CN1584012A - 用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyrium minitans；置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后收集孢子，在磁力搅拌器上高速搅拌，统计孢子浓度，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特点是，将菌丝体与培养基隔开，即在培养基上置一亲水性无菌醋酸纤维膜，膜上接种盾壳霉孢子。或将培养一段时间的膜连同其上的菌体一起转入另一新鲜的培养基上，同时加入0.1％酪氨酸，继续培养；或在培养皿中放一脱脂棉，在脱脂棉和无菌醋酸纤维膜之间插入一层滤纸。本发明便于进行丝状菌固态培养过程的定量研究，特别是分批补料培养或连续培养动力学的研究过程。可大幅度提高孢子密度，有望用于实现其它微生物菌种的高密度培养。
Description
技术领域
本发明属于微生物固态培养方法，特别涉及一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法。
背景技术
固态培养是一种传统的发酵生产方式，由于其具有成本低、预处理简单、设备体积小、能耗低、不易染菌、产物浓度高、生产废弃物少且易处理等特点，已被广泛用于多种酶[1]和菌体孢子[2，3]的生产。工业固态发酵一般都以天然固态基质为底物，与液态发酵相比，由于(1)天然基质的组成复杂，底物消耗或产物生成情况难以定量；(2)菌丝体与基质紧密结合，生物量的测定非常麻烦且不准确，故很难对微生物的生长和代谢过程进行定量研究。如，液态发酵中补料培养通常可以提高生产强度[4，5]，但在固态发酵中，补加固态物质会增加培养基的体积与表面积，补加液体物质则会影响培养体系的湿度，故不能准确判断出所加物质对菌体生长或代谢产物形成的真正影响，如能建立起一套可以将菌丝体与固态基质分开的固态培养技术，就有可能在可控条件下对菌体生长和代谢过程进行深入研究，进而获得对工业固态发酵过程有价值的信息。
就这一学术思想，Weber等人提出用低凝固点的卡拉胶代替琼脂来研究丝状真菌的固态培养过程[6]。结果发现，采用这种方法虽然能够将菌丝体与培养基分开，但是严重影响了菌体对培养基中矿质离子的吸收与利用[7]。Ooijkaas等人也曾利用尼龙膜培养法[8]实现了菌体与培养基的成功分离，但并未详细研究膜对菌体生长及营养利用的影响。如果此法可行，就可以在培养基表面积维持恒定的条件下，研究丝状菌的固态补料培养，乃至连续培养过程。
申请人经过资料检索，给出以下参考文献：
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发明内容
基于上述尼龙膜培养法思想，申请人以盾壳霉(Coniothyrium minitans)的固态培养为例，分析了琼脂-膜培养方法用于固态培养过程研究的可行性，进而提出一种更方便的用于固态培养过程研究的脱脂棉-膜培养方法，并考察了其应用价值。
实现上述发明目的的技术解决方案是，该用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法包括以下3种：
方法1：一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyrium minitans保藏号：CCTCC M203020；将菌种置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后，用200ml 0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，用一层棉布或注射器将脱脂棉中的培养基液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特征在于，在培养基上置一片亲水性无菌醋酸纤维膜，膜上接种盾壳霉孢子，20℃培养。
