CN1624016A - 一种生物大分子浓缩用ma/aa/mma共聚树脂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂及其制备方法，特征是按质量比AA液体∶MA固体∶氢氧化钠固体∶蒸馏水＝9∶1－2∶3－4.5∶30－50配成混合溶液，按与MMA液体体积比15－25混合，震荡至MMA悬浮均匀，采用γ射线引发三元单体聚合，即成为生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂；可应用于生物大分子浓缩脱水。本发明可克服现有生物大分子浓缩的沉淀法和吸附法容易对样品的性质产生影响，透析法的缓冲液要多次更换且透析膜易破裂，超滤不适合样品量较少的情况且有些蛋白可能产生不可逆的变性、超滤膜价格昂贵且清洗困难、样品损失大，减压蒸馏法易使蛋白受热变性，冷冻干燥法操作难度大、且会引起蛋白活性的降低的缺陷。
Description
技术领域：
本发明属于生物大分子吸水浓缩用的共聚树脂技术领域，特别是涉及辐射合成MA/AA/MMA共聚树脂及方法。
背景技术：
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而使样品的浓度变的很低，以致难以直接进行生化实验，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩脱水。
据赵永芳主编《生物化学技术原理及应用》(科学出版社2002，13-15页)和汪家政和范明主编《蛋白质技术手册》(科学出版社2002，60-74页)介绍，现有常用的生物大分子浓缩方法有：沉淀法、吸附法、透析法、超滤法、减压蒸馏法、冷冻干燥法。但是，沉淀法和吸附法容易对样品的性质产生影响；透析法的缓冲液要多次更换且透析膜易破裂；超滤虽易于对透析速度进行控制，但其不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性，超滤膜价格昂贵且清洗困难，样品损失大；减压蒸馏法易使蛋白受热变性；冷冻干燥法操作难度大，难以掌握，冻干过程中还可能会引起蛋白活性的降低。
据邹新禧编著《超强吸水剂》(化学工业出版社，1991，1-8页)介绍，高吸水性树脂是一种吸水能力特别强的功能高分子材料，其吸水量可达自身重量的几十倍乃至几千倍，且在一般压力下具有保水性。该书的200-259页介绍，高吸水性树脂在结构上是交联度很低的空间网络结构，它是由化学交联和树脂分子链间的相互缠绕物理交联构成的。吸水前，高分子长链相互缠绕在一起，彼此交联成网状结构，未电离成离子对，从而达到整体上的紧固程度。当高分子遇水时，亲水基与水分子的水合作用使高分子网束张展，释放出亲水离子，产生网内外离子浓度差，从而造成网络结构内外产生渗透压，水分子以渗透压作用向网络结构内渗透。由于树脂吸水形成凝胶后强度较差，不易分离；树脂网络自身的高度亲水性导致会在树脂表面吸附蛋白质，造成蛋白质浓缩过程中的损失，因而已有吸水树脂并不适用于浓缩生物蛋白样品。
发明内容：
本发明的目的是提出一种生物大分子浓缩用丙烯酰胺/丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚树脂(MA/AA/MMA共聚树脂)及其使用方法，将高吸水性树脂技术应用于生物大分子浓缩脱水，以克服现有生物大分子浓缩的沉淀法和吸附法容易对样品的性质产生影响，透析法的缓冲液要多次更换且透析膜易破裂，超滤不适合样品量较少的情况且有些蛋白可能产生不可逆的变性、超滤膜价格昂贵且清洗困难、样品损失大，减压蒸馏法易使蛋白受热变性，冷冻干燥法操作难度大、且会引起蛋白活性的降低的缺陷。
本发明的生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂，特征在于其为按质量比AA液体∶MA固体∶氢氧化钠固体∶蒸馏水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，将此混合液与MMA液体按照体积比15-25混合，经γ射线辐射共聚形成的三元共聚树脂。
本发明的生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂的制备方法，利用γ射线引发单体的自由基聚合，其特征在于：按质量比AA液体∶MA固体∶氢氧化钠固体∶蒸馏水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，将此混合液与MMA液体按照体积比15-25混合，震荡至MMA悬浮均匀，立即利用γ射线引发三元单体聚合成为生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂。
使用时，先将本发明的MA/AA/MMA共聚树脂取一小段称重，吸水后再称重，算出单位重量树脂吸水量，根据待浓缩溶液需要除去的水量计算出需要加入吸水树脂的量；然后将本发明的树脂根据需要量加入到待浓缩溶液中，静置，吸水后取出膨胀的树脂，取浓缩后溶液与初始溶液一起进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检查浓缩倍数。
