CN1656123A - 用于评估心血管疾病危险性的蛋白和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)的片段的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N－二甲基精氨酸(ADMA)和/或血浆水平比ADMA低的L，N－单甲基精氨酸(LNMMA)的亲和性，且不足以将ADMA或LNMMA水解为瓜氨酸、释放瓜氨酸或二者并存。

Description

用于评估心血管疾病危险性的蛋白和方法
                     政府权利声明
开发本发明期间实施的部分工作使用了美国政府经费。美国政府具有此处所描述的本发明的一些权利。
             相关专利申请的交叉引用
本申请要求提交于2003年5月31日的美国临时申请号.60/384,077的优先权。
                   发明背景
发明领域
本发明涉及包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase(DDAH))的片段的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N-二甲基精氨酸(ADMA)的亲和性且不足以将ADMA水解为瓜氨酸和/或释放游离瓜氨酸。所述测定法还可用于检测血浆水平低于ADMA的L，N-单甲基精氨酸(LNMMA)。
发明背景
动脉粥样硬化是本国内主要的致病原因而每年由于冠状动脉疾病和脑血管疾病发作导致500,000人死亡。因为一氧化氮(NO)具有对促进动脉粥样硬化的多个关键过程(单核细胞粘附、血小板聚集、血管平滑肌增殖)的抑制作用，血管NO生成的慢性增强证实可用于抑制或防止动脉粥样化形成。
高胆固醇血症，高血压，糖尿病，烟草，脂蛋白(a)(“Lp(a)”)和高半胱氨酸水平的增高能加速动脉粥样硬化。所有这些疾病在人类中的特征均为在出现任何动脉粥样硬化临床表现之前的内皮舒张功能障碍(Cooke和Dzau，1997)。在所有这些疾病中，异常状况大部分归因于一氧化氮合成(NOS)途径的扰动。在大多数这些疾病中，心血管异常可通过给予L-精氨酸(NO前体，其经NOS代谢而生成瓜氨酸和NO)而得以逆转或改善(Cooke和Dzau，1997)。
ADMA(不对称二甲基精氨酸)和LNMMA是L-精氨酸对NOS的内源竞争性拮抗物。LNMMA和ADMA作为NOS抑制剂效果相当，但LNMMA的血浆水平低于ADMA。因此，大多数研究都针对ADMA的检测。ADMA水平的提高还可见于高胆固醇血症和动脉粥样硬化患者中(Bode-Bger等，1996；Yu和Xiong，1994)；且在尿毒症大鼠和肾衰竭患者中血浆ADMA水平比正常值提高了5～10倍(Valiance等，1992a，b)。
事实上本领域中还已知与加速的动脉粥样硬化相关的所有危险因子能够减少与ADMA的增高相关的内皮源性NO的合成和/或活性。ADMA或许是内皮血管扩张功能障碍的重要决定子，且有可能是检测动脉粥样硬化的重要的新的危险因子。近年来，已有报道显示ADMA是心血管性死亡的独立预报因子。
虽然其它方法也是可用的，但目前用于检测如血液，血浆和尿的生理液中ADMA的方法包括提取、化学衍生、采用反相HPLC的分离，IC-质谱分析法和荧光(Chen等，1997)。但是，生物样品中ADMA或LNMMA的测定很烦琐的，这是由于存在两种接近的相关化合物，所述化合物在检测中表现出相似的行为和/或交叉反应性，所述化合物称为精氨酸和对称二甲基精氨酸(SDMA)。ADMA与精氨酸的不同仅在于一个胍基氮上的两个甲基(参见图1)。 此外，在正常人血清中，精氨酸的浓度大约是ADMA浓度的100倍。SDMA比精氨酸更近似于ADMA，不同之处仅在于一个甲基的位置。在正常人血清中，SDMA的浓度与ADMA的浓度相当，其大约为1μM。
因此，需要发展一种能够不受与ADMA或LNMMA竞争的交叉反应物质干扰的准确检测生物样品中ADMA和LNMMA的测定法。循环NO合酶抑制剂的准确测定将成为在动脉粥样硬化和其它心血管疾病的早期检测和治疗中的有价值的工具。
                     发明概述
本发明涉及包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)的片段的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N-二甲基精氨酸(ADMA)的亲和性且不足以将ADMA水解为瓜氨酸和/或释放游离瓜氨酸。在某些实施方案中，本发明关于其对LNMMA的亲和性和代谢具有相同的特性。本发明还涉及在生物样品中检测ADMA和LNMMA的方法及用于该用途的试剂盒。
                    附图简介
图1显示了精氨酸，不对称二甲基精氨酸(ADMA)和对称二甲基精氨酸(SDMA)的分子结构。
图2显示了人类志愿者中血浆ADMA水平和血管功能(尤其是内皮依赖性血管舒张)间的关系。显示出血浆ADMA水平和鳃动脉的血流介导的血管扩张间的反相关。迟发反应依赖于内皮源性一氧化氮合酶的激活。
