CN102146417B

CN102146417B - 利用tat核心肽段促进外源蛋白可溶性表达的方法及其专用表达载体

Info

Publication number: CN102146417B
Application number: CN201010119397.8A
Authority: CN
Inventors: 张成岗; 吴永红; 高艳
Original assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-03-08
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2030-03-08
Also published as: CN103865945A; CN102146417A

Abstract

本发明公开了一种利用TAT核心肽段促进原核表达体系高效、可溶性表达外源蛋白的方法及其专用表达载体。该专用表达载体是含有一个或多个TAT核心多肽编码区的原核表达载体。该方法包括以下步骤：1)将外源基因插入该专用表达载体中，得到含有TAT核心多肽编码区和外源基因的原核表达载体；2)将原核表达载体向原核表达体系转化；3)原核表达载体的诱导表达；4)外源蛋白的制备。经检测，表达产物主要以可溶性的形式存在宿主菌裂解上清中，且占裂解上清总蛋白的25-30％，可以获得高产量的外源蛋白，可大量制备具有生物活性的外源蛋白。

Description

利用TAT核心肽段促进外源蛋白可溶性表达的方法及其专用表达载体

技术领域

本发明属于生物技术产品应用领域，涉及外源蛋白的大量制备方法，特别涉及种利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的方法及其专用表达载体。

背景技术

众所周知，蛋白质是机体生命活动的重要执行者，也是目前市场上大量使用的蛋白类药物的物质基础。如何实现有功能的、高活性蛋白质的大量制备并进一步显著提升生物制品的生产效率，不仅是生物工程领域亟待解决的问题，而且还是基于蛋白质药物研发领域的一大难题。

TAT(Trans-activator transduction)是HIV-1(Human Immunodeficiency Virus-1)编码的一段富含碱性氨基酸序列的多肽，属于蛋白转导结构域家族的成员，目前的研究揭示该家族主要还包括Antp、HSV VP22和人工合成的多聚精氨酸和多聚赖氨酸等，能够介导多种外源物质如蛋白质、核酸和其他颗粒性物质(如纳米材料)等通过所有生物膜性结构，而不失去外源物质的活性。

根据病毒株的不同，TAT全长含有86-102个氨基酸不等，核心区含有11个氨基酸(YGRKKRRQRRR)。Frankel与Green分别于1988年独立证明全长TAT多肽能够跨膜转导入细胞，激活HIV-LTR的启动子，继而激活后续蛋白的表达(Frankel et al，Cellularuptake of the TAT protein from human immunodeficiency virus.Cell 1988，55(6)：1189-1193；Green et al，Autonomous functional domains of chemicallysynthesized human immunodeficiency virus TAT trans-activator protein.Cell1988，55(6)：1179-1188)；1994年，Fawel等研究进一步揭示TAT具有蛋白转导活性(Fawell et al，TAT-mediated delivery of heterologous proteins into cells.Proc Natl Acad Sci USA 1994，91(2)：664-668)；而Vives等于1997年揭示TAT中一段富含碱性氨基酸、带正电荷的核心肽段具有蛋白转导活性，后续许多研究都是基于TAT核心区的跨膜转导功能展开(Vives et al，A truncated HIV-1 TAT proteinbasic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulatesin the cell nucleus.J Biol Chem 1997，272(25)：1601016017)。但直到目前为止，所有的研究仅停留在TAT介导外源物质跨膜转导现象的层面，没有资料介绍对TAT多肽其它功能的研究。

发明内容

本发明提供了一种利用TAT核心肽段(氨基酸序列：序列表中序列3)促进外源蛋白高效、可溶性表达的专用表达载体。

本发明所提供的专用表达载体，是含有一个或多个TAT核心多肽编码区的原核表达载体。

所述TAT核心多肽编码区为能够根据三联体密码组合成其氨基酸序列的任意核酸编码序列，如序列1所示的tayggnmgna araarmgnmg ncarmgnmgn mgn序列，其中y＝a、t、g或c，m＝a、t、g或c，n＝a、t、g或c，r＝a、t、g或c；优选的核苷酸序列可如序列表中序列2所示的tacggcagga agaagcggag acagcgacga aga。

用于构建所述专用表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，如pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30等，优选为pET28。

