CN1614033A - 血管紧张素ii 2型受体基因与原发性高血压的相关性 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测原发性高血压易感性的方法，它包括检测个体的血管紧张素II 2型受体基因AT₂R、转录本和/或蛋白与正常相比是否存在变异，存在变异就表明该个体患原发性高血压的可能性大于正常人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒。

Description

血管紧张素II2型受体基因与原发性高血压的相关性

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地涉及人血管紧张素II2型受体基因(Angiotensin II type 2 receptor gene，AT₂R)的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其与原发性高血压的相关性。本发明还涉及检测这些SNP的方法和试剂盒。

背景技术

原发性高血压(essential hypertension，EH)是最常见的心血管疾病，其发病率逐年上升，并可引起严重的心、脑、肾并发症，是脑卒中和冠心病的主要危险因素。EH是一种由遗传因素和环境因素相互作用而发病的多基因病，寻找EH相关基因进而阐明高血压发病的遗传机制已经成为目前研究的热点(HarrapSB.Hypertension：genes versus environment.Lancet，1994，344：169-171)。

肾素-血管紧张素(RAS)系统是体内调节血压和水盐代谢的重要系统。血管紧张素II(AngII)作为系统中的关键环节，主要通过两种受体，即1型受体(AT₁R)和2型受体(AT₂R)来发挥作用(Clin AT，Herblin WF，McCall DE etal.Identification of angiotensin II receptor subtypes.Biochem BiophysRes Commun.1989；165：196-203)。研究表明AT₁R能介导AngII的血管收缩、醛固酮分泌、钠吸收和血管细胞增生等功能。(Timmermans PB，Wong PC，ChiuAT et al.Angiotensin II receptors and angiotensin II receptorantagonists.Pharmacol Rev 1993；45：205-51)，而AT₂R能拮抗这些功能发挥保护作用(Carey RM，Wang ZQ，Siragy HM.Role of the Angiotensin type2 receptor in the regulation of blood pressure and renal function.Hypertension 2000；35[part2]：155-163；Carey RM，Howell NL，Jin XH，Siragy HM. Angiotensin type 2 receptor-mediated hypotension inangiotensin type-1 receptor-blocked rats.Hypertension 2002；39(5)：E27-28)。虽然已有许多关于RAS系统基因多态性与原发性高血压的研究，但没有证实AT₂R基因与原发性高血压相关性的报道，更没有证实AT₂R基因的SNP与原发性高血压相关性的报道。

综上所述，为了最终实现治疗高血压，本领域迫切需要寻找原发性高血压易感基因，并开发检测原发性高血压的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种诊断(尤其是早期诊断)高血压等高血压的方法及检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供一种新的治疗高血压的方法。

本发明的再一目的是提供一种治疗高血压等高血压的药物组合物。

在本发明的第一方面，提供了一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，它包括步骤：

检测该个体的AT₂R基因、转录本和/或蛋白，并与正常的AT₂R基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

在另一优选例中，所述的方法中检测的是AT₂R的基因或转录本，并与正常AT₂R核苷酸序列比较差异。

在另一优选例中，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性：

      362位G→A；

      438位T→C；

      1334位T→C；

      1675位A→G；

      3066位C→T；

      3697位T→C；

      4297位G→T；

      4303位G→A；

      4599位C→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：17。

在本发明的第二方面，提供了一种检测样品是否存在AT₂R基因的单核苷酸多态性的方法，包括步骤：

(a)用AT₂R基因特异性引物扩增样品的AT₂R基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性：

       362位G→A；

      438位T→C；

      1334位T→C；

      3066位C→T；

      4599位C→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：17。

在另一优选例中，所述的单核苷酸多态性是1334位T→C。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的AT₂R蛋白以及药学上可接受的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种检测高血压的试剂盒，它包括特异性扩增AT₂R基因或转录本的引物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的试剂：

