CN1640498A - 一种磁性纳米放射性药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种磁性纳米放射性药物及其制备方法，该方法包括有以下步骤：1)将磁性纳米微粒进行表面化学修饰；2)固载配基；3)对配基进行放射性核素标记。本发明的磁性纳米放射性药物在生理条件下具有良好的稳定性；而且本发明将磁性纳米微粒的纳米特性、磁学性质和放射性核素的治疗特性相结合，使用外加磁场，可将放射性药物快速在病灶部位浓聚，从而提高疗效，降低杀伤正常组织细胞等毒副作用。

Description

一种磁性纳米放射性药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种磁性纳米放射性药物及其制备方法。

背景技术

放射性药物治疗是目前逐渐通用的一种治疗肿瘤的方案，又被称为内放射疗法。这种疗法是将有放射性标记的肿瘤特异性药物注射到肿瘤位置，放射性同位素发出的辐射(α或β-粒子、俄歇电子以及内转化电子)杀死或杀伤肿瘤细胞。迄今为止，已经发现的放射性核素的数量超过2000种，然而真正能够用于治疗的放射性核素却不多，治疗用的放射性核素必须满足：①必须根据肿瘤性质、大小以及可能对邻近器官和组织的伤害程度而慎重选择适宜的射线种类和能量；②适宜的半衰期，以维持一段持续作用的时间，使射线传递给病灶细胞足够的能量，促其死亡，一般选择半衰期在几天到数十天范围的核素；③放射性治疗药物一般要求高比活度(比活度是指单位质量的某种放射性物质的放射性活度)，应接近无载体；④放射性核素不宜在脑及心脏等要害组织中浓集，否则将产生辐射损伤；⑤一般要求放射性核素的含量不低于90％；⑥核素应该易于生产和制备，供应方便，供应频度高，价格低廉。常见医用治疗放射性核素如下表所示：

                衰变类型及最    γ射线能量    组织中的最    内转换电子和俄歇电

核素   半衰期

                大能量(MeV)     (keV，％)     大射程        子能量

³²P    14.28d   β：1.71        /             8.7mm         /

                                0.911

⁸⁹Sr   50.55d   β：1.49        (0.0009％)    8.0mm         /

⁹⁰Y    2.67d    β：2.27        /             12.0mm        /

¹³¹I    8.04d    β：0.61        364(81％)      2.4mm           /

²¹¹At   7.2h     α：5.87        670(0.3％)     65.0μm         /

²¹²Bi   1.0h     α：6.09        727(7％)       70.0μm         /

¹⁵³Sm   46.8h    β：0.806       103(28％)      ～4mm           /

¹⁸⁶Re   90.6h    β：1.027       137(9.3％)     5.0mm           /

¹⁸⁸Re   16.9h    β：2.11        155(15.2％)    ～11mm          /

¹⁹⁹Au   3.13h    β：0.296       158(36.9％)    ～0.8mm         /

⁶⁷Cu    61.9h    β：0.6         185(47％)      2.2mm           /

⁴⁷Sc    3.42d    β：0.44        159(68.5％)    ～2mm           /

^117mSn   13.9d    IT(100％)       159(80％)     ～0.2-0.3mm     内转换电子：0.13

                                                                MeV，0.15MeV

                                 357

¹⁰³Pd   16.7d    EC(100％)

                                 (0.061％)

¹²⁵I    60.14d   EC(100％)       35(6.7％)

¹²³I    13.2h    β⁺(＜0.01％)  159(83％)

                 EC(～100％)                   1～10nm         俄歇电子：20～500eV

⁷⁷Br    57.0h    β⁺(＜0.75％)  239(22.8％)

                 EC(～100％)

⁶⁷Ga    3.26d    EC(～100％)     184(24％)

²⁰¹Tl   3.05d    EC(～100％)     167(11％)