图3显示了人血浆中ADMA和LNMMA的HPLC检测的原始图。已将高精氨酸加入血浆中以便标准化。首先用精氨酸酶处理样品而除去精氨酸。正常情况下精氨酸峰非常接近于高精氨酸峰，精氨酸峰通常拖尾至LNMMA(在该图中标记为MMA)，ADMA和SDMA的峰。注意到在该患者中，ADMA水平提高，因为正常情况下，ADMA和SDMA峰值相似。在该图中SDMA很好地与ADMA分开，但我们的大多数HPLC记录由于SDMA峰拖尾至ADMA峰而并没有这么明显。
                优选实施方案详述
本发明提供了包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)的片段的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N-二甲基精氨酸(ADMA)的亲和性且不足以将ADMA水解为瓜氨酸和/或释放游离瓜氨酸。
DDAH酶是一种含锌(II)的酶，该酶能结合并将ADMA和/或N-单甲基精氨酸(NMMA)水解为L-瓜氨酸，由此灭活ADMA和NMMA对一氧化氮合酶的抑制特性。此外，野生型DDAH酶与很多酶一样还包含Cys-His-Glu催化三联体。近年来，DDAH的特征描述揭示了其是具有功能上独立的催化位点的二聚体(Murray-Rust J，等.Nat StructBiol.8(8)：679-83(2001))。
如此处所使用的，术语蛋白是指成熟，全长蛋白、未加工的蛋白(例如，包含信号序列)或其任何片段或部分。
如此处所使用的，蛋白的片段是指来自全长蛋白的任何部分或片段的至少10个连续氨基酸。
在一个实施方案中，所述片段为至少20个连续氨基酸。在其它实施方案中，所述片段为至少25、30、40或50个连续的氨基酸。如本说明书所述，所述片段可以是完整全长，成熟蛋白减去一个氨基酸。所述片段还可以是另一蛋白的部分。其可与例如氨基酸、核酸、多核苷酸、糖类、脂质、糖蛋白、蛋白聚糖、聚合物或化学物的另一蛋白或分子融合或结合。所述片段可以是融合蛋白的部分或可被移入另一蛋白中。此外，可在所述片段的任一末端添加任何数量的氨基酸。
如此处所使用的，术语突变蛋白是指不具有野生型蛋白的全部特性或功能高于或低于野生型蛋白的蛋白。例如，与野生型相比，所述突变体具有特定功能上的缺陷，或与野生型相比，所述突变体具有实现相同功能的增加的或提高的功能或能力。野生型DDAH蛋白或片段中任何数量氨基酸的突变事件(例如，缺失、添加、改变或取代等)的产物并不一定被定性为DDAH的突变(如此处所使用的)，除非该突变事件与DDAH或片段特性或功能的改变相关，如本文所述。所述突变蛋白或片段可以是多于一个特性或功能的突变体。突变体还可以是指，与野生型相比，具有额外或不同特性的蛋白。此外，所述突变体无须是全长蛋白，而还可以是，例如，不具有相应野生型片段的所有特性或表现出与相应野生型片段相同功能的片段。例如，与能水解ADMA的DDAH的相应野生型片段(催化部分或位点)相比，本发明的突变DDAH片段不足以将ADMA水解为瓜氨酸。
如此处所使用的，“突变DDAH”可指全长突变DDAH蛋白或突变DDAH蛋白的片段。
所述突变DDAH酶在负责结合和代谢ADMA或LNMMA的结构域上的氨基酸序列具有与野生型酶的序列至少80％的同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少85％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少90％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少95％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少96％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少97％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少98％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶至少99％的序列同一性。在某些实施方案中，所述突变DDAH酶具有与野生型酶100％的序列同一性。
序列同一性可用任何方法测定。两个氨基酸序列间的差异可存在于对照氨基酸序列的C或N末端位置或那些末端位置间的任何位置，或者独立分散于对照序列中的氨基酸间或者分散在对照序列中的一个或多个连续基团中。
事实上，任何特定氨基酸分子是否具有与参照氨基酸序列的至少给定的百分比同一性涉及采用标准算法通过手算或机器作出的两个分子间的比较。算法是本领域众所周知的且可按常规采用公众可获得的计算机程序例如BLAST算法族进行确定。(Altschul等，NucleicAcidsRes.25：3389-3402，1997)。
