CN1616490A - 蛋白a功能结构域-荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法 - Google Patents

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CN1616490A CN 200410054330 CN200410054330A CN1616490A CN 1616490 A CN1616490 A CN 1616490A CN 200410054330 CN200410054330 CN 200410054330 CN 200410054330 A CN200410054330 A CN 200410054330A CN 1616490 A CN1616490 A CN 1616490A
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钱旻
张小平
杜冰
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Abstract

本发明提供一种蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法,属于分子药理学生物技术领域。本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白是由蛋白A功能结构域与荧光蛋白融合而成。其构建方法为双酶切蛋白A基因,回收得到蛋白A功能结构域;双酶切含有荧光蛋白的质粒载体;将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒,再转化感受态细胞。构建的蛋白A片断-增强型荧光蛋白的融合蛋白兼有蛋白A可以与大多数哺乳动物IgG的Fc段非特异结合,以及增强型荧光蛋白的强荧光,不影响与其连接的目的基因的表达,可以作为简便快速的免疫检测通用试剂,而且构建的融合蛋白性质稳定,表达量高,操作简便。

Description

蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法
                         技术领域
本发明涉及一种融合蛋白及其构建方法,尤其是蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白及其构建方法,属于分子药理学生物技术领域。
                         背景技术
在常规免疫检测中,常利用蛋白A可与大多数哺乳动物IgG的Fc段结合的特性,用酶联蛋白A代替酶联二抗,作为通用性免疫检测试剂,广泛用于生物和医学的研究和临床检测。传统荧光标记技术目前应用最多的荧光素是异硫氰酸荧光素(FITC),它的优点是特异性强,速度快,灵敏度高。但是它也有许多不足之处,如荧光素价格高,标记操作过程复杂,得率低,荧光易猝灭,标记物不能长期保存,而且对活细胞有毒性,不能用于活细胞观察。
赵志晶,刘秀梅发表的“蛋白A-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建”《卫生研究》2002,31(1):49-52,报道成功构建了蛋白A-GFP融合蛋白。该融合蛋白虽然克服了异硫氰酸荧光素不足之处,但是蛋白A仍具有分子量大易水解、不稳定等缺点。
本发明构建的荧光标记的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白,蛋白A功能结构域是由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereus)胞壁蛋白A改造而来。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereus)胞壁蛋白A(protein A)由三个功能区组成:N端的信号肽,IgG结合区以及C端的胞壁结合区。其中IgG结合区有五个结合位点:E、D、A、B、C。研究发现,如果将蛋白A在原核表达时,则蛋白A在原核宿主细胞内很容易被蛋白酶水解,主要是因为IgG结合区各结合位点之间的铰链部分容易被水解,尤其是近C端的铰链更不稳定。为了增强蛋白A的稳定性,将蛋白A的C端进行改造。
                         发明内容
本发明目的在于构建一种性质稳定,表达量高,操作简便的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白,并同时提供该融合蛋白的构建方法。
本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白是由蛋白A功能结构域与荧光蛋白融合而成。
本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白优选蛋白A功能结构域—绿色荧光蛋白的融合蛋白。
本发明所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白优选蛋白A功能结构域—增强型绿色荧光蛋白的融合蛋白。
为构建蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白,本发明采用如下技术方案:
