CN1630727A

CN1630727A - 用于克隆载体的核酸

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Publication number: CN1630727A
Application number: CNA028214145A
Authority: CN
Inventors: 莱茵哈德·哈牙蒙
Original assignee: GENE ARTISTS AG
Current assignee: GENE ARTISTS AG
Priority date: 2001-09-16
Filing date: 2002-09-16
Publication date: 2005-06-22
Anticipated expiration: 2022-09-16
Also published as: PL370694A1; DE50212518D1; DE10145553B4; DE10145553A1; EP1427822B1; CA2460505A1; WO2003025169A3; ATE401399T1; CN1316029C; JP2005503160A; US20040241852A1; EP1427822A2; KR20040033051A; WO2003025169A2

Abstract

本发明涉及能够形成克隆载体的一部分或者设计用来插入克隆载体的一段核酸。所述核酸包含至少一个克隆和/或表达所需的功能核苷酸序列，并与至少一个识别II型限制性内切酶(REII)的序列相偶联，以使有关的REII切割位点位于所述功能核苷酸序列之内。本发明还涉及一种使用所述核酸的方法。

Description

用于克隆载体的核酸

本发明涉及克隆载体上的或者适于插入克隆载体的核酸，核酸至少含有一段克隆和/或表达所需要的功能序列。

克隆载体的特征是在载体的一段对载体增殖和宿主细胞生存均不重要的区域里含有一个限制性内切酶的单一切点。现有技术中，具有这些性质的原始克隆载体如质粒pBR322、pAT153等，几乎完全被含有连续排列的多重限制性内切酶切点的载体所替代，这种连续排列的切点被称为多克隆位点或多接头。这些多克隆位点/多接头经常被构建在多功能序列单元中，其中单元中还含有其它的功能序列，如RNA聚合酶的启动子序列，用于实现克隆的目标DNA片段(即插入载体的DNA片段)的转录；终止序列和多聚腺苷酸化信号或序列，其能够促进克隆的目标DNA片段表达的蛋白质的纯化。

通常用于克隆的II型限制性内切酶(此后简称为REII)具有如下性质：特异的DNA识别序列(通常为4到8个碱基对)同时也是其特异性的切割位点，而且这一识别序列相对于中心点对称，通常是一个回文结构，即，从两条链上读去时，从两个方向读出相同的序列，这就导致了分别切割不同的DNA序列时，独立与DNA源，产生相同的适配末端。

REII的典型代表是EcoRI，其识别序列在两条链上均为6碱基序列^5’GAATTC^3’(回文结构)，切割点是双链DNA每条链的沿5’到3’方向的G之后A之前：

当拼接同为EcoRI切开的克隆载体(大写字母)与待克隆的目标DNA片段(小写字母)时，该酶的识别序列暨切割位点会再生，尤其是分别在目标DNA片段的两端。

显然不仅对EcoRI如此，对所有的具有回文识别序列和切割位点的REII都是如此。

当要把几个具有相同末端的目的DNA片段按指定顺序克隆入载体时，REII就显出了缺点。由于克隆进第一个目的DNA片段后，REII的识别序列和切割位点再生了两次，即在DNA片段的两端都再生了，而在后续切割中，就不可能特异地切开两个切点中的某一个以插入第二个目标DNA片段。在这种情况下，本领域的技术人员通常会尝试进行部分酶切。但是，这种方法会产生不希望的切割产物，进而产生不希望的克隆产物。

基于REII的传统克隆方法的原理如“图1”所示，其中灰色阴影代表不希望的克隆产物。

从图1的示意图中可以看到，考虑到时间和投入的话，即便是克隆进第二个目标DNA片段时，寻找期望的正确克隆的产物都是效率低下的。当有3个、4个、甚至更多个目标DNA片段需要插入的话，即使本领域的技术人员使用一些诸如重叠PCR、双酶切等方法进行辅助，传统方法实际上仍是不可行的。

现有技术中另有一组使用较少的限制性内切酶，是IIs型限制性内切酶(此后简称REIIs)。这类限制性内切酶与REII的区别有两点：其一是识别序列(一般为4到8碱基对)通常不对称，因而也即不是回文结构；其二是其切割点和识别序列不一定相同，但通常切割点位于识别序列的一定距离之外。以下是几种可能的切割点位置和类型。

a)DNA的两条链均在识别序列外一定的碱基距离处被切割(“外部切割酶”)

