CN2747224Y - 一种用于丝状菌固态培养的膜培养器皿 - Google Patents
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Abstract
本实用新型公开了一种用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，包括一培养器皿以及和培养器皿相配合的盖子，培养器皿内放置有与培养皿大小一致的用于充满培养液的圆形脱脂棉饼；其特点是，在脱脂棉饼上覆盖有一层微孔滤膜；培养器皿的圆周上，设置有培养液入口和培养液出口。本实用新型的膜培养器皿，在培养皿中设置培养液的进口和出口，微生物菌体和培养液之间有滤纸和微孔滤膜，使膜面各处都能与培养基发生充分接触；在培养皿的进口端注入新培养基，从出口端抽出旧培养基，就可在不移动膜的情况下实现补料或连续培养。不仅有助于减轻工作量，还能对培养基中的成分进行灵活控制。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种微生物固态培养的器皿，特别涉及一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养器皿。
背景技术
在常规的固态培养体系中，如琼脂培养、麸皮培养等，进行丝状菌固态培养的动力学研究时，由于菌丝体会深入培养基内部，很难对菌丝生长情况进行定量分析。另外，在这些培养体系中补加固态物质会增加培养基的体积与表面积，补加液体物质则会影响培养基的湿度，无法准确判断出所加物质对菌体生长或代谢产物形成的真正影响，故不适宜固态补料培养和连续培养的动力学研究。
发明内容
本实用新型的目的在于，提供一种用于丝状菌固态培养研究的膜培养器皿。该膜培养器皿可以用于丝状菌的固态分批培养、固态补料培养和固态连续培养的过程动力学研究。
实现上述目的的技术解决方案是，一种用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，包括一培养器皿以及和培养器皿相配合的盖子，培养器皿内放置有与培养皿大小一致的用于充满培养液的圆形脱脂棉饼；其特征在于，在脱脂棉饼上覆盖有一层微孔滤膜；培养器皿的圆周上，设置有培养液入口和培养液出口。
本实用新型的另外一些特点是，所述微孔滤膜为亲水性无菌醋酸纤维膜。
所述脱脂棉饼和微孔滤膜中间有一层滤纸。
所述培养液入口和培养液出口分别设置在位于培养器皿内圆形脱脂棉饼的上面和下面。
所述脱脂棉可以用海绵替代。
本实用新型的膜培养器皿，在培养皿中设置培养液的进口和出口，微生物菌体和培养液之间有滤纸和微孔滤膜，使膜面各处都能与培养基发生充分接触；在培养皿的进口端注入新培养基，从出口端抽出旧培养基，就可在不移动膜的情况下实现补料或连续培养。不仅有助于减轻工作量，还能对培养基中的成分进行灵活控制。
附图说明
图1是本实用新型的结构示意图；
图2是培养基装量和培养基表面孢子量/培养基内部孢子量图；
图3是不同隔离体对孢子产量和分布的影响图；
图4是初始葡萄糖浓度和剩余葡萄糖浓度图；
图5是初糖浓度和新鲜培养基中的糖浓度均为20g/L时孢子总量图；
图6是转移时间为3.5d，初糖浓度为20g/L时，新鲜培养基中的糖浓度为4g/L时，盾壳霉的孢子总量图；
图7是改良的膜培养器皿图，其中培养器皿有培养液入口和培养液出口及其盖子，培养器皿中有脱脂棉饼，其中充满培养液，在脱脂棉饼上方有微孔滤膜，微孔滤膜上有微生物菌体。
图8是脱脂棉+纸+膜的培养器皿进行研究的图示，其中图8a微耗糖趋势图，图8b为酸、碱性物质的产生时期、耗糖速度、pH的变化图，图8c是菌种在两种培养体系下的生长量图，图8d是孢子产量对比图。
具体实施方式
以下结合附图和对本实用新型作进一步的详细说明。
依照上述技术方案用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，包括一培养器皿1以及和培养器皿1相配合的盖子2，培养器皿1内放置有与培养皿大小一致的用于充满培养液的圆形脱脂棉饼5；在脱脂棉饼5上有一层滤纸8，滤纸8上覆盖有一层微孔滤膜4；培养器皿1的圆周上，设置有培养液入口7和培养液出口6(图1)。
以下是发明人采用本实用新型后得到的具体对比实例：
实验菌种与培养基
Coniothyrium minitans CCTCC M203020，自行分离于陕西省关中地区的油菜地中，现保藏在中国典型培养物保藏中心；
PDA培养基：20％土豆汁，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；
PDB培养基：20％土豆汁，20g/L葡萄糖。
除特殊注明外，上述培养基的初始PH均为6.0。
盾壳霉孢悬液的制备
用20％无菌甘油从PDA平板上收集七日龄盾壳霉孢子，获得浓度约为107孢子/ml的孢悬液，分装于1ml小管中，-80℃下保藏。室温解冻后使用。
培养方法
PDA-膜培养法：
在PDA培养基(10ml/皿，φ＝60mm)上置一片0.45μm亲水性无菌醋酸纤维膜(φ＝60mm)，膜上接种106盾壳霉孢子，20℃培养。
