CN1656211B - 抗酸细菌的溶菌方法和用其进行基因扩增或检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗酸细菌的溶菌方法，包括在含有非离子表面活性剂的液体中在低于所述液体的沸点的温度下加热所述抗酸细菌。这个方法可以实现在短时间内不使用特殊的设备和试剂的情况下简单地安全溶解抗酸细菌，而且提取基因。所述加热优选在96℃进行10分钟。所述非离子表面活性剂可以是D-山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯和聚氧乙烯二醇对叔辛基苯基醚等。所述液体的pH值优选8，且所述液体优选含有EDTA。还优选在加热前，用脂肪酶处理所述抗酸细菌。

Description

抗酸细菌的溶菌方法和用其进行基因扩增或检测的方法
技术领域
本发明涉及一个抗酸细菌的溶菌方法和用其进行基因扩增或基因检测的方法。
背景技术
结核病仍然是全球范围内的一个严重的细菌性疾病，因此，不仅治疗方法而且诊断方法都是非常的重要。通过进行一种培养方法完成对于结核病感染的最终诊断。但是，因为结核杆菌(tubercule bacilli)生长速率很低，因此希望可以建立在培养方法之前的初步诊断方法(preliminary diagnostic method)。作为这样的初步诊断方法，使用聚合酶链反应(PCR)的方法是引人注意的。在这个方法中，使用结核杆菌基因的特异引物扩增结核杆菌的基因，如果存在这样的基因，则可以被检测出来，因此能够确定是否存在结核杆菌。
在上述使用PCR方法的初步诊断方法中，对结核杆菌进行溶菌而提取基因是一个必需的预处理。常规的溶菌方法例如包括使用有机溶剂等的化学方法和使用超声波或反复冻融的物理方法。但是，因为结核杆菌具有高的细胞壁脂质含量，这样的常规溶菌方法不能充分地提取基因。为了充分地提取基因，需要使用特殊的设备和/或特殊的试剂及较剧烈的处理条件。而且，这可能需要较长的处理过程和更复杂的操作。有关溶菌的这些问题不是特异针对结核杆菌的，还涉及包括结核杆菌在内的全部抗酸细菌。
发明内容
因此，依据前述，本发明的目的是提供一种不需使用任何特殊设备或特殊试剂的简单且短时间的抗酸细菌的溶菌方法。
为了完成以上目的，本发明的第一种溶菌方法是一种溶解抗酸细菌并从抗酸细菌中提取基因的方法，包括：在含非离子表面活性剂的液体中在低于液体沸点的温度下加热抗酸细菌。
而且，为了完成以上目的，本发明的第二种溶菌方法是一种溶解抗酸细菌并从抗酸细菌中提取基因的方法，包括：通过使用脂肪酶处理抗酸细菌导致脂解作用，并在非离子表面活性剂存在时加热抗酸细菌。
依据本发明的第一种溶菌方法，仅仅通过在含有非离子表面活性剂的溶液中加热抗酸细菌，例如，96℃，10分钟，就可以从抗酸细菌中充分地提取基因。因此，随后进行的扩增或检测基因的方法能够很容易地完成。而且，因为加热温度低于液体的沸点，所述方法具有以下优点，例如，因为防止了所述液体的沸腾，于是减少样品的飞散。此外，因为温度很容易被控制，所以不需要特殊的加热器。
另一方面，基于抗酸细菌具有高的细胞壁脂质含量这个事实，本发明的发明人提供了本发明的第二种溶菌方法。即，在本发明的第二种溶菌方法中，通过脂解作用使抗酸细菌的细胞壁脆弱化并且通过加热溶解抗酸细菌。
依据本发明的第一种和第二种溶菌方法，不使用任何特殊试剂如离液剂(chaotropic reagent)或任何特殊设备如超声波装置，可容易地在短时间内溶解抗酸细菌。此外，因为第一种和第二种溶菌方法是化学方法，因此它们是安全的，样品飞散的风险低。而且，依据本发明的第一种和第二种溶菌方法，提取的基因不经纯化即可以进行基因扩增过程或基因检测过程。需要注意的是，本发明的第一种和第二种溶菌方法不仅适用于进行基因扩增或基因检测的方法，而且还适用于其他领域如基因操纵。
附图简述
图.1显示确定本发明一个实施例的溶菌效果的电泳结果；
图.2显示确定本发明另一个实施例的溶菌效果的电泳结果；
图.3显示确定本发明再一个实施例的溶菌效果的电泳结果。
完成本发明的最佳方式
以下将进一步详细描述本发明的第一种溶菌方法和第二种溶菌方法。
首先，描述本发明的第一种溶菌方法。
在本发明的第一种溶菌方法中，加热温度优选不低于70℃但低于100℃，更优选不低于80℃但低于100℃，最适宜的温度是96℃。而且，例如，加热1到30分钟，优选10分钟。例如，溶液的pH范围是pH7.0到12.0，优选pH8.0。例如，液体中非离子表面活性剂的浓度是0.01％到10wt％，优选0.5到2.0wt％，更优选1.0wt％。