分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点,进行双酶切,回收得到蛋白A功能结构域;另外,双酶切含有荧光蛋白的质粒载体;将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒,再转化感受态细胞。
相应地分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点,进行双酶切,回收得到蛋白A功能结构域;另外,双酶切含有绿色荧光蛋白的质粒载体;将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒,再转化感受态细胞。
再者,分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点,进行双酶切,回收得到蛋白A功能结构域;另外,双酶切含有增强型绿色荧光蛋白的质粒载体;将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒,再转化感受态细胞。
本发明采用的蛋白A就是经过改造了的稳定的蛋白A,它只含有信号肽部分,保留了近N端的两个IgG结合区E、D和一小部分的A区,去除了C端其它部分,可称之为蛋白A功能结构域。因此表达的蛋白更稳定,不易水解。其中,增强型绿色荧光蛋白(Enhanced greenfluorescence protein,EGFP)是绿色荧光蛋白GFP的突变物,通过将64位苯丙氨酸、65位丝氨酸突变为亮氨酸和苏氨酸,激发峰波长偏移到488nm,使荧光更强,比野生型的GFP强6倍以上,而且更稳定,对细胞无毒性,不影响与其连接的目的基因的表达,也不影响目的蛋白的结构和功能,适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。
本发明构建的蛋白A片断-增强型荧光蛋白的融合蛋白兼有蛋白A可以与大多数哺乳动物IgG的Fc段非特异结合,以及增强型荧光蛋白的强荧光、稳定、对细胞无毒性,不影响与其连接的目的基因的表达,也不影响目的蛋白的结构和功能等特点,可以作为简便快速的免疫检测通用试剂,而且构建的融合蛋白性质稳定,表达量高,操作简便。融合蛋白采用的蛋白A和荧光蛋白都是经过改造的,因而在大肠杆菌中能高效表达,而且表达出的融合蛋白具有分子量小、稳定、且荧光强度更强的特点,在普通紫外观察箱也能看到荧光。
                       具体实施例
实施例1:
1、蛋白A基因的克隆
质粒pTSAPA-2提取:参照《分子克隆实验指南》(第三版)碱裂解法提取。
引物设计:利用gene runner软件对pTSAPA-2、pBV221和蛋白A的基因序列的分析,设计两条引物,分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点:
引物1:5′CGGAATTCATGAGCTCGGTACCCACATTA 3′(GAATTC是EcoR I位点)
引物2:5′CTAGCTAGCGATGAAACCATTGCGTTG 3′(GCTAGC是Nhe I位点)
PCR反应体系:10×reaction buffer 5ul,10mM dNTP 1ul,引物50pmol/L各1ul,模板pTSAPA-21ul,RedTaqTM DNA聚合酶3ul,总反应体系50ul。
PCR反应条件:预变性94℃ 5min,变性94℃ 1min,退火60℃1min,复性72℃ 45sec,反应35个循环,最后延伸72℃ 10min。
2、蛋白A基因片断的回收与双酶切
DNA凝胶回收试剂盒回收蛋白A基因片断。
EcoR I,Nhe I双酶切反应体系:10×buffer M 2ul,0.1%BSA 2ul,EcoR I和Nhe I各1ul,回收的DNA,总体积20ul,37℃酶解过夜,65℃ 15min终止反应。
3、质粒载体pBV221双酶切
EcoR I,Nhe I双酶切反应体系:10×buffer M 2ul,0.1%BSA 2ul,EcoR I和Nhe I各1ul,pBV221 1ul,总体积20ul,37℃酶解过夜,65℃ 15min终止反应。琼脂糖电泳,割胶回收酶切产物,DNA凝胶回收试剂盒纯化。
4、连接反应
反应体系:10×Buffer 2.5ul,目标DNA约0.3pmol,载体DNA约0.03pmol,T4 DNA ligase 1ul,总体积25ul,16℃过夜反应
5、转化感受态细胞
参照《分子克隆实验指南》(第三版)将连接产物转化感受态细胞DH5α,涂平板
实施例2:
仅仅是将实施例1中的第“4”步,其中的质粒载体换成含有绿色荧光蛋白的质粒载体,其他与实施例1完全相同。
实施例3:
仅仅是将实施例1中的第“4”步,其中的质粒载体换成含有荧光蛋白的质粒载体,其他与实施例1完全相同。
蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白鉴定
1、PCR鉴定:10×reaction buffer 5ul,10mM dNTP 1ul,引物50pmol/L各1ul,转化菌质粒模板1ul,RedTaqTM DNA聚合酶3ul,总反应体系50ul
经过PCR反应,酶切连接,转化获得多个克隆,挑选若干克隆抽提质粒,并作为PCR反应的模板进行鉴定,PCR产物进行琼脂糖电泳,在500bp位置有特异性条带,与目标基因蛋白A功能结构域的大小相符,在500bp之前较浅的条带应为引物二聚体。