其中¹⁸⁸Re，其β^- _max＝2.12MeV(79％)，1.96MeV(20％)；γ＝155keV(15％)；有效治疗射程X₉₀＝2.1mm；半衰期T_1/2＝16.9h，是一种有吸引力的治疗用放射性核素，可由反应堆生产的W-188母体(半衰期T_1/2＝69d)的衰变而得，因此可以非常方便地按照要求从¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器淋洗得到(D.Z.Yin et al.，Nuclear Techniques 1998，21：51；F.F.J.Knapp，A.L.Beets，S.Guhlke，Anticancer Research 1997，17：1783)。自从1993年Jaouen等人提出Re、Tc的金属羰基化合物在核医学方面应用以来，fac-[M(OH₂)₃(CO)₃]⁺(M＝^99mTc，^186/188Re)用于生物分子的标记已经得到了广泛的研究(Schibli R.andSchubiger P.A.Current use and future potential of organometallicradiopharmaceuticals.Eur J Nucl Med，2002，29：1529-1542)。它有许多优点，比如水溶性较好，在空气及水溶液(pH2～12)中稳定性好。另外其配位体H₂O分子很容易被单齿、多齿双功能配体(含N-N-N，N-N-O，N-N-S，P-P，P-P-O和S-S等键)取代，形成羰基螯合物。这种螯合物很容易和蛋白、单抗、多肽、氨基酸、糖等生物分子结合。fac-[¹⁸⁸Re(H₂O)₃(CO)₃]⁺可以作为聚乳酸微球、磁性微球、磁性纳米微粒、单克隆抗体、蛋白质、多肽或糖类的放射性标记前体。

在过去的十年间发展了各种不同的方法用于将放射药物更加特异性地输运到肿瘤细胞，其中的一种方法是给患者注射具癌症免疫反应及相对癌症特异性的单克隆抗体(标记有发射α-或β-粒子的放射性核素)。注射后，放射性治疗药物逐渐地聚集到肿瘤部位，正常组织通常却少得多。这样放射性药物就更加选择性地被输运，降低了对健康组织的体内辐射。然而，这种方法经常因为药物在肿瘤部位最优浓集之前输运到肿瘤部位相对小的药物浓度及对正常组织的辐射杀伤而受到限制。

另一方面，由于特殊的超顺磁性和纳米特性，磁性纳米微粒在巨磁电阻、磁性流体和磁记录、软磁、永磁、磁致冷、巨磁阻抗材料以及磁光器件、磁探测器等方面具有广阔的应用前景。基于其纳米尺度及超顺磁特性，磁性纳米微粒在生物医学领域中的应用格外引人瞩目。磁性纳米微粒具有超顺磁性和胶体纳米微粒性质，在诸如视网膜脱落治疗(Dailey JP et al. J Magn MagnMater，1999，194：140-148；Rutnakonituk M et al.Polymer，2002，43：2337-2348)、细胞分离(Shinkai M.J Biosci and Bioeng，2002，94(6)：606-613；Molday RS and Mackenzie D.J Immunol Methods，1982，52(3)：353-367；RoathS.J Magn Magn Mater，1993，122(1-3)：329-334；Xu Z and Gu Y.WO03/005029 A2，Canada，2003)、肿瘤超热疗法(Shinkai M.J Biosci and Bioeng，2002，94(6)：606-613；Yanase M，et al.Jpn.J Cancer Res.，1986，8(12)：877-880；Jordan A et al.J Magn Magn Mater，2001，225：118-126；Hilger I et al.AcademicRadiology，2002，9(2)：198-202；Jordan A et al.J Magn Magn Mater，1999，194：185-196)、磁共振显像(MRI)诊断分辨增益试剂(Hasegawa M et al.Jpn.J.Appl.Phys.，1998，37(3A)：1029-1032；Kim DK et al.J Magn Magn Mater，2001，225：256-261；Shinkai M.J Biosci andBioeng，2002，94(6)：606-613；Papisov MI et al.J Magn Magn Mater，1993，122(1-3)：383-386；Kim DK et al.J J Magn MagnMater，2001，225(1-2)：30-36；Babes L et al.J Colloid and Interface Sci，1999，212：474-482)以及用于药物定位或者放射性疗法的磁性导向载体(Shinkai M.J Biosci and Bioeng，2002，94(6)：606-613；Xu Z and Gu Y.WO 03/005029 A2，Canada，2003；Widder KJ，et al.Proc.Soc.Exp.Bio.Med.，1978，58：141-146；Widder KJ，Flouret G and Senyei AE.J Pharm Sci，1979，68：79-82；Leach JH.Magnetic Targeted Drug Delivery.Thesis of Master of Science in ElectricalEngineering，Virginia Polytechnic Institute and State University，Blacksburg，VA，2003)等方面有着广泛和重要的应用价值。纳米粒子粒度小，易于穿过组织间隙并被细胞所吸收，可通过人体最小的毛细血管，还可以通过血脑屏障，并且可以减少或避免网状内皮系统的吸收。磁性纳米微粒由于粒度小，悬浮稳定性好，比表面大，表面活性高，吸附能力强，可以制成脂质体，也可包覆高分子材料，或者进行化学修饰，用于携带药物或其他生物物质。因其超顺磁性，在磁场中可以很好响应，撤去磁场剩磁几乎为零，故可用于生物物质的快速富集、分离和纯化，药物在人体内的靶向运输与定位等等。此外，磁性纳米微粒还可用作MRI分辨试剂；在超热疗法中，利用磁性纳米微粒在交变磁场下发热，使得摄取了磁性纳米微粒的肿瘤组织能够快速升温达45℃～47℃，可直接杀死肿瘤细胞。