(a)与突变部位结合的探针；

(b)识别突变位点的限制性内切酶。

在另一优选例中，所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

      362位G→A；

      438位T→C；

      1334位T→C；

      1675位A→G；

      3066位C→T；

      3697位T→C；

      4297位G→T；

      4303位G→A；

      4599位C→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：17。

在另一优选例中，所述的单核苷酸多态性是1334位T→C。

附图说明

图1显示了AT₂R的一种SNP图像(以SNP03为例)的测序结果。

具体实施方式

本发明人经过多年研究，首次发现和证明了AT₂R基因与高血压密切相关，而且发现了它的新功能：AT₂R的改变将导致高血压，其中关联研究结果显示，在AT₂R第1334位的SNP03(T/C)在病例和对照组中的分布存在显著性差异(P＜0.05)，该SNP多态可改变转录因子结合位点。在此基础上完成了本发明。

AT₂R基因的详细序列可参见登录号为U208605的核苷酸序列(可参见网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，全长是5293bp(SEQ ID NO：17)。

本发明人对AT₂R基因中的2938bp区域进行了测序，包括其中启动子区为1501bp，5’UTR为160bp，编码区为1092bp，内含子为152bp，3’UTR为33bp。

基于本发明的新发现，AT₂R蛋白或多肽有多方面的新用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗AT₂R蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如高血压)，和用于筛选促进AT₂R蛋白功能的物质，如抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人AT₂R蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能刺激人AT₂R蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人AT₂R DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人AT₂R基因产物或片段。较佳地，指那些能与人AT₂R基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人AT₂R蛋白的分子，也包括那些并不影响人AT₂R蛋白功能的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人AT₂R基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人AT₂R蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断人AT₂R蛋白功能的抗体以及不影响人AT₂R蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人AT₂R基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人AT₂R基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人AT₂R蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人AT₂R蛋白。一种优选的抗AT₂R抗体是不识别正常AT₂R但识别突变AT₂R的抗体，或者识别正常AT₂R但不识别突变AT₂R的抗体。利用该抗体对正常和异常AT₂R蛋白的特异性差异，可以方便地进行蛋白质水平的高血压易感性检测。

利用本发明AT₂R蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与AT₂R蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明AT₂R蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

正常的AT₂R多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于高血压治疗。在使用本发明AT₂R蛋白时，还可同时使用其他治疗高血压的药剂。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明AT₂R蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的AT₂R蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人AT₂R蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于AT₂R蛋白的无表达或异常/无活性的AT₂R蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。构建携带AT₂R基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组人AT₂R基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明还涉及定量和定位检测人AT₂R蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测检测样品中是否存在AT₂R蛋白的方法是利用AT₂R蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与AT₂R蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在AT₂R蛋白。

AT₂R蛋白的多聚核苷酸可用于AT₂R蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，AT₂R蛋白的多聚核苷酸可用于检测AT₂R蛋白的表达与否或在疾病状态下AT₂R蛋白的异常表达。如AT₂R DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断AT₂R蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用AT₂R蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测AT₂R蛋白的转录产物。

检测AT₂R基因的突变也可用于诊断高血压。检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。AT₂R蛋白突变的形式包括与正常野生型AT₂R DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。一类优选的突变是表2所示的SNP。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1对象与方法

1.1研究对象

1.1.1中国人SNP发现和确认样本

样本为来自19个核心汉族高血压家系、无亲缘关系的19例原发性高血压病人。

1.1.2 SNP分型和关联分析初步研究样本

所有受试者均为汉族。原发性高血压组(EH组)和正常血压组(NT组)各96例，均来自中国上海地区，彼此无亲缘关系。EH组是上海市瑞金医院高血压科门诊确诊或在上海地区普查中确诊的高血压病患者，其中男46例、女50例，平均年龄49.7±7.13岁，入选标准为：(1)收缩压＞150mmHg和/或舒张压＞95mmHg(即除外临界高血压患者)，或正在接受抗高血压药物治疗一年以上；(2)在20岁之前或60岁以后发病者除外；(3)临床上除外继发性高血压。NT组为40岁以上居民，其中男47例、女49例，平均年龄49.4±5.30岁，收缩压＜140mmHg，且舒张压＜90mmHg。无高血压家族史，排除肝、肾、甲状腺、糖尿病史。EH组和NT组在年龄、性别构成上无统计学差别。