现有技术中“外部切割酶”的典型例子是REIIs AarI。其识别序列为7碱基序列：在DNA的一条链上为^5’CACCTGC³’，在互补链上为^5’GCAGGTG^3’。切割点位于沿5’到3’方向识别序列^5’CACCTGC^3’之后的第四个和第五个碱基之间；另一条链上的切割点位于沿5’到3’方向识别序列^5’GCAGGTG^3’之前的第八个和第九个碱基之间。

b)切割在一条链上识别序列之外一定碱基距离处进行；另一方面，切割在识别序列内某一特定位置进行。(“部分外部切割酶”)

现有技术中这样的例子是REIIs BseNI

c)两条链上都在识别序列之内的特定位点被切割。

现有技术中这样的例子是REIIs BssSI

另有一组尽管不属于REIIs，却与REIIs有相似的性质的限制性内切酶，特别是，称为“自引导核酸酶(homing nucleases)”。它们与REIIs的最显著区别(通常是实质性)是较长的识别序列，一般为8到20个碱基对。

现有技术中已知“自引导核酸酶”的典型例子是I-HmuII酶(“外部缺刻酶”)，其识别序列为24个碱基。

AGTAATGAGCCTAACGCTCAACAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

TCATTACACGGATTGCGAGAAGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN N

N

由于“外部缺刻酶”通常只在切割位点处切断一条链，通过组合使用至少两个这样的酶，可以产生一个新的有用的切点以裂解两条核酸链。

当用“外部切割酶”或“外部缺刻酶”切割一段DNA时，所得到的DNA片断中有一段保留了完整的该酶的识别序列(而在类似情况下使用REII切割时，识别位点就破坏了)，而且切割产生的两个末端与其他DNA片段用同一个酶切割产生的末端通常是不匹配的，所以只能直接与自身的末端重新连接(直接互补)。正是因为如此，这些“外部切割酶”/“外部缺刻酶”不适用于“传统”的克隆，在其他领域至今也罕有应用。

这种“外部切割酶”的不多的几个应用实例在“Fermentas AB(Vilnius，Lithuania)公司2000/2001目录中196/197页有记载。“外部切割酶”被用来切除PCR引物序列以得到适合定向克隆进传统载体的末端。现有技术中已有的用REIIs进行核酸分子引导合成的方法有几个缺点。很多方法都需要进一步的复杂的酶促反应，例如用聚合酶补平，用核酸酶对核酸中特定区域进行切割或修复，或用本领域技术人员熟悉的一些修饰酶对核酸进行修饰，例如用磷酸酶。此外，用已知方法通常不可能将多个核酸片段以定向的方式连接在一起。

本发明的目的之一是为克隆和/或表达提供一个有用的功能序列区，当用REIIs拼接多个DNA片断时没有前述的缺点，同时避免了REIIs的非特异性切割。进一步的目的是提供一种不需复杂酶促反应的核酸合成方法。

作为实现这些目标的一个解决方案，我们提供了一段核酸，位于克隆载体上或适于插入克隆载体的核酸上，其中核酸含有至少一段克隆和/或表达所需的功能核苷酸序列，其特征在于这一功能序列与至少一个REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列相偶联，偶联使REIIs或“自引导核酸酶”的切割位点恰好位于此功能核苷酸序列之内。这段核酸使得本领域技术人员可以选择已存在的、相同的REII的识别序列中的至少一个和/或已存在的、其他单个或重复串联的功能序列中的至少一个，特别是此核酸可以为DNA或RNA。

本文的术语“克隆和表达所需的功能核苷酸序列”特别包括所有类型的REII裂解位点，但也包括RNA聚合酶的启动子序列，REIIs的功能序列或“自引导核酸酶”本身以及其他本领域技术人员已知的具有特定功能的序列或部分序列，例如：

-启动子序列，增强子，沉默子，终止序列，多聚腺苷酸化序列(调节序列)

-基因，开放读框

-蛋白及RNP结合位点

-用于纯化克隆片段的表达产物蛋白的序列

此处文中术语“偶联”一词可以有如下含义：

-REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列与切割位点均位于克隆和/或表达所需的功能序列区内，即，核酸序列中适于克隆入目的DNA片段的或有其他功能的部分序列，和

-切割位点位于克隆和/或表达所需的功能序列区内，即核酸序列中的适于克隆入目的DNA片段的或有其他功能的部分

序列；而识别序列位于克隆和/或表达所需的功能序列区之外(但仍在载体序列内)