用于生物医学领域，特别是应用于人体药物输运的纳米磁性材料主要是磁学性质优良，在生理条件下化学性质稳定，生物相容性好，毒副作用小的Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃。修饰的或未修饰的磁性纳米微粒目前已有市售(如德国Micromod Partikeltechnologie公司的nanomag-D)，但售价昂贵。

因此如果考虑应用及成本需要，磁性纳米微粒亦可自制。采用硅胶包覆磁性纳米微粒，可以在磁性纳米微粒表面形成亲水性的包覆层，改善磁性纳米微粒的分散性；硅胶包覆层是惰性和具有生物相容性的，可以提高磁性纳米微粒的抗氧化能力，同时降低毒性；此外硅胶易于修饰，硅醇基很容易与硅烷偶联剂等修饰剂反应。1990年Philipse就发展了一种用硅胶包裹四氧化三铁纳米微粒的方法(Albert P.Philipse，Michel P.B.van Bruggen and ChellapahPathmamanoharan.Magnetic Silica Dispersions：Preparation and Stability ofSurface-Modified Silica Particles with a Magnetic Core.Langmuir，1994，10：92-99)。硅烷偶联剂是一种双功能试剂：一端与硅醇基或者磁铁矿纳米微粒表面羟基反应，另一端则是可以直接或间接与生物分子及化学药物结合的有机官能团。1991年Kobayashi和Matsunaga用含氨基的硅烷偶联剂修饰四氧化三铁磁性纳米微粒，并用于酶的固定化(Kobayashi H and Matsunaga T.Amino-silane modified superparamagnetic particles with surface-immobilizedenzyme.Journal of Colloid and Interface Science，1991，141(2)：505-511)。

目前国内外有关磁性纳米微粒的制备、修饰以及在生物医学领域的应用的相关文章、专利很多，此处不一一赘述。我们主要关心的是应用携带放射性核素的磁性纳米微粒，用于放射性药物的定位，从而提高放射性药物的靶向性、疗效，降低毒副作用。

国外主要是美国Cleveland Clinic Foundation的Urs O.Hfeli研究组，他们研究了磁性微球携带⁹⁰Y、^186/188Re、¹¹¹In、⁶⁷Ga、¹⁵³Sm等放射性核素(HfeliUO，Sweeney SM，Beresford BA，Humm JL，Macklis RM.Effective targeting ofmagnetic radioactive ⁹⁰Y-microspheres to tumor cells by an externally appliedmagnetic field.Preliminary in vitro and in vivo results.Nuclear Medicine andBiology-International Journal of Radiation Applications and InstrumentationPart B 1995，22：147-155；Hfeli UO，Pauer GJ，and Macklis RM.Treatment ofmouse tumors with radioactive magnetic microspheres：Model for intracavitaryradiotherapy.Proceedings International Symposium on Controlled Release ofBioactive Materials 1995，22：89-90；Hfeli UO，Pauer GJ，Roberts W K andHumm J L，Magnetically targeted microspheres for intracavitary and intraspinalY-90 radiotherapy Presented at International Conf.on Scientific and ClinicalApplications of Magnetic Carriers(Rostock，German)；Hfeli UO，Pauer GJ，Failing S，and Tapolsky G.Radiolabeling of magnetic particles with rhenium-188for cancer therapy.Journal of Magnetism and Magnetic Materials 2001，225：73-78；Hfeli UO，in：R.Arshady(Ed.)，2001，Radiolabeled and MagneticParticulates in Medicine and Biology，MML series Vol.3，Citus Books，London，Chapter 18；Yu JF，Hfeli UO，Dong Y，Sands MJ，Li YH，Failing S，Leakakos T，Tapolsky G.Radiolabeling of magnetic targeted carriers with several therapeuticand imaging radioisotopes.European Cells and Materials 2002，3 Suppl.2：16-18)，其使用的磁性微球有聚乳酸-磁铁矿微球、铁-碳合金微球(MTCs，由美国FeRx公司开发)。