非离子表面活性剂例如包括：D-山梨糖醇脂肪酸酯例如Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80和Span 85(所有产品由NacalaiTesque，Inc.生产)；聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯例如Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween81和Tween85(所有产品由Nacalai Tesque，Inc.生产)；聚氧乙烯二醇对叔辛基苯基醚例如Triton X-100(由Nacalai Tesque，Inc.生产)。这些表面活性剂可单独使用或组合两种或更多种使用。其中，优选TritonX-100，Tween 20和Tween21，更优选Triton X-100。
在本发明的第一种溶菌方法中，优选溶液还含有金属螯合剂。金属螯合剂可防止样品中的基因降解酶如DNase降解基因。溶液中金属螯合剂的浓度是，例如，0.1到100mM，优选1.0mM。金属螯合剂例如包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、环己二胺四乙酸、邻菲咯啉和水杨酸。这些金属螯合剂可单独使用或组合两种或更多种使用。其中，优选EDTA和EGTA，更优选EDTA。
本发明第一种溶菌方法使用的抗酸细菌例如包括鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、草分枝杆菌(M.phlei)、海分枝杆菌(M.marinum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、土分枝杆菌(M.terrae)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、次要分枝杆菌(M.triviale)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、非洲结核菌(M.africanum)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistable)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)。
在本发明的第一种溶菌方法中，含有抗酸细菌的生物样品的实例包括痰液、脊髓液、粪便、唾液、血液、组织和尿液等。
其次，例如，本发明的第一种溶菌方法可以按如下方式进行。首先，上述预先确定pH范围的缓冲液中需要加入金属螯合剂如EDTA，如需要可加入非离子表面活性剂，这样制备成溶菌试剂溶液。缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、HEPPS缓冲液、TAPS缓冲液、磷酸盐缓冲液等缓冲液。这个溶菌试剂溶液优选在高压锅内高压蒸气灭菌。另一方面，制备样品溶液。例如，可以使用由N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH方法(NALC-NaOH方法)均质和灭菌的痰液样品等作为样品溶液。离心样品溶液并去除上清。向沉淀中加入溶菌试剂溶液。之后，使用加热器等在上述预先确定的温度范围内加热混合液进行溶菌处理。除了加热器以外的加热方式例如还包括水浴、微波炉和空气浴。
只有样品正在或已被预处理后，这样溶菌的样品才可进行基因扩增过程或基因检测过程。进行基因扩增或基因检测的方法例如包括PCR方法和修饰的PCR方法，如RT-PCR方法。而且，被分析的基因例如包括DNA和RNA。
下面，描述本发明的第二种溶菌方法。
在本发明的第二种溶菌方法中，优选所述加热也可使脂肪酶失活。这使得无需任何特殊过程而使脂肪酶失活。另外，脂肪酶可能影响溶菌处理后进行的过程的可能性，例如影响基因扩增过程或基因检测过程的可能性可以被排除。
在本发明的第二种溶菌方法中，优选在缓冲液中分别进行脂解作用和加热。更优选在同样的缓冲液中进行脂解作用和加热。缓冲液的种类没有特别的限制，例如，Tris缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、McIlvaine缓冲液等都可使用。其中，优选Tris缓冲液和HEPES缓冲液。
在本发明的第二种溶菌方法中，优选在同样的容器中如一个密闭的系统中进行脂解作用和加热。通过在密闭的系统中进行脂解作用和加热，有可能防止样品飞散。而且，通过在同样的容器中进行脂解作用和加热，可提高处理效率。
