CN1592752A - 用于治疗癌症的e2f－1/细胞周期蛋白相互作用的抑制剂 - Google Patents

用于治疗癌症的e2f－1/细胞周期蛋白相互作用的抑制剂 Download PDF

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CN1592752A
CN1592752A CNA018210104A CN01821010A CN1592752A CN 1592752 A CN1592752 A CN 1592752A CN A018210104 A CNA018210104 A CN A018210104A CN 01821010 A CN01821010 A CN 01821010A CN 1592752 A CN1592752 A CN 1592752A
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Abstract

本发明的新型化合物具有通式Ia－d的结构。本发明的化合物涉及具有如下氨基酸序列的8肽、7肽、6肽和5肽或它们的可药用盐或酯，其被统称为具有“式Ia－d”，该化合物可以抑制转录因子E2F－1与细胞周期蛋白A的相互作用。作为E2F－1/细胞周期蛋白A相互作用的拮抗剂，本发明的化合物可以用于癌症的治疗。

Description

用于治疗癌症的E2F-1/细胞周期蛋白相互作用的抑制剂
本发明的技术领域
本发明总的来说涉及一种新型的肽化合物，其可以抑制E2F-1细胞调节蛋白与细胞周期蛋白A的结合。本发明提供了新型化合物、新型组合物、它们的应用方法以及制备方法，其中该类化合物一般是药理学上有用的物质，可以在治疗中作为治疗物质，其作用机理是抑制E2F-1/细胞周期蛋白A的相互作用，更特别地是用于治疗癌症。
本发明的背景技术
最近的研究证明E2F-1转录活性在细胞生长的调节中有着重要的作用，特别是在G1/S相转变期间起着重要的作用。其功能由G1细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)所调控的Rb族蛋白质控制着E2F族成员的活性。在人癌症发展期间，这种控制途径中各种组分的破坏是正常发生的事件。
哺乳动物细胞周期的进展是由cdks的依次活化所驱动的。Cdk活性又在转移后的修饰中受到调控并且是通过与调节蛋白如细胞周期蛋白的相互作用而调控的。各细胞周期蛋白与所首选的cdks的子集结合，然后所形成的细胞周期蛋白-cdk复合体一般在细胞周期的特定时期内一般表现出最高的激酶活性。
将对主体的毒性降到最低的一种癌症治疗方法是研制优先杀死细胞周期途径中发生了改变的细胞的药物。使用体外的激酶结合抑制试验和体内的生长抑制试验可以对治疗癌症用的化合物进行鉴别，或者可进一步用其为其它新的肽或非肽抑制剂的设计体提供一种骨架。
除了在细胞增殖中的作用外，近来一些观测表明在细胞凋亡(程序细胞死亡)中也可能涉及E2F-1。具体地讲，细胞周期蛋白A/cdk2对E2F-1 DNA-结合活性的抑制与依次进行的S期进展有关；破坏这种联系可导致S期延迟和继发细胞凋亡的细胞周期停止。因此，E2F-1/细胞周期蛋白A/cdk2复合体的破坏是抗肿瘤药物研发的有吸引力的靶点。
建立了ELISA来鉴别E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用的拮抗剂。这种方法是以三种蛋白，即E2F-1、细胞周期蛋白A和cdk2之间的相互作用为基础的，并且是通过比色法来进行分析的。用这种试验方法来测定生物学试验所用的各种合成肽的IC50值，并进行SAR研究。
这些合成肽可被用作对细胞周期调控进行进一步研究的研究工具或是用作制备新的结合(嵌合)肽或其它修饰的肽的中间体，并且在细胞生长抑制试验中进行了测试。可以用能够在转化的细胞系中造成细胞生长抑制和细胞死亡的肽来对其肿瘤对该化合物有反应的患者进行癌症治疗，并且可将其用于癌症患者的治疗方案中。
发明概述
本发明的化合物是包含选自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽或其可药用的盐：
Cap-AA8-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 8肽 Ia
Cap-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 7肽 Ib
Cap-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 6肽 Ic
Cap-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 5肽 Id
其可抑制转录因子E2F-1与细胞周期蛋白A的相互作用。作为E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用的拮抗剂，本发明的化合物可用于癌症的治疗中。在文献中还没有有关用环状肽或非肽抑制E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用的先例。
因此，本发明的目的是提供能抑制E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用的化合物。本发明的另一个目的是提供用式Ia-d的化合物来治疗癌症的方法。本发明的另一个目的还在于提供包含式Ia-d的化合物的药物组合物。本发明的另一个目的还在于提供一种用式Ia-d的化合物来在体外抑制E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用的方法。
发明详述
本发明涉及一种分离的包含选自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽及其可药用的盐：
Cap-AA8-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 8肽 Ia
Cap-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 7肽 Ib
Cap-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 6肽 Ic
Cap-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 5肽 Id
其中
AA1选自：
(a)甘氨酸(Gly)，
(b)丙氨酸(Ala)，
(c)亮氨酸(Leu)，和
(d)小的脂肪族氨基酸；
AA2选自：
(a)苯丙氨酸(Phe)，
(b)噻吩丙氨酸(Tha)，
(c)环己基丙氨酸(Cha)，
(d)酪氨酸(Tyr)，
(e)吡啶基丙氨酸(Pya)，
(f)色氨酸(Trp)，和
(g)另一种芳族氨基酸；
AA3选自：
(a)Leu，
(b)环丙基丙氨酸(Cpa)，和
(c)一种天然或非天然的脂肪族氨基酸；
AA4选自：
(a)赖氨酸(Lys)，
(b)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代的Lys，
(c)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的鸟氨酸(Orn)，和
(d)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的高赖氨酸(hLys)；
AA5选自：
(a)精氨酸(Arg)，
(b)Lys，
(c)Orn，
(d)hLys，和
(e)组氨酸(His)；
AA6选自：
(a)Lys，
(b)hLys，
(c)Orn，
(d)其中Nε被一或两个选自C5-C20烷基、直链或支链C1-C6基、环化的饱和或不饱和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基如苯甲基以及C6-C20芳基如苯基的基团所取代的Lys，和