目前，所有放射性核素标记的磁性微球还没有应用于人体。这是因为磁性微球与所有的微球载体一样，难以通过生物膜从而限制了它们的应用(Rusetskii et al.，1985；Gallo and Hassan，1988)。而正因为此，所有有关磁性微球的工作都是集中于介入疗法中运载高剂量的抗癌药物的载体。如美国FeRx公司开发用于肝癌治疗的MTC-DOX^已通过美国FDA的认证，在美国进行的I/II期临床试验即将完成。

磁性纳米微粒不同于磁性微球，其纳米尺寸可以使得微粒能够穿过组织间隙和毛细血管壁，因此可以通过静脉注射或者动脉注射的方法，将固载有放射性核素或者化疗药物的磁性纳米微粒，在外加磁场作用下快速导向到病灶。国内有山东大学的胡季帆及其同事研究了搭载放射性¹²⁵I-牛血清白蛋白的磁性纳米微粒(中国发明专利申请号为01114912.4)。但其是将¹²⁵I-BSA与纳米磁性材料(Fe₃O₄)和分散剂(如聚乙烯基吡咯烷酮)简单地超声混合，其稳定性尚有疑问。

肿瘤组织由于蛋白质合成速度加快，氨基酸的摄取速度也有所提高，因此标记氨基酸可以进行肿瘤显像或者治疗。L-组氨酸(L-Histidine)是人体的必需氨基酸，含有的咪唑基可以和fac-[¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)₃]⁺发生配体交换反应，形成稳定的配合物。氨噻肟乙酸[(Z)-2-methoxyimino-2-(2-aminothiazol-4-yl)-acetic acid]及其衍生物是重要的制备半合成头孢类抗生素的医药中间体，具有广谱抗菌作用，它们的噻唑基是含有N-和S-原子的杂环，有可能能够与fac-[¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)₃]⁺发生配体交换反应，形成稳定的配合物。如果用化学键方式将配基，如组氨酸等固载到磁性纳米微粒表面，就有可能更好地保证磁性纳米微粒固定的放射性核素在生理条件下的稳定。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述课题，提供一种磁性纳米放射性药物；本发明的另一目的是提供该磁性纳米放射性药物的制备方法。

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的：一种磁性纳米放射性药物的制备方法，其包括有以下步骤：

1)将磁性纳米微粒进行表面化学修饰；

2)固载配基；

3)对配基进行放射性核素标记。

其中，上述方法步骤1)中所说的表面化学修饰包括有磁性纳米微粒的硅胶包覆和硅烷偶联剂修饰两个过程。

所说的硅烷偶联剂可以为氨基或环氧基等硅烷偶联剂。

最佳的氨基硅烷偶联剂为N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷。

而该方法步骤1)中的磁性纳米微粒则一般选用磁学性质优良，在生理条件下化学性质稳定，生物相容性好，毒副作用小的Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃。

本发明的方法步骤2)中所说的配基可以是生物分子、氨基酸、药物或其中间体等。

所说的生物分子一般指蛋白质、单克隆抗体或多肽等。

所说的药物可以是化疗药物，如甲氨喋呤、阿霉素、柔红霉素等；抗生素或其中间体，如氨噻肟乙酸。

另外，上述方法步骤3)中所说的放射性核素可以是^188/186Re、⁹⁰Y、¹¹¹In或^125/131I等。

本发明方法步骤1)中的Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃磁性纳米微粒可购买获得；或如果考虑应用及成本需要，亦可自制。其中Fe₃O₄磁性纳米微粒的制备可采用部分还原沉淀法(Qu S，Yang H，Ren D，et al.Magnetite Nanoparticles Preparedby Precipitation from Partial Reduced Ferric Chloride Aqueous Solutions.JColloid Interface Sci，1999，215：190-192)：因为通常制备四氧化三铁纳米微粒是碱化沉淀Fe³⁺-Fe²⁺混合溶液，但Fe²⁺原料在空气和水溶液中很容易被氧气氧化成Fe³⁺，因此所得产物往往纯度和磁学性质差，部分还原沉淀法可以很好地解决这一问题。但上述文献中不使用惰性气体保护，FeCl₃与Na₂SO₃的摩尔比为3∶1，反应不易控制，产物纯度较低；而本发明的方法使用惰性气体保护，FeCl₃与Na₂SO₃的摩尔比调整至理论比即6∶1，并且反应完成后在60～80℃陈化约30min，能够大大提高磁性纳米微粒的磁学性能和纯度。其制备过程为：在FeCl₃水溶液中，惰性气体保护、搅拌下，滴加Na₂SO₃水溶液，将部分Fe³⁺还原成Fe²⁺；随后滴加碱性溶液。上述反应方程式为：

