ng，dNTP1μl、反应缓冲液5μl，及2.5单位PfuTutbo DNA聚和酶混合，在50μl反应体系中以95℃30″→55℃60″→68℃6′的程序循环12次。反应完成后降温至37℃，加入DpnI孵育1hr，消化未突变的模版链。转化XL1-Blue超级感受态细胞，培养并挑取阳性克隆，测序验证；同法完成m2-m6点突变。

(4)根据常规分子克隆的操作方法，将上述突变修饰后的基因以酶切-连接的方式插入载体质粒，并在该基因前以突变方式插入序列片段-ATG GCT AGCATG ACT GGT GGA CAG CAA ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCC ATG GCT GAT ATC，以保证该基因的表达产物能够通过肠激酶酶切得以纯化。

有益效果：

(1)本发明在对CTGF蛋白进行了全面的结构分析后，对其基因进行了多点突变。获得了较高生物学活性及较好稳定性的CTGF突变体，使之在所选择的原核表达体系获得较高的表达量，并易于纯化，同时，得到了具有较好临床应用意义的CTGF突变体分子；

(2)根据CTGF结构特征分析，针对其37个半胱氨酸所形成靶蛋白空间结构中较多的二硫键而导致蛋白可溶性降低的情况，在确保表达rhCTGF突变体的基本构象的前提下，设计了七个氨基酸的修饰突变，从而在一定程度上改变表达靶蛋白的构象，使之表达量增加，并增加可溶性蛋白的比例，最重要的是，这七个氨基酸的突变，使得表达的CTGF具有稳定的体外生物学活性，及在药效学研究中所表现的对创伤处纤维形成的调节作用。

                        附图说明

从下面给出的说明结合附图，本发明的目的及特征将更加清楚明了。

图1是突变修饰后的pET-CTGF原核表达情况，pET-CTGF质粒转化BL-21宿主菌后，经IPTG诱导可稳定表达CTGF突变体蛋白；

图2是CTGF突变体原核表达蛋白分布分析，显示CTGF突变体原核表达蛋白30％为可溶性蛋白，但大部分仍以不可溶性蛋白存在；

图3是CTGF突变体蛋白的免疫印记分析，显示CTGF突变体蛋白保持了原有的免疫原性；

图4是CTGF突变体蛋白的生物学活性分析(MTT法)，表明CTGF突变体蛋白仍然保持了原有的生物活性；

图5是突变后的CTGF与未突变CTGF的生物学活性的差异分析，表明CTGF突变体蛋白生物学活性已有明显提高；

图6(A)是显示大鼠创伤模型CTGF突变体蛋白受试组，创面被再生上皮覆盖，真皮肉牙组织纤维化间质密，胶原纤维多；

图6(B)是显示大鼠创伤模型对照组，真皮坏死，渗出组织的图；

图6(C)是显示大鼠创伤模型bFGF受试组，肉芽组织与纤维化纤维母细胞变长，有胶原纤维形成；

注：图6(A)-图6(C)系光镜照片，HE染色，×100倍。

图7(A)是显示大鼠创伤模型CTGF突变体蛋白受试组，纤维排列精密、整齐；

图7(B)是显示大鼠皮肤损伤模型，纤维排列紊乱；

图8(A)是显示恒河猴创伤模型CTGF突变体蛋白受试组，纤维排列精密、整齐；

图8(B)是显示恒河猴皮肤损伤模型，纤维排列紊乱；

注：图7(A)-图8(B)系扫描电镜照片，×7000倍。

                       具体实施方式

在下面的实施例中对本发明作进一步说明，但这并不限制本发明的范围。

实施例1

(1)对原有的人结缔组织生长因子，设计了七个氨基酸的修饰突变，其分别为CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→丝氨酸；第115位的丝氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的丝氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；