(e)其中Nδ被一或两个选自C5-C20烷基、直链或支链C1-C6酰基、环化的饱和或不饱和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基如苯甲基以及C6-C20芳基如苯基的基团所取代的Orn；
AA7选自：
(a)Ala，
(b)缬氨酸(Val)，和
(c)一种天然或非天然的氨基酸，或其拟似物或等排物；
AA8选自：
(a)脯氨酸(Pro)，
(b)一种天然或非天然的氨基酸，或其拟似物或等排物；且
Cap不存在或优选地是非限制性地选自：
(a)C1-C8酰基，和
(b)C3-C8环烷基烷酰基或呋喃基乙酰基；
该肽优选连接到核定位肽序列上，其中所说的核定位肽序列是，例如但不仅限于HIV-1 Tat或触角足(antennapedia)肽序列(penetratin)。符号(*)表示一个用于分子内键合的位置。该分子内键合是经由一个酰胺键、取代的酰胺键或其等排物而进行的。当上述肽中的任何一种通过用星号标明的(*)氨基酸进行连接时，该化合物是环状的5肽、6肽、7肽或8肽。与线性链肽相比，优选环状的肽。这些肽还可以是与其它所需氨基酸相连的聚氨基酸片段。各肽序列的N-末端可以以同样的方式被一个“Cap”基团所加帽。任何氨基酸都可以被其拟似物、等排物或类似物所代替。
优选地，本发明涉及分离的包含选自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽及其可药用的盐：
Cap-AA8-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 8肽 Ia
Cap-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 7肽 Ib
Cap-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 6肽 Ic
Cap-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 5肽 Id
其中
AA1选自：
(a)Gly，
(b)Ala，和
(d)Leu；
AA2选自：
(a)Phe，
(b)Tha，
(c)Cha，
(d)Tyr，
(e)Pya，和
(f)Trp；
AA3选自：
(a)Leu，
(b)Cpa，和
(c)一种天然的脂肪族氨基酸；
AA4选自：
(a)Lys，
(b)Orn，和
(c)hLys；
AA5选自：
(a)Arg，
(b)Lys，
(c)Orn，
(d)hLys，和
(e)His；
AA6选自：
(a)Lys，
(b)hLys，
(c)Orn；
AA7选自：
(a)Ala，
(b)Val，和
(c)一种天然的氨基酸；
AA8选自：
(a)Pro，
(b)一种天然的氨基酸；且
Cap不存在或优选地选自：
(a)乙酰基(Ac)、环丙基羰基、环丙基乙酰基(Cpr)、新戊酰基、异丙基羰基、异丙基乙酰基、2，2-二甲基丁酰基(Dmb)、乙酰丙酰基、环丙基甘氨酰基(Cpg)、二甲基甘氨酰基(Dmg)，和
(b)环戊基乙酰基、环己基乙酰基、环庚基乙酰基、呋喃基乙酰基；该肽可以任选地连接于核定位肽序列HIV-1 Tat或触角足肽序列(penetratin)上；
并且符号(*)表示一个经由酰胺键而进行连接的任选的分子内键合位置；所形成的化合物可以分别是环状5肽、6肽、7肽或8肽。
本发明优选化合物的实例非限制性地包括如下的化合物：
环状5肽：
Ac-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Ac-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
环状6肽：
Ac-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-(CH(CH3)(C13H27))-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，[见实施例1]
Dmb-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Dmb-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
环状7肽：
Ac-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Cpr-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
环状8肽：
Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，[见实施例2]
Ac-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Cpr-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
其中的圆括号表示在环化中所涉及的残基；
以及它们可药用的盐。
本发明的化合物参照如下通式的八肽来进行命名：
Cap-AA8-AA7-AA6-AA5-AA4-AA3-AA2-AA1
其中“AAX”代表在从C-末端上的AA1开始的八肽中的“第x”(x＝1-8)位上的氨基酸。‘Cap’是一种连接于N-末端上的非氨基酸基团。AA1是羧基末端残基。命名是以如下的形式给出的：氨基末端‘cap’，接着是第一残基的三个字母代码，然后是一个连字符和第二残基的三个字母代码，再然后是一个连字符和第三残基的三个字母代码，等等(三个字母代码是标准的肽命名法：参见氨基酸和肽命名法J.Biol.Chem 260，14-42以及IUPAC-IUB命名法推荐)。用可接受的命名来称呼非天然的氨基酸。
这里所用的“肽”的定义在适宜的情况中还包括多肽。
这里所用的“烷基”包括具有特定碳原子数的直链和支链的饱和或不饱和脂肪族烃。“酰基”表示通过-C(O)-桥相连的具有所标明碳原子数目的烷基。
这里所用的“分离的”是指是如果其是天然存在的话则将该物质从其原始环境例如自然环境中分离出来。
本发明的化合物是序列：Ac-Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-Leu-Phe-Gly的线性或环状类似物。该线性序列是一些与细胞周期蛋白A进行结合的细胞周期调节蛋白的共有序列，可有效抑制E2F-1与细胞周期蛋白A的结合。确定了许多可提供所需抑制活性水平的化合物。
最初所确定的序列如表1所示：
                 表I：最初确定的序列
序列 来源 IC50(nM)
Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Asp-Leu 得自E2F-1     10
Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-Leu-Phe-Gly 共有序列     100
Ser-Ala-Cys-Arg-Asn-Leu-Phe-Gly p27序列     200
在这些序列中，测定了抑制E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用所需的最小肽长度，并将其列于下面的表II中：
           表II：线性和环状类似物的IC50
肽          IC50(nM)
  线性   环状
Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-*Leu-Phe-Gly*   100   1
Ac-Ala-Lys-Arg-Lys-*Leu-Phe-Gly*   200   10
Ac-Lys-Arg-Lys-*Leu-Phe-Gly*   1,000   20
Ac-Arg-Lys-*Leu-Phe-Gly*   30,000   3,000