其中：

FeCl₃浓度为10^-3～1mol/L；

FeCl₃与Na₂SO₃的摩尔比为6∶1～3∶1；

惰性气体指的是氮气或者氩气或者是它们的混合气体；

碱性溶液指NaOH、KOH、氨水、NR₄ ⁺OH^-等的水溶液；

在本发明优选的方案中，FeCl₃浓度为10^-2mol/L，FeCl₃与Na₂SO₃的摩尔比为6∶1。

上述反应生成的四氧化三铁磁性纳米微粒用Nd-Fe-B永磁体分离，并用蒸馏水洗涤，最后分散在乙醇-水(其体积比为7∶3～9∶1)中以便后续修饰。所得的磁性纳米微粒粒径为7～27nm，平均粒径～15nm；经XRD分析为纯粹的反尖晶石磁铁矿结构。

本发明的具体制备过程为：

1)对上述磁性纳米微粒的表面进行修饰：

a)硅胶包覆：参照文献(WO 01/37721 A2)，在四氧化三铁磁性纳米微粒-乙醇-水分散体系中，搅拌下加入适量的四乙基正硅酸酯(TEOS)和氨水，室温至40℃水浴加热12～24小时。制得的硅胶包覆的磁性纳米微粒如前分离、洗涤，最后分散于甲醇/乙醇/DMF等有机溶剂中，以便进一步修饰。所得硅胶包裹的磁性纳米微粒粒径约20nm；经振动样品磁强计(VSM)分析，饱和磁矩为约61emu/g。

b)硅烷偶联剂修饰：参照文献(Kobayashi H and Matsunaga T.Amino-silane modified superparamagnetic particles with surface-immobilizedenzyme.Journal of Colloid and Interface Science，1991，141(2)：505-511)，在用有机溶剂分散的硅胶包覆的磁性纳米微粒体系中，加入适量的(氨基、环氧基等)硅烷偶联剂，室温至100℃反应2～24小时。反应完毕，用相应的有机溶剂-水洗涤，逐渐转为水洗涤。最后分散在适当的缓冲溶液(如pH7.4的PBS)中保存备用。以氨基硅烷偶联剂N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(采用南京曙光化工总厂产品，商品名SG-Si900)为例，修饰过程如下列反应式所示：

2)固载(immobilization)：

参考文献(蒋中华、张津辉主编，生物分子固定化技术及应用，化学工业出版社，1998.7第一版，北京)，根据所需要固载的配基，选择合适的修饰好的磁性纳米微粒和固载条件。以蛋白质为代表，可选择氨基磁性纳米微粒(即氨基硅烷偶联剂修饰的磁性纳米微粒)，中性条件下，以戊二醛为交联剂，通过Michael加成反应，就可以将蛋白质固载到磁性纳米微粒表面。

3)放射性核素标记(radionuclide labeling)：参考文献(李永键、孙祺薰主编，放射性药物与标记化合物，科学出版社，1996.2第一版，北京)，与普通的蛋白质、多肽等生物分子的放射性标记没有差别，只是分离纯化时可以采用外加磁场(Nd-Fe-B永磁体)。

由上述公开的技术方案可见，本发明在步骤1)，可自制获得平均粒径为15nm的四氧化三铁磁性纳米微粒，或购得Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃磁性纳米微粒；将其用TEOS碱性水解进行硅胶包覆，再用硅烷偶联剂与磁性纳米微粒的硅醇基反应而进行了表面化学修饰，使表面有有机活性官能团；在步骤2)，根据配基可以选择合适的磁性纳米微粒和固载条件，将配基固载到磁性纳米微粒表面；最后，在步骤3)，可以按照以往标记蛋白质、多肽等的方法，对固载了配基的磁性纳米微粒进行放射性核素的标记。

本发明首次将放射性核素¹⁸⁸Re通过化学键固定到磁性纳米微粒表面。首先由¹⁸⁸Re-ReO₄ ^-合成放射性前驱物fac-[¹⁸⁸Re(CO)₃(H₂O)₃]⁺，然后水分子配体与固载到磁性纳米微粒表面的配基，如组氨酸的咪唑基进行配体交换，从而固定到磁性纳米微粒表面上。由于羰基配合物的动力学惰性，这种¹⁸⁸Re(I)化学非常的稳定，如果用化学键方式将配基，如组氨酸固载到磁性纳米微粒表面，就可更好地保证磁性纳米微粒固定的放射性核素在生理条件下的稳定。由本发明的方法制备的磁性纳米放射性药物，其72小时放射性保留率一般可达80％以上。