与现有技术相比较，本发明有以下优点和积极效果：MA/AA/MMA共聚树脂利用分子筛和渗透压协同作用对生物大分子溶液进行脱水浓缩，解决了沉淀法和吸附法对样品的性质产生影响和冷冻干燥法引起蛋白活性的降低的问题；MA/AA/MMA共聚树脂在制备时可以放在各种不同大小的容器中，制得的树脂适用于生物大分子样品量多或少的情况，解决了超滤法不适合样品量较少的情况的问题；MA/AA/MMA共聚树脂在使用过程中不用更换，解决了透析法的缓冲液要多次更换的问题；MA/AA/MMA共聚树脂的使用环境是4℃下，解决了减压蒸馏法易使蛋白受热变性的问题；MA/AA/MMA共聚树脂的表面不会吸附蛋白质，浓缩后易于从溶液中分离出来，不会造成样品的损失，解决了超滤膜价格昂贵且清洗困难，样品损失大的问题；MA/AA/MMA共聚树脂价格低廉，原料常见，制造和使用简单，解决了超滤膜价格昂贵和冷冻干燥法操作难度大，难以掌握的问题。
附图说明：
图1是用本发明的一种MA/AA/MMA共聚树脂浓缩的牛血清白蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的图片。
图2是本发明实施例2采用另一种MA/AA/MMA共聚树脂浓缩牛血清白蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的图片。
图3是实施例3采用本发明共聚树脂浓缩牛血清白蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的图片。
图4是实施例4以共聚树脂浓缩牛血清白蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳的图片。
具体实施方式：
实施例1：制备MA/AA/MMA共聚树脂并用于浓缩牛血清白蛋白
首先用天平称量90g AA液体、10g MA固体、30g氢氧化钠固体；用500mL蒸馏水溶解。用50mL移液管移取25mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液体，震荡悬浮(在此可以使用超声震荡法)。聚AA均聚型高吸水性树脂的吸水率高、耐盐性差，而聚MA均聚型高吸水性树脂的吸水率低，但耐盐性较强，而生物大分子多溶解在盐溶液中，故可用MA/AA两种单体交联。由于MA和AA两种单体都是亲水性化合物，会吸附生物大分子造成不必要的损失，于是按最大悬浮量加入疏水性化合物MMA用来共聚，得到一种新型三元共聚树脂，达到适用于生物大分子浓缩的目的。混匀后用注射器吸取混合液至直径3mm医用点滴管中，铁夹封闭塑料管两端。使用3mm医用点滴管为容器的好处在于制得的树脂吸水膨胀后直径利于操作，也方便我们直接根据树脂的长度估算其吸水的体积来达到不同的浓缩程度。立即将注有混合单体的点滴管置于Co60γ射线辐照，125Gy/min，50min。利用辐射聚合的优势在于辐射聚合可以不加引发剂，聚合物纯度高，性能好；辐射聚合可以比化学聚合在更温和的条件下进行，一般可以在常温常压下进行；辐射射线的穿透力强且在被照体系中均匀分布。辐照结束后室温放置30min，利用辐射后效应增大单体聚合度。取待浓缩牛血清白蛋白(BSA)溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，标记为“1×”。剪取4cm长树脂，剥去外层管壁，投入待浓缩溶液中(15mL离心管)，4℃下静置。观察剩余溶液体积为5mL时，取20μL至EP管2中，标记为“2×”。观察剩余溶液体积为2mL时，取20μL至EP管3中，标记为“5×”。用平头镊夹出树脂，取约20μL EP管4中，标记为“树脂”。分别加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“2×”、“5×”和“树脂”管，100℃煮4min。各管分别加样10μL进行10％SDS PAGE电泳。SDS胶经过染色，脱色如图1。图1中从左向右1-5条泳道分别是蛋白质分子量标记(用来估测蛋白质的分子量大小，标识目标蛋白，排除杂蛋白干扰)，“1×”样品，“2×”样品，“5×”样品，树脂样。由胶可见蛋白的浓缩倍数逼近溶液浓缩前后体积比，蛋白损失趋进于0。需要说明的是在此没有利用其他较精确的生化方法来测定蛋白质的精确浓度，而是根据胶上染色的深浅作出的估算，并且在树脂样品上并没有蛋白存在的事实基础上得到蛋白的浓缩倍数逼近溶液浓缩前后体积比的结论。
实施例2：制备另一种MA/AA/MMA共聚树脂浓缩牛血清白蛋白BSA浓缩实验
首先用天平称量90g AA液体、20g MA固体、45g氢氧化钠固体；用300mL蒸馏水溶解。用20mL移液管移取15mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液体，震荡悬浮。混匀后用注射器吸取混合液至直径3mm医用点滴管中，铁夹封闭塑料管两端。立即将注有混合单体的点滴管置于Co60γ射线辐照，125Gy/min，50min。取待浓缩BSA溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，标记为“1×”。剪取4cm长树脂，剥去外层管壁，投入待浓缩溶液中(15mL离心管)，4℃下静置。观察剩余溶液体积为5mL时，取20μL至EP管2中，标记为“2×”。观察剩余溶液体积为2mL时，取20μL至EP管3中，标记为“5×”。用平头镊夹出树脂，取约20μL EP管4中，标记为“树脂”。分别加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“2×”、“5×”和“树脂”管，100℃煮4min。各管分别加样10μL进行10％SDS PAGE电泳。SDS胶经过染色，脱色如图2。图2中从左向右6-10条泳道分别是蛋白质分子量标记(用来估测蛋白质的分子量大小，标识目标蛋白，排除杂蛋白干扰)，“1×”样品，“2×”样品，“5×”样品，树脂样。由胶可见蛋白的浓缩倍数逼近溶液浓缩前后体积比，蛋白损失趋进于0。