(2)设计了6对突变引物，使用QuikChange突变试剂盒，对pET-CTGF质粒分别进行突变操作，其引物分别为：

m1：5′_AggTgTAAgCCTCgTgCTggACgg_3′

m2：5′_AgggCCTCTTCTgTgACTTCggCTCC_3′

m3：5′_AgCggAgAgTCCTTCCAgAgCAgC_3′

m4：5′_gTTCgTCTgCCCAgCCCTgAgTgCC_3′

m5：5′_CgggAAATgCTgCgAggAgTgggT_3′

m6：5′_gTgTgACgAACCCAAggACCAAA_3′

依照QuikChange突变试剂盒操作指南将纯化的pET-CTGF质粒40ng与m1引物，正链及其互补链各125ng，dNTP1μl、反应缓冲液5μl，及2.5单位PfuTutbo DNA聚和酶混合，在50μl反应体系中以95℃30″→55℃60″→68℃6′的程序循环12次。反应完成后降温至37℃，加入DpnI孵育1hr，消化未突变的模版链。转化XL1-Blue超级感受态细胞，培养并挑取阳性克隆，测序验证；同法完成m2-m6点突变。

实施例2

pET-CTGF表达载体改造。设计一条突变引物：5-ATG GCT AGC ATGACT GGT GGA CAG CAA ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCC ATG GCT GAT ATC-3，其中包含了一个肠激酶酶切序列，并使其保证在改造pET-CTGF载体时，仍然维持pET-28a的读码框架，该序列插入在CTGF编码区起始子ATG之前的几个氨基酸位置。以保证该基因的表达产物能够通过肠激酶酶切得以纯化，使表达蛋白在肠激酶酶切后产生在N-末端仅带5个额外氨基酸的CTGF蛋白。

实施例3

根据突变结果，对该CTGF突变体的表达情况，表达产物的免疫学原性，生物学活性进行了全面分析，试验内容及结果如下。

(1)突变后的pET-CTGF质粒转化BL-21宿主菌，设置不同条件检测其表达情况，其条件为：(1)0.5umol IPTG，1umol IPTG，2UMOL IPTG；(2)培养温度的改变30℃，200rpm过夜，转为37℃，200rpm诱导；30℃，200rpm过夜，30℃，200rpm诱导；37℃，200rpm过夜，37℃，200rpm诱导；其结果参见图1.经比较确定了37℃，200rpm过夜，1umol IPTG，37℃，200rpm诱导培养条件。同时，对表达的突变体靶蛋白进行了分布分析，结果参见图2.

试验结果说明，经突变后的CTGF突变体表达蛋白已有30％的比例为可溶性蛋白，但大部分仍以不可溶性蛋白存在。因而其纯化系统仍需考虑靶蛋白的溶解和复性步骤。总体看来，突变修饰后的pET-CTGF的表达量已有较大幅度的提高，达到总菌蛋白的20％。

(2)突变修饰后的pET-CTGF表达蛋白的免疫原性分析

为确定所设计的突变未影响CTGF的基本结构，利用购自博士德生物工程有限公司的抗CTGF标准抗体，并使用购自Biovendor公司的CTGF标准品对上述突变修饰后的pET-CTGF突变体表达蛋白进行了Western blot分析，其操作方法按标准程序，其结果参见图3。

Western blot实验证明，经改造后的CTGF突变体表达蛋白仍然保持了原有的免疫原性。

(3)突变修饰后的pET-CTGF表达蛋白初纯后的生物学活性分析

为确定经突变后的CTGF突变体表达蛋白仍然具有原有的生物活性，我们根据前期基础工作中的活性检测方法，对初步纯化的CTGF突变体蛋白进行了活性检测，方法同样用MTT法，其结果参见图4。

MTT检测证明，经突变后的rhCTGF突变体表达蛋白仍然保持了原有的生物活性。利用MTT检测分析了突变后的CTGF与未突变CTGF的生物学活性的差异，其结果表明，突变后的CTGF生物学活性已有明显提高，其ED50＝1.15ng.而突变前CTGF的ED50＝1.45ng。其结果参见图5.