如有必要，识别序列或切割位点或其他功能核苷酸序列仅以片段形式出现并不重要，而且为了产生依照本发明的核酸，识别序列或切割位点或其他功能核苷酸序列通过本领域已知的方法拼接起来用于特定用途。

在依照本发明核酸的一个优选实施方案中，可以分别选择REII与REIIs，使其特别性能与功能单元偶联。每个识别序列(在相应的核酸中)，可以是多个相连的REII，都对应一个或多个任意的REIIs，此REIIs的识别序列如通常的REIIs一样，在限制酶切反应之中或之后会被保留下来，此REIIs的切割位点位于相应的REII识别序列之内，如果需要的话，可以将切割序列做成与REII的切点一致。结果，使得此REII切点可以被特异而选择地使用，这就意味着，用相应的酶(REIIs)切开，当REII与REIIs的切点一致时，则开放端(切割开放)与通常用REII切开的DNA黏性末端完全相同。

这一优选的实施方案可用于将多个核酸片段以任意指定顺序连续地或线性地拼接在一起，而无需更多的酶促反应步骤。插入的核酸片段的方向可以用本领域技术人员熟知方法来判断，例如用不对称限制性酶切分析或测序。

本发明还包括使用依照本发明的核酸，将核酸片段连续或线性拼接起来的方法，该方法包括以下步骤：

(i)提供依照本发明的核酸，其中REIIs的切割位点或“自引导核酸酶”的切割位点位于REII的识别和切割序列之内，并可以与REII切割位点相同，

(ii)用REIIs或REII切开依照本发明的核酸，

(iii)插入第一个核酸片段，其5’端和3’端都与依照本发明的核酸的REII末端相匹配，

(iv)用相应的REIIs(不是REII)切开依照本发明的核酸，和

(v)插入第二个核酸片段，其5’端和3’端都与依照本发明的核酸的REII末端相匹配。

如有必要，可重复步骤(iv)-(v)以插入更多的核酸片段。

实施例1进一步描述了依照本发明的方法。

根据本发明，可以将一个或多个这样的REIIs偶联的REII切点插入一个和同样核酸，在大多数应用中，每一个单独的REIIs/REII组合在核酸中只出现一次。在特殊的应用(定向克隆等)中多重偶联可能是有用的，即一个REIIs与不同的REII裂解位点分别偶联，或将不同的REIIs与同一REII裂解位点偶联。

因此，特别地，本发明的目的是一族功能性的DNA克隆与表达序列，各自含有不同的REIIs识别序列与REII切割序列的组合。

REIIs/自引导核酸酶识别序列也可以以同样方式与多功能序列单元(多功能接头)中的其他功能性的部分序列相偶联，这样的偶联可以作为与REII的偶联的替代、补充或与之组合，其中“功能性的部分序列”可以是任何选择的功能序列(启动子，增强子，沉默子，蛋白质结合位点等)。

本发明也可用于REIIs与RNA聚合酶启动子序列的偶联。在多功能多接头位点中如果有这样的RNA聚合酶启动子序列的话，通常也都是多重的，而且在很多应用中，为了特定目的只希望激活其中一个。根据本发明，如果可能，可以用与之相偶联的REIIs或自引导核酸酶酶切灭活特定的启动子序列，以便只留下一个有功能的启动子序列供相应的RNA聚合酶使用。与其它方法相比，优点是对多个顺序偶联的DNA片段(理想地来自全基因)，有意义链和反意义链的转录都可以在一个或同一个载体上由同一个RNA聚合酶完成。