其中，以pET28为出发载体构建的专用表达载体为pET28b-TAT。

另一方面，用以上所述的专用表达载体构建的带外源基因的原核表达载体也属于本发明。具体的，可以为图2(B)所构建的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP，或图6(B)所构建的原核表达载体pET28b-TAT-NGB。

本发明的第二个目的是提供一种利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的方法。

本发明所提供的利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的方法，可包括以下步骤：

1)将外源基因插入上述专用表达载体中，得到含有TAT核心多肽编码区和外源基因的原核表达载体；

2)将原核表达载体向原核表达体系转化；

3)原核表达载体的诱导表达；

4)外源蛋白的制备。

制备得到的外源蛋白可采用SDS-PAGE、免疫印迹和荧光显微镜观察等方法鉴定。

在上述外源蛋白的表达方法中，步骤1)中的原核表达载体中，所述TAT核心肽段可以是一个拷贝或多个拷贝与外源蛋白的核酸编码序列相连接；所述TAT核心肽段编码区可以置于外源蛋白编码序列的上游或下游。

步骤2)中的原核表达体系可为大肠杆菌或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。

所述大肠杆菌可为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5α、HB101或JM109等。

上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。

步骤3)中可采用化学试剂诱导外源基因在宿主细胞中表达，其中，化学试剂诱导表达条件可为：采用500mL摇瓶发酵(150mL/瓶)；诱导剂IPTG诱导表达(终浓度1mM)；诱导表达的OD₆₀₀＝0.6-1.0；诱导表达时间6-8小时。

此外，还可低温诱导外源蛋白的表达，低温诱导表达条件为：采用平皿涂布制备克隆；4℃低温诱导表达；诱导表达时间4天。

步骤4)中外源蛋白的制备方法可为：用预冷的PBS重悬菌体后超声破碎、离心。

本发明提出了TAT核心肽段促进原核表达体系高效可溶性表达外源蛋白的新用途，并具体提供了一种利用TAT核心肽段促进原核表达体系高效、可溶性表达外源蛋白的方法及其专用表达载体。经检测，表达产物主要以可溶性的形式存在宿主菌裂解上清中，且占裂解上清总蛋白的25-30％。通过本发明的实施，不仅可以获得可溶性的外源蛋白，而且还可以获得高产量的外源蛋白，可为大量制备具有生物活性的外源蛋白奠定基础和提供关键技术，可望解决生物工程和药物研发领域等外源蛋白难以高效表达的部分难题，从而可显著节约后续进行外源蛋白分离纯化的成本等。虽然TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的具体机制还有待进一步研究，但是这种通过与TAT核心肽段融合而促进外源蛋白高效、可溶性表达的技术不仅可用于显著提升外源蛋白的表达量并促进其形成正确的折叠构象，而且在提高原核表达生产水平和提升生物工程产品生产效率等方面也具有十分重要的应用价值。因此，本发明具有十分广泛的应用前景，有望成为生物工程研究和药物研发的重要技术手段。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达方法的流程图

图2为原核表达载体pET28b-EGFP/TAT-EGFP构建示意图

图3为离心后诱导表达菌体示意图

图4为TAT-EGFP和EGFP蛋白表达情况鉴定分析

图5为荧光显微镜观察分析TAT-EGFP和EGFP的荧光信号强弱

图6为原核表达载体pET28b-NGB/TAT-NGB构建示意图

图7为离心后诱导表达菌体示意图

图8为TAT-NGB菌液裂解上清示意图

图9为TAT-NGB和NGB蛋白表达情况鉴定分析

图10为荧光显微镜观察及分析TAT-EGFP和EGFP荧光信号变化

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、构建利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的专用表达载体pET28b-TAT

首先通过化学合成的方法合成含有酶切位点为NcoI(上游)和NdeI(下游)的双链TAT的核心编码序列片段(本实施例中选用序列表中序列2)，然后采用限制性内切酶NcoI和NdeI双酶切该核心片段和空载体pET28b，分别回收目的片段后，经T4 DNA连接酶连接外源DNA片段和空载体，转化入感受态细胞BL21(DE3)。按照常规方法提取质粒DNA并进行NcoI和NdeI双酶切鉴定，最后送英骏公司直接测序，确证含有TAT核心片段的原核表达载体pET28b-TAT构建成功，为后续TAT功能的鉴定奠定了基础。

