CN1616490A

CN1616490A - 蛋白a功能结构域－荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法

Info

Publication number: CN1616490A
Application number: CN 200410054330
Authority: CN
Inventors: 钱旻; 张小平; 杜冰
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2004-09-07
Publication date: 2005-05-18

Abstract

本发明提供一种蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法，属于分子药理学生物技术领域。本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白是由蛋白A功能结构域与荧光蛋白融合而成。其构建方法为双酶切蛋白A基因，回收得到蛋白A功能结构域；双酶切含有荧光蛋白的质粒载体；将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒，再转化感受态细胞。构建的蛋白A片断－增强型荧光蛋白的融合蛋白兼有蛋白A可以与大多数哺乳动物IgG的Fc段非特异结合，以及增强型荧光蛋白的强荧光，不影响与其连接的目的基因的表达，可以作为简便快速的免疫检测通用试剂，而且构建的融合蛋白性质稳定，表达量高，操作简便。

Description

蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其构建方法，尤其是蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法，属于分子药理学生物技术领域。

背景技术

在常规免疫检测中，常利用蛋白A可与大多数哺乳动物IgG的Fc段结合的特性，用酶联蛋白A代替酶联二抗，作为通用性免疫检测试剂，广泛用于生物和医学的研究和临床检测。传统荧光标记技术目前应用最多的荧光素是异硫氰酸荧光素(FITC)，它的优点是特异性强，速度快，灵敏度高。但是它也有许多不足之处，如荧光素价格高，标记操作过程复杂，得率低，荧光易猝灭，标记物不能长期保存，而且对活细胞有毒性，不能用于活细胞观察。

赵志晶，刘秀梅发表的“蛋白A-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建”《卫生研究》2002，31(1)：49-52，报道成功构建了蛋白A-GFP融合蛋白。该融合蛋白虽然克服了异硫氰酸荧光素不足之处，但是蛋白A仍具有分子量大易水解、不稳定等缺点。

本发明构建的荧光标记的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白，蛋白A功能结构域是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereus)胞壁蛋白A改造而来。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereus)胞壁蛋白A(protein A)由三个功能区组成：N端的信号肽，IgG结合区以及C端的胞壁结合区。其中IgG结合区有五个结合位点：E、D、A、B、C。研究发现，如果将蛋白A在原核表达时，则蛋白A在原核宿主细胞内很容易被蛋白酶水解，主要是因为IgG结合区各结合位点之间的铰链部分容易被水解，尤其是近C端的铰链更不稳定。为了增强蛋白A的稳定性，将蛋白A的C端进行改造。

发明内容

本发明目的在于构建一种性质稳定，表达量高，操作简便的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白，并同时提供该融合蛋白的构建方法。

本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白是由蛋白A功能结构域与荧光蛋白融合而成。

本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白优选蛋白A功能结构域—绿色荧光蛋白的融合蛋白。

本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白优选蛋白A功能结构域—增强型绿色荧光蛋白的融合蛋白。

为构建蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白，本发明采用如下技术方案：

分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点，进行双酶切，回收得到蛋白A功能结构域；另外，双酶切含有荧光蛋白的质粒载体；将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒，再转化感受态细胞。

相应地分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点，进行双酶切，回收得到蛋白A功能结构域；另外，双酶切含有绿色荧光蛋白的质粒载体；将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒，再转化感受态细胞。

再者，分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点，进行双酶切，回收得到蛋白A功能结构域；另外，双酶切含有增强型绿色荧光蛋白的质粒载体；将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒，再转化感受态细胞。

本发明采用的蛋白A就是经过改造了的稳定的蛋白A，它只含有信号肽部分，保留了近N端的两个IgG结合区E、D和一小部分的A区，去除了C端其它部分，可称之为蛋白A功能结构域。因此表达的蛋白更稳定，不易水解。其中，增强型绿色荧光蛋白(Enhanced greenfluorescence protein，EGFP)是绿色荧光蛋白GFP的突变物，通过将64位苯丙氨酸、65位丝氨酸突变为亮氨酸和苏氨酸，激发峰波长偏移到488nm，使荧光更强，比野生型的GFP强6倍以上，而且更稳定，对细胞无毒性，不影响与其连接的目的基因的表达，也不影响目的蛋白的结构和功能，适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。