1.1.3 SNP分型和关联分析扩大研究样本

对于在上述初步研究中得到的阳性结果，扩大样本量后(EH组和NT组各250例)进一步验证。EH组男137例、女113例，平均年龄57.03±12.09岁。NT组男126例，女124例，平均年龄49.94±5.47岁。EH组和NT组在性别构成上无统计学差别。

1.2实验方法

1.2.1 DNA提取

常规酚-氯仿法提取外周血白细胞DNA，并标化DNA浓度值至20ng/μl。

1.2.2 PCR及测序引物的设计

根据GenBank中AT₂R的基因组序列，应用prime3软件(美国麻省理工生物医学白头研究所，http：//www-gonome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)设计引物。具体引物如下表1所示。

                           表1引物序列表

位置	引物名称	序列(5’-3’)	SEQ ID NO：
				启动子-1	AT2RL1N1F	gtgccttcctcttgctggtat	1
AT2RL1N1R	tatgtgccgaacactgtgatg	2
			启动子-2		AT2RL1N2F	aggtggtagagctgggtttgt	3
AT2RL1N2R	cttctaaaatttcggccttgc	4
				启动子-3	AT2RL1N3F	tgacagagacctatgaaaggaga	5
AT2RL1N3R	gccagctttccagagaggtt	6
			启动子-4和外显子1，2		AT2RL1N4F	gcacatttgtggaaacttcattt	7
AT2RL1N4R	ctggttgttgaagtttaaagcag	8
				外显子3-1	AT2RL2N1F	caaggatgtcctcagctctgt	9
AT2RL2N1R	actttgcacatcacaggtcca	10
			外显子3-2		AT2RL2N2F	tccttttggctactcttcctc	11
AT2RL2N2R	ggtcacgggttatcctgttct	12
				外显子3-3	AT2RL2N3F	agcaacatgctattttggaatta	13
AT2RL2N3R	tggtgagcctcaaagcaagta	14
			3’UTR		AT2RL2N4F	aactatgttatatcgtccagtga	15
AT2RL2N4R	tagattaactataaacctccactc	16

1.2.3 AT₂R基因的调控区和编码区分段体外扩增

以提取的DNA为模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR仪上以Touchdown程序进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10个循环，每个循环退火温度递减0.5℃；以后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。

1.2.4 SNP的发现和检测

PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI))进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件(美国华盛顿大学http：//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。

1.2.5 SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型。选择启动子区、第1内含子区和外显子区的高频SNP进行初步分型，即在96个高血压病人和96正常血压对照组中进行分型和关联分析，有阳性意义的位点再在250个高血压病人和250个正常血压对照组中进行分型和关联分析。

1.3统计学方法

SNPs各基因型在病人和正常血压对照中分布的比较采用R×C表x²检验。P＜0.05认为有统计学差别。

2.结果

2.1 AT₂R基因SNP的发现和分布

AT₂R的基因共有3个外显子，测序总长度是2938bp，共发现9个SNP，包括启动子区3个，编码区2个，3′非编码区3个，内含子1个，其中5个是新发现的SNP。AT₂R基因SNP分布情况见表2。测序确认杂合子图像见图1。

              表2中国人AT₂R基因SNP的种类及其分布

SNP名称	在基因序列中的位置	基因区域	等位基因	检测引物
					SNP01	362	promoter	G/A	AT2RL1N1
SNP02	438	promoter	T/C	AT2RL1N1
					SNP03	1334	promoter	T/C	AT2RL1N4
SNP04	1675	intron	A/G	AT2RL1N4
					SNP05	3066	exon	C/T	AT2RL2N1
SNP06	3697	exon	T/C	AT2RL2N2
					SNP07	4297	3’UTR	G/T	AT2RL2N4
SNP08	4303	3’UTR	G/A	AT2RL2N4
					SNP09	4599	3’UTR	C/A	AT2RL2N4

