CN1634537A - 一种灵芝提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝提取物及其制备方法和用途。该灵芝提取物可由下述方法制备获得：以灵芝破壁孢子粉为原料，采用石油醚脱脂，挥发至无醚味；将获得的粉状物用乙醇回流提取，提取液浓缩至浸膏状。进一步，可以将获得的浸膏状物制成粉状，用氯仿提取后的固体物，再用醋酸乙酯提取，该提取液经减压回收、干燥，获得粉末状的灵芝提取物。该提取物能有效诱导神经细胞分化，可用于制备治疗神经损伤及神经退行性病变的药物。

Description

一种灵芝提取物及其制备方法和用途

                            技术领域

本发明涉及一种灵芝提取物，具体涉及一种灵芝孢子粉的脂溶性提取物，本发明还涉及所述提取物的制备方法及其在制备药物方面的应用。

                            背景技术

灵芝为担子菌类多孔菌科灵芝属植物，其生长过程包括子实体、菌丝体和孢子粉三个阶段。灵芝自古以来就被认为是一种有效的滋补强壮药，其应用最多的是灵芝的子实体，研究表明，灵芝的主要化学成分有多糖类、核苷类、三萜酸类、甾醇、生物碱类及氨基酸等，其在镇静、强心、抗衰老、提高机体的耐缺氧能力和抗疲劳、以及抗肿瘤等诸多方面有着广泛的作用。因而被用于制备各种药品、食品、饮料和美容保健品。

上述灵芝的各种应用，主要采用灵芝的子实体，包括其水溶性及脂溶性提取物，也有报道采用灵芝菌丝体、孢子粉或其水溶性提取物的，由于灵芝在不同阶段其各种物质的含量有较大差异，对灵芝孢子粉用适当的方式提取，可能起到意想不到的作用。

随着现代社会的发展，人口老龄化、交通事故的增加，以及战争、自然灾害等因素的影响，使得神经损伤性疾病、神经退行性疾病的发生率呈上升趋势。神经退行性病变是导致早衰的重要原因之一，如老年痴呆症是老年人多发的慢性进行性退化性疾病，在全球约有超过2000万人患有该病，其治疗是一个待攻克的世界性难题；帕金森病是一种常见的神经功能障碍疾病，主要影响中老年人，目前欧美国家50岁以上人群的帕金森病患病率为1％；享廷顿舞蹈病是由变异基因引起的遗传性疾病，这种病会逐步损耗患者的脑神经细胞。神经损伤性疾病包括外周和中枢神经损伤，缺血性中风引起的神经细胞坏死，运动神经元疾病，癫痫等。这些疾病目前尚无非常有效的治疗药物。

经过多年研究发现，神经营养因子类物质如神经生长因子，作为体内重要的神经营养分子，能促进神经干细胞的增殖，诱导神经干细胞的分化，对损伤神经具有较强的修复作用，也为治疗神经退行性病变提供了一个新的研究领域。然而，这类神经营养因子若取自动物机体则价格昂贵，若为基因工程产物则其临床疗效仍有争议。

所以，寻找天然的保护和促进神经生长的物质乃是神经科学、中医药学中的一个热点。

                            发明内容

本发明目的是提供一种灵芝的脂溶性提取物；

本发明的另一个目的是提供这种灵芝提取物的制备方法；

本发明的再一个目的是提供这种灵芝提取物在制备药物方面的应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种灵芝提取物，该灵芝提取物可由下述方法制备获得：以灵芝破壁孢子粉为原料，采用石油醚脱脂，挥发至无醚味；将获得的粉状物用乙醇回流提取，提取液浓缩至浸膏状，即获得灵芝提取物。

进一步的技术方案，可以将获得的浸膏状物制成粉状，用氯仿提取后的固体物，再用醋酸乙酯提取，该提取液经减压回收、干燥，获得粉末状的灵芝提取物。在此获得的灵芝提取物与上一步获得的提取物其有效成份是相同的，但由于作了进一步提取，有效成份的含量较高，且其形态更有利于在制备药物中应用。