在本发明的第二种溶菌方法中，可以在脂解作用之后进行加热，或脂解作用和加热可同时进行。在前一种情况中，例如，在pH4到8和温度为37℃到60℃，脂解5到30分钟，并且在温度为37℃到100℃，加热5到30分钟。优选地，在pH6到8和温度为37℃到50℃，脂解5到20分钟，并在温度为80℃到100℃，加热5到20分钟。更优选地，在pH6.5到7.5和温度为37℃到50℃，脂解10分钟，并在温度为90℃到98℃，加热10分钟。另一方面，在后一种情况中，例如，在pH4到8和温度为37℃到60℃，脂解和加热10到30分钟；优选在pH6到8和温度为37℃到50℃，脂解和加热10到20分钟，和更优选在pH6.5到7.5和温度为45℃到50℃，脂解和加热10到20分钟。
缓冲液中脂肪酶的浓度为10到10000单位/ml，优选100到2000单位/ml，更优选200到1000单位/ml。使用的脂肪酶没有特别的限制，例如，商品名为脂肪酶R“AMANO”G、脂肪酶M“AMANO”10、脂肪酶G“AMANO”50、脂肪酶AY“AMANO”30G、脂肪酶A“AMANO”6的产品(所有产品由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd生产)等。它们可以单独使用或两种或多种组合使用。其中，优选脂肪酶G“AMANO”50和脂肪酶AY“AMANO”30G，更优选脂肪酶AY“AMANO”30G。
在缓冲液中非离子表面活性剂的浓度是，例如，0.01到10wt％，优选0.1到2.0wt％，更优选0.5到1.0wt％。
非离子表面活性剂例如包括：D-山梨糖醇脂肪酸酯如Span20、Span40、Span60、Span65、Span80和Span85(例如，所有产品由NacalaiTesque，Inc.生产)；聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯如Tween20、Tween21、Tween40、Tween60、Tween65、Tween80、Tween81和Tween85(例如，所有产品由Nacalai Tesque，Inc.生产)；聚氧乙烯二醇对叔辛基苯基醚如Triton X-100(例如，由Nacalai Tesque，Inc.生产)。这些表面活性剂可单独使用或两种或多种组合使用。其中，优选Tween 20和Triton X-100，更优选Triton X-100。
优选地，除了非离子表面活性剂之外，在金属螯合剂存在下进行加热。金属螯合剂可以防止基因降解酶如包含在样品中的DNase降解基因。金属鳌合剂在溶液中的浓度是，例如，0.1到2.0mM，优选0.5到1.0mM。金属螯合剂例如包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、和1，2-环己二胺四乙酸(CyDTA)。这些金属螯合剂可单独使用或两种或多种组合使用。其中，优选EDTA和EGTA，且更优选EDTA。
第二种溶菌方法适用于与第一种溶菌方法相同的抗酸细菌。而且，在第二种溶菌方法中使用的包含抗酸细菌的生物样品也与在第一种溶菌方法中的相同。
其次，本发明的第二种溶菌方法例如按如下方式进行。首先，向具有上述预先确定范围pH的缓冲液中加入脂肪酶和非离子表面活性剂，如需要可加入金属螯合剂如EDTA，因此，制备溶菌试剂溶液。这个溶菌试剂溶液优选在高压锅内高压蒸汽灭菌。将样品加入该溶菌试剂溶液中，所得的混合液在45℃孵育10分钟(脂解作用)，然后，在96℃孵育10分钟(加热)。抗酸细菌的细胞壁被前次孵育脆弱化，通过后次孵育，抗酸细菌被溶菌并且脂肪酶被失活。使用加热器、水浴、热循环仪等进行这2次孵育。或者，将样品加入溶菌试剂溶液，然后，所得混合液在37℃到50℃孵育10到20分钟来同时进行脂解作用和加热。
例如，通过N-乙酰基-L-半胱氨酸-NaOH方法(NALC-NaOH方法)等均质化和灭菌痰液来制备样品。样品离心并去除上清。之后，将溶菌试剂溶液加入留下的沉淀中。
这样溶菌的样品只有当正在或已被预处理后，才可用于基因扩增过程或基因检测过程。进行基因扩增或基因检测的方法例如包括PCR方法和修饰的PCR方法，如RT-PCR方法。而且，被分析的基因例如包括DNA和RNA。
实施例
以下，与比较例一起描述本发明的实施例。实施例1-1、1-2、1-3和1-4涉及本发明的第一种溶菌方法，实施例2-1、2-2、2-3和2-4涉及本发明的第二种溶菌方法。
(实施例1-1，比较例1)