多肽序列的相似性可采用BLASTP算法进行检测。BLASTP程序可获自NCBI匿名FTP服务器(ftp：//ncbi.nlm.nih.gov)的/blast/executables下，以及获自国家医学图书馆国家生物技术信息中心(NCBI)，38A楼，8N805室，Bethesda，MD20894，美国。BLASTP算法可用于确定根据本发明的多肽序列同一性。BLAST算法族(包括BLASTP)描述于NCBI的国际互联网站中，其URL为http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html以及计算机算法FASTA的公开中，其可获自国际互联网的ftp站点ftp：//ftp.virginia.edu/pub/fasta/，以及可通过David Hudson(Assistance Provost for Research，University of Virginia，POBox 9025，Charlottesville，VA.)而从弗吉尼亚大学获得，Version2.Ou4[1996年2月](Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448，1988；and Pearson，Methods in Eslaymol.183：63-98，1990.)。
除了与本发明的多核苷酸或多肽序列具有特定百分比的同一性外，变体多核苷酸和多肽优选具有与本发明的多核苷酸或多肽相同的附加结构和/或功能特性。与本发明的多肽具有特定同一性的多肽在其一级结构上具有高度相似性且基本具有相似的功能特性。除了其一级结构与本发明的多核苷酸具有高度相似性以外，与本发明的多核苷酸具有特定同一性的或能与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸优选具有至少一种下述特性：(i)它们由基因编码，所述基因包含当翻译时能提供基本上与本发明的多核苷酸相同的功能特性的多肽的开放读码框或部分开放读码框；或(ii)它们具有相同的结构域。
如此处所使用的，DDAH水解ADMA能力的不足可以是部分的或全部的。在一个实施方案中，所述突变DDAH完全不能水解ADMA，因此其不能将ADMA水解为任何能检测到的程度。所述不足可通过在适宜酶致水解的条件下，无论在体内、体外或原位将样品暴露于DDAH，或其片段后检测样品中瓜氨酸的水平或浓度(采用标准比色测定)进行测定。可选地，可将已知量的ADMA加入含有突变DDAH的溶液中，然后通过HPLC或毛细管电泳检测ADMA随时间的降低。
一般来说，酶催化反应的能力可通过米氏常数(Km)以本领域众所周知的方法来判断。Km小意味着该酶能在低底物浓度下达到半-最大速度(催化反应的速度)，这提示该酶是有效或快速的酶。与具有较低Km的酶相比，具有较高的Km的酶，在催化反应中具有较高的不足性(即，较低的有效性)。例如，如果酶A(Km为1×10-2M)的Km值高于酶B(Km为1×10-5M)，则在相同条件下(例如，时间，pH等)，催化相同反应时酶A的不足性要比酶B高1000倍。
DDAH作为ADMA敏感子仅具有如下两个局限，对SDMA的结合亲和性低，即，Km高(＞1.00μM)和释放出分析物水解产物。然而，这两个局限可在单工程化步骤中通过两种机制中的至少一种而得以减少。
通过诱变处理DDAH，在噬菌体表面显示突变体文库，和在存在可溶性精氨酸和SDMA的条件下对固定化ADMA淘选，可获得具有对ADMA高特异亲和性的DDAH突变体。由于直接增加对ADMA亲和性的突变或抑制了反应产物(瓜氨酸)释放的突变，所述变体应具有更高的亲和性。在消耗过渡态亲和性的情况下通常必须实施增加底物亲和性的突变，所述过渡态亲和性的消耗降低了所需的酶的催化速度。
选择性地，突变可阻断产物解离。因为反应中间产物是经由底物的胍基碳在所述酶的Cys249上的共价硫醚加成物，在产物释放前水解该加成物需要水(Murray-Rust等，2001，Nature Structural Biology8：679-683)。因此突变可以或者阻断水至活性位点的通路或者空间阻断产物瓜氨酸从活性位点袋向外扩散。在任一方式中，所述分析物将被酶以可用于检测的方式保留，即使后者类型的突变并非抑制水解实质上必须的。
为利于选择具有对游离ADMA高亲和性而对精氨酸或SDMA低亲和性(或不存在)的突变DDAH蛋白，修饰标准淘选(强制进化)策略是有益的。例如，可将可溶性精氨酸和SDMA加到噬菌体悬液中来抑制具有对这些化合物高亲和性的突变DDAH与固定化ADMA的结合。
本发明的突变DDAH至少具有部分(若非全部)对ADMA的亲和性。与野生型DDAH相比，本发明的突变DDAH还可具有对ADMA增高的亲和性。在一个实施方案中，所述突变DDAH保留了与野生型DDAH相同的对ADMA的亲和性。在另一个实施方案中，与野生型DDAH相比，所述突变DDAH还可具有对ADMA增高的亲和性。