本发明将磁性纳米微粒的纳米特性、磁学性质和放射性核素的治疗特性相结合，使用外加磁场，可将放射性药物快速在病灶部位浓聚，从而提高疗效，降低杀伤正常组织细胞等毒副作用。

附图说明

图1(1)为HITACHI-600型透射电子显微镜(TEM)测得Fe₃O₄磁性纳米微粒的的照片；图1(2)为硅胶包覆的磁性纳米微粒TEM照片。

图2为D/max 2250型X-射线衍射仪在室温下用Cu靶Kα线(λ＝1.5418)为X-射线光源测得的硅胶包覆的磁性纳米微粒的X-射线粉末多晶衍射(XRD)图样。

图3为硅胶包覆的磁性纳米微粒的LEO 1530VP扫描电子显微镜(SEM)照片。

图4为硅胶包覆的磁性纳米微粒用EG&G Princeton Research 155型振动样品磁强计(VSM)测量的磁滞迥线。

图5为¹⁸⁸Re标记固载有组氨酸和氨噻肟乙酸的磁性纳米微粒的体外稳定性(小牛血清中，37℃)曲线图，其中MN-His为固载组氨酸的磁性纳米微粒；MN-(1)为固载氨噻肟乙酸的磁性纳米微粒。

图6为¹⁸⁸Re标记固载有BSA的磁性纳米微粒的体外稳定性(小牛血清中，37℃)曲线图，其中MN-BSA为固载BSA的磁性纳米微粒。

具体实施方式

以下将通过实施例对本发明具体实施方式作进一步说明，但实施例并不限制本发明的保护范围。实施例中所用试剂，2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)和BH₃·NH₃购自Fluka，SG-Si900购自南京曙光化工总厂，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)购自ACROS，N，N′-羰基二咪唑(CDI)购自吉尔生化(上海)有限公司，其余购自上海化学试剂公司，除L-组氨酸和25％戊二醛为生化试剂外其余均为分析纯。Nd-Fe-B永磁体购自上海跃龙有色金属有限公司，表面磁场强度为1Tesla。新鲜、无载体的¹⁸⁸Re-ReO₄ ^-从¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器(上海科兴药业有限公司生产，其¹⁸⁸W母体由橡树岭实验室(ORNL)提供)用生理盐水淋洗而得。

实施例1

步骤1四氧化三铁磁性纳米微粒的制备：首先取2mol/L FeCl₃溶液12.0ml(预先用2mol/L盐酸配制)到500-ml三颈圆底烧瓶中，并加约100ml重蒸水稀释；通氮气、搅拌下，缓慢滴加新鲜配制的0.08mol/L Na₂SO₃溶液50ml，可观察到溶液颜色从黄色逐渐转变为橙红色，直至转变为橙黄色为止；60～80℃水浴加热、通氮气、激烈搅拌下，缓慢滴加稀氨水(V_28％氨水/V_{重 蒸水}＝1∶9)至pH至8～10，生成大量黑色沉淀；继续保持约70℃水浴15～30min；停止加热后冷却至45℃以下，用磁铁分离出黑色沉淀，并用重蒸水洗涤至中性。所得Fe₃O₄磁性纳米微粒的TEM照片如图1(1)所示，其粒径7～27nm。

步骤2硅胶包覆四氧化三铁磁性纳米微粒：将上述所得四氧化三铁磁性纳米微粒分散于100ml乙醇-水(体积比为7∶3)中，40℃水浴、缓慢搅拌下，加入5ml TEOS和5ml稀氨水(V_28％氨水/V_重蒸水＝1∶9)，继续反应12小时以上，其间每隔约4小时超声一次，每次约5min。反应完毕，用磁铁分离出黑色沉淀，并用乙醇和水反复洗涤，以除去过量的TEOS和未结合在磁性纳米微粒表面的硅胶。所得硅胶包覆的四氧化三铁磁性纳米微粒TEM照片如图1(2)所示，其形貌与Fe₃O₄磁性纳米微粒相似，粒径约20nm；其XRD图样如图2所示，与国际衍射数据中心标准X射线衍射数据卡片(JCPDS卡片No.19-0629)相比较，证实核心为反尖晶石磁铁矿结构；其SEM表征，结果如图3所示，微粒基本呈圆球形，粒径～20nm；其磁滞迴线如图4所示，得饱和磁矩σ_S＝60.9emu/g，矫顽力H_C＝22Oe。