结核杆菌的临床分离物在商品名为MycoBroth(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.，Ltd)的产品中在37℃培养，直到获得相应于McFarland标准浊度的#1的浊度。然后，培养物用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释以得到10倍系列稀释液(100倍到1010倍)，这样制备包含结核杆菌的测试溶液。随后，分别将100μl上述浓度的测试溶液倒入螺旋盖试管，然后，离心(10000g，15分钟)制备沉淀。从各自的测试溶液中获得的沉淀用做溶菌反应的样品。另一方面，将商品名为TritonX-100(Nacalai Tesque，Inc.)的产品溶解在TE缓冲液(10mM EDTA和25mM Tris-HCl，pH8.0)中，使其浓度达到3wt％以制备溶菌试剂溶液。溶菌试剂溶液在高压锅内高压蒸汽灭菌。
然后，将50μl上述的溶菌试剂溶液加入各个样品，在加热器中在96℃，加热所得的混合物10分钟进行溶菌处理。而比较例1使用商品名为AMPLICOR Specimen Pretreatment试剂盒(Nippon Roche K.K)的产品溶菌按照以上方法制备的样品。
向37.5μl实施例1-1和比较例1的这样获得的溶菌样品溶液中加入50μl商品名为AMPLICOR Amplification and Detection试剂盒(NipponRoche K.K)的产品和12.5μl的12mM醋酸镁的预先混合物。在COBASAMPLICOR中依据试剂盒的操作说明，采用PCR方法扩增和检测每一个获得的混合物。
已发现在实施例1-1和比较例1的上述扩增和检测的结果中，从测试溶液制备的稀释率达到107倍的样品被鉴定为结核病阳性，那些稀释率超过107倍的样品被鉴定为结核病阴性。因此，可以认为依据实施例1-1的溶菌方法可达到常规方法(比较例1)的灵敏度(溶菌效率)。而且，依据实施例1-1的溶菌方法仅需常规方法(比较例1)一半的处理时间。
(实施例1-2，比较例2)
结核杆菌的临床分离物在商品名为MycoBroth(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.，Ltd)的产品中在37℃培养，直到获得相应于McFarland标准浊度的#1的浊度。然后，使用已被商品名为SUPTAZYME(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd)的产品均质化的非结核病痰液稀释培养物以便得到10倍系列稀释液(100倍到1010倍)。生成的稀释液被用做样品。另一方面，商品名为TritonX-100(Nacalai Tesque，Inc.)的产品溶解在TE缓冲液(10mM EDTA和25mM Tris-HCl，pH8.0)中，使其浓度达到3wt％以制备溶菌试剂溶液。溶菌试剂溶液在高压锅内高压蒸汽灭菌。
然后，将50μl上述的溶菌试剂溶液加入各个样品(100μl)中，在加热器中在96℃，加热生成的混合液10分钟进行溶菌处理。而比较例2使用商品名为AMPLICOR Specimen Pretreatment试剂盒(Nippon Roche K.K)的产品溶菌按照以上方法制备的样品。
向37.5μl实施例1-2和比较例2的这样获得的溶菌样品溶液中加入50μl的商品名为AMPLICOR Amplification and Detection试剂盒(Nippon Roche K.K)的产品和12.5μl的12mM醋酸镁的预先混合物。在COBAS AMPLICOR中依据试剂盒的操作说明，采用PCR方法扩增和检测每一个获得的混合液。
已发现在实施例1-2和比较例2的上述扩增和检测的结果中，稀释率达到104倍的样品被鉴定为结核病阳性，那些稀释率超过104倍的样品被鉴定为结核病阴性。因此，可以认为，即使在污染物的影响下，依据实施例1-2的溶菌方法也可达到与常规方法(比较例2)相当的灵敏度(溶菌效率)。而且，依据实施例1-2的溶菌方法仅用常规方法(比较例2)一半的处理时间。
(实施例1-3，比较例3)
收集病人的90个痰液样品，通过NALC-NaOH方法(“NewGuideline for Tubercle Bacillus Test 2000”，由日本结核病学会编辑)将其均质化并灭菌。然后，将100μl每种已处理的痰液样品离心，13000g，10分钟。去除上清后，收集沉淀。另一方面，将商品名为Triton X-100(Nacalai Tesque，Inc.)的产品溶解在TE缓冲液(10mMEDTA和25mM Tris-HCl，pH8.0)中，使其浓度达到3wt％以制备溶菌试剂溶液。溶菌试剂溶液在高压锅内高压蒸汽灭菌。特别地，将50μl已灭菌的溶菌试剂溶液加入到各自样品获得的沉淀中以悬浮沉淀。然后，在加热器中在96℃，加热悬液10分钟进行溶菌处理。另一方面，比较例3采用如上的同样方法制备的样品(沉淀)使用AMPLICOR Specimen Pretreatment试剂盒(Nippon Roche K.K)溶菌。