2、EcoR I,Sal I双酶切鉴定:10×buffer H 2ul,0.1%BSA 2ul,EcoR I和Sal I各1ul,DNA 1ul,总体积20ul,37℃酶解
目标基因蛋白A约500bp的片断双酶切,两端分别为EcoR I和Nhe I位点。载体pBV221中的EGFP基因N端有两个相近的位点:EcoRI和Nhe I,EGFP的两端是EcoR I和Sal I位点。经酶切连接转化后,对重组质粒进行EcoR I和Sal I双酶切证实,含有EGFP的质粒pBV221双酶切获得的小片断在700bp左右的位置,与EGFP的大小相符,而阳性克隆因为加入了500bp的目标基因,所以双酶切小片断在1200bp的位置。通过上述两部初步证明重组质粒构建成功。经联合基因集团有限公司测序进一步确定重组质粒序列准确。
3、融合基因热诱导表达与提取
转化菌37℃扩增过夜,次日1:20稀释,30℃继续扩增至OD600约0.4-0.6,转至42℃热诱导3小时。收集菌体超声波破碎:100g/L菌体浓度,水重悬,480W,15min间隔破碎,离心收集上清和沉淀。经过42℃热诱导,超声波破碎获得的菌体总蛋白进行SDS-PAGE电泳,以相同条件诱导和破碎的pBV221(空载体)和含有EGFP基因的pBV221为对照。在43kD左右,转化菌显示有明显的特异性条带,与蛋白nA-EGFP的分子量相符。超声波破碎离心后的沉淀也含有目标蛋白,由此可见,融合蛋白在宿主菌内大量可溶性表达。对照EGFP在27kD左右有特异性条带,而空载体pBV221则没有明显的特异表达带。
4、蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的活性鉴定:
SDS-PAGE电泳鉴定融合蛋白的表达情况,Native-PAGE电泳鉴定融合蛋白的EGFP活性,双向免疫扩散和Western blotting鉴定融合蛋白与抗体的结合活性。
双向免疫扩散:为了鉴定融合蛋白中蛋白A功能结构域结合IgG的活性,用免疫球蛋白参考血清和羊抗人IgG诊断血清进行双向免疫扩散,并以EGFP的菌体蛋白作为对照,结果显示,融合蛋白能与上述血清都产生明显的沉淀线,而对照EGFP没有形成,该沉淀线在荧光显微镜下用蓝光激发能观察到荧光,与背景的暗色不同。
Western Blotting:SDS-PAGE电泳后凝胶进行Western blotting鉴定,转膜后封阻过夜,直接用酶标二抗(羊抗兔)与之孵育,EGFP的菌体蛋白作为阴性对照,结果显示,融合蛋白的特异性条带显色清楚,而对照没有该特异性条带。
Native-PAGE:Native-PAGE电泳过程保留了蛋白质活性,电泳结束后,直接在普通紫外监测仪下观察,蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白呈现亮色条带,而其他任何条带在紫外照射下看不到。
实验材料
质粒与菌株:含pTSAPA-2的菌株BE21(pTSAPA-2含有改造的蛋白A基因序列,Takeshi Sano),pBV221(INVITROGEN公司,含有改造的EGFP基因序列)。
试剂:RedTaqTM DNA聚合酶(北京赛百盛基因技术有限公司),限制性内切酶EcoR I(华美生物工程公司),限制性内切酶Nhe I、SalI和T4 DNA ligase(宝生物工程有限公司),SD004 DNA MARKER(北京鼎国生物),日常型质粒DNA小量快速制备试剂盒(V-geneBiotechnology limited),DNA凝胶回收试剂盒(V-gene Biotechnologylimited)。

Claims (6)

1、一种蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白,其特征在于:由蛋白A功能结构域与荧光蛋白融合而成。
2、如权利要求1所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白,其特征在于:由蛋白A功能结构域与绿色荧光蛋白融合而成。
3、如权利要求1所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白,其特征在于:由蛋白A功能结构域与增强型绿色荧光蛋白融合而成。
4、一种蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的构建方法,其特征在于:分别在蛋白A基因的5′和3′端加入EcoR I和Nhe I位点,进行双酶切,回收得到蛋白A功能结构域;另外,双酶切含有荧光蛋白的质粒载体;将双酶切的两产物连接在一起形成重组质粒,再转化感受态细胞。
5、如权利要求4所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的构建方法,其特征在于:其中荧光蛋白为绿色荧光蛋白。
6、如权利要求4所述的蛋白A功能结构域—荧光蛋白的融合蛋白的构建方法,其特征在于:其中荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白。
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