该肽是在Lys*的氨基侧链和Gly*的羧基之间进行环化的。注意：按照普遍接受的规则，在下文中将Pro-Ala-Lys-Arg-Lys-*Leu-Phe-Gly*用Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)表示，其中，括号内的残基是涉及成环的残基。获得有效抑制作用所需的最小序列是5-8个残基。该环状类似物一般是比相应的线性类似物好50-100倍的抑制剂。在共有序列——Pro8-Ala7-Lys6-Arg5-Lys4-Leu3-Phe2-Gly1中抑制E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用所需的关键残基是Lys6、Arg5、Leu3以及Phe2。最佳的活性肽是该环化的共有序列，但是，Pro8、Ala7和/或Lys6可以被其它的氨基酸、拟似物、等排物或类似物代替。在Lys6的情况中，其可以用其它的胺和硫醇代替，如可用半胱氨酸(Cys)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸以及乙酰丙酸所代替。其还可以被hLys、Orn或带有Nε的Lys和带有Nδ取代基的Orn所代替，所述取代基是C5-C20线性或支链、直链或环化的饱和或不饱和烷基，或可以被C6-C20芳基如苯基、C5-C20芳基烷基如苯甲基或Arg所代替。Ala7可以被Pro、直链或支链酰基所代替。
在Arg5的情况中，虽然该肽中可以有Arg拟似物、等排物或类似物，但是对Arg5的替换对活性不利。Leu3对于活性而言很关键。Phe2的存在也很关键，虽然其也可以有其它的拟似物、等排物或类似物，优选芳基或疏水性基团。Gly1是环状肽所需要的。
在环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)中关键残基的鉴别
为了评估环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)中各氨基酸在与细胞周期蛋白A结合中的作用，将各氨基酸用一种等排物进行替换，然后用体外ELISA来测定抑制活性。
A.苯丙氨酸(Phe，F)的替换
用各种Phe等排物来合成一些环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的类似物并对它们的活性进行测定。数据表明所用的所有Phe的氨基酸等排物都不能增加原始的先导物环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的活性。但是，可用非天然的氨基酸如Tha和Cha代替Phe而不会使该环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的活性有很大降低。
B.亮氨酸(Leu，L)的替换
用各种Leu等排物来合成一些环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的类似物并对它们的活性进行测定。所得结果表明用于替换Leu的所有氨基酸等排物都不会使原始的先导物2的活性增加。但是，可用非天然的氨基酸如Cpa替换Leu而不会使活性降低。
C.抑制作用所需最小序列的鉴别
环状肽是通过从环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的N-末端上依次除去氨基酸，然后用一个乙酰基封端来进行合成的，然后在体外ELISA中对这些肽的抑制活性进行分析(表III)。E2F-1/细胞周期蛋白A相互作用所需的绝对最小序列是环状6肽，4。
          表III：各种肽的IC50
肽序列     ELISAIC50(nM)
Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，2     1
Ac-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，3     10
Ac-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，4     20
Ac-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，5     1,000
将4的乙酰基用一些其它的酰基进行替换，并且在ELISA中对各种类似物的活性进行测定。将乙酰基用异丙基羰基、异丙基乙酰基-、新戊酰基-、环丙基羰基、环丙基乙酰基-进行替换得到与环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)等效的6肽类似物。这种对第二个疏水性袋状残基的处理可以从环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)上除去两个氨基酸而不会丧失抑制活性。
本发明的化合物可以用蛋白质合成的标准方法，用其组成的氨基酸来进行制备，其中所说的蛋白质合成的标准方法为例如Schroeder等人，“肽”，第I卷，Academic Press，1965，或Bodanszky等人，“肽合成”，IntersciencePublishers 1966，或McOmie(ed.)，“有机化学中的保护基”，Plenum Press1973，以及“肽、分析、合成、生物学”2，第1章，George Barany和R.B.Merrifield，Academic Press，1980，纽约。
两个氨基酸或一个氨基酸和一个肽以及两个肽的缩合可以用常用的缩合方法来进行，如叠氮化物法，混合酸酐法、碳二亚胺法、活性酯法(对-硝基苯基酯法、BOP[苯并三唑-1-基氧基-三-(二甲基氨基)-磷鎓六氟磷酸盐]法、N-羟基琥珀酸亚氨基酯法等等)、伍德沃德试剂K法或HBTU法。在固相法中将肽链延长的情况中，将该肽在C末端氨基酸的位置上连接一种不溶性的载体。对于不溶性的载体而言，可以使用可与该C-末端氨基酸的羧基进行反应从而形成一个以后易于裂解的键的物质，例如，可以使用一种卤代甲基树脂如氯甲基树脂和溴甲基树脂、羟基甲基树脂、氨基甲基树脂、对-羟基甲基苯基乙酰胺(PAM)树脂、二苯甲基胺树脂、叔烷氧基羰基-酰肼树脂或SASRIN、Wang树脂或三苯甲基树脂。
肽化学合成的共同之处在于用适宜的保护基团对各种氨基酸部分的反应性侧链在需要保护的部位进行保护，直至该链被完全组装好后才最终除去该保护基团。共同之处还在于氨基酸或片段上α-氨基的保护，从而可以在羧基上进行实体反应然后选择性地除去该α-氨基保护基以使得该位置上发生后面的反应。因此，作为合成中的共同步骤，生产了一种中间体化合物，其包括位于带有这些具有侧链保护基的各种残基的肽链的所需序列中的各氨基酸残基。然后，通常基本上同时除去这些保护基以制备出所需产物，随后进行纯化。
适于保护该α-和ω-侧链氨基的保护基团有，例如苄氧基羰基、异烟酰氧基羰基(iNOC)、邻-氯苄氧基羰基、对-硝基苄氧基羰基、对-甲氧基苄氧基羰基、叔-丁氧基羰基(Boc)、叔戊氧基羰基(Aoc)、异冰片氧基羰基、金刚烷氧基羰基、2(4，4-联苯)-2-丙氧基羰基(Bpoc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、甲基磺酰基乙氧基羰基(Msc)、三氟乙酰基、邻苯二酰、甲酰基、2-硝基苯基硫(NPS)、二苯基硫膦基(Ppt)、二甲基硫膦基(Mpt)等等。
作为羧基的保护基团，可以列举的实例有例如苯甲基酯(Bzl)、叔-丁基环酯(t-Bu)、4-吡啶基甲基酯(OPic)等等。希望在必要时用适宜的保护基团将特定氨基酸所具有的除氨基和羧基外的其它功能基保护起来，其中所说的特定氨基酸为例如Arg、Cys和丝氨酸(Ser)。例如Arg中的胍基可以用硝基、对-甲苯磺酰基、苄氧基羰基、金刚烷氧基羰基、对-甲氧基苯磺酰基、4-甲氧基-2，6-二甲基苯磺酰基(Mds)、1，3，5-三甲基苯磺酰基(Mts)、2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(PBF)、三苯甲基等等来进行保护。在半胱氨酸中的巯基可以用对-甲氧基苯甲基、三苯基甲基、乙酰基氨基甲基、乙基氨基甲酰基、4-甲基苯甲基、2，4，6-三甲基苯甲基(Tmb)等等来进行保护，在Ser中的羟基可以用苯甲基、叔-丁基、乙酰基、四氢吡喃基等等来进行保护。