一般来说，酶(DDAH)对其底物(ADMA)的亲和性可通过检测所述酶关于所述底物的米氏常数(Michaelis constant(Km))进行测定。检测Km的方法是本领域众所周知的。例如，KM可通过利-伯二氏方程式(Lineweaver-Burke plots)或Hofstee-Eadie方程式进行计算，所述方程式描述于任何普通生物化学教材中，如Lehninger或Abeles，Frey，和Jencks。KD(平衡解离常数)，可通过多种方法检测，所述方法例如为，竞争抗体捕捉ELISA(Harlow and Lane，Antibodies A Laboratory Manual 1988 Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor)。在该方法中，例如，将半抗原化的ADMA固定于固体支持物上然后用标记的或加标记物的突变DDAH的悬液平衡化。冲洗掉未结合的物质，然后定量测定结合的DDAH。当用悬液中增加竞争性ADMA的量重复该方法时，DDAH结合将减少与ADMA浓度和KD成比例量。当DDAH浓度小于或等于10％KD时，背景-校正信号降低50％时的游离ADMA的浓度等于KD。
与KD值相似，则酶对其底物的亲和性随着KM值降低而增加。KM值越高，酶和其底物彼此间的亲和性就越低。例如，如果酶A(KM为1×10-4M)具有高于酶B(KM为1×10-7M)的KM值，则对于相同的底物而言酶B的亲和性比酶A高1000倍。在某些实施方案中，所述突变DDAH的平衡解离常数(KD)不高于10-7M。
KD是解离速率常数和结合速率常数(分别是kD/kA)的比率。所述kA不能高于104-105M-1秒-1，因此在该假设下所述kD最大应为10-2-10-3秒-1。这比野生型酶的可能kCAT低104-106倍。为达到kCAT的这一降低，所述突变可以或者降低这些量的水解速率或者降低这些量的产物离解速率或者二者联合。例如，一个突变可以增加底物亲和性，即降低KM，而这将降低水解速率与突变对底物kA的作用成反比的系数。即，如果kA未被作用，则水解速率将降低与KM相同的量，但如果kA增加，水解速率将降低按比例减少的量。其它突变可抑制产物离解，而任何能够降低KM的突变能增加这一作用。
在一个实施方案中，突变DDAH，或其片段，和ADMA的KD至少约为1×10-7M。在另一个实施方案中，所述突变DDAH对SDMA的亲和性低于野生型DDAH对SDMA的亲和性。
本发明的突变DDAH可源自在动物细胞中的野生型DDAH。优选地，所述动物细胞是哺乳动物的。更优选地，所述动物细胞是人类的。
如此处所使用的，“衍生的”是指用于从野生型DDAH氨基酸序列获得或分离和纯化所述突变DDAH氨基酸序列的任何技术。“衍生”的实例包括(但不限于)经由编码所述野生型DDAH的DNA的多聚酶链式反应(PCR)的定向诱变和通过在DNA复制发生时使用已知化学诱变剂或放射的随机诱变。“衍生”还可使用如相关蛋白的“强制进化”的标准噬菌体展示技术(噬菌体展示)来改变其结合特性。此外，可将Cadwell和Joyce (PCR Primer A Laboratoiy Manual，Dieffenbachand Dveksler，Eds.，1995，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，NY，pp.583-590)所述的易错聚合酶链式反应用于诱变。Phage Display of Peptides and Proteins A Laboratory Manual，Kay，Winter，and McCafferty，Eds.，1996，Academic Press，SanDiego中描述了噬菌体展示技术。衍生不是必须是试验操作的结果但还可以是天然存在的具有本发明所述特性的DDAH的突变体的发现和随后的分离和纯化。
分离的和纯化的是指将蛋白或其它分子从其天然环境中提出。只要该蛋白或其它分子经过操作(或其环境作用)而不再存在于其天然环境中即可，纯化无须是100％。
在一个实施方案中，本发明的突变体蛋白包含可检测的标记物。在另一个实施方案中，所述突变体蛋白和标记物经由一个或多个连接分子或化合物而彼此结合。
可检测的标记物的实例(其是本领域所熟知的)包括但不限于，酶、荧光剂、化学发光剂、放射性同位素和能够不透明或透明的微粒，或能与其它标记物结合的微粒。
本发明还提供了测定生物样品中ADMA水平的方法，所述方法包括将所述生物样品与突变DDAH蛋白或其片段接触，然后测定与所述突变蛋白结合的ADMA的量。在一个实施方案中，所述生物样品用可检测的标记物标记。在另一个实施方案中，所述突变蛋白用可检测的标记物标记。
如此处所使用的，生物样品可指组织、器官或体液的任何样品(完整或部分)。所述方法可在体内、体外或原位环境实施。样本的实例包括，但不限于，全血或其任何成分，尿，唾液，胃液，脑脊液、胆汁、器官或其任何部分、血管，或其部分，肌肉组织、神经组织，和恶性和良性肿瘤组织。此外，样本还包括从生物样品中分离的个体细胞和细胞培养物。细胞和细胞培养物包括原代培养物，以及原代培养物的任何随后的子代。