本文中，本发明包括一个选择性灭活启动子序列的方法，包括以下步骤：

(i)提供按照本发明的核酸，其中

a)REIIs或“自引导核酸酶”的切点分别位于启动子序列内，

b)启动子序列以相反方向出现两次，其中两个启动子序列可以相同或不同，和

c)两个启动子序列与分别与REIIs(REIIs-A，REIIs-B)至少一个偶联，其中REIIs-A与REIIs-B是不同的酶，

(ii)选择性地用REIIs-A和/或REIIs-B切开核酸。

实施例3进一步描述了依照本发明的方法。本领域的技术人员有许多方法检测启动子的成功灭活，例如体外转录。

功能核苷酸序列也可以是REIIs识别序列或“自引导核酸酶”的识别序列。利用这种依照本发明的核酸，本领域的技术人员可以构建完整的开关系统。

依照本发明的核酸，既可以是DNA，也可以是RNA，可以直接制备(作为原始产物)，也可以是间接地，例如由RNA逆转录得到DNA(作为转录产物)。

在另一个优选的实施方案中，依照本发明的核酸与载体材料偶联。相比之下，优点是得到的克隆和/或表达产物可直接用于进一步的自动处理或其他分析。本发明包括了所有的适合与核酸偶联的载体材料。这些例子有琼脂糖，硅化合物，聚苯乙烯化合物，聚四氟乙烯-丙烯酰胺，聚丙烯，尼龙，丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)，乳胶，顺磁性颗粒，纳米颗粒和纤维素衍生物。核酸与基质的偶联用本领域的技术人员已知的方法进行，既可共价连接，也可非共价连接。如果需要的话，终产物也可从载体材料中分离出来。为此目的可以使用独立与载体材料的物质——特定的酶、化学试剂、高分子量和低分子量物质，也可利用预定波长的光和依赖温度的影响。

本发明之目的，除上文已经描述核酸之外，也涉及含有这种核酸的克隆载体，及含有一个或多个这种克隆载体的细胞。

使用本发明的必要条件是用于插入本发明所述之核酸的克隆载体上，不含有所述核酸中包含的REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列或切割位点。

本发明也覆盖利用了一种试剂盒，其含有至少一种依照本发明的核酸，其可以选择性地与载体材料偶联；至少一个适用的REIIs，其可以选择性地与一个或多个REII组合；一种连接酶；以及如有必要，还含有其他的酶类和缓冲液。

附图说明

图1

用II型限制性内切酶克隆核酸片段

a部分显示片段A的克隆；b部分显示再克隆入片段B。闭合剪刀代表任意类型的II型限制性内切酶，黑框及黑色箭头代表REII的识别与切割序列。框A和B代表将要克隆的目标DNA片段。

图2

通过组合使用II型及IIs型限制性内切酶克隆核酸片段

a部分显示片段B的克隆；b部分显示再克隆入片段A。闭合剪刀代表任意类型的II型限制性内切酶，打开的剪刀代表任意IIs型限制性内切酶或“自引导核酸酶”。连在一起的带有黑色箭头的阴影/黑色框代表REIIs或“自引导核酸酶”(阴影框)的识别序列，与任意类型的II型限制性内切酶(黑框)的切割序列偶联。框A和B代表将要克隆的目标DNA片段。

图3

REIIs/自引导核酸酶，与功能序列偶联

数字1和2代表IIs型限制性内切酶的识别序列，其中1与2可以相同也可以不同。A代表功能序列(如启动子序列，见实施例3)，B是一段插入序列(例如，一个基因)。

图4

功能序列和REIIs的偶联与REII/REIIs偶联相结合

数字1和2代表IIs型限制性内切酶的识别序列，其中1与2可以相同也可以不同。A代表功能序列(如启动子序列，见实施例3)，B可以是多接头，其中REIIs/“自引导核酸酶”的识别序列与REII切点序列相偶联。

图5

若干个功能序列和REIIs的偶联与若干个REII/REIIs的偶联相结合

数字1到5代表IIs型限制性内切酶的识别序列，其中1到5可以部分或完全相同，或者可以部分或完全不相同。A到E代表任意功能序列，a到c代表不同的多接头。

图6

含有多个REIIs/“自引导核酸酶”控制下的REII切点的多功能DNA克隆位点(多接头)的结构示例

加框的是每个REIIs的识别序列，加阴影的是与之相偶联的REII的识别和切割序列，框中引出的箭头代表REIIs的切割位点。

通过下面的实施例对本发明进行更详细的解说。

实施例1：在含有REIIs AarI偶联的EcoRI-(REII-)切点的克隆载体中进行核酸构建

出发元件为任意类型的质粒，其含有至少一个EcoRI切点及REIIs AarI切点。已知REIIs AarI识别序列的特征在一条链上为^5’CACCTGC^3’，在互补链上相应为^5’GCAGGTG^3’。切割点在第一条链上沿5’到3’方向在^5’CACCTGC^3’识别序列之后的第四和第五碱基之间；在互补链上的切割点在沿5’到3’方向识别序列^5’GCAGGTG^3’之前的第八和第九碱基之间。

定位质粒上EcoRI的切割位点/识别序列。自EcoRI识别序列起，在EcoRI序列向前3个碱基处插入REIIs AarI的识别序列。插入用本领域技术人员已知的方法进行。插入后，EcoRI和AarI各自的切割位点应该是重合的，即，是局部等同的。由于这一重合，相应的EcoRI切点既可以用REII EcoRI特异性切开，也可以用REIIsAarI特异性切开，而产生的黏性末端是完全相同的。