实施例2、利用TAT核心肽段促进增强型绿色荧光蛋白(EGFP)高效、可溶性表达

如图1所示，用本发明的方法促进增强型绿色荧光蛋白(EGFP)高效、可溶性表达，具体方法包括以下步骤：

一、构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和pET28b-EGFP

1、通过聚合酶链式反应技术(PCR)扩增目的基因EGFP

通过常规PCR方法扩增出EGFP的cDNA片段，50μl PCR反应体系为：模板DNA 0.5μl；10×dNTP 5μl；10×LA Taq缓冲液5μl；上下游引物各0.5μl；LA Taq酶0.25μl，ddH₂O 38.25μl。PCR反应条件为：95℃2分钟；95℃30秒，56℃45秒，72℃60秒(32个循环)；72℃7分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约717bp的目的片段。

2、限制性内切酶分别酶切目的基因EGFP、载体pET28b和pET28b-TAT

如图2所示((A)：pET28b多克隆位点示意图；(B)：原核表达载体pET28b-TAT-EGFP的构建示意图；(C)：原核表达载体pET28b-EGFP的构建示意图)，用限制性内切酶EcoRI和NotI切割目的基因EGFP和载体pET28b-TAT，用限制性内切酶BamHI和XhoI切割目的基因EGFP和载体pET28b，回收酶切产物后用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化涂布LB平皿。

3、鉴定

将长出的克隆分别通过限制性内切酶酶切及测序鉴定，得到序列及插入位置均正确的携带TAT核心肽段编码区和EGFP的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和作为对照的携带EGFP的原核表达载体pET28b-EGFP。

二、转化宿主大肠杆菌及菌体复苏

将步骤一构建正确的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和pET28b-EGFP转化入大肠杆菌BL21(DE3)并涂布至LB平皿待长出克隆，各组分别挑取一个克隆接种到5mL含有Kana⁺(终浓度100μg/mL)的LB培养基中，37℃、220rpm摇菌约16小时，待菌体完全复苏。

三、原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和pET28b-EGFP的诱导表达

将复苏的菌液稀释至OD₆₀₀＝0.8，然后吸取5mL菌液接种到150mL含有Kana⁺(终浓度100μg/mL)的LB培养基中，37℃、220rpm摇菌约4-5小时后测定OD₆₀₀，待OD₆₀₀＝0.6-1.0时迅速加入诱导剂IPTG(终浓度1mM)，并于30℃、220rpm诱导表达6小时。在诱导表达0小时、2小时、4小时和6小时时各组分别取菌液10mL待制备样品检测。

四、蛋白样品的制备

上述诱导表达菌液于4℃、12000rpm离心10分钟收集菌体，然后于4℃低温下拍照，如图3所示(左边两个为TAT-EGFP离心菌体，右边两个为EGFP离心菌体。)，从实验结果可以直观地看出TAT-EGFP表现出明显的绿色荧光，且其荧光信号明显强于EGFP，这说明制备的TAT-EGFP具有显著的活性；预冷的PBS重悬菌体后超声破碎，制备总蛋白；另取预冷的PBS重悬菌体后超声破碎，在4℃、12000rpm离心收集上清和沉淀，分别制备上清蛋白和沉淀蛋白样品待鉴定。

五、蛋白样品鉴定

1、SDS-PAGE和免疫印迹鉴定

上述制备的蛋白样品分别采用15％SDS-PAGE和免疫印迹鉴定，然后采用ImageJ图像分析软件和Origin 8.0统计软件分析作图，结果如图4所示((A)：15％SDS-PAGE鉴定；(B)：免疫印迹鉴定；(C)：柱状图显示)。从图中可以看出，TAT-EGFP和EGFP蛋白均以可溶性的形式表达于上清中，且TAT-EGFP总蛋白表达量及上清蛋白表达量明显高于EGFP(参见图4中(A)和(B))，柱状图分析也显示了同样的结果(图4中(C)，**：P＜0.01，与EGFP比较)。上述实验数据显示TAT核心肽段不仅能够提高外源蛋白的表达量，而且能够促进外源蛋白可溶性表达。

