CN1651466A - 一种多糖的硫酸酯化衍生物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

一种多糖硫酸酯化衍生物，它是多糖YCP的硫酸酯化衍生物，它的分子量为45×10⁴Da～64×10⁴Da，多糖硫酸酯化衍生物的硫酸基取代度(DS)为0.13～1.3。本发明的多糖YCP硫酸酯化衍生物具有明显的抗凝血、抗血小板聚集、抗自由基产生、体外抗肿瘤细胞增殖和抗HIV－1逆转录酶的作用，因此本发明的多糖硫酸酯化衍生物可以应用于制备抗凝血药物、抗血栓药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物或抗艾滋病药物。本发明公开了其制法。

Description

一种多糖的硫酸酯化衍生物及其制法和用途

一、技术领域

本发明涉及一种多糖，具体地说是涉及一种海洋真菌炭团菌多糖YCP的硫酸酯化衍生物及其制法和用途。

二、背景技术

多糖是自然界存在的一大类高分子化合物，广泛参与细胞的各种生命活动而产生多种生物学功能，如增强免疫特性、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、延缓衰老等功能。随着人们对多糖组成，性质，结构与功能的研究不断深入，人们注意到以下问题：(1)自然界中存在的多糖并不都具有活性。例如，一种从土壤微生物中提取的多糖curdlan，尽管与多糖药物——香菇多糖有相似的主链结构，却没有后者所具有的抗肿瘤活性；未经处理的茯苓多糖也不具有任何生物学活性。(2)有些多糖由于结构或理化性质等障碍而不利于其生物学活性的发挥。如未经处理的裂褶多糖由于粘度太大而在临床上无法使用；一些硫酸葡聚糖因分子量大，无法跨越多重细胞膜障碍，很难达到发挥生物学活性的血药浓度。(3)也有些多糖尽管药效良好，但同时也会产生一些不良反应，甚至毒副作用。如有些具有抗病毒活性的低分子量硫酸葡聚糖可产生不利于其抗病毒活性的抗凝血现象；某些多糖硫酸化衍生物由于硫酸基过多而显示一定的细胞毒性。(4)有些从天然生物体内分离的多糖活性较弱，有待进一步提高。已完成的研究证实，多糖的活性直接或间接地受到其结构的制约。因此，采取一定的方法对多糖结构进行适当修饰是解决以上问题的根本途径。目前对多糖结构修饰的研究还处在方法探索阶段。

分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行结构改造，以获得众多结构类型衍生物的方法。多糖经分子修饰可改变其结构从而提高其生物活性或降低其毒副作用。因此多糖的分子修饰研究引起了高度重视。近些年，海洋多糖分子修饰方法研究已取得很大进展，降解、硫酸酯化、脱硫酸根、乙酰化、羧甲基化、磷酸酯化、硬脂酰化等方法也已被广泛应用。多糖结构修饰也是研究多糖构效关系、探寻多糖活性中心的重要手段。

自从Nakashima等人报道卡拉胶具有抑制单疱疹病毒复制的作用以来，硫酸多糖逐渐引起人们的关注。通过对多种天然硫酸多糖的研究证实，硫酸多糖具有突出的抗病毒(如艾滋病毒HIV、巨噬细胞病毒、流感病毒等)活性。硫酸多糖是一类糖基上带有硫酸基团的多糖。日本学者Mizumoto等人于1988年首次将硫酸基团引入到一些均多糖结构中，制成硫酸化多糖，并发现硫酸化多糖能抑制T-淋巴细胞病毒，至此，硫酸化成为多糖结构修饰中的一个重要方向。多糖经过硫酸化修饰后，除了能获得抗病毒活性外，还可产生其它生物学活性。此外，通过控制硫酸化多糖的硫酸基取代度，也可使产物产生较强的抗凝血活性。向多糖引入硫酸根的方法视主链糖单元的类型而定，对于呋喃型的糖单元，一般采用Nagasava法；若主链糖单元为吡喃型单糖，通常采用Wolfrom法和二甲基甲酰胺溶剂法，前者应用较多。最近，Takano等报道了另一种多糖硫酸化方法——单甲基硫酸酯化法，采用该方法可避免使用有毒的有机试剂，且反应条件较温和，但与其它的多糖硫酸化修饰方法一样，依然存在硫酸取代度较低、多糖主链降解较严重等问题。继续开展对多糖硫酸化方法的探讨，开发高效的硫酸化工艺将推动硫酸化多糖在药物领域中的发展。