此外，根据样品特性和检测法特性，在本发明的方法之前可对所述生物样品进行处理、保存、浓缩、稀释、操作(例如，调整pH，加入缓冲液)或改变(例如，沉淀出颗粒)。例如，可将抗本底干扰因子加入全血，或选择性地，可除去红细胞，血液可被枸橼酸化或半抗原化等。然后将未处理或处理的样品与其它适于检测的试剂联合或进行适宜的孵育，然后实施检测。
本发明说明书中可使用任何能够准确检测与突变DDAH蛋白结合的ADMA的相对或绝对水平的测定法。这些测定法可用用有效分析物或所述结合蛋白分别取代ADMA或DDAH的测定法作为模型。这些测定法包括(但不限于)光谱光度测量法、荧光检测法、视觉检测法和放射性检测法，可使用任何种类繁多的试剂，所述试剂可是商业获得或用本领域中所描述的方法学制备。
可采用多种试剂实施用于免疫测定法的多种步骤。例如，ADMA模拟物(与ADMA竞争结合突变DDAH蛋白的化合物)和生物样品中任何ADMA间的竞争，随后检测与ADMA模拟物结合的突变DDAH蛋白的量。这可通过将所述ADMA模拟物结合在例如，如管壁或微量滴定板或能从培养基分离的微粒的固体表面上得以实施。
还可使用通道化(Channeling)由此将两个结合蛋白置于一起，一个获得不同的信号。例如，荧光能量转移实验过程使用多表位试剂，所述多表位试剂具有至少两个与ADMA竞争的表位，和两个不同的突变DDAH蛋白，一个带有荧光剂(作为供体)，而一个带有荧光剂(作为受体)。当两个不同突变体蛋白与多表位试剂结合时，将发生能量转移，因此通过采用激发光来激发供体，可发射出可检测波长的光。
对由所述突变体蛋白和结合的ADMA形成的复合物的抗体是检测样本中ADMA的另一途径。然后可采用通常为ELISA或反向ELISA技术的标准技术检测所述抗体。一类或另一种酶联免疫吸附试验(ELISA)在超过25年的时间里已经广泛的应用于体液中分析物的检测和测量(Harlow和Lane，1988)。其根本优势在于单克隆抗体(mAb)对标记分析物的优良亲和性和特异性，以及酶对信号扩增的优良催化能力。近年来，操作步骤少于ELISA同时具有改进的动力学和敏感性的均质液相测定法的发展扩展了免疫测定法领域(Kopetzki等，1994；Coty等，1994；Henderson等，1986)。
在常规ELISA中，将半抗原化突变DDAH固定在微量滴定板孔的表面上(Harlow和Lane，1988)。例如，可通过与固定的半抗原的结合可从溶液中吸附出ADMA，冲洗后，通过结合第二抗体-酶结合物检测结合的ADMA，所述结合物与显色底物反应，产生与结合的ADMA成比例的信号。
荧光偏振免疫测定(Fluorescence Polarization Immunassay(FPIA))是用于小分子分析物的另一种均质液相测定法，其具有独特的优势，即通过竞争产生阳性信号。当由平面偏振光激发时，FPIA检测作为发射光的偏振的结合的突变DDAH和游离荧光标记的配体间的差异。处于激发态的小分子配体快速振动，发射出的管接近均质，而，在整个激发态期间较大的结合突变DDAH的配体很难滚动因此发射出高度偏振或各向异性的光。分析物可根据其与标记物竞争与突变DDAH结合的能力得以检测，因此发射光较低的偏振，其以特定角相对入射光的强度增加。敏感性是突变DDAH亲和性和结合的和游离的配体间差异的函数。具有纳摩尔亲和性和游离的和突变DDAH-结合的分析物间的大尺寸差异，可检测亚-皮摩尔浓度。ADMA可通过ADMA的游离伯氨基与荧光团如异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光团的活化衍生物的反应而与如荧光素的多种荧光团结合。游离ADMA可作为其浓度依赖性的与荧光素-ADMA竞争与突变DDAH结合并由此降低了偏振性发射的能力的函数而得以检测。
可使用本发明的突变DDAH的另外的免疫检测法形式包括，但不限于，放射免疫测定法(RIA；Lauritzen等，1994)，克隆酶供体免疫测定法(cloned enzyme donor immunoassay(CEDIA；Coty等，1994))，生物分子交叉分析(BIA；Fagerstam等，1992)，和荧光共振能量转移免疫测定法(FRET；Youn等，1995)。如ELISA一样，用于小、单价分子的大多免疫测定时竞争抑制测定法，其中样本分析物与标记的配体竞争结合突变DDAH。在RIA中，所述配体具有放射性。在CEDIA中，所述配体与β-半乳糖苷酶的α-片段结合，因此突变DDAH结合抑制酶的活性。因此，样本分析物对突变DDAH-配体相互作用的竞争性抑制导致显色酶活性的增加。在FRET免疫测定法中，所述配体用荧光团标记，所述荧光团能可检测地将其能量转移至结合于突变DDAH的荧光团，所述能量转移仅在两个荧光团非常接近时发生。BIA不是通过结合的竞争性抑制进行检测，而是使用称为表面等离子共振的现象直接监测样本分析物和固定化突变DDAH间的相互作用，由此当分析物结合所述突变DDAH时在结合抗体的表面的屈光指数发生可检测的改变。