用AarI或EcoRI切割依照本发明核酸的AarI和EcoRI

AarI： AarI EcoRI AarI

CACCTGCNNNNNNNNNN→ ACCTGCNNN GAATTCN→ CACCTGCNNNG AATTCN

GTGGACGNNNNNNNNNN TGGACGNNN CTTAAGN GTGGACGNNN CTTAA GN

目标DNA片段克隆入这个切开的切点，其具有特异的EcoRI末端，而且它可以通过例如用EcoRI从其他来源切割而得到。这一目标EcoRI片段用下图中的小写字母表示：

为了选择性地在这个EcoRI目标片段之前再插入第二个EcoRI目标片段，必须用AarI进行切割，因为只有在用REIIs时，才能特异地只切开一个切点，即与AarI识别位点相偶联的那个EcoRI切点(图中左边的)，而用EcoRI切割的话两个切点都会被切开。

用AarI切割

AarI EcoRI EcoRI EcoRI

CACCTGCNNN G a attcxxx-xxx gaattcnn--nn gAATTCN

GTGGACGNNN CTTAAgxxx-xxx cttaagnn--nn cttaaGN

用同样的方法，可以选择性地插入第三个、第四个以至更多EcoRI片段，原则上任意个具有EcoRI末端的片段可以按任何给定的顺序插入核酸中，或分别插入载体中以便做进一步的表达。

作为示例的限制性内切酶EcoRI和AarI可以被代替，原则上可以使用任何其他类型的REIIs与REII的组合。依照本发明的构建原则的图例见图2。

通过比较图1与图2，可以看出本发明的直接优点，即减少了不需要的切割和克隆产物，进而节约了筛选目的产物所花费的时间和精力，尤其是当克隆多于两个DNA目标片段时。

实施例2：具有若干个REIIs/“自引导核酸酶”控制的REII切点的多功能DNA克隆位点(多接头位点)的结构

在一个实施方案中，依照本发明核酸的、具有多个REIIs/“自引导核酸酶”控制的REII切点的多功能DNA克隆位点(多接头位点)的一个核酸的结构如图6所示。加框的是每个REIIs的识别序列，加灰色阴影的是与之相偶联的REII识别与切割序列，框中引出的箭头代表REII的切割位点。

实施例3：REIIs AarI与Eco571特别控制下的DNA聚合酶启动子序列

出发元件为一个质粒，其中RNA聚合酶(如RNA聚合酶T7)的启动子序列以相反方向出现两次，REIIs AarI与Eco571的识别序列也一样。AarI的性质已在实施例1中有详细描述。REIIs Eco571识别序列的特征在一条链上为^5’CTGAAG^3’，在互补链上相应地为^5’CTTCAG^3’。其中切割点在第一条链上沿5’到3’方向是^5’CTGAAG^3’识别序列之后的第十六和第十七碱基之间；另互补链上的切割点沿5’到3’方向在识别序列^5’CTTCAG^3’之前的第十四和第十五碱基之间。

质粒

REIIs AarI与Eco571的识别序列通过本领域的技术人员已知的方法被分别插入到两个启动子旁。插入后启动子序列与限制性酶切位点以如下图所示方式重叠：“左”启动子由AarI专一控制，“右”启动子由Eco571专一控制，每个酶都可以切开相应启动子的序列使之失活，从而只允许从另一个启动子进行转录。

用AarI切割

用Eco571切割

依照本发明的REIIs/“自引导核酸酶”与功能DNA序列之偶联通常情况下如图3所示。

可以理解，按照本发明，REIIs/“自引导核酸酶”可以单一单元形式或以多功能DNA克隆位点(多接头位点)形式偶联，也可以与其他功能序列相偶联，还可以与单一载体相连，示意性的例子如图4所示。

相应地，本发明还提供了DNA克隆与表达序列的构建方法，其中一个功能序列被多次偶联或不同功能序列与不同REIIs/“自引导核酸酶”相偶联，其中这些REIIs/“自引导核酸酶”偶联的功能序列与各种REIIs/“自引导核酸酶”偶联的切割点相联系。因此，根据不同的构建需要，多种可能的组合示例如图5所示。

序列表

<110>基因设计股份有限公司

<120>用于克隆载体的核酸

<130>GA62022PC

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>6

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<223>EcoRI限制性位点

<400>1

gaattc 6

<210>2

<211>7

<212>DNA

<213>Arthrobacter aurescens

<220>

<221>misc_feature

<223>AarI限制性位点

<400>2

cacctgc 7

<210>3

<211>5

<212>DNA

<213>牙胞杆菌属N种(Bacillus species N)