说明：

(1)表中第一列为SNP的名称；第二列为SNP在AT₂R基因序列中的位置；第三列为SNP所属基因区域，Promoter为启动子区，Exon为外显子区，Intron为内含子区，3′UTR为3′末端非翻译序列；第四列为在等位基因中SNP的两个碱基；第五列为测序所用引物。

(2)SNP01，SNP02，SNP03(图1)，SNP05，SNP09为新发现的SNP。

(3)在基因序列中的位置以SEQ ID NO：17的序列为标准序列。

2.2 SNP位点的基因分型

在各为96例的EH组和NT组中，对3个SNP(SNP03、SNP04、SNP05)进行初步基因分型和关联分析。

结果提示，SNP03等位基因分布在两组中有显著差异(P＜0.05)(表3)，即扩大样本，在250例原发性高血压病人和250例正常血压对照中对该SNP进行分型和关联研究。结果表明该SNP与高血压显著相关(P＜0.05)(表4)。

                      表3：3个SNPs基因分型和关联分析结果

                        男性                                      女性

                   频率                                  频率

SNP

          等位基因1   等位基因2   x²     P       等位基因1   等位基因2   x²     P

          EH    CON   EH    CON                    EH    CON   EH    CON

SNP03     0.80  0.95  0.20  0.05  12.72   0.0004   0.84  0.97  0.16  0.03  7.05   0.0079

SNP04     0.48  0.67  0.52  0.33  8.00    0.0047   0.67  0.74  0.33  0.26  0.863  0.353

SNP05     0.96  0.98  0.04  0.02  2.56    0.262    0.96  0.98  0.04  0.02  1.006  0.316

                      表4 SNP03基因分型和关联分析结果

                           基因型    等位基因频率

                     TT        TC    CC     T         C          x2        p

男性    EH    137    113       0     24     0.825     0.175      5.63      ＜0.05

        NT    126    113       0     13     0.897     0.103

女性    EH    113    72        39    2      0.810     0.190      1.732     0.188

        NT    124    93        26    5      0.854     0.145

EH，原发性高血压NT，正常血压对照

3.讨论

高血压是遗传因素与多种环境因素相互作用而导致的多基因疾病，其遗传机制的研究已经成为目前的研究热点。迄今研究者已经成功地确定了几种单基因遗传性高血压的候选基因，但占高血压约95％的原发性高血压的遗传方式和易感基因仍未确认。研究候选基因是原发性高血压遗传研究的主要策略之一。RAS系统是体内调节血压和水盐代谢的重要系统，该系统中的AGT、ACE、AT₁R、AT₂R、REN、RENBP等均为原发性高血压的候选基因。

AT₂R基因位于X染色体上，约5kb长，包括3个外显子，其启动子区和第一个内含子与基因的调控有关(Martin MM，Elton TS.The sequence andgenetic organization of the human type 2 angiotensin II receptor.Biophys Res Commun 1995；209：554-562；Warnecke C，Willich T，HolzmeisterJ，Bottari S，Fleck E，Regitz-Zagrosek V.Efficient transcription ofthe human angiotensin II type 2 receptor gene requires intronic sequenceelements.Biochem J 1999；340：17-24)。研究发现AT₂R能拮抗AT₁R而发挥保护性作用如舒张血管、利钠、抗血管增生等，并在动物中对血压调节起重要作用(Carey RM，Wang ZQ，Siragy HM.Role of the Angiotensin type 2receptor in the regulation of blood pressure and renal function.Hypertension 2000；35[part2]：155-163；Carey RM，Wang ZQ，Siragy HM.Update：role of the angiotensin type-2(AT(2))receptor in bloodpressure regulation.Curr Hypertens Rep 2000；2(2)：198-201)。但因其表达在胚胎早期较高，而出生后迅速下降；在成体中的表达也仅局限于肾上腺、心脏、大脑等少数组织(Shanmugam S，Llorens-Cortes C，Clauser E，CorvolP，Gase JM.Expression of angiotensin II AT₂ receptor mRNA duringdevelopment of the rat kidney and adrenal gland.Am J Physiol 1995；268：F922-F930；Sechi LA，Griffin CA，Grady EF，Kalinyak JE，SchambelanM.Characterization of angiotensin II receptor subtypes in rat heart.Circ Res 1992；11：1482-1489)，故对其的研究特别是多态性方面的研究很少。