步骤3硅烷偶联剂修饰：将上述所得硅胶包覆的磁性纳米微粒分散在100ml甲醇中，确保体系含水在1～4％(重量百分比)；加入5ml SG-Si900，超声约5min混匀，水浴60℃、搅拌下反应12小时以上。反应完毕后，用磁铁分离出磁性纳米微粒，用甲醇洗涤数遍除去过量的硅烷偶联剂，然后用重蒸水洗涤，最后分散在重蒸水或者0.1mol/L PBS(pH7.4)中保存备用。

步骤4组氨酸的固载：取1ml SG-Si900修饰的磁性纳米微粒(固含量＞20mg/ml)，磁场分离，弃去上清夜，用0.1mol/L的PBS(pH7.4)洗涤1～2次；加入2.5％戊二醛溶液(25％戊二醛水溶液用0.1mol/L、pH7.4的PBS稀释而得)1ml，超声混匀，4℃～40℃反应2～24小时；反应完毕，磁场分离，用0.1mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次，然后加入1ml新鲜配制的0.2mol/L的L-组氨酸溶液(用pH7.0，0.1mol/L的PBS；0.15mol/L的NaCl；0.005mol/L的EDTA溶液配制)，超声混匀，室温反应24小时，完毕后用0.1mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次；再加入1ml含0.5mg/ml NaBH₄的0.1mol/L Na₂B₄O₇(pH9.2)，混匀，4℃反应30min以消除过剩的醛基和双键。最后用0.1mol/L PBS(pH7.4)洗涤3次，并且分散在1ml 0.5mol/L MES(pH6.6)缓冲溶液中。上述反应方程式如下：

步骤5 ¹⁸⁸Re标记固载了组氨酸的磁性纳米微粒：我们以fac-[¹⁸⁸Re(H₂O)₃(CO)₃]⁺为放射性标记前体，利用组氨酸的咪唑基与Re(I)配位中心的络合反应(与H₂O发生配体交换)，从而将¹⁸⁸Re标记到磁性纳米微粒表面。称取5mg NH₃·BH₃到10ml干燥洁净安瓿中，加橡皮塞和铝盖，密封，通高纯CO气体约15分钟；用注射器加入6μl 85％H₃PO₄和1ml新鲜生理盐水淋洗的¹⁸⁸Re-ReO₄ ^-(从¹⁸⁸W/¹⁸⁸Re发生器淋洗而得)的混合溶液，60～80℃水浴反应约20min，得到fac-[¹⁸⁸Re(H₂O)₃(CO)₃]⁺放射性标记前体，不必分离纯化，可直接用于标记磁性纳米微粒。在含标记前体的溶液中，加入等体积的0.5mol/L的MES(pH6.6)缓冲溶液分散的固载了组氨酸的磁性纳米微粒(固含量＞20mg/ml)，60～80℃水浴反应约30～50min。在优化条件下(pH6.6 0.5mol/L MES；反应温度70℃；反应时间40min)，我们获得91.4±0.3％的较高标记率(前体的标记率为85.7±6.1％)，标记好的磁性纳米微粒在小牛血清中、37℃、3天内有良好的稳定性，如图5所示，其24小时放射性保留率为89.3±0.3％；48小时放射性保留率为86.5±0.3％；72小时放射性保留率为81.6±2.2％。

实施例2

步骤1、2、3同实施例1。

步骤4氨噻肟乙酸的固定：1ml SG-Si900修饰的磁性纳米微粒(固含量＞20mg/ml)，磁场分离后，用0.1mol/L的PBS(pH7.4)洗涤，然后超声分散在1ml含有0.2mol/L氨噻肟乙酸的0.1mol/L的MES(pH6.3)缓冲溶液中，加入500mg EDC活化氨噻肟乙酸的羧基以启动反应，室温反应12小时以上，完毕后用0.1mol/L PBS(pH7.4)洗涤，最后分散在1ml pH约6.6的0.5mol/LMES缓冲溶液中，用于下一步的¹⁸⁸Re标记。上述反应方程式如下：

步骤5 ¹⁸⁸Re标记固载了氨噻肟乙酸的磁性纳米微粒：同样以fac-[¹⁸⁸Re(H₂O)₃(CO)₃]⁺为放射性标记前体，利用氨噻肟乙酸的噻唑基与Re(I)配位中心的络合反应(与H₂O发生配体交换)，从而将¹⁸⁸Re标记到磁性纳米微粒表面。方法与实施例1中的步骤5相同，其标记率为78.4±1.4％，稳定性如图5所示：其24小时放射性保留率为77.2±1.2％；48小时放射性保留率为73.5±3.5％；72小时放射性保留率为72.1±4.7％。

