CN1587395A - 利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法，其特征是：将谷物籽粒进行筛选、消毒、清洗；将籽粒在温水中浸泡使其吸胀，在发芽槽中保温发芽；将发芽谷物研磨成粗浆，加入缓冲液；将粗浆加入纤维素酶并打成细浆，加入氯化钙；固液分层后，滤液压滤，滤液通过离心机离心，收集离心液；离心液过超滤膜，加入糖化酶，再通过中性超滤膜浓缩，使其达到所需要的SOD浓度；本发明的优点是超氧化物歧化酶，过氧化物酶和过氧化氢酶都能提取出来，产品杂蛋白少，酶的活力高，酶活力可控效果好，保质期长；一条基本工艺路线可以产生系列产品，工艺简单，自动化程度高，安全无污染，耗能少，成本低，效益高；五种谷物种子均可用此工艺生产。

Description

利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产超氧化物歧化酶复合酶的方法，特别是一种利用玉米、小麦、水稻、谷子、高粱五种作物种子大规模制造生产超氧化物歧化酶(SOD)复合酶及系列产品的方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于生物体中，60年代才被科学家发现，其功能为清除对生物体有强烈毒性的超氧自由基，过多的自由基被认为是使细胞衰老到死亡的主要原因之一。近年来，发展了一些制取SOD的方法，并将其用于医药、保健品、食品、化妆品和日用化学品等领域，取得了很好的效果。特别是对消炎、抗衰老、抗辐射损伤和抑制肿瘤生长等均有较好作用。

目前，SOD制剂大都是从动物血液或组织中提取制备的，这些原材料不易收集，运输，贮存和清洗，易携带病原微生物，极不安全，国务院于1997年颁布了“血液制品管理条例”进行限制，2004年国家食品药品管理局又进一步强调对血液制品要限制从严，没有了用血液生产SOD的空间。有的SOD制品是从蔬菜或水果中提取制备的，原料易腐烂变质，贮存成本高，都不是制备SOD的理想原材料。谷物易收集、易贮存，可以做到随取随用，副产物淀粉和蛋白质等，又是有用之物，故谷物籽粒是理想的生产SOD复合酶的原料。

在SOD制备的加工工艺方面，目前也没有统一的好方法。有的方法非常复杂烦琐，生产周期长，要用有机溶剂，成本高，易着火，不安全，提纯过度，不但产量低，而且只剩下单一SOD，这种纯的SOD只能用作生化试剂，不能做保健品和药品，因为纯SOD不能将超氧自由基直接转化成水，只能转化成过氧化氢，过氧化氢仍然对细胞有毒。有两种酶可以将过氧化氢转化成水，即过氧化氢酶(CAT)与过氧化物酶(POD)，此二种酶在生物组织中是与SOD共同存在的，如提取过纯，失去了CAT与POD就只能做试剂SOD了。反之，提取过粗，杂蛋白太多，SOD活力太低，也失去了做保健品和药品的功效。有的工艺要用大量硫酸铵提取，造成环境污染。有的工艺所用药剂价格昂贵，成本太高，甚至有毒等等。都不能生产高活力、安全无毒、低成本的超氧化物歧化酶(SOD)复合酶，故制取工艺甚为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)三种酶都能提取出来，酶的活力高，效果好，保质期长；工艺简单，自动化程度高，安全无污染，耗能少，成本低，效益高；五种谷物种子均可生产。

本发明的技术方案如下：

一、液体复合酶的制备方法，其特征是有如下步骤：

1、将谷物籽粒进行筛选、消毒、清洗，并保证发芽率要达到70％以上；

2、将消毒后的籽粒在温水中浸泡一昼夜，使其吸胀，在发芽槽中保温发芽，保温温度为24-30℃，芽长约1-2mm即可；

3、将发芽谷物用胶体磨研磨成粗浆，在磨制过程中加入含60-65mMol的磷酸盐缓冲液或磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，PH7.6-7.8，缓冲液为玉米重量的1-2倍；