上述技术方案中，所述将获得的浸膏状物制成粉末的方法是，在所述浸膏状物内拌入硅藻土，硅藻土与浸膏状物的比例不低于0.5∶1，再减压挥干至无醇味。

另一种所述将获得的浸膏状物制成粉末的方法是，将所述浸膏状物干燥后研磨，获得粉状物。

为实现本发明的另一个目的，提供了一种灵芝提取物的制备方法，依次包括下列步骤：

(1)以灵芝破壁孢子粉为原料，先以石油醚回流脱脂1-2次，每次不少于5分钟，脱脂后的孢子粉挥至无醚味；

(2)用不小于5倍量的乙醇回流提取1-3次，每次不少于5分钟，提取液合并，回收乙醇至浸膏状，即获得灵芝提取物。

上述技术方案中，所述乙醇可以是50.0％-99.9％的乙醇，通常，采用95％的乙醇提取，每次提取时间以半小时为佳；所述石油醚回流脱脂的时间以半小时为佳。

进一步的技术方案，将获得的提取物再进行如下处理：

(1)按硅藻土与浸膏状物不低于0.5∶1的比例拌入硅藻土，减压挥干至无醇味；

(2)用不低于5倍浸膏量的氯仿超声提取；再用不低于5倍浸膏量的醋酸乙酯超声提取1-3次，醋酸乙酯提取液减压回收溶剂至干，即得灵芝提取物的粉末。

上述技术方案中，所述减压挥干的温度以不高于60℃为宜。

也可以是，将获得的提取物再进行如下处理：

(1)将浸膏状物干燥后研磨，获得粉状物；

(2)用不低于5倍浸膏量的氯仿提取；再用不低于5倍浸膏量的醋酸乙酯提取1-3次，醋酸乙酯提取液减压回收溶剂至干，即得灵芝提取物的粉末。

本发明同时提供了上述灵芝提取物在制备治疗神经损伤性疾病的药物中的应用。

以及上述灵芝提取物在制备治疗神经退行性病变的药物中的应用。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明获得的灵芝提取物，经对比实验证明，能有效诱导神经细胞分化，同时，与低浓度的神经生长因子合用时，对细胞的分化有明显的促进作用，因而可以替代神经生长因子，或者与小剂量的神经生长因子配合，用于制备治疗神经损伤及神经退行性病变的药物；

2.本发明的原料为灵芝孢子粉，属天然原料，与神经生长因子相比，成本低，也不会有基因工程产品可能造成的不良影响；

3.本发明的制备工艺简单，可以有效提取灵芝孢子粉中的灵芝三萜类活性成份。

                          附图说明

附图1为本发明实施例一的验证例1中空白对照组、灵芝高剂量组和阳性对照组在第3天、第5天、第7天时的形态对比图(放大200倍)；

附图2为本发明实施例一的验证例2中经5天培养后各组的形态对比图(放大200倍)；

附图3为本发明实施例二中经过3天培养后各组的形态对比图(放大200倍)。

                           具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，实施例仅用于说明本发明，对本发明的保护范围没有限制：

实施例一：

灵芝提取物的制备：

以灵芝破壁孢子粉为原料，先以石油醚(60-90℃)回流脱脂2次，每次30分钟，脱脂后的孢子粉挥至无醚味；再用10倍量95％的乙醇回流提取3次，每次半小时，提取液合并，回收乙醇至浸膏状，即获得灵芝提取物。

对细胞分化的影响试验：

对比物质神经生长因子(NGF)是机体重要的神经营养因子之一，它能促进中枢及外周神经系统的发育与分化，维持神经系统的正常功能，加快神经系统损伤后的修复。目前的研究表面，中枢胆碱能神经元和某些运动神经元在损伤(缺氧、神经毒、病毒感染、机械损伤)时，NGF可以提供保护、减轻伤害的程度，并且促进相应神经纤维的再生和功能修复。

PC12细胞是目前广泛用来研究神经细胞功能、分化和凋亡的一种细胞模型。PC12细胞系即嗜铬细胞瘤细胞株，在体外诱导分化后具有神经细胞的特征。NGF通过激活酪氨酸激酶相关的受体TrkA完成信号传导，抑制PC12细胞增殖、促进分化，诱导细胞长出大量突起，表达神经细胞特征性蛋白，已被人们作为判断该细胞株向神经细胞分化的指标之一。

PC12细胞接种于DMEM培养液中(含10％马血清，5％胎牛血清，100M/ml青霉素，100mg/ml链霉素)，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80％汇合后，传代培养。将PC12细胞接种到24孔培养板中，细胞密度为2×10⁴/cm²，接种前24孔板用0.1％多聚赖氨酸铺板。在做细胞突起伸长分析时，光镜下，每个孔随机选择3或4个视野，统计长度超过一倍细胞直径的细胞突起，每个孔统计100个细胞，每个数据点至少重复3次。

验证例1：

采用本实施例获得的灵芝提取物，与NGF(购于Sigma公司)进行对比试验，分成5组，分别为灵芝高剂量组(500μg/ml)、灵芝中剂量组(250μg/ml)、灵芝低剂量组(125μg/ml)、阳性对照组(NGF 10ng/ml)、空白对照组(加入等量的基础培养基)。3天换液一次且维持培养基药物浓度，实验重复3次，第3天、第5天、第7天时观察细胞分化的形态改变。

附图1分别为空白对照组、灵芝高剂量组和阳性对照组在第3天、第5天、第7天时的形态对比图(放大200倍)，其中左列为空白对照组，中间列为灵芝高剂量组，右列为阳性对照组(NGF)。

表1给出了各组在第7天时的细胞分化率情况。

从附图1和表1可见，灵芝提取物对PC12细胞分化具有明显的作用。

         表1灵芝对PC12细胞分化的影响

组别	浓度(μg/ml)	细胞分化率(％)
			空白对照组	0	3.11±1.05
阳性对照组(NGF)	0.01	79.67±4.36**
			灵芝提取物	500	51.67±5.05**
250	37±3.08**
		125		23.44±4.3**