Stewart和Young在“固相肽合成”，Pierce Chemical Company，Rockford，III.(1984)中给出了有关肽制备的详细信息。α-氨基的保护在第14-18页进行了描述，侧链阻断在第18-28页进行了描述。在第149-151页上给出了用于胺、羟基和巯基官能团的保护基的表格。这些描述在这里被引入作为参考。
本发明的肽还可以用制造商所提供的方案用自动的肽合成仪来进行制备，其中所说的自动的肽合成仪为例如Beckman，Applied BiosystemsInc.，或使用采用标准Fmoc方案的Milligen Co.An Applied BiosystemsABI 433A肽合成仪。所需的氨基酸衍生物和树脂通过商业来源购得。反相HPLC用市售的HPLC系统在YMC C18柱上进行，使用乙腈/0.1％TFA水溶液的线性梯度洗脱。在215、230、254和280nm对洗脱进行监测。用质谱技术对经过提纯的肽进行分析。用在DMF中的荧光黄-5-马来酰亚胺和DIEA(4当量)在肽的Cys残基上对该肽用荧光黄进行标记。
本发明的化合物可以根据如下的实施例或其变体用易于获得的起始材料、试剂和常规的合成方法来容易地进行制备。在这些反应中，其还可进行各种变型，这些变型对于本领域普通技术人员而言都是公知的，在这里不再进行详细的描述。
在一个实施方案中，本发明提供了一种抑制E2F-1细胞调节蛋白与细胞周期蛋白A结合的方法，该方法包括给需要进行该种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的肽或其可药用的盐。
本发明的肽及其可药用的盐抑制E2F-1细胞调节蛋白与细胞周期蛋白A结合的能力可以用这三种蛋白，即E2F-1、细胞周期蛋白A和cdk2之间的相互作用为基础的ELISA来进行证实。这种试验可测定用于生物学实验或SAR研究的各种合成肽的IC50值。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括给需要进行该种治疗的哺乳动物施用治疗有效量的本发明的肽或其可药用的盐。
本发明还包括用于抑制E2F-1细胞调节蛋白与细胞周期蛋白A的结合的药物组合物，该药物组合物包含可药用的载体或稀释剂和治疗有效量的本发明的肽或其可药用的盐。
本发明还提供了用于哺乳动物的治疗方法中的本发明的肽或其可药用的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含本发明的肽或其可药用的盐和可药用载体的药物组合物。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗哺乳动物癌症的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本发明的肽或其可药用的盐和可药用的载体。
本发明还涉及本发明的肽或其可药用的盐在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
本发明还进一步涉及本发明的肽或其可药用的盐在治疗癌症中的用途。
本发明的化合物可以以可药用盐的形式来进行给药。术语“可药用的盐”是指所有可接受的盐，如醋酸盐、乳糖酸盐、苯磺酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、realate、碳酸氢盐、马来酸盐、硫酸氢盐、扁桃酸盐、酒石酸氢盐、甲磺酸盐、硼酸盐、溴化物、甲基硝酸盐、乙二胺四乙酸钙盐、甲基硫酸盐、樟脑磺酸盐、粘酸盐、碳酸盐、萘磺酸盐、氯化物、硝酸盐、棒酸盐、N-甲基葡糖胺、枸橼酸盐、铵盐、二盐酸盐、油酸盐、乙二胺四乙酸盐、草酸盐、乙二磺酸盐、双羟萘酸盐(扑酸盐)、丙酸酯十二烷基硫酸盐、棕榈酸盐、乙磺酸盐、泛酸盐、延胡索酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、葡庚糖酸盐、聚半乳糖醛酸盐、葡萄糖酸盐、水杨酸盐、谷氨酸盐、硬脂酸盐、乙醇酰对氨基苯胂酸盐、硫酸盐、己基间苯二酚盐、碱式乙酸盐、哈胺盐、琥珀酸盐、氢溴酸盐、单宁酸盐、盐酸盐、酒石酸盐、羟基萘甲酸盐、8-氯茶碱盐、碘化物、甲苯磺酸盐、异硫代硫酸盐、乳酸盐、panoate、戊酸盐等等，这些盐可以以剂型的形式被应用，以改变溶解度或水解特性，或者可以以缓释或前体药物制剂的形式被应用。根据本发明化合物的特定官能团，本发明化合物的可药用盐包括那些由阳离子所形成的盐和由碱所形成的盐，其中所说的阳离子如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌，所说的碱如氨、乙二胺、N-甲基谷酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苯甲基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苯甲基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三-(羟基甲基)氨基甲烷以及氢氧化四甲基铵。
这些盐可以用标准的方法来进行制备，例如通过将游离酸与适宜的有机或无机碱进行反应来进行制备。在存在碱性基团如氨基的情况中，可以用酸盐，即盐酸盐、氢溴酸盐、三氟醋酸盐、醋酸盐、双羟萘酸盐等等作为剂型。
在存在酸性基团(-COOH)或醇基团的情况中，还可以使用可药用的酯，例如醋酸酯、马来酸酯、新戊酰氧基甲基酯等等，这些酯在现有技术中已知可改善溶解度或水解特性，可用作缓释或前体药物制剂。
本发明的化合物或其衍生物除了那些在式Ia-d中对其立体化学进行了描述的中心外还可以具有其它手性中心，从而其可以以外消旋体、外消旋混合物的形式以及各旋光对映体或非对映异构体的形式存在，所有这些同分异构形式及其混合物都被包括在本发明中。此外，本发明化合物或其衍生物的一些结晶可以以多晶型物的形式存在，其也包括在本发明中。此外，本发明的一些化合物可以与水或常用的有机溶剂形成溶剂化物。该类溶剂化物也属于本发明的范畴。
术语“治疗有效量”是指能引起组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的药物或药用物质的数量，该数量由研究人员、兽医、医生或其它临床医师来确定，所说的生物学或医学反应包括所治疗疾病症状的缓解。本发明的新治疗方法用于本领域技术人员公知的病症。
术语“哺乳动物”包括人。
根据各种因素来对使用本发明化合物的剂量方案进行选择，其中所说的各种因素包括患者的类型、种属、年龄、体重、性别和身体情况；所治疗病症的严重程度；给药途径；患者的肾功能和肝功能；以及其所使用的特定化合物。普通的医生或兽医可以容易地开出预防、对抗或阻止疾病进展所需的药物有效量。获得在起效而不产生毒性的范围内的药物浓度的最佳精确度需要一种以靶部位药物生物利用度的动力学为基础的方案。这包括要考虑药物的分布、平衡以及消除情况。
每个成人每天所用的该产品的日剂量可以在0.01至500mg的范围内变化。对于口服给药而言，该组合物优选地以包含0.01至500mg活性成分的片剂的形式被提供，该片剂优选包含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0或50.0mg的活性成分，根据症状对所治疗患者的剂量进行调整。药物的有效量可以通过每天约0.001mg/kg体重至约50mg/kg体重的剂量来获得。该范围特别是每天约0.01mg/kg体重至10mg/kg体重。
对于癌症的治疗而言，本发明的化合物可以与用于治疗癌症的已知物质一起使用。
对于使用一种以上的活性物质的联合治疗而言，在活性物质在不同制剂中的情况中，这些活性物质可以同时给药，或其可以各自独立地在错开的时间进行给药。
本发明的化合物可以在载体或陪伴载体中进行口服给药、静脉内给药、鞘内给药或通过非肠道的方式来进行给药，从而将该化合物有效地传递到体内的靶部位。