(4)rhCTGF药剂学处方研究

根据药效学研究的结果，确定了rhCTGF的临床应用方式为局部外用。因CTGF为蛋白质多肽类，稳定性相对较差，故以冻干剂型制备而成；经过对动物临床药效、制品稳定性等方面指标的分析，最终确定了用于创伤局部使用的rhCTGF制剂处方。每个剂量的组成为：rhCTGF2500ng(2500IU)；甘露醇50mg，注射用水1ml。

[试验例1]rhCTGF突变体药效学研究

基于rhCTGF突变体制品在体外实验中所表现的生物学活性，根据药学研究的规定，对rhCT6F突变体制品在不同动物创伤模型中所表现的创伤治疗作用进行定性定量的研究分析。所使用的实验动物包括两类：其一是常规药学实验所要求的SD大鼠；其二是灵长类动物恒河猴。创伤模型均为动物背部双侧深II度烫伤。药效分析指标为：创面面积及愈合时间；创面组织光学显微镜检测；创面组织扫描电镜检测；流式细胞仪检测细胞生长周期，并由统计学分析方法得出最终结果。

rhCTGF突变体制品促进大鼠烫伤创面愈合实验

SD大鼠由东南大学动物中心提供，动物质量合格证号为97004，实验环境合格证号为苏动[环]97008。实验前一周领取，雌雄各半，体重180-220g，实验时动物室温度15-22℃，相对湿度50-70％。

将受试鼠随机分为受试药组(CTGF突变体给药量为100ng/创面)、阳性药对照组(rhbFGF 250u/创面)和自体对照组，每组8只，单笼喂养。各组动物左右两侧皮肤分别以电烫仪制备深II度烫伤模型，每只背部双侧各设一个创伤面。造模后次日起开始给药，另一侧给等量生理盐水，每日一次，共14天。每日观察创面愈合状况并拍照后行图像分析，给药第15天时取愈合组织行光镜、电镜观测并分离细胞行细胞周期检测。实验结果表明：在大鼠创伤模型的CTGF突变体治疗过程中，给药后第15天时，给药组动物的受试侧创面相对愈合面积与同组对照侧差异显著；创面愈合速度由快至慢分别为rhCTGF突变体、rhbFGF。创面完全脱痂时取组织进行光学显微镜观察并评分发现，受试侧与对照侧相比差异显著；扫描电镜检测反应受试侧纤维排列明显较对照侧更近似于正常皮肤；流式细胞仪检测结果显示，受试侧细胞G1期较对照侧短，并有显著差异，实验结果参见附表1.1-1.6，图6(A)～图7(B)。提示局部应用rhCTGF突变体可促进受试大鼠深II度烫伤创面的愈合，并明显缩短创面愈合的时间。

rhCTGF突变体制品促进恒河猴烫伤创面愈合实验

选用的灵长类动物-恒河猴由中国医学科学院医学生物学研究所灵长类中心提供，动物质量合格证为滇实动证D2000005，实验环境合格证号为滇实动证D2000005。雌雄各半，体重4-4.5Kg，单笼喂养，自由饮水，饮食，实验时动物室温度21-23℃，相对湿度44-65％。

将受试猴随机分受试药组(1100ng/创面)、阴性对照组和阳性对照组(rhbFGF 250u/创面)。每只动物背部以电烫仪制备深II度烫伤模型，双侧各三个创伤面，烫伤次日起始给受试药，阴性对照采用等量生理盐水。每日观察创面愈合状况并拍照后行图像分析，给药18天时取愈合组织行光镜、电镜检测并分离细胞行细胞周期检测。结果表明，在恒河猴创伤后局部用药的第18天，受试动物的受试侧面相对愈合面积与同组对照侧差异显著；同时受试侧创面相对愈合周期与同组对照侧差异显著；扫描电镜可见受试侧纤维排列明显较对照侧更近似于正常皮肤，这提示局部应用rhCTGF可促进恒河猴深II度烫伤创面愈合，缩短创面愈合的时间，结果详见表2.1-2.6，图8(A)～图8(B)。