方法2：一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyrium minitans保藏号：CCTCC M203020；将菌种置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后，用200ml压计0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，用一层棉布或注射器将脱脂棉中的培养基液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特征在于，在培养基上置一片亲水性无菌醋酸纤维膜，膜上接种盾壳霉孢子，20℃培养；培养一段时间后，将膜连同其上的菌体一起转入另一新鲜的培养基上，再继续培养至7d。
上述2种培养基含有20％土豆汁，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；培养基的初始PH为6.0。
方法3：一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyrium minitans保藏号：CCTCC M203020；将菌种置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后，用200ml压计0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，用一层棉布或注射器将脱脂棉中的培养基液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特征在于，在培养皿中放一0.800±0.005压计g厚度均匀、与培养皿大小一致的圆形脱脂棉饼，在脱脂棉和无菌醋酸纤维膜之间插入一层滤纸，使膜面各处都能与培养基发生充分接触，灭菌后，在其中注入培养基，脱脂棉上放置无菌醋酸纤维膜，接种盾壳霉孢子，20℃培养。
上述培养基含有20％土豆汁，20g/L葡萄糖；培养基的初始PH为6.0。
采用本发明建立的膜培养方法，可以对固态分批培养和补料/连续培养过程进行定量研究，获得传统固态发酵技术不能获得的信息，故本申请所采用的研究思路及方法，对其它丝状真菌的固态培养研究也具有一定的参考价值。
附图说明
图1是膜培养装置示意图；
图2是培养基装量对C.minitans孢子在PDA培养基中分布的影响(φ＝90mm)，图中符号说明：◆，培养基表面孢子量；■，培养基内部孢子量；▲，培养基表面和内部孢子总和；×，培养基表面孢子量/培养基内部孢子量；
图3是支撑体种类对C.minitans孢子
琼脂培养基内部分布的影响(φ＝60mm，10ml培养基)图中的符号说明：■，培养基表面孢子量；□，培养基内部孢子量；F途中符号说明：■，培养基表面孢子量；□，培养基内部孢子量；F，孢子总量；
图4是初始葡萄糖浓度对C.minitans孢子产量的影响；
图5是转移时间对C.minitans孢子产量的影响(新培养基中葡萄糖浓度为20g/L)，图中符号说明：▲，C.minitans孢子产量；●，转移时旧培养基中残糖浓度；○，培养结束时新培养基中残糖浓度。
图6是新培养基中葡萄糖含量对C.minitans孢子产量的影响(转移时间为3.5天)；
图7是改良的膜培养体系示意图；
图8是膜脂棉-膜培养体系和PDA培养体系对C.minitans生长的影响，图中符号说明：■，脱脂棉-膜培养体系；◆，PDA培养体系；其中a)表示剩余葡萄糖浓度和培养时间的对比曲线，b)表示PH值和培养时间的对比曲线，c)表示菌体干重的对比曲线，d)是脱脂棉培养体系和PDA培养体系孢子产量直方图；
图9是用PDA培养体系和脱脂棉培养体系研究所得pH对C.minitans菌体生长量(a)及孢子产量(b)的影响结果；图中符号说明：■，PDA培养体系；◆，脱脂棉培养体系研究。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步的详细描述。
申请人以盾壳霉(Coniothyrium minitans)的固态培养为例，分析了琼脂-膜培养方法用于固态培养过程研究的可行性，进而提出一种更方便的用于固态培养过程研究的脱脂棉-膜培养方法，并考察了其应用价值。
选择盾壳霉为研究对象是因为：(1)盾壳霉可用于多种菌核病的生物防治[9，10]，大量孢子的获得是将其用于生产实践的前提，而固态培养则是达到这一目的有效手段[11]；(2)以获得大量孢子为目标，不考虑代谢产物的形成，可简化研究过程。
1实验材料和方法
1.1菌种与培养基
Coniothyrium minitans CCTCC M203020，自行分离于陕西省关中地区的油菜地中，现保藏在中国典型培养物保藏中心；