本发明的目的还在于提供用于本发明新型治疗方法中的适宜的口服、全身和非肠道的药物制剂。“治疗”的定义包括改善症状和/或阻止已知患有癌症或认为其患有癌症的个体的癌症进程。化合物的“给药”是指将一种本发明的化合物或本发明化合物的前体药物给予需要进行治疗的患者。治疗上述病症所用的包含作为活性成分的本发明化合物的组合物可以在全身给药用的常规赋形剂中以各种治疗剂型来进行给药。例如，该化合物可以以口服剂型如片剂、胶囊(各自还分别包括定时释放制剂和缓释制剂)、丸剂、粉末、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液、混悬剂、糖浆和乳剂的形式来进行给药，或可以通过注射来进行给药。它们还可以以静脉内给药(包括推注和输液)、腹膜内给药、鞘内给药、皮下给药、闭合或不闭合的局部给药或肌内给药的形式来进行给药，所有的应用形式对于药学领域的普通技术人员而言都是众所周知的。
在本发明的方法中，这里所详细描述的化合物可以形成该活性成分，并且一般是以与适宜的药用稀释剂或赋形剂形成的混合物的形式来进行给药，所说的稀释剂或赋形剂可以根据给药的形式来适宜的进行选择，即可以根据口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆等等来进行选择，并且与常规的药学实践相一致。
例如，对于片剂或胶囊的口服给药形式而言，该活性药物成分可以与一种口服的无毒可药用的惰性载体如乙醇、甘油、水等合用。此外，当需要或必需使用时，还可以向该混合物中加入适宜的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂。适宜的粘合剂非限制性地包括淀粉、明胶、天然的糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然胶和合成胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等等。在这些剂型中所用的润滑剂非限制性地包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等等。崩解剂非限制性地包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等等。
液体在适当矫味的助悬剂或分散剂如合成胶和天然胶，例如黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等中形成。可以使用的其它分散剂包括甘油等等。对于非肠道给药而言，需要无菌的混悬液和溶液。当需要进行静脉内给药时，通常使用包含适宜防腐剂的等渗制剂。
本发明的化合物还可以以脂质体传递系统如小单层囊、大单层囊和多层囊的形式进行给药。可以用各种磷脂来形成脂质体，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。
本发明的化合物可以与一些可生物降解的聚合物合用以便于实现对药物的控制释放，所说的聚合物为例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联或两亲性的水凝胶嵌段共聚物。
常规方法
在下面实施例中所给出的所有温度均为摄氏度。除非特别说明，所有从商业上获得的化合物在使用时都不需要进行进一步的纯化。当没有特别说明时，天然和非天然的氨基酸都是(L)构型。
肽合成
肽是用Applied Biosystems ABI433A肽合成仪，用标准的Fmoc方案来组装的。氨基酸衍生物和树脂购自Bachem Bioscience和MidwestBiotech。反相HPLC使用采用YMC C18柱的Waters HPLC系统，用乙腈/0.1％TFA水溶液来进行线性梯度洗脱。在215、230、254和280nm下对洗脱进行监测。用质谱T(SCIEX API III质谱仪)对进行了纯化的肽进行分析。
在表IV和V中列出了通常所用缩写的实例：
               表IV：在本文中所用的缩写
ABTS 2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉-磺酸)
Ala 丙氨酸
Arg 精氨酸
BSA 牛血清白蛋白
Cdk 细胞周期蛋白依赖性激酶
Cha 环己基丙氨酸
Cpa 环丙基丙氨酸
Cpr 环丙基乙酰基
Dmb 2，2-二甲基丁酸
DMEM 4’，6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐
ELISA 酶联免疫吸附测定
FBS 胎牛血清
Gly 甘氨酸
HEPES N-[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]
h-Lys 高赖氨酸
HOBt 1-羟基苯并三唑
HPLC 高效液相色谱法
HRP 辣根过氧化物酶
IC50 50％抑制浓度
Leu 亮氨酸
Lys 赖氨酸
Mtt 甲基三苯甲基
Orn 鸟氨酸
PBF 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
Phe 苯丙氨酸
Phg 苯基甘氨酸
Pro 脯氨酸
Pya 吡啶基丙氨酸
SAR 构效关系
TBS Tris缓冲盐水
TBST Tris缓冲盐水+0.1％Tween 20
Tha 噻吩丙氨酸
Val 缬氨酸
表V：通用的单氨基酸代码
代码 氨基酸
A 丙氨酸
C 半胱氨酸
D 天门冬氨酸
E 谷氨酸
F 苯丙氨酸
G 甘氨酸
H 组氨酸
I 异亮氨酸
K 赖氨酸
L 亮氨酸
M 蛋氨酸
N 天冬酰胺
P 脯氨酸
Q 谷酰胺
R 精氨酸
S 丝氨酸
T 苏氨酸
V 缬氨酸
W 色氨酸
Y 酪氨酸
生物学试验
测定特定的肽对肿瘤细胞生长抑制的材料和方法
细胞系(表VI)：将MDA-MB-435、U2OS、A549、MDA-MB-231细胞在另外添加了10％FCS的DMEM中培养。将SW480和HCT-116在另外添加了10％FCS的RPMI 1640中培养。
表VI：在试验中所用的人细胞系
细胞系缩写 细胞类型*
MDA-MB-435 乳癌
MDA-MB-231 乳癌
U2OS 结肠癌
A549 肺癌
SW480 结肠癌
HCT-116 结肠癌
WI38/VA13 SV40 SV40转化的人肺成纤维细胞
*所有的细胞系都得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD。
肽处理和荧光显微镜检查：以4×104细胞/孔的数量将细胞在48孔板中用10％FCS培养过夜。弃去培养介质，然后将细胞用Opti-MEM洗涤一次。将该细胞的单分子层在37℃下用各种浓度的肽溶液培养24小时。对于用荧光黄进行了标记的肽的检测而言，将细胞用PBS(pH＝7.3)清洗一次，然后用荧光显微镜(Axiovert 135，320倍)目测检验。
生长抑制作用的评估：以3×103细胞/孔的数量将细胞在96孔板中用10％FCS培养过夜。弃去培养介质，然后将细胞用Opti-MEM洗涤一次。将该细胞的单分子层在37℃下用各种浓度的肽溶液进行培养。用由3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓；MTS(得自Promega)和吩嗪硫酸二甲酯；PMS(得自Sigma)所组成的溶液对生长抑制作用进行评估。在24小时后，计算将生长抑制50％所需的浓度(IC50)。
肽：Tat-肽是在Applied Biosystems 433A肽合成仪上通过固相化学过程来进行合成的。将肽用荧光黄马来酰亚胺在它们的半胱氨酸残基上进行标记。Penetratin-肽是用可以获得的技术来进行合成的。肽的氨基酸序列如表VII所示。
               表VII：各种肽的序列
名称 序列
Tat YGRKKRRQRRRG
Tat-线性 YGRKKRRQRRRG PVKRRLDL
Tat-环状 YGRKKRRQRRRG PAKR(KLFG)
Tat-Smt(杂乱的) YGRKKRRQRRRGRLDLPKVRKRS
Tat-Umt(不相关的) YGRKKRRQRRRGETDHQYLAESS
FITC-Tat-mt FluMalCXYGRKKRRQRRRG PVKARLDL
Penetratin RQIKIWFQNRRMKWKK