在上述应用rhCTGF突变体的大鼠及恒河猴创伤治疗药学研究中，选用了作为基因工程产品的上市药物bFGF作为阳性对照。bFGF的生物学活性主要表现为刺激成纤维细胞的增生，因而可促进创伤的修复，其在创伤临床治疗中意义已被明确，并已作为商品化药物被广泛使用。与bFGF相比较，rhCTGF突变体具有更为广泛的生物学活性，它除了可以促进成纤维细胞的增殖之外，还具有刺激血管内皮细胞、上皮细胞、细胞外基质的活性及增生的能力，尤其是具有针对创伤修复过程中纤维修复的调节作用，因此，在促进创伤修复的治疗过程中，其具有突出的调节创伤组织纤维疤痕形成的作用，避免了创伤修复过程中通常存在的疤痕形成这一生理学的结果，上述药学研究中针对创伤组织的修复过程使用rhCTGF突变体调节其纤维形成作用的电镜分析明确地证实了这一点。

因此，临床前实验已表明，rhCTGF突变体具有较好的促创伤修复活性和安全性，可以作为创伤修复治疗制剂用于创伤修复的临床试验治疗。

                                  序列表

1.结缔组织生长因子突变体蛋白核苷酸序列

SEQ ID NO：1

1      ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT

49     CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT

97     TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC

145    TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG

193    GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC

241    TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC

289    GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC

337    GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC

385    GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC

433    AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC

481    CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG

529    CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA

577    ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC

625    TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC

673    AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG

721    CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC

769    ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC

817    TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC

865    GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG

913    TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC

961    AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT

1009   GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA

2.结缔组织生长因子突变体蛋白序列

SEQ ID NO：2

1    MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV

51   LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG

101  APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF

151  PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL

201  VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI

251  KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT

301  LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA

表1.1 rhCTGF对大鼠皮肤创面愈合面积的影响

药物	剂量	不同时相(天)皮肤创面愈合面积(×108um2)
											1	2	3	4	5	6	9	12	15
		rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGF	10ng030ng0100n90250u0	47.8±14.437.0±5.8935.3±11.529.3±6.2042.8±17.138.4±16.332.0±14.233.6±9.96	53.1±9.8442.6±20.228.8±8.6626.6±18.047.3±27.535.2±8.1338.7±11.840.7±11.4	38.4±16.951.0±9.5427.3±5.8530.7±8.6532.1±11.435.5±8.7833.2±9.9737.6±16.0	44.2±13.630.6±9.7028.0±10.832.4±14.738.8±16.933.7±6.8628.7±6.8530.8±3.70	34.8±11.125.8±7.9129.8±12.824.2±5.2630.3±7.5130.0±5.2730.9±8.4728.8±7.74	28.8±6.6424.8±3.7330.5±9.4*21.0±7.1327.3±8.7627.0±7.1128.6±9.5925.8±6.79	31.4±10.024.2±3.7321.5±9.6318.8±3.7721.9±5.6222.6±6.5623.4±9.7*19.0±5.9										19.0±3.2019.0±4.3213.9±5.710.8±5.4417.6±8.2118.0±9.7713.0±7.616.75±4.68	11.5±7.078.52±1.668.31±3.427.12±5.229.15±4.037.98±5.38.81±6.6713.2±4.73

x±sd，组内Student t检验，^*p＜0.05

表1.2  rhCTGF对大鼠II度烫伤创面愈合面积的影响Δ％

drug	Dose	不同时相(天)创面愈合Δ％								总评
											2	3	4	5	6	9	12	15
		rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGF	10ng030ng0100ng0250u0	16.1115.6148.1514.5031.412.74-9.6-10.75	31.27-9.2950.131.5453.5312.196.05-2.09	20.9934.3548.8947.2443.8716.5210.4516.3	37.7544.6854.5335.2656.1325.8512.3821.87	48.5446.9458.2846.5660.4233.2618.9030.02	43.8548.0363.5744.2968.2444.0533.8248.35										66.0759.3680.0573.8974.5154.9462.8557.22	79.4981.7484.11*74.4186.74**80.2471.6864.23	0.43±0.210.40±0.280.61±0.14*0.30±0.400.59±0.17*0.34±0.24*0.22±0.250.28±0.27