注：与空白对照组相比**P＜0.01

验证例2：

将1ng/ml NGF与灵芝提取物混合培养，结果发现突起伸长的细胞比例和单个细胞突起总长度都显著增加。这表明，在低浓度NGF存在下，该提取物对NGF诱导PC12细胞分化有明显的增强作用。

附图2是经过5天培养后各组的形态对比图(放大200倍)。其中，A是空白对照组，B中加入了1ng/ml的NGF，C中加入了500μg/ml的灵芝提取物，D中同时加入了1ng/ml的NGF和500μg/ml的灵芝提取物。

表2给出了各组的细胞分化率情况。

    表2灵芝在小剂量NGF作用下对PC12细胞分化的影响

组别	细胞分化率(％)
		空白对照组	3.15±0.93
NGF(1ng/ml)	4.63±1.06*
		灵芝提取物(500μg/ml)	30.75±5.42**
灵芝提取物(500μg/ml)+NGF(1ng/ml)	46.75±2.55**

注：与空白对照组相比*P＜0.05，**P＜0.01。

实施例二：

灵芝提取物的制备：

以灵芝破壁孢子粉为原料，先以石油醚(60-90℃)回流脱脂2次，每次30分钟，脱脂后的孢子粉挥至无醚味；再用10倍量95％的乙醇回流提取3次，每次半小时，提取液合并，回收乙醇至浸膏状；按硅藻土与浸膏状物1∶1的比例拌入硅藻土，60℃减压挥干至无醇味；用氯仿5倍量超声提取3次，并回收氯仿；用5倍量醋酸乙酯超声提取3次，合并提取液，减压回收溶剂至干，即得灵芝提取物的粉末。

将本实施例获得的灵芝提取物与NGF进行对比试验。

附图3是经过3天培养后各组的形态对比图(放大200倍)。其中，A是空白对照组；B中加入了10ng/ml的NGF；C和D中加入了500ug/ml的本

实施例的灵芝提取物。

表3则是本实施例的灵芝提取物与对比试验的细胞分化率情况表。

从附图3和表3可以看出，本实施例的灵芝提取物可以明显诱导PC12细胞的分化。

   表3灵芝提取物粉末对PC12细胞分化的影响

组别	浓度(μg/ml)	细胞分化率(％)
			空白对照组	-	1.89±0.78
NGF	0.01	40.22±5.70**
			灵芝提取物粉末	500	31.89±4.59**

注：与空白对照组相比(compared with control group)**P＜0.01

Claims (9)

1.一种灵芝提取物，该灵芝提取物可由下述方法制备获得：以灵芝破壁孢子粉为原料，采用石油醚脱脂，挥发至无醚味；将获得的粉状物用乙醇回流提取，提取液浓缩至浸膏状，即获得灵芝提取物。

2.根据权利要求1所述的灵芝提取物，其特征在于：将获得的浸膏状物制成粉状，用氯仿提取后的固体物，再用醋酸乙酯提取，该提取液经减压回收、干燥，获得粉末状的灵芝提取物。

3.根据权利要求2所述的灵芝提取物，其特征在于：所述将获得的浸膏状物制成粉末的方法是，在所述浸膏状物内拌入硅藻土，硅藻土与浸膏状物的比例不低于0.5∶1，再减压挥干至无醇味。

4.根据权利要求2所述的灵芝提取物，其特征在于：所述将获得的浸膏状物制成粉末的方法是，将所述浸膏状物干燥后研磨，获得粉状物。

5.一种灵芝提取物的制备方法，依次包括下列步骤：

(1)以灵芝破壁孢子粉为原料，先以石油醚回流脱脂1-2次，每次不少于5分钟，脱脂后的孢子粉挥至无醚味；

(2)用不小于5倍量的乙醇回流提取1-3次，每次不少于5分钟，提取液合并，回收乙醇至浸膏状，即获得灵芝提取物。

6.根据权利要求5所述的灵芝提取物的制备方法，其特征在于，将获得的提取物再进行如下处理：

(1)按硅藻土与浸膏状物不低于0.5∶1的比例拌入硅藻土，减压挥干至无醇味；

(2)用不低于5倍浸膏量的氯仿超声提取；再用不低于5倍浸膏量的醋酸乙酯超声提取1-3次，醋酸乙酯提取液减压回收溶剂至干，即得灵芝提取物的粉末。

7.根据权利要求5所述的灵芝提取物的制备方法，其特征在于，将获得的提取物再进行如下处理：

(1)将浸膏状物干燥后研磨，获得粉状物；

(2)用不低于5倍浸膏量的氯仿提取；再用不低于5倍浸膏量的醋酸乙酯提取1-3次，醋酸乙酯提取液减压回收溶剂至干，即得灵芝提取物的粉末。

8.权利要求1或2所述的灵芝提取物在制备治疗神经损伤性疾病的药物中的应用。

9.权利要求1或2所述的灵芝提取物在制备治疗神经退行性病变的药物中的应用。

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