三、发明内容

本发明的目的在于提供多糖的硫酸酯化衍生物及其制法，以及多糖的硫酸酯化衍生物在制备药物中的应用。

本发明的具体的技术方案如下：

一种多糖硫酸酯化衍生物，它是多糖YCP的硫酸酯化衍生物，它的分子量为45×10⁴Da～64×10⁴Da，多糖硫酸酯化衍生物的硫酸基取代度为0.13～1.3。

多糖YCP是由葡萄糖和糖醛酸构成，不含蛋白质和核酸，分子量为1.6×10⁶Da～2.6×10⁶Da，端基碳为α-构型，旋光度[α]_D ^t＝+131.7～+159.4°，多糖的基本骨架由1→4糖苷键连接的葡萄糖构成，每17个葡萄糖残基有一个侧链，侧链为葡萄糖和糖醛酸，比例为2∶1，均通过1→6糖苷键与主链葡萄糖相连接，构成每摩尔多糖分子中葡萄糖与糖醛酸的物质的量之比为53∶1(参见：“一种多糖及其制法和用途”申请号200310106520.2的中国专利申请)。

一种上述多糖硫酸酯化衍生物的制法，它由下列步骤组成：

步骤1.将附有冷凝管的圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入无水吡啶10～15mL，磁力搅拌，使之充分冷却。用滴管缓慢逐滴加入氯磺酸1.5～3.0mL，约15～30min滴加完毕。

步骤2.称取精品多糖YCP 200mg悬浮于10～30mL新蒸馏的无水甲酰胺中，超声后倾入圆底烧瓶，并迅速将圆底烧瓶移入油浴，60～100℃恒温搅拌0.5～2h。

步骤3.反应完毕后，将圆底烧瓶移出油浴，静置冷却至室温。

步骤4.将已冷却至室温的反应混合物倾入100mL冰水中，以2.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5。

步骤5.在搅拌下，缓缓加入5倍体积的无水乙醇，室温静置过夜。

步骤6.将所得溶液3000rpm高速离心机离心10min，倾去上清液，沉淀以100mL蒸馏水溶解，将此溶液对流动的蒸馏水透析3天。

步骤7.将所得约为200ml的未透液，于60℃减压蒸馏至体积为5mL，加入4～5倍无水乙醇沉淀，4℃静置过夜。

步骤8.所得溶液8000rpm离心15min，弃去上清液，沉淀用P₂O₅真空干燥过夜，即得多糖YCP硫酸酯化衍生物。

本发明的多糖YCP硫酸酯化衍生物具有明显的抗凝血、抗血小板聚集、抗自由基产生、体外抗肿瘤细胞增殖和抗HIV-1逆转录酶的作用，因此本发明的多糖硫酸酯化衍生物可以应用于制备抗凝血药物、抗血栓药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物或抗艾滋病药物。