4、将粗浆装入贮罐，加入每克酶活为2000单位以上的纤维素酶，其量为谷物重量的0.2-0.5％，搅匀；

5、将粗浆用胶体磨打成细浆，细浆装入贮罐，加入谷物重量1-2％的氯化钙，搅匀，在10℃以下静置3-5小时；

6、固液分层后，滤液进入饮料压滤机，滤布为200-300目，助滤剂为硅藻土，滤液通过连续管式离心机离心，收集离心液；

7、离心液过超滤膜，收集小于14万分子量的流出液，在流出液的贮罐中加入流出液重量0.1-0.3％的糖化酶，搅匀，作用2-3小时，再通过10000分子量的中性超滤膜浓缩，使其达到所需要的SOD浓度；

8、在浓缩液中加入0.1-0.2的VE原粉，再加入0.1-0.2％的山梨酸钾或海藻糖，搅匀，将浓缩液置-18--22℃冷冻室使SOD进一步分离、浓缩、净化，将冷冻浓缩液移出，化冻后通过离心机离心；

9、将离心液分装、杀菌即成。

二、利用本发明提供的超氧化物歧化酶复合酶生产的产品：

1、利用液体复合酶生产片剂、胶囊产品的方法，其特征是：

将上述超氧化物歧化酶复合酶浓缩液，加入液体重量8-10％的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。

2、利用液体复合酶生产纯化产品的方法，其特征是：

将上述超氧化物歧化酶复合酶浓缩液置超滤机中，以分子量为10000的膜超滤浓缩至6-7倍即可。此时小分子量的杂质已去，  但保留了CAT与POD两种酶，为纯质复合酶。

3、利用液体复合酶生产生化试剂的方法，其特征是：

将上述纯质复合酶，先用Sephadex G-75柱层析，进行系统分离，可得电泳纯之产品，其中过氧化氢酶与过氧化物酶均极少，酶的比活力每毫克可达4500单位以上(国际标准为3000单位)，层析只有一个峰，电泳只有一条带。

在浓缩液中加入0.1-0.2的VE(均为原粉)，再加入0.1-0.2％的山梨酸钾或海藻糖，搅匀，待加入的药剂溶化后，将浓缩液置-20℃冷冻室使SOD进一步分离、浓缩、净化，将冷冻浓缩液移出，置室温下，化冻后，再在每分钟10000-15000转的离心机中离心。将离心液分装并密封，以钴60杀菌即可。

4、利用液体复合酶生产冻干粉的方法，其特征是：

将上述冷冻前的超氧化物歧化酶复合酶浓缩液，分装入安瓶中，置冻干机中，在-20℃下冻干即成。

本发明的优点是：

(1)超氧化物歧化酶，过氧化物酶和过氧化氢酶三种酶都能提取出来，成为复合酶，产品杂蛋白少，酶的活力高，酶活力可控效果好，保质期长；

(2)一条基本工艺路线可以产生系列产品，即口服液、粉剂、片剂、胶囊和冻干粉等复合酶产品，将工艺延长还可生产试剂级超氧化物歧化酶，即纯SOD。工艺简单，自动化程度高，不用有毒不安全和造成污染的方式提取药剂，安全无污染，耗能少，成本低，效益高；

(3)五种谷物种子，即玉米、小麦、水稻、谷子、高粱均可用此工艺生产。副产物主要是淀粉和纤维素，可生产各种淀粉制品和食用纤维素，其产值不亚于主产品，是一项可持续发展的农业产业化技术。