<220>

<221>misc_feature

<223>BseNI限制性位点

<400>3

actgg 5

<210>4

<211>6

<212>DNA

<213>芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)

<220>

<221>misc_feature

<223>BssSI限制性位点

<400>4

cacgag 6

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>枯草杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221>misc_feature

<223>I-HmuII限制性位点

<400>5

tcattacacg gattgcgaga agtt 24

<210>6

<211>6

<212>DNA

<213>大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<223>Eco47I限制性位点

<400>6

ctgaag 6

Claims

1.克隆载体中的一段核酸，或适合插入克隆载体的具有至少一个克隆和/或表达所需功能核苷酸序列的核酸片段，特征在于该核酸或至少一个功能核苷酸序列与至少一个REIIs识别序列或“自引导核酸酶”识别序列相偶联，从而使相应的REIIs或“自引导核酸酶”的切割位点位于功能核苷酸序列之内。

2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是II型限制性内切酶(REII)的识别序列和/或切割位点。

3.根据权利要求1或2所述的核酸，其特征在于它有若干个REIIs偶联的REII切割位点。

4.根据权利要求1或2所述的核酸，其特征在于REIIs与不同的REII切割位点相偶联，或若干个不同的REIIs与一个REII切割位点相偶联。

5.根据权利要求1至4所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列。

6.根据权利要求1至5任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少功能核苷酸序列是RNA聚合酶的启动子序列。

7.根据权利要求1至6任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是DNA结合蛋白或RNP颗粒的识别序列。

8.根据权利要求1至7任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是增强子序列。

9.根据权利要求1至8任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是沉默子序列。

10.根据权利要求1至9任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是终止序列。

11.根据权利要求1至10任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是多聚腺苷酸化序列。

12.根据权利要求1至11任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是基因或开放读框。

13.根据权利要求1至12任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是另一个调节序列。

14.根据权利要求1至13任一项所述的核酸，其特征在于该核酸或至少其功能核苷酸序列是一段能够促进从克隆片段表达的蛋白质纯化的序列。

15.根据权利要求1至14任一项所述的核酸，其特征在于它是克隆载体的一个元件。

16.根据权利要求1至15任一项所述的核酸，其特征在于它与载体材料相偶联。

17.根据权利要求16所述的核酸，其中的载体材料选自下列物质组：琼脂糖，硅化合物，聚苯乙烯化合物，聚四氟乙烯-丙烯酰胺，聚丙烯，尼龙，丙烯葡聚糖凝胶，乳胶，顺磁性颗粒，纳米颗粒和纤维素衍生物。

18.通过依照本发明的核酸连续和线性拼接核酸片段的方法，该方法包括以下步骤：

(i)提供根据权利要求1至4所述的核酸，其中REIIs或“自引导核酸酶”的切割位点位于REII的识别和切割序列之内，选择性地可以与REII的切割位点相同，

(ii)分别用REIIs或REII切开依照本发明的核酸，

(iii)插入第一个核酸片段，其5’端和3’端都与依照本发明核酸的REII的末端相匹配，

(iv)用相应的REIIs(不是REII)切开依照本发明的核酸，和

(v)插入第二个核酸片段，其5’端和3’端都与依照本发明核酸的REII的末端相匹配，

如有必要，可重复步骤(iv)-(v)以插入更多的核酸片段。

19.选择性灭活启动子序列的方法，方法包括以下步骤：

(i)提供根据权利要求6所述的核酸，其中

a)REIIs或“自引导核酸酶”的切点位于启动子序列内，

c)两个启动子序列与至少一个REIIs(REIIs-A，REIIs-B)偶联，其中REIIs-A与REIIs-B不同，和

(ii)选择性地用REIIs-A和/或REIIs-B切开核酸。

20.含有根据权利要求1至14所述之核酸的克隆载体。

21.根据权利要求20所述的克隆载体，其特征在于它不含有其他的所述核酸中出现的REIIs或“自引导核酸酶”的识别序列或切割位点。

22.一种含有根据权利要求20或21所述之克隆载体的细胞，或者含有根据权利要求1至15任一项所述之核酸的细胞。

23.一种试剂盒，含有至少一个根据权利要求1至16任一项所述的核酸，至少一个合适的REIIs，其选择性地与一个或多个REII组合，一种连接酶，和选择性添加的合适的酶类和合适的缓冲液。