四、附图说明

图1：多糖YCP与其硫酸酯化衍生物的红外光谱图，其中(A)为YCP；(B)为YCP-SL；(C)为YCP-SM；(D)为YCP-SH。

图2：多糖YCP硫酸酯化衍生物对血小板聚集率的影响

图3：多糖YCP硫酸酯化衍生物对羟自由基的清除作用

图4：多糖YCP硫酸酯化衍生物对对超氧阴离子自由基的清除作用

图5：多糖YCP硫酸酯化衍生物抗人肺癌细胞A549增殖活性

图6：多糖YCP硫酸酯化衍生物抗人鼻咽癌细胞KB增殖活性

五、具体实施方式

实施例1.多糖YCP硫酸酯化衍生物的制备

采用氯磺酸-吡啶法。将附有冷凝管的圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入无水吡啶10mL，磁力搅拌，使之充分冷却。用滴管慢慢加入氯磺酸1.5mL，约15min滴加完毕。称取精品多糖YCP 200mg悬浮于10mL新蒸的甲酰胺中，超声15min，加入圆底烧瓶，迅速将烧瓶移入60℃油浴，恒温搅拌，0.5h后反应完毕，冷却至室温。将反应混合物倾入100mL冰水中，以2.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5。加入5倍体积的无水乙醇，室温静置过夜。3000rpm高速离心机离心10min，倾去上清液，沉淀以100mL蒸馏水溶解，转移至烧杯中，将此溶液蒸馏水透析3天。得未透液约200ml，将此未透液减压蒸馏至体积为5mL，4～5倍无水乙醇沉淀，4℃静置过夜。8000rpm离心15min，所得沉淀用P₂O₅真空干燥过夜，即得低取代度YCP硫酸单酯的钠盐YCP-SL(Low YCP-Sulfates)222mg。

实施例2.多糖YCP硫酸酯化衍生物的制备

采用氯磺酸-吡啶法。将附有冷凝管的圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入无水吡啶12.5mL，磁力搅拌，使之充分冷却。用滴管慢慢加入氯磺酸2.0mL，约20min滴加完毕。称取精品多糖YCP200mg悬浮于20mL新蒸的甲酰胺中，超声15min，加入圆底烧瓶，迅速将烧瓶移入80℃油浴，恒温搅拌，1h后反应完毕，冷却至室温。将反应混合物倾入100mL冰水中，以2.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5。加入5倍体积的无水乙醇，室温静置过夜。3000rpm高速离心机离心10min，倾去上清液，沉淀以100mL蒸馏水溶解，转移至烧杯中，将此溶液蒸馏水透析3天。得到未透液约200ml，将此未透液减压蒸馏至体积为5mL，4～5倍无水乙醇沉淀，4℃静置过夜。8000rpm离心15min，所得沉淀用P₂O₅真空干燥过夜，即得中取代度YCP硫酸单酯的钠盐YCP-SM(Medium YCP-Sulfates)369mg。

实施例3.多糖YCP硫酸酯化衍生物的制备

采用氯磺酸-吡啶法。将附有冷凝管的圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入无水吡啶15mL，磁力搅拌，使之充分冷却。用滴管慢慢加入氯磺酸3.0mL，约30min滴加完毕。称取精品YCP200mg悬浮于30mL新蒸的甲酰胺中，超声15min，加入圆底烧瓶，迅速将烧瓶移入100℃油浴，恒温搅拌，2h后反应完毕，冷却至室温。将反应混合物倾入100mL冰水中，以2.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5。加入5倍体积的无水乙醇，室温静置过夜。3000rpm高速离心机离心10min，倾去上清液，沉淀以100mL蒸馏水溶解，转移至烧杯中，将此溶液蒸馏水透析3天。得到未透液约200ml，将此未透液减压蒸馏至体积为5mL，4～5倍无水乙醇沉淀，4℃静置过夜。8000rpm离心15min，所得沉淀用P₂O₅真空干燥过夜，即得高取代度YCP硫酸单酯的钠盐YCP-SH(High YCP-Sulfates)410mg。

实施例4.硫酸酯化YCP多糖衍生物相对分子量的测定

Sephacryl S-400脱气，湿法装柱，柱规格为1.0cm×100cm，柱高90cm，以0.05mol/LNaCl溶液平衡。将上述一系列不同取代度的酯化衍生物配成2mg/mL的溶液上已平衡好的Sephacryl S-400分子筛，上样体积为0.5mL，用0.05mol/LNaCl洗脱。每管1mL分部收集，苯酚-硫酸比色法跟踪检测，以管号为横坐标，光密度为纵坐标，绘制洗脱曲线。