向12.5μl这样获得的实施例1-3和比较例2的溶菌样品中加入50μl的商品名为AMPLICOR Amplificaiton and Detection试剂盒(Nippon Roche K.K)的产品和37.5μl的12mM醋酸镁的预先混合物。在COBAS AMPLICOR中依据试剂盒的操作说明，采用PCR方法扩增和检测每一个获得的混合液。另外，对如上述的同样方法制备的样品(沉淀)采用常规方法进行培养测试。
结果，当采用常规方法(比较例3)处理时，在90个唾液样品中，41个样品被鉴定为结核病阳性，49个样品被鉴定为结核病阴性。另一方面，当采用本发明的第一种溶菌方法处理时(实施例1-3)，41个样品被鉴定为结核病阳性，49个样品被鉴定为结核病阴性。因此，当采用实施例1-3的方法处理所获得的结果与采用常规方法(比较例3)处理所获得的结果非常一致。而且，依据培养测试，42个样品被鉴定为结核病阳性而48个样品被鉴定为结核病阴性，这些结果与采用实施例1-3和比较例3方法处理所获得的结果大约100％(97.8％)一致。因此，可以认为本发明的溶菌方法能够产生相当于常规方法的溶菌效果并可在实际临床测试中作为一个有用的方法。另外，在实施例1-3的方法中，溶菌处理需要的时间比比较例3方法中的时间少30分钟。
(实施例2-1，实施例1-4)
将商品名为脂肪酶G“AMANO”50(Amano Pharmaceutical Co.，Ltd)的产品和商品名为脂肪酶AY“AMANO”30G(Amano PharmaceuticalCo.，Ltd)的产品溶解于10mM HEPES缓冲液(pH7.0)中制备脂肪酶试剂溶液。此外，在TE缓冲液(10mM Tris和1mM EDTA，pH8.0)中加入商品名为Triton X-100(Nacalai Tesque，Inc.)的产品制备溶菌试剂溶液并在高压锅内高压蒸汽灭菌混合液(这样获得的溶菌试剂溶液以下称为“TE-Triton试剂溶液”)。通过在生长抗酸细菌(产品商品名为MycoBroth，由Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd生产)的液体培养基中培养BCG制备物用于制备样品的BCG培养物，直到含有BCG的溶液达到相应于McFarland标准浊度的#1的浊度。然后，按所需稀释该溶液。
此后，生成的含有BCG的溶液使用磷酸盐缓冲液(pH6.8)梯度稀释(10-4，10-3.5，10-3，10-2.5，10-2)，这样制备了测试溶液。随后，将100μl上述浓度的测试溶液分别倒入螺旋盖试管，然后离心(10000g，15分钟)制备沉淀。从各自测试溶液获得的沉淀被用做溶菌反应的样品。制备上述的脂肪酶溶液以使脂肪酶浓度分别为100，500，1000，2000和3000(单位/ml)。将50μl每种上述浓度的脂肪酶溶液加入样品。生成的混合液在涡旋混合器上混合，然后稍稍离心，37℃孵育30分钟。然后，将50μl TE-Triton试剂溶液(Triton浓度：2％)加入混合液，在96℃加热生成的混合液20分钟来进行溶菌处理。另一方面，除未进行脂肪酶处理之外，实施例1-4进行同样的步骤。
在通过上述步骤获得的100μl的每种溶菌液中，2μl被用作模板进行PCR以确定细胞是否被溶解。PCR按如下步骤完成：94℃，1分钟变性，30个循环，每个循环由94℃30秒，60℃1分钟，及72℃1分钟组成。引物序列和反应液成分如下：
(PCR反应成分)
10×Ex-Taq Buffer               2.5μl
2.5mM dNTP Mixture              2.0μl
100μM引物No.1                  0.125μl(序列号1)
100μM引物No.2                  0.125μl(序列号2)
Ex-Taq(5μ/μL)                 0.125μl
D.W.                            18.125μl
每种溶菌样品                    2.0μl
总体积                          25.0μl
8μl每种扩增反应产物使用3％琼脂糖凝胶进行电泳。结果在图1显示。图1中泳道1到7的样品如下。
(图1说明)
(1)样品仅在TE-Triton试剂溶液中热处理。