PDA培养基：20％土豆汁，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；
PDB培养基：20％土豆汁，20g/L葡萄糖。
除特殊注明外，上述培养基的初始PH均为6.0。
1.2 盾壳霉孢悬液的制备
用20％无菌甘油从PDA平板上收集七日龄盾壳霉孢子，获得浓度约为107孢子/ml的孢悬液，分装于1ml小管中，-80℃下保藏。室温解冻后使用。
1.3 培养方法
1.3.1 PDA-膜培养法：
在PDA培养基(10ml/皿，φ＝60mm)上置一片0.45μm亲水性无菌醋酸纤维膜(φ＝60mm)，膜上接种106盾壳霉孢子(见图1)，20℃培养。
1.3.2 膜转移培养法：
采用上述膜培养法，将盾霉在PDA上培养一段时间后，将膜连同其上的菌体一起转入另一新鲜的培养基(除含糖量有所变化外，其它组分与PDA相同)上，再继续培养至7d.对照组在整个培养过程中不添加任何物质。
1.3.3 脱脂棉-膜培养法：
在培养皿中放一0.800±0.005g厚度均匀、与其大小一致的圆形脱脂棉饼，灭菌后，在其中注入10ml PDB，其上放置无菌膜，接种106盾壳霉孢子，20℃培养。
1.4 测定方法
1.4.1 菌体生长量：
用菌体干重表示(g/皿)。培养结束时将菌体从膜上轻轻刮下，60℃烘48h后称重。
1.4.2 孢子产量：
用200ml 0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，表示为×109孢子/皿。
1.4.3 成分测定：
用一层棉布将PDA或用注射器将脱脂棉中的液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH。
2 结果
2.1 膜在固态培养研究中的作用
2.1.1 盾壳霉孢子在琼脂培养体系中的分布
在没有覆膜的琼脂培养体系(φ＝90mm)中，菌体除了在培养基表面生长外，还伸入培养基内部，并在其中形成孢子(图2)。活性检测结果显示：这两部分孢子在寄生、致腐菌核方面具有同等的生物防治功效(数据未给出)。因此，为了提高孢子产量，又能简化菌体和孢子的收集与测量过程，应该将菌体及孢子尽可能地集中在培养基的表面。然而，由图2可以看出，虽然十六大培养基的用量可以在一定程度上增大培养基表面孢子的比率，但是并不能完全阻止培养基内部孢子的形成。其它丝状真菌的研究中也存在类似的问题。
2.1.2 隔离体的选择
避免孢子在培养基内部形成的一个思路是：将菌丝体与培养基隔开但又不影响菌体的生长和产孢过程。为此申请人研究了不同隔离体对孢子产量和分布的影响。结果表明(图3)：在所选的多种隔离体中，只有0.45μm的醋酸纤维膜能完全阻止孢子在培养基内部的形成，孢子总产量也稍高于对照。与Ooijkaas等人所用的尼龙膜相比[8]，醋酸纤维膜的亲水性更强，成本更低，适合在国内研究领域推广。本申请的其余实验均用此法。
2.2 盾壳霉的膜转移培养
图4表明，提高培养基中的初糖浓度不利于盾壳霉孢子产量的提高。以前的研究大多是通过改变碳源的方式来减轻这种不利影响，以实现菌体的高密度培养[12]。本申请则利用上述膜培养方法，通过转移培养的方式来提高孢子产量。
实验中将培养了一定时间的膜(其上附着菌丝体和孢子)转移到新鲜培养基上，研究结果表明：当初糖浓度和新鲜培养基中的糖浓度均为20g/L时，在第4.0d转移时所得孢子总量最高(约为对照的2.5倍)(图5)；当转移时间为3.5d，初糖浓度为20g/L时，新鲜培养基中的糖浓度为4g/L时，盾壳霉的孢子总量最高(约为对照的2.8倍)(图6)。采用此法，如果在新鲜培养基(20g/L葡萄糖)中同时加入0.1％酪氨酸，则可以将盾壳霉的孢子产量提高4.0倍以上(数据未给出)。由此可见，采用这种培养方式，可以达到液态培养条件下细胞循环发酵的效果，从而大幅度提高孢子密度，同时也利于对培养过程中菌丝生长、孢子形成和底物消耗情况等参数进行准确定量。
但是，当考察因素和样品重复数较多时，上述转移培养法的实验强度较大，故本申请提出以下一种改良的固态培养体系来简化这一操作过程，并有望将其用于实验条件下的固态连续培养研究。
2.3 改良的膜培养方法