具体实施方式

实施例一，加工以玉米籽粒为基本原料生产超氧化物歧化酶复合酶及产品：

液体复合酶

1、将风干重一吨，发芽率达70％以上的玉米籽粒(发芽率与酶产率成正比)，先进行风选，再进行磁选，置发芽槽内，加50-100ppm的次氯酸钠水溶液，使淹过玉米，搅匀，约30-60分钟后，放出次氯酸钠液，加清水洗两遍(以PH试纸试验，无碱性合格，否则再洗)。在放尽水的发芽槽内，加入28℃的温水，保温24小时，使玉米粒充分吸胀，放出剩余水分。发芽槽内徐徐通风，保温28℃，保持饱和湿度，使玉米发芽，防止厌氧发酵产热。发芽长度约1-2mm即可。将发芽玉米籽粒送入胶体磨，打粗浆，同时不断滴入PH7.8的磷酸盐或磷酸柠檬酸盐缓冲液(约为玉米风干重的1.5倍左右。粗浆打入贮罐，加入2-3公斤工业纤维素酶(每克酶活力在2000单位以上)，搅匀，放置2-3小时。将粗浆在胶体磨中进一步打成细浆后，输入贮罐，加入8-10公斤氯化钙(以无水物计)，搅匀。待罐内物固液分层后，通过滤布为200目的板框过滤机过滤，滤饼为副产品淀粉，滤液在饮料压滤机中，以生产酶制剂等级的硅藻土为助滤剂，滤布为300目，压滤。滤液入贮罐，在滤液中加入1-2公斤市售制酒用糖化酶，搅匀，滤液在管式离心机中以10000-15000转/分钟速度离心。离心液过分子量为14万的超滤膜，收集流出液，流出液再以10000分子量的超滤机浓缩。浓缩程度根据产品需要而定。

2、在该流出液的贮罐中加入流出液重量0.1-0.3％的糖化酶，搅匀，使作用2小时，再通过10000分子量的中性超滤膜浓缩，使其达到所需要的SOD浓度。

液体产品(口服液)：将液态SOD浓缩至每毫升为400-600单位，为了长期保存，在浓缩液中加入浓缩液重量0.8-0.12％的VE和0.1-0.2％的山梨酸钾(最好是0.1％左右的海藻糖)，加入搅匀后，送入冷冻室冷冻(-20℃)，冷冻后置室温融化，再以每分钟10000-15000转离心，分瓶包装(约250-500毫升)，用钴60辐射灭菌即成。在-10℃以下可保存1年，不产生沉淀，活力保持在80％以上。

产品

1、干粉、片剂或胶囊：将上述液体SOD产品(1)不必冷冻，加入以液体产品重量为基数8-10％的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在不断搅拌下进行喷雾干燥，将SOD干粉打成肠溶片，分瓶包装，或制成塑料板水泡眼或装入肠溶胶囊。包装物用钴60 100rad辐射杀菌，在10℃以下避光贮存。可保存1-2年。

2、纯化产品：可供输液用等医药产品。将上述超氧化物歧化酶复合酶浓缩液置超滤机中，以分子量为10000的膜超滤浓缩至6-7倍即可。此时小分子量的杂质已去，但保留了CAT与POD两种酶，为纯质复合酶。按输液要求作进一步处理。

3、生化试剂：将上述纯质复合酶，先用Sephadex G-75柱层析，后用DEAE-32层析，可得电泳纯之产品，其中过氧化氢酶与过氧化物酶均极少，酶的比活力每毫克可达4500单位以上(国际标准为3000单位)，层析只有一个峰，电泳只有一条带。

4、冻干粉：将冷冻前的超氧化物歧化酶复合酶浓缩液体装入安瓶，在冻干机内冻干，封口，其他如灭菌保存等，同胶囊或片剂。

各种产品的质量(酶活力检测近似数据液体u/m1，固体u/g)

酶	超氧化物歧化酶(SOD)	过氧化氢酶(CAT)	过氧化物(POD)
				分析方法	*NBT光还原法	紫外分光光度计法	愈创木酚法
浓缩液	600	48	54
				干粉剂	2000	158	183
冻干粉	5000	390	450