penetratin-线性 RQIKIWFQNRRMKWKKPVKRRLFG
在将氨基酸用其通用的单氨基酸代码表示的情况中，Flu是荧光黄，Mal是马来酰亚氨基，X是Gly或Gly-Gly连接体。
结果
E2F-1/细胞周期蛋白A结合抑制作用。因为来自E2F-1的8-残基肽(87-94)可以破坏细胞周期蛋白A-cdk2复合体与E2F-1和p21的结合，所以在哺乳动物细胞中引入这些肽可以提供一种评估使E2F-1/细胞周期蛋白A杂二聚体灭活的生理学后果的方法。已经证实得自HIV-tat 47-56或由果蝇触角足同源结构域蛋白的第三螺旋获取的16个氨基酸残基的内化序列(表VII)可以通过生物膜转运。将Tat序列连接到E2F-1Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Asp-Leu、环化的共有系列Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)或杂乱的线性8肽上以生成Tat-线性、Tat-环状或Tat-mt。对penetratin系列进行相同的命名(表VII)。测定了这些融合肽对E2F-1/细胞周期蛋白A结合的抑制活性。Tat-线性、Tat-环状和penetratin-线性在0.1-1μM的范围内对E2F-1/细胞周期蛋白A结合试验表现出50％的抑制作用。
该IC50值比那些未进行核定位序列融合的物质高约1-100倍。相反，Tat、杂乱的-Tat或penetratin肽在高至100μM时仍未表现出抑制作用。用体外转运试验进行的GST-破坏试验获得了类似的结果。
Tat肽的摄取和细胞内区室化：对用荧光黄马来酰亚胺在半胱氨酸残基上进行了标记的Tat-mt肽的内化进行了研究。用质谱对进行了标记的肽进行检验并在使用前用HPLC进行纯化。当加入到MDA-MB-435细胞的细胞培养最优介质中时，在仅仅培养30分钟后，该肽就可以主要从带有核仁积聚物的核中进行回收。我们通过将骨肉瘤U2OS细胞用30和100μM的肽培养24小时而进一步的重复了该实验。结果表明对核100％的渗透。在直接用荧光黄马来酰亚胺进行标记后，在相同的条件下对该肽进行了试验。与Tat-肽相比，发现在内化肽的数量和定位上没有变化。
生长抑制作用。当将U2OS不同时期的培养物用Tat-线性或Tat-环状进行处理时，在处理后约3小时开始并且其后一直持续，该细胞采用了一种圆形的形态。正如在环状肽的情况中具有更显著作用的MTS试验所测定的那样，它们表现出剂量依赖性的抑制作用。正如用线性肽进行了处理的细胞那样，该作用对于融合的肽具有特异性，环状物(没有另外的核定位序列)没有表现出任何形态学上的改变。类似地，引入Tat本身或具有杂乱的或不相关序列的Tat融合肽也不会造成任何形态学的改变，并且MTS读数高至300μM。其它的细胞类型，如MDA-MB435、MDA-MB231乳癌细胞、HCT-116、SW480结肠癌细胞、WI38/V A13 SV40转化的肺成纤维细胞也对Tat-线性和环状肽敏感，而Rat1和HeCat除外。当向A549肺癌细胞和其它的肿瘤细胞类型中引入penetratin-wt序列时可以观察到类似的抑制作用。
计算不同肽的IC50值并将其概括的列于表VIII中。在细胞中，Tat-环状肽比Tat-线性肽更有效，这与它们的体外IC50值是一致的。此外，肿瘤细胞系受到的抑制比无限增殖化正常细胞系所受到的抑制作用更强。正如前面的免疫印迹法所表现出来的那样，肿瘤细胞中E2F-1的内源性基础水平可能更高。
                  表VIII：各种肽的IC50(μM)
细胞系  Tat-线性  Tat-环状  Tat-mt  Penetratin-wt
U2OS  28-40  6-7  ＞100  7
MDA-MB-435  48-50  6-7  ＞100  18
MDA-MB-231  NT  6-7  NT  8
HCT-116  80  NT  NT  NT
SW480  26  NT  NT  NT
WI38/VA13 SV40  NT  6-7  NT  14
A549  NT  26-46  ＞100  22-25
Rat1  ＞100  NT  NT  NT
HeCat  ＞100  NT  NT  NT
*NT，未进行试验
各种肽对E2F-1/细胞周期蛋白A/cdk2结合的抑制作用
为了评估与细胞周期蛋白A结合所需的最小序列，制备出各种长度的肽并对其在E2F-1/细胞周期蛋白A/cdk2 ELISA中的抑制活性进行了试验。环状8肽和环状6肽的IC50值分别为1nM和20nM。但是，环状5肽的IC50值为3μM，或比环状8肽高2个数量级。因此，6个氨基酸的肽似乎是活性肽所需的最小长度。此外，环状肽比相应的线性肽更有效。
ELISA
将Nunc Immulon II ELISA板用250μL 4mg/mL在碳酸氢盐缓冲液中的抗-GST抗体(Pharmacia Biotech)进行涂布并在4℃下放置一夜。在用由50mM Tris(pH＝7.5)、0.15M NaCl和0.01％Tween-20(TBST)所组成的缓冲液对其洗涤五次后，用300μL由50mM HEPES(pH＝7.5)、0.15MNaCl、0.1％Triton X-100和5％牛血清白蛋白(BSA)所组成的试验缓冲液对其非特异性部位进行阻断。然后将板用TBST洗涤五次，吸气干燥，然后用100μL在TBS中的GST-E2F-1(25nM)进行处理。将GST-E2F-1在室温下培养至少1小时，非特异性结合(NSB)对照孔接受不含蛋白的试验缓冲液。然后将板用TBST洗涤五次，将用试验缓冲液进行稀释的多种试验化合物浓度与用试验缓冲液稀释的5nM细胞周期蛋白A/cdk2共同进行培养。在将其加到试验板之前，通过将两种蛋白以1∶1的比例在4℃下混合30分钟来新制备该细胞周期蛋白A/cdk2复合体。在室温下培养2小时后，将板用TBST洗涤五次，然后向所有的孔中加入100μL用试验缓冲液进行了稀释的兔子抗-cdk2抗体(Santa Cruz)的1∶500稀释液。将其在室温下培养半小时，将该板用TBST洗涤五次，吸气干燥，然后通过加入100μL在枸橼酸钠缓冲液(pH＝4.2)中所制备的HRP底物ABTS而使其显影，用微板读数器在405nm下读取吸光度。
虽然已经参考其某些特定的实施方案对本发明进行了描述和解释，但现有技术中的技术人员显然可以对其进行各种改变、修饰和替换而不会脱离本发明的主旨和范围。例如，对于本发明上述化合物的任何适应症而言，除了上述特定的剂量外，还可以根据所治疗哺乳动物的响应能力的变化而使用有效的剂量。同样，所观察到的特定药理学反应可以根据并依赖于所选择的特定活性化合物、是否存在药用载体以及制剂类型和所用给药方式而进行变化，并根据本发明的目标和实践来考虑结果中该类可预期的变化或差异。因此，将用下面的权利要求对本发明的范围进行定义，并合理地对该类权利要求进行尽可能宽的解释。
实施例1：环状6肽：Cpr-Lys-(CH(CH3)(C13H27))-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)的合成
该环状6肽的合成利用商业上可获得的Fmoc-Gly-SASRIN树脂作为起始点。将该6肽的链在‘C’至‘N’方向上通过依次用25％的哌啶脱保护然后与Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Lys(Dde)-OH进行由HBTU介导的偶联来进行加工，最后与环丙烷甲酸进行偶联。在Applied Biosystems ABI433A肽合成仪中将肽组装在固相上以后，用30mL在DMF中的2％NH2NH2对该进行了保护的肽-树脂(2mM)处理两次(30分钟和90分钟)。用DMF(2X)、CH2Cl2(2X)、MeOH(1X)和CH2Cl2将该树脂充分洗涤。将该肽树脂在Lys-1上用在THF/MeOH(50mL，1∶1)中的十七烷酮和NaBH3CN(0.75g)和催化量的AcOH(3滴)还原烷基化。用在CH2Cl2中的1％的TFA选择性地除去Lys-4上的Mtt基团(3次，每次60mL)。这些条件还可以将被保护的肽从树脂上裂解下来，将肽浓缩。然后将粗制的被保护的直链肽在Lys-4的侧链氨基和Gly的α-羧基间用HBTU(11.25mM)/HOBt(11.25mM)/DIEA(12mL)DMF(25mL)环化30分钟。在冷水(2L)中使该环状肽析出沉淀，然后过滤。用50％的TFA/H2O(100mL)将该环状肽脱保护2小时，从而得到粗制的肽，将其在冷的二乙醚中进行沉淀。用使用C8柱的反相HPLC对该粗品(1.2g)进行纯化，用CH3CN(+0.1％TFA)的H2O(+0.1％TFA)溶液梯度洗脱。合并包含同一物质的级分然后冷冻干燥，得到一种白色的絮状粉末。纯净6肽的m/z(MH+)为1008.7，总收率为24％(480mg)。