按相同条件，将相对分子质量分别为10kDa，40kDa，70kDa，500kDa的标准Dextran以及蓝色葡聚糖(2000kDa)相继进样，以洗脱体积为横坐标，分子量的对数为纵坐标，绘制标准曲线。查标准曲线，得到多糖衍生物相对分子质量，结果见表1。

实施例5.多糖硫酸酯化衍生物的硫酸基取代度(DS)的测定

准确吸取0.6mg/mL的标准硫酸基溶液0.00，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20mL于带塞试管中，各管以1mol/L的HCl溶液补足总体积到0.2mL，各管再加入3.8mL3％三氯乙酸和1mL 1％的氯化钡-明胶溶液，混匀，室温静置15min，360nm处测OD值，以0管对照得A₁值。另同系列标准溶液，以明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液，以0’管对照得A₂。以SO₄ ^2-的含量(μg)为横坐标，以A₁-A₂为纵坐标作标准曲线。

取酯化衍生物2mg封于装有2mL的安瓿中，110℃水解3h。平行取3份水解产物，每份0.2mL，置于带塞试管中，再加入3.8mL3％三氯乙酸和1mL1％的氯化钡-明胶溶液，混匀，室温静置15min，360nm处测OD值，以0管对照得A₁值。另同系列标准溶液，以明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液，以0’管对照得A₂。将A₁-A₂带入上述标准曲线，得SO₄ ^2-％。根据SO₄ ^2-％计算出酯化衍生物中S的百分含量，再根据公式(1)计算DS，(参见：1.史宝军等.硫酸酯化灰树花多糖的制备与分析，无锡轻工业大学学报，2003，22，75-78；2.Silvestri LJ，Hurst RE，Simpson L，Settine JM.Analysis of sulfate in comllex carbohydrates.Anal Biochem.1982，123，303-309；3.Dodgson KS，Price RG.A Note on the determination of Ester Sulfate Content of SulfatedPolysaccharides.Biochem J，1962，84，106-110)

$\mathrm{DS}=\frac{1.62\×S\%}{32-1.02\×S\%}---\left(1\right)$

结果见表1。

            表1.多糖YCP硫酸酯化衍生物的基本理化性质

                [ClSO₃H]/                   Mw

     样品                       DS

                 [YCP]¹                 (×10³kDa)

    YCP-SL        6∶1         0.13        0.64

    YCP-SM        8∶1         0.99        0.57

    YCP-SH        12∶1        1.3         0.45

1)[ClSO₃H]/[YCP]是ClSO₃H与多糖YCP中羟基的物质的量的比值

实施例6.多糖硫酸酯化衍生物的红外光谱分析

多糖YCP硫酸酯化衍生物经干燥后称取1mg，用溴化钾压片法在Nicolet-170X型红外光谱仪上于4000～400cm区间扫描，结果见图1。三种硫酸酯化YCP多糖衍生物的红外光谱图基本相同，除显示YCP多糖母体的特征吸收外，在1240cm^-1和820cm^-1附近有硫酸酯键的特征吸收，且与YCP多糖相比衍生物的羟基吸收在3600～3200cm^-1出现的宽峰也大为减小，表明部分羟基被酯化(参见图1)。

实施例7.多糖YCP硫酸酯化衍生物对凝血酶时间(thrombin time，TT)的影响

TT是反映凝血酶使纤维蛋白原转变为纤维蛋白的试验。YCP硫酸酯化衍生物对TT影响的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行。于酶标板小孔中加入200μl0.5％人纤维蛋白原，再加入1μl样品液，充分混匀。用微量进样器吸取5μl凝血酶溶液(100U/mL)迅速混匀并计时，记录纤维蛋白原发生凝固的时间，结果见表2。

纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白，该实验反映药物对于外源性凝血系统的影响。不加药物时，纤维蛋白原与凝血酶作用，约25s发生凝固，而YCP-SH和YCP-SM在各浓度(0.625，1.25，2.5和5mg/mL)均可显著延长纤维蛋白原的凝固(p＜0.05)，与对照组相比，5mg/mL的YCP-SH和YCP-SM作用后，凝固时间分别延长503％和242％。

        表2.多糖YCP硫酸酯化衍生物对凝血酶时间(TT)的影响

                                  凝结时间(s)          

   样品

                 25μg/ml   12.5μg/ml   6.25μg/ml       -

  Control                                                25.3

  Heparin                                                40.3

(6.25μg/ml)

  YCP-SL           26.5         27.0         26.9

  YCP-SM           61.2         56.0         45.3

  YCP-SH           127          81.1         50.3

注：所有结果均为3次试验结果的平均值

实施例8.多糖YCP硫酸酯化衍生物对活化部分凝血活酶时间(activated partialthrombinplastin time，APTT)的影响

待测血浆活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定，使用上海太阳生物技术有限公司提供的APTT试剂盒进行。待测血浆加入部分凝血活酶溶液，在Ca⁺⁺参与下纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，测定凝固所需的时间，即为APTT。

家兔静脉采血，置于含有1/10体积0.109mol/L枸橼酸钠抗凝液的塑料管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，收集上层液(血浆，黄色)。取血浆0.1ml，加入不同浓度的样品液0.1ml，37℃预温，然后加入37℃预温的APTT悬液0.1ml，混匀，37℃孵育5min。加入37℃预温的0.025MCacl₂溶液0.1ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间。每个浓度的样品液，重复测定3次，取平均值。结果见表3。

 表3.多糖YCP硫酸酯化衍生物物对活化部分凝血活酶时间的影响

    样品                    凝结时间(s)             

              20μg/ml    10μg/ml     5μg/ml     -

  Control                                         33.7

  Heparin                                         426

(2.5μg/ml)

  YCP-SL        35.7        35.5        35.6

  YCP-SM        307         105         68.7

  YCP-SH        745         226         91.0

注：所有结果均为3次试验结果的平均值

在样品终浓度为10μg/ml时，YCP-SM和YCP-SH分别将APTT延长至104.5s和226.3s，分别是参比血浆的3倍和7倍。在样品终浓度为20μg/ml时，YCP-S3的活性略高于肝素对照品(2.5μg/ml)。

实施例9.多糖YCP硫酸酯化衍生物对凝血酶原时间(prothrombin time，PT)的影响

PT测定是外源性凝血系统较理想和常用的筛选实验，使用上海太阳生物技术有限公司提供的APTT试剂盒进行。待测血浆加入过量的含钙组织凝血活酶，重新钙化的血浆在组织因子存在时激活因子X成为Xa，后者使凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶使纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，测定凝固所需时间，即为待测血浆凝血酶原时间(PT)。

家兔静脉采血，置于含有1/10体积0.109mol/L枸橼酸钠抗凝液的塑料管中，轻轻颠倒混匀，3000rpm离心15min，收集上层液(血浆，黄色)。每瓶PT试剂加入2.0ml缓冲液轻摇溶解。取血浆0.1ml，加入不同浓度的样品液0.1ml，混匀，37℃孵育2min，加入37℃预温凝血活酶0.2ml，混匀，立即启动秒表，记录凝固时间，即为PT值。每个浓度的样品液，重复测定3次，取平均值。结果见表4。

      表4.多糖YCP硫酸酯化衍生物对凝血酶原时间的影响

    样品                          凝结时间(s)

                  2.5mg/ml     1.25mg/ml      0.625       -

                                              mg/ml

  Control                                                11.9

  Heparin                                                34.6

(0.625mg/ml)