本发明构建的蛋白A片断-增强型荧光蛋白的融合蛋白兼有蛋白A可以与大多数哺乳动物IgG的Fc段非特异结合，以及增强型荧光蛋白的强荧光、稳定、对细胞无毒性，不影响与其连接的目的基因的表达，也不影响目的蛋白的结构和功能等特点，可以作为简便快速的免疫检测通用试剂，而且构建的融合蛋白性质稳定，表达量高，操作简便。融合蛋白采用的蛋白A和荧光蛋白都是经过改造的，因而在大肠杆菌中能高效表达，而且表达出的融合蛋白具有分子量小、稳定、且荧光强度更强的特点，在普通紫外观察箱也能看到荧光。

具体实施例

实施例1：

1、蛋白A基因的克隆

质粒pTSAPA-2提取：参照《分子克隆实验指南》(第三版)碱裂解法提取。

引物设计：利用gene runner软件对pTSAPA-2、pBV221和蛋白A的基因序列的分析，设计两条引物，分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点：

引物1：5′CGGAATTCATGAGCTCGGTACCCACATTA 3′(GAATTC是EcoR I位点)

引物2：5′CTAGCTAGCGATGAAACCATTGCGTTG 3′(GCTAGC是Nhe I位点)

PCR反应体系：10×reaction buffer 5ul，10mM dNTP 1ul，引物50pmol/L各1ul，模板pTSAPA-21ul，RedTaq^TM DNA聚合酶3ul，总反应体系50ul。

PCR反应条件：预变性94℃ 5min，变性94℃ 1min，退火60℃1min，复性72℃ 45sec，反应35个循环，最后延伸72℃ 10min。

2、蛋白A基因片断的回收与双酶切

DNA凝胶回收试剂盒回收蛋白A基因片断。

EcoR I，Nhe I双酶切反应体系：10×buffer M 2ul，0.1％BSA 2ul，EcoR I和Nhe I各1ul，回收的DNA，总体积20ul，37℃酶解过夜，65℃ 15min终止反应。

3、质粒载体pBV221双酶切

EcoR I，Nhe I双酶切反应体系：10×buffer M 2ul，0.1％BSA 2ul，EcoR I和Nhe I各1ul，pBV221 1ul，总体积20ul，37℃酶解过夜，65℃ 15min终止反应。琼脂糖电泳，割胶回收酶切产物，DNA凝胶回收试剂盒纯化。

4、连接反应

反应体系：10×Buffer 2.5ul，目标DNA约0.3pmol，载体DNA约0.03pmol，T4 DNA ligase 1ul，总体积25ul，16℃过夜反应

5、转化感受态细胞

参照《分子克隆实验指南》(第三版)将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂平板

实施例2：

仅仅是将实施例1中的第“4”步，其中的质粒载体换成含有绿色荧光蛋白的质粒载体，其他与实施例1完全相同。

实施例3：

仅仅是将实施例1中的第“4”步，其中的质粒载体换成含有荧光蛋白的质粒载体，其他与实施例1完全相同。

蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白鉴定

1、PCR鉴定：10×reaction buffer 5ul，10mM dNTP 1ul，引物50pmol/L各1ul，转化菌质粒模板1ul，RedTaq^TM DNA聚合酶3ul，总反应体系50ul

经过PCR反应，酶切连接，转化获得多个克隆，挑选若干克隆抽提质粒，并作为PCR反应的模板进行鉴定，PCR产物进行琼脂糖电泳，在500bp位置有特异性条带，与目标基因蛋白A功能结构域的大小相符，在500bp之前较浅的条带应为引物二聚体。

2、EcoR I，Sal I双酶切鉴定：10×buffer H 2ul，0.1％BSA 2ul，EcoR I和Sal I各1ul，DNA 1ul，总体积20ul，37℃酶解