(2)样品使用脂肪酶G“AMANO”50处理，然后，在TE-Triton试剂溶液中热处理。脂肪酶浓度：100单位/ml。
(3)样品使用脂肪酶G“AMANO”50处理，然后，在TE-Triton试剂溶液中热处理。脂肪酶浓度：500单位/ml。
(4)样品使用脂肪酶G“AMANO”50处理，然后，在TE-Triton试剂溶液中热处理。脂肪酶浓度：1000单位/ml。
(5)样品使用脂肪酶AY“AMANO”30G处理，然后，在TE-Triton试剂溶液中热处理。脂肪酶浓度：100单位/ml。
(6)样品使用脂肪酶AY“AMANO”30G处理，然后，在TE-Triton试剂溶液中热处理。脂肪酶浓度：500单位/ml。
(7)样品使用脂肪酶AY“AMANO”30G处理，然后，在TE-Triton试剂溶液中热处理。脂肪酶浓度：1000单位/ml。
*图1的标记“M”指示一个100bp梯形分子量标记。
*在(1)到(7)的每个区域中，从左边的泳道开始，样品的稀释率是10-4，10-3.5，10-3，10-2.5和10-2。
从图1可见，即使在TE-Triton试剂溶液中只进行加热处理时，也可以获得充分的溶菌作用((1)，实施例1-4)，当用脂肪酶进行预处理后((2)到(7)，实施例2-1)，仍然可获得改善的溶菌作用。
(实施例2-2，实施例2-3)
使用磷酸盐缓冲液(pH6.8)梯度稀释(10-4，10-3.5，10-3，10-2.5)按上述方式获得的含BCG的溶液。生成的稀释液被用作测试溶液。随后，将100μl上述浓度的测试溶液分别加入螺旋盖试管，然后，离心(10000g，15分钟)生成沉淀。从各自的测试溶液获得的沉淀被用作溶菌反应的样品。另一方面，脂肪酶AY“AMANO”30G加入上述TE-Triton溶液以使其浓度达到500单位/ml制备溶菌试剂溶液。将100μl溶菌试剂溶液加入样品。生成的混合液在涡旋混合器上混合，然后稍稍离心，45℃孵育。按照如下两个不同时间进行孵育：10分钟和30分钟。随后，在96℃加热混合液10分钟进行溶菌处理(实施例2-2)。此外，除了同时进行脂肪酶处理和加热处理之外，实施例2-3进行同样的步骤(45℃，10分钟)。
在通过上述步骤获得的100μl每种溶菌液中，2μl被用作模板进行PCR以确定细胞是否被溶解。进行PCR的条件与实施例2-1的相同。8μl每种PCR扩增反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳以确定细胞是否被溶解。图2显示结果。图2中泳道(1)到(5)的样品如下。
(图2说明)
(1)在含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton试剂(实施例2-3)的混合试剂中的样品同时进行脂肪酶处理和加热处理。
(2)用含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton试剂的混合试剂处理样品。
45℃，10分钟→96℃，10分钟
(3)用含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton试剂的混合试剂处理样品。
45℃，30分钟→96℃，10分钟
(4)用脂肪酶AY“AMANO”30G在37℃处理样品10分钟，然后，加入TE-Triton试剂，在96℃加热处理10分钟。
(5)用脂肪酶AY“AMANO”30G在37℃处理样品10分钟，然后，加入TE-Triton试剂，在96℃加热处理10分钟。
*图2的标记“M”指示一个100bp梯形分子量标记。
*在(1)到(5)的每个区域中，从左边的泳道开始，样品的稀释率是10-4，10-3.5，10-3和10-2.5。
从图2可见，即使同时进行脂解处理和加热处理也可以获得充分的溶菌效果(实施例2-3)。另一方面，当脂解处理和加热处理分别进行时(实施例2-2)，仍然可获得改善的溶菌效果。进行孵育的时间不影响溶菌效果，在同样的缓冲液中溶解非离子表面活性剂和脂肪酶不会出现问题。
(实施例2-4)
将Triton X-100(Nacalai Tesque，Inc.)加入TE缓冲液(10mM Tris和1mMEDTA，pH8.0)和Tris缓冲液(10mM Tris，pH8.0)中以使其浓度达到1％。生成的混合液在高压锅内灭菌，这样制备了含有EDTA的试剂和不含EDTA的试剂。以下，这些试剂分别被称为TE-Triton试剂(含EDTA)和Tris-Triton试剂(不含EDTA)。通过在生长抗酸细菌(产品商品名为MycoBroth，由Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.，Ltd生产)的液体培养基中培养BCG制备物用于制备样品的BCG培养物，直到含有BCG的溶液具有相应于McFarland浊度标准的#1的浊度，然后按所需稀释溶液。