2、荧光显微镜观察

结果如图5所示((A)：图像采集及组合分析；(B)：TAT-EGFP和EGFP图片放大2倍的效果图)，从图中可以看出TAT-EGFP的荧光信号明显强于EGFP，而对照组未见任何荧光信号(图5(A))；当将TAT-EGFP和EGFP组合图片放大后，还可以清楚地看到TAT-EGFP单个细胞的荧光强度也明显强于EGFP(图5(B))。

实施例3、利用TAT核心肽段促进人源脑红蛋白(rhNGB)高效、可溶性表达

如图1所示，用本发明的方法促进人源脑红蛋白(rhNGB)高效、可溶性表达，具体方法包括以下步骤：

一、构建携带人源脑红蛋白(rhNGB)编码基因的原核表达载体pET28b-TAT-NGB和pET28b-NGB

1、通过聚合酶链式反应技术(PCR)扩增目的基因NGB

通过常规PCR方法扩增出NGB的cDNA片段，50μl PCR反应体系为：质粒模板0.5μl；10×dNTP 5μl；10×Ex Taq缓冲液5μl；上下游引物各0.5μl；Ex Taq酶0.25μl，ddH₂O 38.25μl。PCR反应条件为：95℃4分钟；95℃45秒，56℃30秒，72℃45秒(30个循环)；72℃7分钟。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约453bp的目的片段。

2、限制性内切酶分别酶切目的基因NGB、载体pET28b和pET28b-TAT

如图6所示((A)：pET28b多克隆位点示意图；(B)原核表达载体pET28b-TAT-NGB的构建示意图；(C)：原核表达载体pET28b-NGB的构建示意图)，用限制性内切酶BamHI和Xho I切割目的基因NGB和载体pET28b-TAT，用限制性内切酶BamH I和Xho I切割目的基因NGB和载体pET28b-TAT，回收酶切产物后用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化涂布LB平皿。

3、鉴定

将长出的克隆分别通过限制性内切酶酶切及测序鉴定，得到序列及插入位置均正确的携带TAT核心肽段编码区和NGB的原核表达载体pET28b-TAT-NGB和作为对照的携带NGB的原核表达载体pET28b-NGB。

二、转化宿主大肠杆菌及菌体复苏

将步骤一构建正确的原核表达载体pET28b-TAT-NGB和pET28b-NGB转化入大肠杆菌BL21(DE3)并涂布至LB平皿待长出克隆，各组分别挑取一个克隆接种到5mL含有Kana⁺(终浓度100μg/mL)的LB培养基中，37℃、220rpm摇菌约16小时，待菌体完全复苏。

三、原核表达载体pET28b-TAT-NGB和pET28b-NGB的诱导表达

将复苏的菌液稀释至OD₆₀₀＝0.8，然后吸取5mL菌液接种到150mL含有Kana⁺(终浓度100μg/mL)的LB培养基中，37℃、220rpm摇菌约4-5小时后测定OD₆₀₀，待OD₆₀₀＝0.6-1.0时迅速加入诱导剂IPTG(终浓度1mM)，并于30℃、220rpm诱导表达8小时。

四、蛋白样品的制备

上述诱导表达菌液于4℃、12000rpm离心10分钟以收集菌体，然后于4℃低温下拍照(如图7所示，左边为TAT-NGB离心菌体，右边为NGB离心菌体)，从实验结果可以直观地看出TAT-NGB呈现出鲜艳的肉红色，且其肉红色明显强于NGB，这说明制备的TAT-NGB具有明显的活性；预冷的PBS重悬菌体后超声破碎，4℃、12000rpm离心收集上清并于4℃低温条件下拍照(如图8)，超声上清也呈现出鲜艳的肉红色，进一步说明TAT-NGB具有活性，最后制备蛋白样品待鉴定。

五、蛋白样品鉴定

步骤四制备的蛋白样品采用15％SDS-PAGE和免疫印迹鉴定，然后采用ImageJ图像分析软件和Origin 8.0统计软件分析作图，结果如图9所示((A)：15％SDS-PAGE鉴定；(B)：免疫印迹鉴定；(C)：柱状图显示)。从图中可以看出，TAT-NGB和NGB蛋白均主要以可溶性的形式表达于上清中，且TAT-NGB总蛋白表达量及上清蛋白表达量明显高于NGB(图9(A)和(B))，柱状图分析也显示了同样的结果(图9(C)，**：P＜0.01，与NGB比较)。