如果适宜，所述检测法可使用荧光激活细胞分类器以及使用荧光颗粒。该测定法将提供如下事实，计数的荧光微粒的数量与ADMA存在量相关。例如，通过在ADMA结合的微粒和样品中ADMA在用突变DDAH进行荧光标记上实施竞争性测定法，用荧光性突变DDAH标记的微粒的程度将与样品中的ADMA的量成比例。然后可将对样品计数的荧光微粒的数量与对照值比较。
下表显示了可用于本发明主题的多种测定法。
免疫测定法类型 基本定量剂 实例
竞争性-分析物对基本定量剂的非线性比例 反向 与竞争剂的复合物中的标记的突变DDAH与突变DDAH的复合物中的标记的竞争剂 ELISA1FPIA2
正向 未结合的标记的竞争剂与结合的的标记的竞争剂的比率 FRET′2
未结合的标记的竞争剂 CEDIA4
非-竞争性-分析物对基本定量剂的线性比例 与分析物的复合物中的标记的突变DDAH未标记的突变DDAH-分析物复合物 APEIA5BIA6
1.竞争剂是固定化抗原且结合的标记物与分析物成反比。
2.荧光标记物的偏振与分析物成反比。
3.供体荧光与分析物成正比，可选择的受体荧光与分析物成反比。
4.竞争剂是酶-分析物结合物。仅游离竞争子为活性的且与分析物成反比。
5.分析物受保护的酶免疫测定法；仅分析物-结合的酶-抗体融合物是活性的。获自Panorama Research，Inc.，Mountain View，CA。
6.双分子干涉分析法。
本发明的方法还包括使用能结合所述突变DDAH的分子，如抗体。将DDAH-特异性分子结合在固体表面，如微量滴定板上，而检测生物样品中的ADMA的量包括检测与结合在表面的DDAH特异性分子结合的标记的突变DDAH的量。
本发明还提供了检测生物样品中ADMA的量的试剂盒，所述试剂盒包括突变DDAH和至少一种试剂。所述试剂盒种可包括任何适用于检测生物样品中ADMA量的试剂。
如此处所使用的，试剂还可包括适用于实施检测的器械(例如，注射器)，辅助材料(例如，微量滴定板)或装置。试剂的实例包括(但不限于)抗体、拮抗剂(竞争性和非-竞争性)、激动剂、缀合物、比色分子或溶液、酶、二级信使、放射性同位素、溶液、注射器、微量滴定板和冻干化合物。在其它实施方案中，所述试剂盒包括抗-(突变体蛋白)抗体，和可检测的标记物。
应用于本发明的方法和试剂盒的抗体可以是来自如下任何适宜来源的抗血清，例如牛、山羊、羊、犬、马、啮齿类等，其中可通过选择出能与突变DDAH或由突变DDAH和ADMA形成的复合物有力结合的抗体来纯化抗血清。可通过在α-氨基或羧基结合突变DDAH制备用于制备抗体的免疫原，尤其在后者的情况下要使用结合抗原的交联剂。可根据包括重组方法的已知方法制备单克隆抗体，代替抗血清。特别地，使用小鼠，可用DDAH结合物，分离的和永生化的脾细胞免疫小鼠，然后筛选针对突变DDAH的亲和性，以及可能的额外特性。可扩增和生长兴趣克隆或分离和操作编码抗-DDAH重和轻链的基因用于在适宜的宿主细胞或宿主中进行表达。事实上，如下所述，可突变所述基因以便进一步增强结合亲和性。
实施例
1.分离具有对ADMA高度、特异亲和性的DDAH突变体
可以采用克隆自内皮细胞(DDAH 2同工型)或神经细胞(DDAH 1同工型)的DDAH的噬菌体显示文库(bacteriophage displaylibrary)作为突变DDAH蛋白或片段的来源。使用包含编码人类DDAH的5′和3′序列的兼并引物通过逆转录和多聚酶链式反应(RT-PCR)从分离自这些培养细胞的RNA扩增人类DDAH酶。然后将该DDAH-编码序列连接至噬菌粒载体中以便在E.coli周质中表达融合至噬菌体次要衣壳蛋白(gIIIp)的氨基端的DDAH。然后通过Cadwell和Joyce(PCR Primer A Laboratory Manual，Dieffenbach and Dveksler，Eds.，1995，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.583-590)所描述的易错聚合酶链反应(Error-Prone PCR)实施DDAH序列的诱变。该方法能产生平均～1.5突变/克隆。将诱变处理的序列连接回噬菌体表达载体，然后收集至少1千万个克隆以便确保文库中存在全部可能的双击(two-hit)突变体。
在表达产物中DDAH和gIIIp之间，由所述载体编码三个额外元件：(1)用于通过抗-表位抗体的ELISA检测的12-残基附加表位(c-myc)，(2)用于通过亲合色谱法的纯化的六-组氨酸标记(histidine tag)，和(3)用于在非抑制型宿主无需亚克隆而产生游离DDAH片段的可抑制的终止密码子(琥珀型(amber))。通过定量感染含有辅助噬菌体的表达DDAH-gIIIp融合体的E.coli菌株TGI细胞(琥珀抑制型宿主)制备噬菌体文库，所述辅助噬菌体基本上是包含抗生素抗性基因的野生型噬菌体。由感染细胞产生的噬菌体颗粒在其表面包含DDAH突变体而在其内部包含编码DDAH-突变体的噬菌粒。一般来说，所使用的文库包括存在～4×1010独立DDAH突变体克隆的噬菌体。