x±sd，组内Student t检验，^*p＜0.05  ^**p＜0.01

表1.3  rhCTGF对创面面积愈合60％时间的影响

drug	dose	回归方程	r	愈合60％的时间(days)	与对照侧相比缩短％
						rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGF	10ng030ng0100ng0250u0	Y＝11.7294+4.4684xY＝3.9222+5.1793xY＝39.94+3.0013Y＝8.3725+4.8351xY＝34.4219+3.5628xY＝-0.8653+5.1199xY＝-16.9619+6.1103xY＝-11.4011+5.6493x	0.95100.86490.98350.87140.94080.98850.98890.9526	10.8010.826.6810.687.17911.8812.6012.64	0.0137.539.50.3

表1.5  电镜观察rhCTGF对创面细胞及纤维的影响

药物	剂量	细胞	纤维
				rhCTGF	10ng030ng0100ng0	趋化为纤维可见成纤维细胞趋化为纤维大量杆菌，球菌覆盖，可见细胞可见趋纤维化可见圆形纤维细胞，较长成纤维细胞	成束状生长的纤维生长较乱，成网状部分生长较乱，部分较为整齐纤维不规则成网状，较乱纤维结合较为紧密略有弯曲纤维成网状，较乱
模型组		巨嗜细胞，淋巴细胞	可见网状，束状纤维
				空白		可见血细胞

表1.4  rhCTGF对创面愈合的组织学影响

药物	剂量	表皮结构特征	真皮结构特征	评 分
					rhCTGF	10ng030ng0100ng0	坏死，炎性渗出较少，再生情况较好坏死脓性渗出较多，几乎不可见再生情况坏死脱落有炎性渗出坏死脱落，复层鳞状上皮覆盖复层鳞状上皮覆盖，有轻度角化坏死脱落，复层鳞状上皮覆盖	水肿炎症细胞少，肉牙组织多，胶原纤维多且致密水肿炎症细胞较多肉牙组织血管丰富，较成熟，有炎细胞浸润，间质出现胶原纤维肉牙组织填补，肉牙组织纤维化肉牙组织富有血管，深部为纤维肉牙组织，胶原纤维多致密炎性肉牙组织填补，肉牙组织纤维化，胶原纤维多而致密	16.4±8.0*18.4±2.613.5±4.517.4±4.514.2±6.016.6±4.6
RhbFGF	250u0	坏死脱落，复层鳞状上皮覆盖复层鳞状上皮覆盖	肉牙组织富有血管，有多量炎细胞浸溶纤维肉牙组织，间质出现胶原纤维，多而致密	14.33±8.213.0±6.2
					模型		复层鳞状上皮覆盖	肉牙组织富有血管，纤维母细胞已转变为纤维细胞，出现胶原纤维	15.5±7.01

x±sd，组内Student t检验，^*p＜0.05

表1.6 rhCTGF对创面愈合细胞的细胞周期的影响

药物	剂量	动物数只	G1期细胞％
				rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGF	10ng030ng0100ng0250u0	33554433	53.83±15.5175.32±24.5377.12±11.14*82.10±11.3371.39±9.8080.80±8.0577.55±2.9182.95±4.87