本发明人首次在中国人群中对该基因启动子区、3个外显子及其连接区内含子共2938bp进行了SNP检测，共发现9个SNP，包括启动子区3个，编码区2个，3′非编码区3个，内含子1个。与NCBI的SNP数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中的数据相比较，本发明在中国人群中发现的9个SNP，该库收录的仅4个，它们分别是SNP04、SNP06、SNP07和SNP08，其余5个SNP(SNP01、SNP02、SNP03、SNP05和SNP09)均为未被该库收录的新SNP。这反映了SNP的分布存在种族差异性。

由于多基因疾病表现型的复杂性、相关基因的微效性和人群的遗传异质性，其相关基因定位克隆研究一直是一个很大的挑战。在原发性高血压候选基因中筛选多态性标记，然后在病例-对照中进行相关分析是目前寻找疾病相关基因的重要方法之一。SNP数量多、分布广、密度高，是进行遗传连锁分析和关联研究最理想的遗传标记。本研究从AT₂R基因的9个SNP中选出启动子区、第一个内含子和第一个外显子区内各1个SNP(SNP03、SNP04、SNP05)，在上海地区汉族中，通过病例-对照分析，进行它们与高血压间的相关性研究。结果表明这3个SNP在上海地区汉族中都存在，并在一项病例-对照组各为250例的研究中发现SNP03(1334T/C)的2种等位基因频率分布，在男性EH组和NT组之间有显著性差异(P＜0.05)。

AT₂R基因的这个位于启动子区的SNP是一个新发现的SNP，该位点涉及3个转录因子的结合位点(V$COMP1.01、V$RBPJK.01和V$HMGIY.01)，T到C的改变将失去其中1个转录因子的结合位点V$RBPJK.01，且不能增加新的结合位点，设想该位点能够影响AT₂R基因的表达，从而影响AT₂R的功能。而该SNP等位基因频率分布的差异在男性中存在，可能与该基因位于X染色体而对男性与女性的影响不同有关。本发明的结果提示，AT₂R基因变异与上海汉族人群EH发病相关，尤其是男性的EH发病相关。

实施例2

原发性高血压易感性检测试剂盒

制备一试剂盒，它含有：

名称        序列(5’→3’)           编号          浓度

正向引物    gcacatttgtggaaacttcattt  SEQ ID NO：7  干粉2OD

反向引物    ctggttgttgaagtttaaagcag  SEQ ID NO：8  干粉2OD

PCR反应液  含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

抽取待检测男性病人的血液3ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从血液中提取DNA。将高血压检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所提取的DNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

检测结果图1所示，其中，含C表示高血压易感性高于正常人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                            序列表

<110>上海市高血压研究所

     国家人类基因组南方研究中心

<120>血管紧张素II 2型受体基因与原发性高血压的相关性

<130>036164

<160>17

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

gtgccttcct cttgctggta t                                            21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

tatgtgccga acactgtgat g                                            21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

aggtggtaga gctgggtttg t                                            21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

cttctaaaat ttcggccttg c                                              21

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

tgacagagac ctatgaaagg aga                                            23

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gccagctttc cagagaggtt                                                20