实施例3

采用自制固载有牛血清白蛋白(BSA)的磁性纳米微粒，利用经典的Sn(II)还原法，在磁性纳米微粒表面标记了¹⁸⁸Re。

步骤1、2同实施例1。

步骤3硅烷偶联剂修饰：首先合成半琥珀酸化N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，4.5mmol N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷和4.5mmol琥珀酸酐(即丁二酸酐)溶于1ml无水DMF中，滴加350μl二异丙基胺，氩气保护，室温搅拌反应24小时。在20ml无水DMF中，加入约500mg半琥珀酸化N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷和50mg硅胶包覆的Fe₃O₄磁性纳米微粒，室温搅拌反应24小时，用DMF洗涤然后干燥，得到表面含有末端羧基的磁性纳米微粒。上述反应过程如下：

步骤4牛血清白蛋白(BSA)的固载：首先用CDI活化磁性纳米微粒表面的羧基，形成活化的酰基咪唑中间体，当含伯氨基的BSA存在时，咪唑基被取代，载体与BSA配基之间形成稳定的酰胺键。50mg半琥珀酸化N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷修饰的磁性纳米微粒分散于1ml无水丙酮中，加入100mg CDI室温摇振反应1小时进行活化，然后离心或磁场分离，用无水丙酮洗涤数遍，再用冰冷的蒸馏水完成2次快速洗涤，立即加入1ml含有20mg/ml BSA的0.1mol/L pH8.5碳酸钠缓冲溶液并分散均匀，4℃振摇反应24小时以上，用0.1mol/L pH8.5碳酸钠缓冲溶液洗涤，以除去游离的BSA，最后分散在1ml 0.1mol/L pH7.4 PBS中，4℃保存。上述反应过程如下：

步骤5¹⁸⁸Re直标固载BSA的磁性纳米微粒：在新鲜配制的10ml的0.1mol/L柠檬酸溶液中通N₂(g)15min，然后加入80mg的SnCl₂·2H₂O和80mg维生素C(Vc)溶解，继续通N₂(g)保存备标记用。通常地，标记过程如下：25mg固载BSA的磁性纳米微粒(MN-BSA)与500μl溶解有SnCl₂和Vc的柠檬酸溶液相混合，然后加入25μl新鲜淋洗的¹⁸⁸Re-ReO₄ ^-(约1mCi)，沸水浴反应30min，磁场或离心分离，用生理盐水洗涤除去游离的¹⁸⁸Re-ReO₄ ^-，最后重新分散在500μl的0.1mol/L、pH7.4的PBS中。在优化条件下，标记率可达92％，标记好的磁性纳米微粒在小牛血清中、37℃、3天内有良好的稳定性，如图6所示：其24小时放射性保留率为100.1±0.3％；48小时放射性保留率为95.9±1.5％；72小时放射性保留率为81.0±8.1％。

当然，上述各实施例中的磁性纳米微粒还可选用γ-Fe₂O₃，可直接购买得到修饰的或未修饰的磁性纳米微粒(如德国Micromod Partikeltechnologie公司的nanomag-D)；固载的配基还可为其它的蛋白质、单克隆抗体、多肽等生物分子，氨基酸，以及化疗、抗生素等药物或其中间体；放射性核素还可选用⁹⁰Y、¹¹¹In或^125/131/123I等，在此不一一赘述。

Claims (12)

1、一种磁性纳米放射性药物的制备方法，其包括有以下步骤：

1)将磁性纳米微粒进行表面化学修饰；

2)固载配基；

3)对配基进行放射性核素标记。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法步骤1)中所说的表面化学修饰包括有磁性纳米微粒的硅胶包覆和硅烷偶联剂修饰两个过程。

3、如权利要求2所述的方法，其特征在于该硅烷偶联剂为氨基或环氧基硅烷偶联剂。

4、如权利要求3所述的方法，其特征在于该氨基硅烷偶联剂为N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法步骤1)中的磁性纳米微粒为Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于该Fe₃O₄磁性纳米微粒的制备过程中有惰性气体保护。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于该惰性气体为氮气或者氩气或者是它们的混合气体。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法步骤2)中所说的配基为生物分子、氨基酸、药物或其中间体。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于该生物分子为蛋白质、单克隆抗体或多肽。

10、如权利要求8所述的方法，其特征在于该药物是指化疗药物、抗生素。

11、如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法步骤3)中所说的放射性核素为^188/186Re、⁹⁰Y、¹¹¹In或^125/131/123I等。

12、如权利要求1-11任一权利要求所述的方法制备的磁性纳米放射性药物。

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