*植物SOD常规应用方法

数据说明：以上数据根据需要可以做高或低，如浓缩液的SOD活力单位可以做到300，也可做到1000；喷干粉既可做到1000，也可做到5000；冻干粉既可做到4000，也可做到10000。多一道工艺，单位酶活力能提高，但酶的总活力要下降，要注意总体经济效益。产品酶活的高低与作物的种类、品种和生育期均有关。要得到好的产品必须采取综合措施。

五种谷物在制取超氧化物歧化酶复合酶的工艺基本上是相同的，所用设备也相同，即一条生产线可以以上述五种谷物为原料生产SOD复合酶。

其不同点是：即(1)酶产率不同，如以每公斤风干种子为基数比较则玉米约为10万单位；小麦约为6万单位；水稻约为5.3万单位；谷子约为4.5万单位；高粱约为1.5万单位。(2)尽管五种谷物的副产物主要都是淀粉，但因水稻与谷子有壳，在利用其淀粉时，还需有一道去壳的工艺。

Claims (5)

1、一种利用谷物籽粒大规模生产超氧化物歧化酶复合酶的方法，其特征是有如下步骤：

A、将谷物籽粒进行筛选、消毒、清洗，并保证发芽率要达到70％以上；

B、将消毒后的籽粒在温水中浸泡一昼夜，使其吸胀，在发芽槽中保温发芽，保温温度为24-30℃，芽长约1-2mm即可；

C、将发芽谷物用胶体磨研磨成粗浆，在磨制过程中加入含60-65mMol的磷酸盐缓冲液或磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液，PH7.6-7.8，缓冲液为谷物籽粒重量的1-2倍；

D、将粗浆装入贮罐，加入每克酶活为2000单位以上的纤维素酶，其量为谷物重量的0.2-0.5％，搅匀；

E、将粗浆用胶体磨打成细浆，细浆装入贮罐，加入谷物重量1-2％的氯化钙，搅匀，在10℃以下静置3-5小时；

F、固液分层后，滤液进入饮料压滤机，滤布为200-300目，助滤剂为硅藻土，滤液通过连续管式离心机离心，收集离心液；

G、离心液过超滤膜，收集小于14万分子量的流出液，在流出液的贮罐中加入流出液重量0.1-0.3％的糖化酶，搅匀，作用2-3小时，再通过10000分子量的中性超滤膜浓缩，使其达到所需要的SOD浓度；

H、在浓缩液中加入0.1-0.2的VE原粉，再加入0.1-0.2％的山梨酸钾或海藻糖，搅匀，将浓缩液置-18--22℃冷冻室使SOD进一步分离、浓缩、净化，将冷冻浓缩液移出，化冻后通过离心机离心；

I、将离心液分装、杀菌即成。

2、一种利用权利要求1液体复合酶生产片剂、胶囊产品的方法，其特征是：在超氧化物歧化酶复合酶浓缩液中，加入液体重量比例8-10％的可溶性淀粉或药用淀粉，搅匀，在喷雾干燥机内调节适宜温度喷制成细粉，将粉进行胶囊包装或制片装瓶包装、杀菌。

3、一种利用权利要求1液体复合酶生产纯化产品的方法，其特征是：将超氧化物歧化酶复合酶浓缩液置超滤机中，以分子量为10000的膜超滤浓缩至6-7倍即可。

4、一种利用权利要求1液体复合酶生产生化试剂的方法，其特征是：将纯质复合酶，先用Sephadex G-75柱层析，进行系统分离，可得电泳纯之产品，在浓缩液中加入重量比例0.1-0.2的VE原粉，再加入重量比例0.1-0.2％的山梨酸钾或海藻糖，搅匀，待加入的药剂溶化后，将浓缩液置-20℃冷冻室使SOD进一步分离、浓缩、净化，将冷冻浓缩液移出，置室温下，化冻后，再在每分钟10000-15000转的离心机中离心。将离心液分装并密封，以钴60杀菌即可。

5、一种利用权利要求1液体复合酶生产冻干粉的方法，其特征是：将超氧化物歧化酶复合酶浓缩液，分装入安瓶中，置冻干机中，在-20℃下冻干即成。