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

gcacatttgt ggaaacttca ttt                                            23

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

ctggttgttg aagtttaaag cag                                           23

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

caaggatgtc ctcagctctg t                                             21

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

actttgcaca tcacaggtcc a                                             21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>11

tccttttggc tactcttcct c                                             21

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

ggtcacgggt tatcctgttc t                                            21

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

agcaacatgc tattttggaa tta                                          23

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

tggtgagcct caaagcaagt a                                            21

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

aactatgtta tatcgtccag tga                                          23

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

tagattaact ataaacctcc actc                                             24

<210>17

<211>5293

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>17

aactatagaa acccatctag tcacaagttt ctccttcctg tggtctccat ttgggcaata      60

caattaagaa aaatacgttt ccccacataa caattcttcc aattcttttc cccttctttg     120

atgcttttat gatagattat gaatggtcat cagtgatttt ctgtaaatgc cacgtttcct     180

ttttgccaag acaaagagtg agactaaggg accatctagt gccttcctct tgctggtata     240

gaggctaaac agcgtgagtt ctgatattag tttcctttga tttaaatgca agtgtcttca     300

tttaatagct gtatgatctc agaaaagtta ttaaactcta tgagtcctag tttcctgatt     360

tgtaaagtgg gggctaatat gaatagcttg taatagcacc taccatatgc taggcatgat     420

tttaggcact ttaaacatat tagctcattt aaatttccat tagcttattt aaaattccta     480

ctctacgatg taggtaattt atatcattct cctttctcag atgagaaact gagacatgaa     540

gaagtaaagt aacttggcca aggtcagaat tagtaggtgg tagagctggg tttgtaaagc     600

caggtagttg gatcccagag gctatttact aaccagtgtg ctatattgcc tctctattaa     660

attattgatg ataaataact catcacagtg ttcggcacat aacatttatt gtcagctagt     720

attatcacta ccatcacctg ttcttatctt tcttcatttt gtcactcttg cttctgctgg     780

attggttgtg tagtttattg cccccactgc cacaagagac agcagcaaca gtgatctagg     840

ttgaaatagc tagctaatcc ctcttcactt tatgtgcttt gtatttaaac cacaaatatg     900

acagagacct atgaaaggag actaaacctc tttttggtcg tgtaaaaatt atattcctgc     960

aatctccaac cctccagcaa caagccaaca aaaactgcgc aaagcaaggc cgaaatttta    1020

gaagtggtag acttcaagta aaattcctac cattctttaa taaacagggg taaaaatttc    1080

agaaagtaat gaaggttgtg aaagctgatg aagcaaagac tttgctacta taataaattt    1140

cctagtctct actcactaat ttctattaga atgccaatat caggaaaaaa ggaagagaaa    1200

attctgtaaa taacttacta tatttttctc ctacgaagta agccactgac ttcaaaattc    1260

tctagcacat ttgtggaaac ttcatttttt ttgtttgaga tttatttgaa tgagctgtta    1320

tgattggaga cagtgagaat ttcagattaa tgttttgcag tcaaaaaaaa acctctctgg    1380

aaagctggca agggttcata agtcagccct agaattatgt aggttgaagg ctcccagtgg    1440