实施例2：环状8肽：Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的合成
描述了环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的合成方法。环状8肽ProAlaLysArg(LysLeuPheGly)的合成使用商业上可获得的Fmoc-Gly-SASRIN树脂作为起始点。将环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的链在‘C’至‘N’的方向上通过依次用25％哌啶脱保护然后与Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Lys(t-Boc)-OH、Fmoc-L-Ala-OH进行由HBTU-介导的偶联来进行加工，最后与Boc-L-Pro-OH进行偶联。在将肽组装在固相上之后，用1％TFA的CH2Cl2溶液选择性地除去Lys-5上的Mtt基团。这些条件还可以将被保护的肽从该树脂上裂解下来。然后，将该粗制的被保护的直链肽(FAB-MS，m/z 1168)在Lys-5的侧链氨基和Gly-8的α-羧基间用HBTU/HOBt/DMF进行环合。将该环状肽用95％TFA/H2O脱保护1小时，得到粗制的环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)。将粗品通过反相HPLC进行纯化，用CH3CN(+0.1％TFA)的H2O(+0.1％TFA)溶液进行梯度洗脱。合并包含同一物质的级分然后冷冻干燥，得到一种白色的絮状粉末。该纯净的环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)显示出与所计算的该环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)的分子量相一致的m/z(MH+)899.13，FAB-MS，C43H71N13O8的MH+。
该环状8肽Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly的结构如下：
                                     序列表
<110>诺瓦提斯公司
<120>用于治疗癌症的E2F-1/细胞周期蛋白相互作用的抑制剂
<130>4-31664A/USN
<160>19
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>1
Pro Ala Lys Arg Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>2
Pro Val Lys Arg Arg Leu Asp Leu
 1               5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>3
Ser Ala Cys Arg Asn Leu Phe Gly
 1               5
<210>4
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>4
Ala Lys Arg Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>5
Lys Arg Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>6
Arg Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>7
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly
 1               5                  10
<210>8
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>8
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Val Lys Arg
 1               5                  10                  15
Arg Leu Asp Leu
            20
<210>9
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>9
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Pro Ala Lys Arg
 1               5                  10                  15
Lys Leu Phe Gly
            20
<210>10
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>10
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Arg Leu Asp Leu
 1               5                  10                  15
Pro Lys Val Arg Lys Arg Ser
            20
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>11
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Glu Thr Asp His
 1               5                  10                  15
Gln Tyr Leu Ala Glu Ser Ser
            20
<210>12
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>12
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
<210>13
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>13
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
Pro Val Lys Arg Arg Leu Phe Gly
            20
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>14
Lys Lys Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>15
Lys Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>16
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>16
Ala Lys Arg Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>17