x±sd，组内配对Student t检验，^*p≤0.05

表2.1  rhCTGF对猕猴皮肤创面愈合面积的影响

药物	剂量	不同时相(天)皮肤创面愈合面积(cm2)
											1	2	3	4	5	6	7	8	9
		rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng30ng100ng250u0	3.43±0.773.23±0.422.82±0.383.37±0.583.28±0.54	3.15±0.512.81±0.603.07±0.543.13±0.483.06±0.60	2.08±0.552.40±0.532.46±0.622.52±0.422.71±0.77	2.39±0.512.27±0.372.04±0.282.24±0.382.39±0.42	2.39±0.382.15±0.412.10±0.342.44±0.602.33±0.42	2.20±0.332.08±0.402.00±0.332.07±0.322.15±0.35	2.14±0.561.99±0.451.83±0.352.12±0.402.12±0.47										2.01±0.331.90±0.431.71±0.321.99±0.472.11±0.45	1.87±0.471.66±0.391.61±0.321.88±0.562.03±0.39
药物	剂量										不同时相(天)皮肤创面愈合面积(cm2)
		10	11	12	13	14	15	16	17	18
											rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhCTGFModel	10ng30ng100ng250u0	1.75±0.381.51±0.371.49±0.301.69±0.571.92±0.53	1.57±0.501.46±0.331.33±0.321.39±0.311.83±0.49	1.46±0.441.37±0.321.23±0.391.31±0.411.63±0.44	1.33±0.471.20±0.361.09±0.321.11±0.381.50±0.43	1.23±0.411.03±0.361.04±0.341.03±0.441.30±0.38	1.01±0.330.97±0.260.90±0.350.92±0.311.24±0.34	0.87±0.420.88±0.290.73±0.330.84±0.261.06±0.29	0.69±0.360.77±0.270.62±0.300.66±0.350.96±0.29	0.57±0.420.63±0.300.49±0.290.55±0.300.89±0.30

表2.2  rhCTGF对猕猴皮肤创面愈合周长的影响

药物	剂量	不同时相(天)皮肤创面愈合周长(cm)
											1	2	3	4	5	6	7	8	9
		rhCTGFrhCTGFrhCGGFrhCTGFModel	10ng30ng100ng250u0	6.85±1.256.91±0.566.49±0.416.99±0.597.04±0.63	7.01±0.926.53±0.666.85±0.556.83±0.456.94±1.25	6.50±0.796.08±0.666.17±0.676.15±0.466.45±1.11	5.95±0.645.83±0.505.58±0.405.84±0.455.96±0.65	5.96±0.445.63±0.525.60±0.436.01±0.705.97±0.68	5.76±0.405.55±0.525.46±0.395.57±0.385.56±0.45	5.58±0.715.42±0.655.22±0.515.64±0.515.77±0.84										5.46±0.425.31±0.655.13±0.435.41±0.645.68±0.80	5.35±0.554.84±0.614.95±0.475.23±0.775.57±0.76
药物	剂量										不同时相(天)皮肤创面愈合周长(cm)
		10	11	12	13	14	15	16	17	18
											rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng30ng100n9250u0	5.07±0.524.69±0.554.73±0.435.08±0.705.39±0.97	4.77±0.684.66±0.564.44±0.524.52±0.465.20±0.88	4.61±0.644.48±0.514.24±0.684.37±0.645.04±0.91	4.38±0.714.16±0.624.02±0.064.06±0.654.77±0.82	4.27±0.673.96±0.613.92±0.653.88±0.754.40±0.57	3.88±0.563.78±0.543.64±0.703.67±0.574.42±0.66	3.61±0.743.58±0.613.28±0.743.54±0.564.01±0.49	3.20±0.793.35±0.633.05±0.873.07±0.803.83±0.57	2.84±0.992.97±0.802.61±0.942.72±0.803.64±0.57

表2.3  rhCTGF对猕猴II度烫伤创面愈合面积的影响Δ％

药物	剂量	不同时相(天)创面愈合Δ％
											2	3	4	5	6	7	8	9	10
		rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGModel	10ng30ng100ng250u0	94.9387.69108.3794.43100.75	84.8774.2286.9675.7089.35	72.5370.4372.6866.9876.85	72.4766.4374.2972.2976.08	66.8364.4971.1762.6970.76	64.4161.0064.6163.2469.31	60.6358.5060.6658.8469.60										56.2951.2057.2355.4668.68	52.8346.4052.6849.4162.37
药物	剂量										不同时相(天)创面愈合Δ％
		11	12	13	14	15	16	17	18	总评
											rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng30ng100n25u0	47.1045.0446.9341.6760.40	44.0042.0143.5638.5852.52	39.9436.8538.4432.9049.25	36.9131.5936.9230.4142.99	30.8229.8531.7527.5442.61	26.7426.8125.7425.0337.23	20.9223.5021.7119.0933.02	17.2019.1717.1316.1028.85	0.52±0.220.49±0.200.54±0.250.49±0.220.60±0.20