实施例3：采用本发明共聚树脂浓缩牛血清白蛋白实验
首先用天平称量90g AA液体、8g MA固体、40g氢氧化钠固体；用400mL蒸馏水溶解。用20mL移液管移取20mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液体，震荡悬浮(在此可以使用超声震荡法)。混匀后用注射器吸取混合液至直径3mm医用点滴管中，铁夹封闭塑料管两端。立即将注有混合单体的点滴管置于Co60γ射线辐照，125Gy/min，50min。取待浓BSA溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，标记为“1×”。剪取4cm长树脂，剥去外层管壁，投入待浓缩溶液中(15mL离心管)，4℃下静置。观察剩余溶液体积为5mL时，取20μL至EP管2中，标记为“2×”。观察剩余溶液体积为3.3mL时，取20μL至EP管3中，标记为“3×”。观察剩余溶液体积为2mL时，取20μL至EP管4中，标记为“5×”。用平头镊夹出树脂，取约20μL EP管5中，标记为“树脂”。分别加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“2×”、“3×”、“5×”和“树脂”管，100℃煮4min。各管分别加样10μL进行10％SDS PAGE电泳。SDS胶经过染色，脱色如图3。图3中从左向右11-16条泳道分别是蛋白质分子量标记，“1×”样品，“2×”样品，“3×”样品，“5×”样品，树脂样。由胶可见蛋白的浓缩倍数小于溶液浓缩前后体积比，有部分蛋白吸附在树脂上，以树脂膨胀后总体积计算则蛋白损失量较大。说明MA相对含量减少会使树脂表面吸附蛋白。
实施例4：以共聚树脂浓缩牛血清白蛋白实验
首先用天平称量90g AA液体、10g MA固体、40g氢氧化钠固体；用400mL蒸馏水溶解。用20mL移液管移取28mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液体，震荡悬浮。混匀后用注射器吸取混合液至直径3mm医用点滴管中，铁夹封闭塑料管两端。立即将注有混合单体的点滴管置于Co60γ射线辐照，125Gy/min，50min。取待浓缩BSA溶液10mL，吸取20μL至EP管1中，标记为“1×”。剪取4cm长树脂，剥去外层管壁，投入待浓缩溶液中(15mL离心管)，4℃下静置。观察剩余溶液体积为6.7mL时，取20μL至EP管2中，标记为“1.5×”。观察剩余溶液体积为5mL时，取20μL至EP管3中，标记为“2×”。观察剩余溶液体积为3.3mL时，取20μL至EP管4中，标记为“3×”。观察剩余溶液体积为2.5mL时，取20μL至EP管5中，标记为“4×”。观察剩余溶液体积为2mL时，取20μL至EP管6中，标记为“5×”。用平头镊夹出树脂，取约20μL EP管7中，标记为“树脂”。分别加80mL1×Sample Buffer至“1×”、“1.5×”“2×”、“3×”、“4×”“5×”和“树脂”管，100℃煮4min。各管分别加样10μL进行10％SDS PAGE电泳。SDS胶经过染色，脱色如图3。图3中从左向右17-23条泳道分别是蛋白质分子量标记，“1×”样品，“1.5×”样品，“2×”样品，“3×”样品，“4×”样品，“5×”样品，树脂样。由胶可见蛋白的浓缩倍数小于溶液浓缩前后体积比，有部分蛋白吸附在树脂上，蛋白损失量较大。说明MMA相对含量减少会使树脂表面吸附蛋白。
实施例5：BSA浓缩实验
首先用天平称量90g AA液体、10g MA固体、20g氢氧化钠固体；用550mL蒸馏水溶解。用20mL移液管移取28mL上述溶液，。用1mL移液管加入1mL MMA液体，震荡悬浮。混匀后用注射器吸取混合液至直径3mm医用点滴管中，铁夹封闭塑料管两端。立即将注有混合单体的点滴管置于Co60γ射线辐照，125Gy/min，50min。氢氧化钠相对含量减少和蒸馏水含量增加使树脂表面粘着性增大粘着性大，处理困难，不适用于浓缩用途。
Claims (2)
1、一种生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂，特征在于其为按质量比AA液体∶MA固体∶氢氧化钠固体∶蒸馏水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，将此混合液与MMA液体按照体积比15-25混合，经γ射线辐射共聚形成的三元共聚树脂。
2、一种生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂的制备方法，利用γ射线引发单体的自由基聚合，其特征在于：按质量比AA液体∶MA固体∶氢氧化钠固体∶蒸馏水＝9∶1-2∶3-4.5∶30-50配成混合溶液，将此混合液与MMA液体按照体积比15-25混合，震荡至MMA悬浮均匀，立即利用γ射线引发三元单体聚合成为生物大分子浓缩用MA/AA/MMA共聚树脂。
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