  YCP-SL            12.2          12.3         11.9

  YCP-SM            56.2          42.7         26.2

  YCP-SH            ＞12h         ＞12h        51.1

注：所有结果均为3次试验结果的平均值。

在样品终浓度为0.635mg/ml时，YCP-SM和YCP-SH分别延长PT为26.20s和51.10s，分别为参比血浆的2.5倍和5倍。YCP-SH更表现出高于对照品肝素(34.60s)的活力。提高浓度至1.25mg/ml以上，YCP-SH的存在使血浆在12小时内不能发生凝固。

实施例10.血小板聚集率的测定

大鼠颈动脉插管取血，加1.33mg/mL肝素(9∶1)抗凝，室温下放置1小时待用。在测定管中加入500μl缓冲液(0.2gNaCl，0.05gKCl，0.05gCaCl₂，0.106gMgCl₂·6H₂O，0.375gNaHCO₃，0.0125gNaH₂PO₄，0.25g葡萄糖溶于250mL蒸馏水中)，500μl血液和10μl的样品液，以ADP(5μl)作诱导剂，用全血血小板聚集仪仪检测5分钟内血小板的聚集情况，结果以欧姆值表示，欧姆值越小，抗凝效果越好。结果见图2。

ADP是一种强有力的血小板聚集剂。血小板膜上有ADP受体，当血小板与ADP受体接触后，即发生血小板聚集称为第一相聚集或原发性聚集；接着血小板发生结构变化，放出自身的ADP，促使血小板进一步聚集，称为第二相聚集或次发性聚集。实验表明，YCP-SH和YCP-SM在较高浓度(1.25，2.5和5mg/mL)均可显著抑制血小板的聚集。

实施例11.多糖YCP硫酸酯化衍生物对羟自由基的清除作用

采用南京建成生物工程公司试剂盒测定。将配好的应用液，先在37℃水浴中预温3分钟，空白管为0.4mL蒸馏水，对照管为0.2mL蒸馏水加0.2mL底物应用液，测定管为0.2mL样品加0.2mL底物应用液，各管分别加入甲乙混合液0.4mL，混匀，37℃准确反应1分钟，立即加入2.0mL显色剂终止反应。混匀，室温放置20分钟后，以蒸馏水调零，550nm测各管吸光度值。结果见图3。

YCP-SH和YCP-SM在各浓度(25，50，100和200μg/mL)时对Fenton反应产生的羟自由基均显示显著的的清除作用(p＜0.01)，YCP-SH和YCP-SM的半数抑制浓度分别为52.2μg/mL和103μg/mL。

实施例12.多糖YCP硫酸酯化衍生物对超氧阴离子自由基的清除作用

采用南京建成生物工程公司试剂盒测定。将以上配好的应用液，先在37℃水浴中预温3分钟，空白管为1.355mL蒸馏水，对照管为0.055mL蒸馏水加1.0mL试剂一，测定管为0.055mL样品加1.0mL试剂一，各管分别加入试剂二、试剂三和试剂四各1.0mL，混匀，置37℃恒温水浴40分钟。各管分别加入显色剂2.0mL，混匀，10分钟后以蒸馏水调零，波长550nm处比色。结果见图4。

YCP-SH和YCP-SM在各浓度(25，50，100和200μg/mL)时对超氧阴离子自由基均显示显著的的清除作用(p＜0.01)，YCP-SH和YCP-SM的半数抑制浓度分别为193μg/mL和476μg/mL。

实施例13.多糖YCP硫酸酯化衍生物抗人肺癌细胞A549增殖活性

取对数生长期的人肺癌细胞A549用胰蛋白酶消化后以5×10⁴个/mL，100μL/孔的细胞浓度接种于96孔板，培养6h后实验组各孔均以100μl/孔分别加入终浓度为200，100，50和25μg/mLYCP硫酸酯化产物，阴性对照孔改以100μl/孔加入培养基，各组均设3个复孔，于37℃，5％CO₂培养箱培养48小时，各孔中加入20μl的5mg/mLMTT，继续培养4小时后测定OD₅₇₀，并按下列公式计算细胞生长抑制率(IR)。细胞生长抑制率(IR)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。结果见图5。