acagaccaaa catataagaa ggaaaccaga gatctggtgc tattacgtcc cagcgtctga    1500

gagaacgagt aagcacagaa ttcaaagcat tctgcagcct gaattttgaa ggtaagtatg    1560

aagcaattta tatataattt acttggaagg tagaacatac attaaatgaa aatatttttt    1620

atggatgaac ttctgttttt cctgtgtttt aacactgtat tttgcaaaac tcctaaatta    1680

tttagctgct gtttctctta caggagtgtg tttaggcact aagcaagctg atttatgata    1740

actgctttaa acttcaacaa ccagtaagtc ttcaagtgga atttattatt gattctttta    1800

tgttaatttg ttaggtcaaa agaaaaatct ttagagcaaa ataaaagttt tgctctttat    1860

taggaggttc tttagatatt acacttttaa ttgggtagct tatttgcatg tattttgaaa    1920

ctatctaaag taaatagtgt ttcctttgta tgcttatctt tagctaatgt gttttttttt    1980

tggtttaaat atgctctagt gaaaaaatca caaaactcac actgtaacgt ttgagagcaa    2040

cggctattca gttcggttaa accgaaaaga gagaaaaaga aaaatgataa gactatatca    2100

tgattaatca ttgatgttca tttctcattt cactgagcaa tctaaactac ttctacttga    2160

acctaacata ggtttggctg tttttttctt tatctgattt aattgaaaat ggattgttta    2220

gatattaaat agaccaaaat tagatatcta tatctaaaac taatattctc tattaaaagg    2280

agaagactta gaaatataaa tatatttcat aacttcttct taactatatt attattgtga    2340

aaacaataga aaagtaaaac taaaggaatt atttttaatt attaaagaca aaccatgatt    2400

ccccatcaca atatgttcct ttggcatatt ctcttttagt tttttatata cttatttttt    2460

ccattgctta tgttacttat attttccaca gctgtagtga tttgtatgta attagttact    2520

taaatagagc atttctctat gcaatagcaa gcagcagtgt ggtttctaga aagtatacaa    2580

acagagatat atgctcaagt gttttttgaa agattacttt tcttacctct gggtttctta    2640

tttgtttcac acatttcctg ccctgactaa tcttttgaaa tattaatttt ctttaaatct    2700

ttcaaaaaca tcatagaaaa gatggcgaaa aggtagtttt attcagaact ttgaatctct    2760

gaaatgtctt ttttctacta tcaggaaaat tatttctcct ttttcaagag gtaaaatgaa    2820

ttcttgtttt acaagccatg gctctgtttc ttaatgtttt ctataatcac tcactttttt    2880

tttgcttttg acaaacattc aaaatgctaa tgattcaagg atgtcctcag ctctgtatgt    2940

gttctaagag ttctatgttt tttctccaca gaaggcataa gaactaggag ctgctgacat    3000

ttcaatatga agggcaactc cacccttgcc actactagca aaaacattac cagcggtctt    3060

cacttcgggc ttgtgaacat ctctggcaac aatgagtcta ccttgaactg ttcacagaaa    3120

ccatcagata agcatttaga tgcaattcct attctttact acattatatt tgtaattgga    3180

tttctggtca atattgtcgt ggttacactg ttttgttgtc aaaagggtcc taaaaaggtt    3240

tctagcatat acatcttcaa cctcgctgtg gctgatttac tccttttggc tactcttcct    3300

ctatgggcaa cctattattc ttatagatat gactggctct ttggacctgt gatgtgcaaa    3360

gtttttggtt cttttcttac cctgaacatg tttgcaagca ttttttttat cacctgcatg    3420

agtgttgata ggtaccaatc tgtcatctac ccctttctgt ctcaaagaag aaatccctgg    3480

caagcatctt atatagttcc ccttgtttgg tgtatggcct gtttgtcctc attgccaaca    3540

ttttattttc gagacgtcag aaccattgaa tacttaggag tgaatgcttg cattatggct    3600

ttcccacctg agaaatatgc ccaatggtca gctgggattg ccttaatgaa aaatatcctt    3660

ggttttatta tccctttaat attcatagca acatgctatt ttggaattag aaaacactta    3720

ctgaagacga atagctatgg gaagaacagg ataacccgtg accaagtcct gaagatggca    3780

gctgctgttg ttctggcctt catcatttgc tggcttccct tccatgttct gaccttcctg    3840

gatgctctgg cctggatggg tgtcattaat agctgcgaag ttatagcagt cattgacctg    3900