按照已经确立的方法以固定化ADMA淘选噬菌体(McCafferty andJohnson，1996；McCafferty，1996)。在牛血清白蛋白(BSA)上经由辛二酸盐交联剂将ADMA经α-氨基结合至暴露的赖氨酸的ε-氨基，然后将该结合物固定在聚苯乙烯表面上。在淘选步骤中，将包含～1013噬菌体颗粒的悬液暴露于固定化ADMA结合物1-2小时以便实现结合平衡。该悬液应包含大约10微摩尔精氨酸和100纳摩尔SDMA以便抑制对具有对这些ADMA类似物高亲和性的DDAH片段的捕捉。选择这些浓度是基于辨别具有所需KD(例如，10-8M)的突变DDAH片段或蛋白的所需水平。用三乙胺冲洗并洗脱结合的噬菌体。从第一轮操作中，大约回收6.5×1010噬菌体，然后将其在E.coli菌株TGI再扩增至～1013然后再实施两轮淘选，即，结合，冲洗，洗脱和扩增。从最后一轮淘选中回收1.6×1010噬菌体。将该噬菌体种群的等分等份用于感染E.coli菌株HB2151。该菌株不会抑制DDAH和gIIIp间的琥珀型终止密码子，因此所述DDAH突变体能在无gIIIp结构域时以可溶形式在细菌周质中表达。
可在固定化ADMA-辛二酸盐-BSA结合物上通过ELISA筛选来自克隆的游离DDAH突变体。
为进一步鉴定和用于临床检测中，DDAH突变体可从克隆的大规模细菌培养物的上清中纯化。使用超滤将浓度增加大约40倍并用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)代替细菌生长培养液。然后采用位于由表达载体编码的每个突变体的羧基末端的六-组氨酸标记以固定化金属离子亲和色谱法对DDAH突变体进行亲和纯化(IMAC；Janknecht等，1991)。
然后可实施ELISA再次检测纯化的DDAH突变体并优化条件。当用1微克ADMA-辛二酸盐-BSA包被微量滴定孔时，1×10-9M突变DDAH将产生适宜抗-myc-标记小鼠抗体，辣根过氧化物酶结合的(HRP)兔抗小鼠抗体，和ABTS(HRP的显色底物)的信号(30′内1-2OD405，环境OD0.1-0.2)。在这些条件下，即，当所述DDAH浓度低于或等于所述KD的10％时，游离ADMA的浓度(此时本底-校正信号减少50％)等于KD。当用10-9M突变DDAH检测ADMA浓度范围(10-7M和10-8M)时，在检测的范围中某些位置证实了至少50％的抑制作用，这证实了KD的最初估计。当分析物浓度等于KD，即50％抑制，而所述ADMA浓度相应于健康血清10-100倍稀释度时，竞争ELISA最敏感，。
通过对吸光度数据的Scatchard分析可获得KD的附加证实。当以突变DDAH-ADMA复合物的浓度与游离ADMA的浓度的比率对复合物的浓度绘图时，KD可获自斜率(-1/KD)。复合物浓度等于总突变DDAH浓度乘(A-Ab)/(Af-Ab)，其中，A是欲测定的复合物的A405，Af是在不存在ADMA时突变DDAH的A405，而Ab是在存在过量ADMA时突变DDAH的A405。游离ADMA等于总ADMA减去所述复合物。
2.采用突变DDAH片段通过竞争ELISA测定血清ADMA
使用来自健康人类受试者的血样。从血清中除去细胞后，通过标准方法测定ADMA，所述标准方法包括除去血清蛋白，采用邻苯二醛的荧光标记，反相高效液相色谱法(HPLC)，和柱后，在线(in-line)荧光检测(Chen等，1997)。通过基本上如实施例1中所述的竞争ELISA采用浓度1×10-9的突变DDAH对相同的样本进行测定。以三等份检测每个样本的1∶10至1∶100的系列稀释液，然后将这些结果与10-9至10-7M的纯ADMA的标准方法和标准曲线的结果相比较。在标准测定法和竞争ELISA之间可以观察到非常好一致性。
3.优化荧光偏振免疫测定
将ADMA经其α-氨基结合至Oregon Green(OG)然后通过反相HPLC纯化。以偏振荧光498nm激发最大值和524nm发射最大值在10-10至10-8M的浓度范围内的偏振荧光测定游离结合物的荧光偏振。ADMA-OG的偏振应在整个范围内保持相当恒定，其值通常是10-9M时20±5。在10-9M ADMA-OG时，在用10-10M-10-6M的多种浓度的突变DDAH平衡之后测定偏振。最小值应等于游离结合物的最小值。在10-7M和10-6M之间达到(150-200)的最大值。因此拐点可出现在10-7M和10-8M之间，这于KD的预先估计一致，这可通过荧光偏振数据的Scatchard分析证实。在这一情况下，以突变DDAH-ADMA-OG复合物与游离突变DDAH的比率对复合物再次作图，KD获自斜率(-1/KD)。复合物的浓度应等于总ADMA-OG浓度乘上(P-Pf)/(Pb-Pf)，其中P是浓度要测量的复合物的偏振，Pf是游离ADMA-OG的偏振，而Pb是存在过量突变DDAH的情况下ADMA-OG的偏振。游离突变DDAH等于总突变DDAH减去所述复合物。还可在10-7M游离ADMA情况下，检测偏振，10-7M游离ADMA相当于健康血清的10倍稀释度，其将大约按比例减去最大偏振。优选地，在精氨酸100倍高浓度或SDMA的相等浓度情况下，不应观测到可检测到的抑制。
4.采用突变DDAH片段通过FPIA测定血清ADMA