在改良的膜培养体系，参见图7，在培养皿中设置培养液的进口和出口，微生物菌体和培养液之间有微孔滤膜，用浸有PDB的隋性基质(如脱脂棉)代替琼脂凝固剂，通过在培养皿的一端注入新培养基，从另一端抽出旧培养基的方法，就可在不移动膜的情况下实现补料或连续培养。如此，不仅有助于减轻工作量，还能对培养基中的成分进行灵活控制。
为了证明这一体系的可行性，申请人对其与PDA体系间的异同之处进行了考察。
2.3.1 支撑体的选择
在培养基用量(10ml PDB)和膜吸水率相同(约150％)的条件下，本申请选用了纱布、棉布、海绵、脱脂棉等吸水性较强的物体作为支撑体，在其上覆膜后接种菌体，结果发现：这些体系上的孢子产量分别为1.54×109、6.21×108、1.94×109、和2.24×109孢子/皿。其中，脱脂棉体系上的孢子产量与琼脂体系(2.15×109孢子/皿)最为接近，这可能是因为脱脂棉的吸水性较强、孔隙较大，能够为菌体生长提供足够的水分及氧气。
需要指出的是，如果菌体能够利用脱脂棉中的成分，则需更换另一种隋性支撑体，如海绵。
2.3.2 脱脂棉-膜培养体系的建立
考虑到将膜直接覆盖在脱脂棉饼表面易造成膜面干湿状态不一，申请人在脱脂棉和膜之间插入一层滤纸，从而使膜面各处都能与培养基发生充分接触。结果发现，与脱脂棉+滤纸(8.1×108孢子/皿)和脱脂棉+膜(2.2×109孢子/皿)的培养体系相比，脱脂棉+滤纸+膜培养体系上的孢子产量最大(2.9×109孢子/皿)。因此，申请人选用脱脂棉+纸+膜的培养体系进行下一步研究。
由图8可以看出，菌种在这种培养体系中耗糖趋势(图8a)及酸、碱性物质的产生时期(图8b)基本相同，只是脱脂棉体系中的耗糖速度稍慢一些，pH的变化幅度稍大一些；但是，菌种在两种培养体系下的生长量(图8c)和孢子产量(图8d)基本相同。由此说明，用被液体培养基所饱和的脱脂棉可以代替琼脂培养体系用于盾壳霉的固态培养研究。
2.3.3 脱脂棉-膜培养法用于pH的影响研究
当培养基中的pH过低时，琼脂会在灭菌的过程中发生水解，从而导致培养基不能凝固。因此，在用琼脂培养体系研究pH对菌体生长的影响时，需要将琼脂与其它营养成分分开灭菌，然后再进行混合。这一操作过程比较麻烦，且误差较大，使用脱脂棉-膜培养体系就可以避免这些问题。
本申请用此法研究了pH(用磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液体系控制)对盾壳霉菌体生长影响，结果表明(图9)：由脱脂棉培养体系所得结论与琼脂体系基本吻合，再次证明了这一体系能够用于盾壳霉的生长过程研究。
3 讨论
(1)本申请提出的膜转移培养技术简化了丝状菌固态培养过程的定量研究，并有望用于固态补料培养或连续培养过程的研究。在这种培养体系中，0.45μm的醋酸纤维膜能将菌丝体与固态培养基完全分开，但又不影响菌体对营养物质的吸收和代谢，从而使菌丝生长、产孢、底物消耗和产物形成等指标的准确定量成为可能；通过膜转移培养法或脱脂棉-膜培养体系可以实现培养基中成分的改变，从而可以在不改变培养基与菌体接触表面积的条件下，对丝状菌的固态补料培养或连续培养过程进行深入研究。
(2)在培养过程中补加新鲜培养基可以将盾壳霉的孢子产量提高1.8倍。因此，对盾壳霉的固态补料/连续培养过程进行研究是很有必要的。由于补料/连续培养有助于及时补充已消耗掉的营养物质和缓解有害代谢产物的不利影响，故对实验室条件下其它丝状菌态发酵过程也具有一定的参考价值。
(3)在脱脂棉-膜培养体系可以得到与琼脂培养体系相似的研究结果，且其操作更为简便，更适用于实验室条件下固态补料/连续培养过程的研究。
具体表现如下：
①在这种培养体系中，菌体在生长或发酵过程中产生的亲水性代谢物质一般都会进入脱脂棉中的液体里，培养结束时，只要将脱脂棉中的液体挤出，就可以达到发酵液与菌体分离的目的。这比从琼脂培养体系进行分离要容易得多，且易于获得高浓度的产物溶液。
②在用这种体系进行固态补料/连续培养过程研究时，只要更换脱脂棉中的液体成分就可以实现中间补料或连续培养。与琼脂培养体系相比，该体系简化了操作步骤；与天然基质的固态培养体系相比，该体系则排除了由表面积变化所带来的影响。
③在这种培养体系中，脱脂棉支撑体具有强大的吸水能力，它能束缚住足量的水分与营养液，在为菌体供给营养物的同时，减小了培养基水分的散失速度，从而有效地解决了常规固态培养体系中不可避免的水分散失问题，又不会对菌体的生长及孢子形成产生不利影响。