gcacttcctt ttgccatcct cttgggattc accaacagct gcgttaatcc gtttctgtat    3960

tgttttgttg gaaaccggtt ccaacagaag ctccgcagtg tgtttagggt tccaattact    4020

tggctccaag ggaaaagaga gagtatgtct tgccggaaaa gcagttctct tagagaaatg    4080

gagacctttg tgtcttaaac gtgagagcaa aatgcatgta atcaacatgg ctacttgctt    4140

tgaggctcac cagaattatt tttaagtggt tttaataaaa taataaaatt tcccctaatc    4200

ttttctgaat cttctgaaac caaatgtaac tatgttttat cgtccagtga ctttcaggaa    4260

ttgcccattg tttttctgat atgtttgtac aagattttca ttggtgagac atatttacaa    4320

cctagaagta actggtgata tatctcaaat tgtaattaat aatagattgt gaataatgat    4380

ttggggattc agatttctct ttgaaacatg cttgtgtttc ttagtggggt tttatatcca    4440

tttttatcag gatttcctct tgaaccagaa ccagtctttc aactcattgc atcatttaca    4500

agacaacatt gtaagagaga tgagcacttc taagttgagt atattataat agattagtac    4560

tggattattc aggctttagg catatgcttc tttaaaaacg ctataaatta tattcctctt    4620

gcatttcact tgagtggagg tttatagtta atctataact acatattgaa tagggctagg    4680

aatatagatt aaatcatact cctatgcttt agcttatttt tacagttata gaaagcaaga    4740

tgtactataa catagaattg caatctataa tatttgtgtg ttcactaaac tctgaataag    4800

cactttttaa aaaactttct actcatttta atgattgttt aaaggtttct attttctctg    4860

atactttttt gaaatcagta aacactgtgt attgttgtaa aatgtaaagg tcacttttca    4920

catccttgac tttttagatg tgctgctttg atatatagga cattgatttg atttttatta    4980

ttaatgcttt ggttctgggt tgtttcctaa aatatctggg tggcttaaaa aaaactcttt    5040

aacttgtaat aaacccttaa ctggcatagg aaatggtatc cagaatggaa ttttgctaca    5100

tggggtctgg gtgggggcaa agagacccag tcaattacat gtttggtacc aagaaaggaa    5160

cctgtcaggg cagtacaatg tgactttgaa aatatatacc gtgggggtag ttttacccta    5220

tatctataaa cactgtttgt tccagaatct gtatgattct atggagctat tttaaaccaa    5280

ttgcaggtct aga                                                       5293

Claims (10)

1.一种对个体的高血压易感性进行诊断的方法，其特征在于，它包括步骤：

检测该个体的AT₂R基因、转录本和/或蛋白，并与正常的AT₂R基因、转录本和/或蛋白相比较，

存在差异就表明该个体患高血压的可能性高于正常人群。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测的是AT₂R的基因或转录本，并与正常AT₂R核苷酸序列比较差异。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的差异是选自下组的单核苷酸多态性：

   362位G→A；

   438位T→C；

   1334位T→C；

   1675位A→G；

   3066位C→T；

   3697位T→C；

   4297位G→T；

   4303位G→A；

   4599位C→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：17。

4.一种检测样品是否存在AT₂R基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)用AT₂R基因特异性引物扩增样品的AT₂R基因，得到扩增产物；和

(b)检测扩增产物中是否存在选自下组的单核苷酸多态性：

   362位G→A；

   438位T→C；

   1334位T→C；

   3066位C→T；

   4599位C→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：17。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是1334位T→C。

6.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的AT₂R蛋白以及药学上可接受的载体。

7.一种检测高血压的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增AT₂R基因或转录本的引物。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，它还含有选自下组的试剂：

(a)与突变部位结合的探针；

(b)识别突变位点的限制性内切酶。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的突变是选自下组的单核苷酸多态性：

      362位G→A；

      438位T→C；

      1334位T→C；

      1675位A→G；

      3066位C→T；

      3697位T→C；

      4297位G→T；

      4303位G→A；

      4599位C→A；

其中，核苷酸位置编号基于SEQ ID NO：17。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是1334位T→C。

Images