目标基因蛋白A约500bp的片断双酶切，两端分别为EcoR I和Nhe I位点。载体pBV221中的EGFP基因N端有两个相近的位点：EcoRI和Nhe I，EGFP的两端是EcoR I和Sal I位点。经酶切连接转化后，对重组质粒进行EcoR I和Sal I双酶切证实，含有EGFP的质粒pBV221双酶切获得的小片断在700bp左右的位置，与EGFP的大小相符，而阳性克隆因为加入了500bp的目标基因，所以双酶切小片断在1200bp的位置。通过上述两部初步证明重组质粒构建成功。经联合基因集团有限公司测序进一步确定重组质粒序列准确。

3、融合基因热诱导表达与提取

转化菌37℃扩增过夜，次日1：20稀释，30℃继续扩增至OD₆₀₀约0.4-0.6，转至42℃热诱导3小时。收集菌体超声波破碎：100g/L菌体浓度，水重悬，480W，15min间隔破碎，离心收集上清和沉淀。经过42℃热诱导，超声波破碎获得的菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳，以相同条件诱导和破碎的pBV221(空载体)和含有EGFP基因的pBV221为对照。在43kD左右，转化菌显示有明显的特异性条带，与蛋白nA-EGFP的分子量相符。超声波破碎离心后的沉淀也含有目标蛋白，由此可见，融合蛋白在宿主菌内大量可溶性表达。对照EGFP在27kD左右有特异性条带，而空载体pBV221则没有明显的特异表达带。

4、蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的活性鉴定：

SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达情况，Native-PAGE电泳鉴定融合蛋白的EGFP活性，双向免疫扩散和Western blotting鉴定融合蛋白与抗体的结合活性。

双向免疫扩散：为了鉴定融合蛋白中蛋白A功能结构域结合IgG的活性，用免疫球蛋白参考血清和羊抗人IgG诊断血清进行双向免疫扩散，并以EGFP的菌体蛋白作为对照，结果显示，融合蛋白能与上述血清都产生明显的沉淀线，而对照EGFP没有形成，该沉淀线在荧光显微镜下用蓝光激发能观察到荧光，与背景的暗色不同。

Western Blotting：SDS-PAGE电泳后凝胶进行Western blotting鉴定，转膜后封阻过夜，直接用酶标二抗(羊抗兔)与之孵育，EGFP的菌体蛋白作为阴性对照，结果显示，融合蛋白的特异性条带显色清楚，而对照没有该特异性条带。

Native-PAGE：Native-PAGE电泳过程保留了蛋白质活性，电泳结束后，直接在普通紫外监测仪下观察，蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白呈现亮色条带，而其他任何条带在紫外照射下看不到。

实验材料

质粒与菌株：含pTSAPA-2的菌株BE21(pTSAPA-2含有改造的蛋白A基因序列，Takeshi Sano)，pBV221(INVITROGEN公司，含有改造的EGFP基因序列)。

试剂：RedTaq^TM DNA聚合酶(北京赛百盛基因技术有限公司)，限制性内切酶EcoR I(华美生物工程公司)，限制性内切酶Nhe I、SalI和T4 DNA ligase(宝生物工程有限公司)，SD004 DNA MARKER(北京鼎国生物)，日常型质粒DNA小量快速制备试剂盒(V-geneBiotechnology limited)，DNA凝胶回收试剂盒(V-gene Biotechnologylimited)。

Claims

1、一种蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白，其特征在于：由蛋白A功能结构域与荧光蛋白融合而成。

2、如权利要求1所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白，其特征在于：由蛋白A功能结构域与绿色荧光蛋白融合而成。

3、如权利要求1所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白，其特征在于：由蛋白A功能结构域与增强型绿色荧光蛋白融合而成。

4、一种蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的构建方法，其特征在于：分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点，进行双酶切，回收得到蛋白A功能结构域；另外，双酶切含有荧光蛋白的质粒载体；将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒，再转化感受态细胞。

5、如权利要求4所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的构建方法，其特征在于：其中荧光蛋白为绿色荧光蛋白。

6、如权利要求4所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的构建方法，其特征在于：其中荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白。