因此，这种经隋性支撑体改良的培养体系在实验室条件下丝状菌固态培养过程的定量研究中具有很大的应用潜力与优势[13]，特别是在菌体或产物的高密度培养方面。
Claims (8)
1.一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyriumminitans保藏号：CCTCC M203020；将菌种置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后，用200ml0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，用一层棉布或注射器将脱脂棉中的培养基液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特征在于，在培养基上置一片亲水性无菌醋酸纤维膜，膜上接种盾壳霉孢子，20℃培养。
2.一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyriumminitans保藏号：CCTCC M203020；将菌种置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后，用200ml0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，用一层棉布或注射器将脱脂棉中的培养基液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特征在于，在培养基上置一片亲水性无菌醋酸纤维膜，膜上接种盾壳霉孢子，20℃培养；培养一段时间后，将膜连同其上的菌体一起转入另一新鲜的培养基上，新鲜培养基中同时加入0.1％酪氨酸，再继续培养至7d。
3.如权利要求1所述的用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，其特征在于，所述培养基含有20％土豆汁，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；培养基的初始PH为6.0。
4.如权利要求2所述的用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，其特征在于，所述培养基含有20％土豆汁，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；培养基的初始PH为6.0。
5.一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，菌种选用Coniothyriumminitans保藏号：CCTCC M203020；将菌种置入培养基中培养，以大量获得培养菌体，培养结束后，用200ml0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，用一层棉布或注射器将脱脂棉中的培养基液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH；其特征在于，在培养皿中放一0.800±0.005g、厚度均匀、与培养皿大小一致的圆形脱脂棉饼，在脱脂棉和无菌醋酸纤维膜之间插入一层滤纸，使膜面各处都能与培养基发生充分接触，灭菌后，在其中注入培养基，脱脂棉上放置无菌醋酸纤维膜，接种盾壳霉孢子，20℃培养。
6.如权利要求5所述的用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，其特征在于，所述培养基含有20％土豆汁，20g/L葡萄糖；培养基的初始pH为6.0。
7.如权利要求5所述的用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，其特征在于，注入培养基的方式采用通过在培养皿的一端注入新培养基，从另一端抽出旧培养基，在不移动无菌醋酸纤维膜的情况下实现补料或连续培养。
8.如权利要求2所述的用于丝状菌固态培养研究的膜培养方法，其特征在于，所述新鲜培养基含有20％土豆汁，40g/L葡萄糖，20g/L琼脂；培养基的初始PH为6.0。
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