其后，用磷酸盐缓冲液(pH6.8)梯度稀释(10-4.5，10-4，10-3.5，10-3，10-2.5)生成的含BCG的溶液，这样制备测试溶液。随后，将100μl上述浓度的测试溶液分别加入螺旋盖试管，然后离心(10000g，15分钟)生成沉淀。从各自的测试溶液获得的沉淀被用作溶菌反应的样品。将脂肪酶AY“AMANO”30G加入上述的TE-Triton溶液和Tris-Triton溶液以使其浓度达到500单位/ml。然后，将100μl每种溶液加入样品。生成的混合液在涡旋混合器上混合，然后稍稍离心，45℃孵育。按照如下两个不同时间进行孵育：10分钟和30分钟。随后，在96℃加热混合液10分钟进行加热处理。
在通过上述步骤获得的100μl的每种溶菌液中，取2μl用作模板以进行PCR以确定细胞是否被溶解。进行PCR的条件与实施例2-1的相同。将8μl每种PCR扩增反应产物进行3％琼脂糖凝胶电泳以确定细胞是否被溶解。图3显示结果。图3中泳道(1)到(6)的样品如下。
(图3说明)
(1)到(3)：用含脂肪酶AY“AMANO”30G和TE-Triton试剂(存在EDTA)的混合试剂处理样品。
45℃，10分钟→96℃，10分钟
(4)到(6)：用含脂肪酶AY“AMANO”30G和Tris-triton试剂(不存在EDTA)的混合试剂处理样品。
45℃，10分钟→96℃，10分钟
*图3的标记“M”指示一个100bp梯形分子量标记。
*在(1)到(6)的每个区域中，从左边的泳道开始，样品的稀释率是10-4.5，10-4，10-3.5，10-3和10-2.5。
从图3可见，即使未使用EDTA((4)到(6))，也可以获得充分的溶菌效果。但是，使用EDTA((1)到(3))，仍然可获得改善的溶菌效果。
工业应用
如上所述，本发明提供了一种不使用任何特殊设备或特别试剂的可以容易地在短时间内安全地对抗酸细菌溶菌的方法。因此，在抗酸细菌测试中，通过利用基因扩增和检测应用本发明的方法例如预处理一个要分析的样品，可以容易地改善测试效率。
序列表
<110>爱科来株式会社
<120>抗酸细菌的溶菌方法和用其进行基因扩增或检测的方法
<130>H1724-01
<150>JP 2002-146823
<151>2002-05-21
<150>JP 2002-183461
<151>2002-06-24
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer No.1
<400>1
tcgtccagcg  ccgctt                                            16
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Primer No.2
<400>2
caaaggccac gtaggcgaac                                         20

Claims (28)

1.一种溶解抗酸细菌以提取抗酸细菌的基因的方法，包含：
在含有非离子表面活性剂的液体中在低于所述液体的沸点的温度下加热所述抗酸细菌；
所述非离子表面活性剂是聚氧乙烯二醇对叔辛基苯基醚。
2.依据权利要求1的方法，其中所述加热温度不低于70℃但低于100℃。
3.依据权利要求1的方法，其中加热进行1到30分钟。
4.依据权利要求1的方法，其中在96℃加热10分钟。
5.依据权利要求1的方法，其中所述液体的pH值范围是7.0到12.0。
6.依据权利要求1的方法，其中所述液体中的非离子表面活性剂的浓度是0.01到10wt％。
7.依据权利要求1的方法，其中所述液体还含有金属螯合剂。
8.依据权利要求7的方法，其中所述液体中金属螯合剂的浓度是0.1到100mM。
9.依据权利要求7的方法，其中所述金属螯合剂至少是从乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、环己二胺四乙酸、邻菲咯啉和水杨酸组成的组中选出的一种。