实施例14.多糖YCP硫酸酯化衍生物抗人鼻咽癌细胞KB增殖活性

取对数生长期的人鼻咽癌细胞KB用胰蛋白酶消化后以5×10⁴个/mL，100μL/孔的细胞浓度接种于96孔板，培养6h后实验组各孔均以100μl/孔分别加入终浓度为200，100，50和25μg/mLYCP硫酸酯化产物，阴性对照孔改以100μl/孔加入培养基，各组均设3个复孔，于37℃，5％CO₂培养箱培养48小时，各孔中加入20μl的5mg/mLMTT，继续培养4小时后测定OD₅₇₀，并按下列公式计算细胞生长抑制率(IR)。细胞生长抑制率(IR)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。结果见图6。

实施例15.多糖YCP硫酸酯化衍生物对HIV-1逆转录酶的抑制作用

将三种样品和阳性对照品(磷钾酸钠：PFA，常州三厂生产)配成适当的浓度，用水做5倍稀释，各5个稀释度。将各稀释的样品加入含有Biotin-dUTP和基因工程酶靶的反应Buffer中，在最佳条件下孵育，以亲和素表记的辣根过氧化酶系统显色，测定OD₄₅₀值，计算IC₅₀。结果见表5。

表5.多糖YCP硫酸酯化衍生物对HIV-1逆转录酶的抑制作用

  样品          初始浓度       IC₅₀(μg/ml)

                (μg/ml)

  PFA             4               0.165

YCP-SL            333             --

YCP-SM            66.7            2.57

YCP-SH            66.7            2.18

注：表中“--”表示样品在初始浓度无抑制HIV-1逆转录酶的活性

Claims (3)

1.一种多糖硫酸酯化衍生物，其特征是：它是多糖YCP的硫酸酯化衍生物，它的分子量为45×10⁴Da～64×10⁴Da，硫酸基取代度为0.13～1.3。

2.一种制备权利要求1所述的多糖硫酸酯化衍生物的方法，其特征是它由下列步骤组成：

步骤1.将附有冷凝管的圆底烧瓶置于冰盐浴中，加入无水吡啶10～15mL，磁力搅拌，使之充分冷却。逐滴加入氯磺酸1.5～3.0mL，15～30min滴加完毕；

步骤2.称取精品多糖YCP 200mg悬浮于10～30mL新蒸馏的无水甲酰胺中，超声后倾入圆底烧瓶，并将圆底烧瓶移入油浴，60～100℃恒温搅拌0.5～2h；

步骤3.反应完毕后，将圆底烧瓶移出油浴，静置冷却至室温；

步骤4.将已冷却至室温的反应混合物倾入100mL冰水中，以2.5mol/L的NaOH溶液调节pH至7.5；

步骤5.在搅拌下，加入5倍体积的无水乙醇，室温静置过夜；

步骤6.将所得溶液3000rpm高速离心机离心10min，倾去上清液，沉淀以100mL蒸馏水溶解，将此溶液对流动的蒸馏水透析3天；

步骤7.将所得约为200ml的未透液，于60℃减压蒸馏至体积为5mL，加入4～5倍无水乙醇沉淀，4℃静置过夜；

步骤8.  将所得溶液8000rpm离心15min，弃去上清液，沉淀用P₂O₅真空干燥过夜，即得多糖YCP硫酸酯化衍生物。

3.权利要求1所述的多糖硫酸酯化衍生物在制备抗凝血药物、抗血栓药物、抗氧化药物、抗肿瘤药物或抗艾滋病药物中的应用。

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