如上所述，当抗体浓度等于KD而荧光配体浓度大约为KD的10％时产生荧光偏振对竞争抑制的最佳灵敏度。在这些条件下，未抑制的偏振位于其范围的中点，而在100倍过量游离分析物情况下可实现～80％抑制。将实施例2中分析的相同样品用FPIA以浓度为KD的突变DDAH和浓度为10％KD的ADMA-OG再次分析。测定1∶2～1∶100的稀释液然后在与10-6M～10-8M的范围内与标准曲线对比。该结果可同样与标准测定法以及竞争ELISA一致。
本说明书所提及的全部出版物和专利申请均以如同各独立出版物或专利申请被具体且独立地引入作为参考的相同的范围而被引入本文作为参考。
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Claims (26)

1.包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)的片段的分离的或纯化的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N-二甲基精氨酸(ADMA)的亲和性，且其中所述突变蛋白不足以将ADMA水解为瓜氨酸和/或释放所述瓜氨酸，或二者并存。
2.权利要求1的突变蛋白，其中所述突变DDAH酶具有对不对称L，N-单甲基精氨酸(LNMMA)的亲和性，其中所述突变蛋白不足以或者将LNMMA水解为瓜氨酸或者释放所述瓜氨酸，或二者并存。
3.权利要求1的突变蛋白，其中所述片段具有高于野生型DDAH的对ADMA的亲和性。
4.权利要求1的突变蛋白，其中所述突变DDAH来源于动物细胞的野生型DDAH。
5.权利要求4的突变蛋白，其中所述动物细胞是哺乳动物的。
6.权利要求5的突变蛋白，其中所述哺乳动物细胞是人的。
7.权利要求1的突变蛋白，其中所述对ADMA的亲和性具有至少约为1×107M-1的KA，或不高于10-7M的KD。
8.权利要求1的突变蛋白，其还包含可检测的标记物。
9.权利要求8的突变蛋白，其中所述可检测的标记物是光吸收剂、荧光剂、化学发光剂、酶、或放射性同位素。
10.测定生物样品中ADMA水平的方法，所述方法包括将所述生物样品与突变蛋白接触和测定与所述突变蛋白结合的ADMA的量，其中所述突变蛋白是包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)的片段的分离的或纯化的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N-二甲基精氨酸(ADMA)的亲和性，其中所述突变蛋白不足以将ADMA水解为瓜氨酸和/或释放所述瓜氨酸，或二者并存。
11.权利要求10的方法，其中将所述生物样品中的所述ADMA用可检测的标记物进行标记。
12.权利要求11的方法，其中所述可检测的标记物是光吸收剂、荧光剂、化学发光剂、酶、或放射性同位素。
13.权利要求11的方法，其中对与所述突变蛋白结合的ADMA的量的所述测定包括荧光免疫测定。
14.权利要求11的方法，其中对与所述突变蛋白结合的ADMA的量的所述测定包括酶免疫测定。
15.权利要求10的方法，其中将所述突变蛋白用可检测的标记物进行标记。
16.权利要求15的方法，其中所述可检测的标记物是光吸收剂、荧光剂、化学发光剂、酶、或放射性同位素。
17.权利要求15的方法，其中对与所述突变蛋白结合的ADMA的量的所述测定包括荧光免疫测定。
18.权利要求15的方法，其中对与所述突变蛋白结合的ADMA的量的所述测定包括酶免疫测定。
19.测定生物样品中ADMA水平的方法，所述方法包括将所述生物样品与权利要求7的突变蛋白接触和测定与所述突变蛋白结合的ADMA的量。
20.权利要求19的方法，其中将所述突变蛋白与选自荧光剂和酶的可检测的标记物结合。
21.权利要求20的方法，其中将与所述突变蛋白结合的分子结合到固体表面且对与所述突变蛋白结合的ADMA的量的所述测定包括检测与所述表面结合的所述标记物的量。
22.权利要求10的方法，其中所述突变DDAH酶具有对不对称L，N-单甲基精氨酸(LNMMA)的亲和性，其中所述突变蛋白不足以或者将所述LNMMA水解为瓜氨酸或者释放所述瓜氨酸，或二者并存。
23.检测生物样品中ADMA的量的试剂盒，其包括突变蛋白和至少一种试剂，其中所述突变蛋白是包含至少突变二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)的片段的分离的或纯化的突变蛋白，其中所述片段具有对不对称N，N-二甲基精氨酸(ADMA)的亲和性，其中所述突变蛋白不足以将ADMA水解为瓜氨酸和/或释放所述瓜氨酸，或二者并存。
24.权利要求23的试剂盒，其还包含抗-(突变蛋白)抗体。
25.权利要求23的试剂盒，其还包含可检测的标记物。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述标记物选自荧光剂和酶。
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