10.依据权利要求1的方法，其中被裂解的所述抗酸细菌至少是从鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellularae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、草分枝杆菌(M.phlei)、海分枝杆菌(M.marinum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、土分枝杆菌(M.terrae)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、次要分枝杆菌(M.triviale)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、非洲结核菌(M.africanum)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistable)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)组成的组中选出的一种。
11.依据权利要求1的方法，其中所述抗酸菌来自含抗酸细菌的生物样品，所述含抗酸细菌的生物样品至少是从痰液、脊髓液、粪便、唾液、血液、组织和尿液组成的组中选出的一种。
12.依据权利要求1的方法，其中进一步包含：
用脂解酶处理所述抗酸细菌产生脂解作用。
13.依据权利要求12的方法，其中加热也用作使脂肪酶失活。
14.依据权利要求12的方法，其中在缓冲液中进行脂解作用和加热。
15.依据权利要求12的方法，其中脂解作用和加热在为密闭系统的同一容器中进行。
16.依据权利要求12的方法，其中在脂解作用后进行加热。
17.依据权利要求16的方法，其中在pH4到pH8，温度37℃到60℃，5到30分钟进行脂解作用，和在温度不低于37℃但低于100℃加热5到30分钟。
18.依据权利要求12的方法，其中脂解作用和加热同时进行。
19.依据权利要求18的方法，其中在pH4到pH8，温度37℃到60℃进行脂解作用和加热5到30分钟。
20.依据权利要求14的方法，其中所述缓冲液中脂肪酶的浓度是10到10000单位/ml。
21.依据权利要求14的方法，其中所述缓冲液中的非离子表面活性剂的浓度是0.01到10wt％。
22.依据权利要求12的方法，其中在存在离子表面活性剂和金属螯合剂时，进行加热。
23.依据权利要求22的方法，其中所述金属螯合剂至少是从乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)和1，2-环己二胺四乙酸(CyDTA)组成的组中选出的一种。
24.依据权利要求22的方法，其中所述缓冲液中金属螯合剂的浓度是0.1到2.0mM。
25.依据权利要求12的方法，其中被溶解的所述抗酸细菌至少是从鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellularae)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、牛型分枝杆菌(M.bovis)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、草分枝杆菌(M.phlei)、海分枝杆菌(M.marinum)、猿分枝杆菌(M.simiae)、斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、土分枝杆菌(M.terrae)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、次要分枝杆菌(M.triviale)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、非洲结核菌(M.africanum)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistable)和耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)组成的组中选出的一种。
26.依据权利要求12的方法，其中所述抗酸菌来自含抗酸细菌的生物样品，所述含抗酸细菌的生物样品至少是从痰液、脊髓液、粪便、唾液、血液、组织、药签、洗胃术获得的液体和尿液组成的组中选出的一种。
27.一种非诊断目的的特异性扩增抗酸细菌基因的方法，包含：
依据权利要求1到11任一项的方法溶解抗酸细菌以提取所述抗酸细菌的基因；和
使用提取的基因作为样品特异性扩增所述基因。
28.一种非诊断目的的特异性扩增抗酸细菌基因的方法，包括：
依据权利要求12到26任一项的方法溶解抗酸细菌以提取所述抗酸细菌的基因；和
使用提取的基因作为样品特异性扩增所述基因。
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