表2.4  rhCTGF对猕猴II度烫伤创面愈合周长的影响Δ％

药物	剂量	不同时相(天)创面愈合Δ％
											2	3	4	5	6	7	8	9	10
		rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng30n100n25u0	105.2995.74105.2496.7497.13	98.5886.9091.8288.3091.02	90.0683.5882.6982.6683.99	92.1181.4286.0786.4484.26	87.1677.9683.2777.7779.26	84.7476.9577.6981.8381.08	82.9273.9275.6176.0179.24										78.9269.5573.8572.6678.35	75.6665.5668.7668.8674.48
drng	Dose										不同时相(天)创面愈合Δ％
		11	12	13	14	15	16	17	18	总评
											rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng300ng100ng250u0	71.0766.5564.9661.7472.98	68.5362.9362.1860.4068.75	65.5158.3259.0555.4565.35	64.0255.1457.5653.4859.98	57.7153.5353.1749.6561.22	54.8950.2749.4050.1855.65	49.8247.6746.5042.5353.94	44.4641.8540.3339.5452.42	0.75±0.170.68±0.160.69±0.180.67±0.170.73±0.13

表2.5  rhCTGF对创面面积愈合60％时间的影响

drng	dose	回归方程	r	愈合60％的时间(days)	与对照侧相比缩短％
						rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng30ng100ng250u0	Y＝-0.0438x+0.9614Y＝-0.039x+0.8812y＝-0.0508x+0.956Y＝-0.0435x+0.923Y＝-0.0389x+0.9956	0.99250.99270.97400.98430.9818	8.257.217.017.4310.17	18.8829.1131.0726.94

表2.6  rhCTGF对创面周长愈合60％时间的影响

drng	dose	回归方程	r	愈合60％的时间(days)	与对照侧比缩短％
						rhCTGFrhCTGFrhCTGFrhbFGFModel	10ng30ng100ng250u0	Y＝-0.0327x+1.1004Y＝-0.0288x+0.99Y＝-0.0337x+1.018Y＝-0.032x+1.01Y＝-0.0238x+0.9889	0.99360.99390.98840.98930.9851	15.3013.5412.4012.8116.34	6.3617.1424.1121.60

Claims (5)

1.一种人结缔组织生长因子(CTGF)突变体蛋白，其序列特征为：在CTGF蛋白序列中具有七个氨基酸的修饰突变，该类突变为相应位置上的氨基酸的非特定置换。该突变体蛋白序列描述如下：

 1     MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV

 51    LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG

101    APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF

151    PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL

201    VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI

251    KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT

301    LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA

2.权利要求1所述及的人结缔组织生长因子突变体蛋白的编码基因，其序列特征为：在七个氨基酸的编码子结构上具有非特定的碱基置换，同时，在编码区第1-100位碱基上进行了密码简并性置换修饰，其序列描述如下：

   1    ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT

  49    CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT

  97    TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC

 145    TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG

 193    GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC

 241    TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC

 289    GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC

 337    GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC

 385    GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC

 433    AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC

 481    CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG

 529    CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA

 577    ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC

 625    TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC

 673    AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG

 721    CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC

 769    ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC

 817    TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC

 865    GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG

 913    TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC

 961    AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT

1009    GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA

3.包含权利要求2所述人结缔组织生长因子编码基因的，经特定构建的重组表达载体，其特征包括权利要求2的基因序列和具有易于纯化该基因表达产物的特定酶切位点的编码序列。

4.一种权利要求1所述的人结缔组织生长因子突变体蛋白在制备修复治疗创伤的药中的应用。

5.权利要求1所述的人结缔组织生长因子突变体蛋白以安全有效量与甘露醇，特定缓冲系统按比例配成的冻干药物组合物。

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