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>17
Lys Arg Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>18
Ala Lys Lys Lys Leu Phe Gly
 1               5
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成蛋白
<400>19
Pro Ala Lys Lys Lys Leu Phe Gly
 1               5

Claims (10)

1.一种分离的包含选自通式Ia、Ib、Ic和Id的氨基酸序列的肽及其可药用的盐：  Cap-AA8-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 8肽 Ia  Cap-AA7-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 7肽 Ib  Cap-AA6-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 6肽 Ic  Cap-AA5-AA4*-AA3-AA2-AA1* 5肽 Id
其中
AA1选自：
(a)Gly，
(b)Ala，
(c)Leu，和
(d)小的脂肪族氨基酸；
AA2选自：
(a)Phe，
(b)Tha，
(c)Cha，
(d)Tyr，
(e)Pya，
(f)Trp，和
(g)另一种芳族氨基酸；
AA3选自：
(a)Leu，
(b)Cpa，和
(c)一种天然或非天然的脂肪族氨基酸；
AA4选自：
(a)Lys，
(b)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代的Lys，
(c)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的Orn，和
(d)被C1-C17烷基、C5-C20芳基烷基或C6-C20芳基所取代或未被取代的hLys；
AA5选自：
(a)Arg，
(b)Lys，
(c)Orn，
(d)hLys，和
(e)His；
AA6选自：
(a)Lys，
(b)hLys，
(c)Orn，
(d)其中Nε被一个或两个选自C5-C20烷基、直链或支链C1-C6酰基、环化的饱和或不饱和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基和C6-C20芳基的基团所取代的Lys，和
(e)其中Nδ被一个或两个选自C5-C20烷基、直链或支链C1-C6酰基、环化的饱和或不饱和C5-C20烷基、C5-C20芳基烷基和C6-C20芳基的基团所取代的Orn；
AA7选自：
(a)Ala，
(b)Val，和
(c)一种天然或非天然的氨基酸，或其拟似物或等排物；
AA8选自：
(a)Pro，
(b)一种天然或非天然的氨基酸，或其拟似物或等排物；且
Cap不存在或选自：
(a)C1-C8酰基，和
(b)C3-C8环烷基烷酰基或呋喃基乙酰基；该肽可任选地连接于核定位肽序列HIV-1 Tat或触角足肽序列(penetratin)上；
并且符号(*)表示一个任选的分子内键合位置，该键合是通过一个酰胺键取代的酰胺键或它们的等排物而进行的；所得化合物可以分别是环状5肽、6肽、7肽或8肽。
2.如权利要求1所述的分离的肽及其可药用的盐，其中
AA1选自：
(a)Gly，
(b)Ala，和
(c)Leu；
AA2选自：
(a)Phe，
(b)Tha，
(c)Cha，
(d)Tyr，
(e)Pya，和
(f)Trp；
AA3选自：
(a)Leu，
(b)Cpa，和
(c)一种天然的脂肪族氨基酸；
AA4选自：
(a)Lys，
(b)Orn，和
(c)hLys；
AA5选自：
(a)Arg，
(b)Lys，
(c)Orn，
(d)hLys，和
(e)His；
AA6选自：
(a)Lys，
(b)hLys，
(c)Orn；
AA7选自：
(a)Ala，
(b)Val，和
(c)一种天然的氨基酸；
AA8选自：
(a)Pro，
(b)一种天然的氨基酸；且
Cap不存在或选自：
(a)乙酰基(Ac)、环丙基羰基、环丙基乙酰基(Cpr)、新戊酰基、异丙基羰基、异丙基乙酰基、2，2-二甲基丁酰基(Dmb)、乙酰丙酰基、环丙基甘氨酰基(Cpg)、二甲基甘氨酰基(Dmg)，和
(b)环戊基乙酰基、环己基乙酰基、环庚基乙酰基、呋喃基乙酰基；该肽可任选地连接于核定位肽序列HIV-1 Tat或触角足肽序列(penetratin)上；
并且符号(*)表示一个任选的分子内键合位置，该键合是通过一个酰胺键而进行的；所得化合物可以分别是环状5肽、6肽、7肽或8肽。
3.如权利要求1或2所述的分离的肽及所述肽的可药用盐，包括：
环状5肽：
Ac-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Ac-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
环状6肽：
Ac-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Lys-(CH(CH3)(C13H27))-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Dmb-Lys-(C5-C20)-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Dmb-Lys-(C5-C20)-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
环状7肽：
Ac-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Cpr-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；
或
环状8肽：
Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Ac-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)，
Cpr-Pro-Ala-Lys-Arg-(Lys-Leu-Phe-Gly)，或
Cpr-Pro-Ala-Lys-Lys-(Lys-Leu-Phe-Gly)；其中圆括号表示在环化中所涉及的残基。
4.一种用于哺乳动物治疗方法中的如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐。
5.一种包含如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐和可药用载体的药物组合物。
6.一种用于治疗哺乳动物癌症的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐和可药用的载体。
7.如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐在制备用于治疗癌症的药物组合物的用途。
8.如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐在治疗癌症中的用途。
9.一种治疗癌症的方法，该方法包括给需要进行该类治疗的哺乳动物施用治疗有效量的如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐。
10.一种抑制E2F-1细胞调节蛋白与细胞周期蛋白A结合的方法，该方法包括给需要进行该类治疗的哺乳动物施用治疗有效量的如权利要求1至3中任意一项所述的肽或其可药用的盐。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
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