实施例4、利用TAT核心肽段在未添加诱导剂及4℃低温条件下促进增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的高效、可溶性表达

具体构建方法见实施例2。

二、转化宿主大肠杆菌及菌体复苏

将步骤一构建正确的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和pET28b-EGFP转化入大肠杆菌BL21(DE3)并涂布至含有Kana⁺(终浓度100μg/mL)的LB平皿上，置于37℃恒温箱孵育10-12小时待长出克隆。

三、原核表达载体的诱导表达

将上述长出克隆的平皿(平皿上不含任何诱导剂)迅速置于4℃恒温冰箱低温诱导表达4天，其间0小时、24小时、48小时、72小时和96小时分别采集图像。

四、荧光显微镜观察分析

将步骤三4℃低温条件下诱导表达的克隆置于荧光显微镜下观察蛋白表达情况，实验结果如图10所示((A)：荧光显微镜观察TAT-EGFP和EGFP单克隆荧光信号变化；(B)：线条图显示TAT-EGFP和EGFP荧光变化)。TAT-EGFP单克隆的荧光信号随着时间的增加在增强，且在24小时时增加最快(图10(A))；统计分析也显示了同样的结果，24小时时，TAT-EGFP和EGFP都达到了较高表达水平，随着时间的增加二者的表达水平缓慢增加，但总体上TAT-EGFP的表达量明显高于EGFP(图10(B)，*：P＜0.05，**：P＜0.01，与EGFP比较)。

用实施例1同样方法，以pBV220、pET30、pCRT7/CT-TOPO、pET101/D-TOPO或pQE30为出发载体可以得到系列的利用TAT核心肽段促进外源蛋白高效、可溶性表达的专用表达载体，并可进一步按照实施例2或3或4的方法得到高表达水平的外源蛋白。另外，转化宿主不限于大肠杆菌，也可为枯草杆菌等；所用的大肠杆菌也不限于E.coliBL21(DE3)，也可以为E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5α、HB101或JM109等。借鉴本发明技术，这些过程均成为常规操作，恕不再一一例举。

序列表

<160>3

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>y＝a、t、g或c，m＝a、t、g或c，n＝a、t、g或c，r＝a、t、g或c

<223>

<400>1

tayggnmgna araarmgnmg ncarmgnmgn mgn 33

<210>2

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

tacggcagga agaagcggag acagcgacga aga 33

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

Claims

1.一种利用TAT核心肽段促进外源蛋白脑红蛋白NGB或增强型绿色荧光蛋白EGFP高效、可溶性表达的专用表达载体，是含有一个TAT核心多肽编码区的原核表达载体，用于构建所述专用表达载体的出发载体为pET28b；所述TAT核心多肽编码区的核苷酸序列如序列表中序列2所示，置于外源蛋白编码序列的上游。

2.利用权利要求1所述的专用表达载体构建的带外源基因的原核表达载体，为图2(B)所构建的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP。

3.利用权利要求1所述的专用表达载体构建的带外源基因的原核表达载体，其特征在于，为图6(B)所构建的原核表达载体pET28b-TAT-NGB。

4.一种利用TAT核心肽段促进外源蛋白脑红蛋白NGB或增强型绿色荧光蛋白EGFP高效、可溶性表达的方法，包括以下步骤：

1)将外源基因EGFP或NGB插入权利要求1所述的专用表达载体中，得到图2(B)或图6(B)所构建的含有TAT核心多肽编码区和外源基因的原核表达载体；

2)将所述原核表达载体向原核表达体系转化；

3)原核表达载体的诱导表达；

4)外源蛋白的制备。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的原核表达载体中，TAT核心肽段是一个拷贝与外源蛋白的核酸编码序列相连接；TAT核心肽段编码区置于外源蛋白编码序列的上游。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的原核表达体系为大肠杆菌或枯草杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plys、BLR(DE3)、B834、DH5α、HB101或JM109。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的诱导表达为化学试剂诱导表达，化学试剂诱导表达条件为：终浓度1mM的诱导剂IPTG诱导表达；诱导表达的OD₆₀₀=0.6-1.0；诱导表达时间6-8小时。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述的诱导表达为低温诱导表达，低温诱导表达条件为：采用平皿涂布制备克隆；4℃低温诱导表达；诱导表达时间4天。