膜转移培养法：
采用上述膜培养法，将盾霉在PDA上培养一段时间后，将膜连同其上的菌体一起转入另一新鲜的培养基(除含糖量有所变化外，其它组分与PDA相同)上，再继续培养至7d.对照组在整个培养过程中不添加任何物质。
脱脂棉一膜培养法：
在培养皿中放一0.800±0.005g厚度均匀、与其大小一致的圆形脱脂棉饼，灭菌后，在其中注入10mlPDB，其上放置无菌膜，接种106盾壳霉孢子，20℃培养。
1.测定方法
1.1菌体生长量：
用菌体干重表示(g/皿)。培养结束时将菌体从膜上轻轻刮下，60℃烘48h后称重。
1.2孢子产量：
用200ml 0.1％土温-80溶液将孢子收集起来，在磁力搅拌器上高速搅拌5min，用血球计数板统计孢子浓度，表示为×109孢子/皿。
1.3成分测定：
用一层棉布将PDA或用注射器将脱脂棉中的液体挤出，用DNS法测定残糖浓度，用酸度计测pH。
2结果
2.1膜在固态培养研究中的作用
2.1.1盾壳霉孢子在琼脂培养器皿中的分布
在没有覆膜的琼脂培养器皿(φ＝90mm)中，菌体除了在培养基表面生长外，还伸入培养基内部，并在其中形成孢子(图2)。活性检测结果显示：这两部分孢子在寄生、致腐菌核方面具有同等的生物防治功效(数据未给出)。因此，为了提高孢子产量，又能简化菌体和孢子的收集与测量过程，应该将菌体及孢子尽可能地集中在培养基的表面。然而，由图2可以看出，虽然增大培养基的用量可以在一定程度上增大培养基表面孢子的比率，但是并不能完全阻止培养基内部孢子的形成。其它丝状真菌的研究中也存在类似的问题。
2.1.2隔离体的选择
避免孢子在培养基内部形成的一个思路是：将菌丝体与培养基隔开但又不影响菌体的生长和产孢过程。为此申请人研究了不同隔离体对孢子产量和分布的影响。结果表明(图3)：在所选的多种隔离体中，只有0.45μm的醋酸纤维膜能完全阻止孢子在培养基内部的形成，孢子总产量也稍高于对照。与Ooijkaas等人所用的尼龙膜相比，醋酸纤维膜的亲水性更强，成本更低，适合在国内研究领域推广。本申请的其余实验均用此法。
2.2盾壳霉的膜转移培养
图4表明，提高培养基中的初糖浓度不利于盾壳霉孢子产量的提高。以前的研究大多是通过改变碳源的方式来减轻这种不利影响，以实现菌体的高密度培养。本申请则利用上述膜培养方法，通过转移培养的方式来提高孢子产量。
实验中将培养了一定时间的膜(其上附着菌丝体和孢子)转移到新鲜培养基上，研究结果表明：当初糖浓度和新鲜培养基中的糖浓度均为20g/L时，在第4.0d转移时所得孢子总量最高(约为对照的2.5倍)(图5)；当转移时间为3.5d，初糖浓度为20g/L时，新鲜培养基中的糖浓度为4g/L时，盾壳霉的孢子总量最高(约为对照的2.8倍)(图6)。采用此法，如果在新鲜培养基(20g/L葡萄糖)中同时加入0.1％酪氨酸，则可以将盾壳霉的孢子产量提高4.0倍以上(数据未给出)。由此可见，采用这种培养方式，可以达到液态培养条件下细胞循环发酵的效果，从而大幅度提高孢子密度，同时也利于对培养过程中菌丝生长、孢子形成和底物消耗情况等参数进行准确定量。
但是，当考察因素和样品重复数较多时，上述转移培养法的实验强度较大，故本申请提出以下一种改良的固态培养器皿来简化这一操作过程，并有望将其用于实验条件下的固态连续培养研究。
2.3改良的膜培养方法
在改良的膜培养器皿，参见图7，在培养皿中设置培养液的进口和出口，微生物菌体和培养液之间有微孔滤膜，用浸有PDB的隋性基质(如脱脂棉)代替琼脂凝固剂，通过在培养皿的一端注入新培养基，从另一端抽出旧培养基的方法，就可在不移动膜的情况下实现补料或连续培养。如此，不仅有助于减轻工作量，还能对培养基中的成分进行灵活控制。
为了证明这一器皿的可行性，申请人对其与PDA体系间的异同之处进行了考察。
2.3.1支撑体的选择
在培养基用量(10ml PDB)和膜吸水率相同(约150％)的条件下，本申请选用了纱布、棉布、海绵、脱脂棉等吸水性较强的物体作为支撑体，在其上覆膜后接种菌体，结果发现：这些体系上的孢子产量分别为1.54×109、6.21×108、1.94×109、和2.24×109孢子/皿。其中，脱脂棉体系上的孢子产量与琼脂体系(2.15×109孢子/皿)最为接近，这可能是因为脱脂棉的吸水性较强、孔隙较大，能够为菌体生长提供足够的水分及氧气。
需要指出的是，如果菌体能够利用脱脂棉中的成分，则需更换另一种隋性支撑体，如海绵。
2.3.2脱脂棉一膜培养器皿的建立
考虑到将膜直接覆盖在脱脂棉饼表面易造成膜面干湿状态不一，申请人在脱脂棉和膜之间插入一层滤纸，从而使膜面各处都能与培养基发生充分接触。结果发现，与脱脂棉+滤纸(8.1×108孢子/皿)和脱脂棉+膜(2.2×109孢子/皿)的培养器皿相比，脱脂棉+滤纸+膜培养器皿上的孢子产量最大(2.9×109孢子/皿)。因此，申请人选用脱脂棉+纸+膜的培养器皿进行下一步研究。
由图8可以看出，菌种在这种培养器皿中耗糖趋势(图8a)及酸、碱性物质的产生时期(图8b)基本相同，只是脱脂棉体系中的耗糖速度稍慢一些，pH的变化幅度稍大一些；但是，菌种在两种培养体系下的生长量(图8c)和孢子产量(图8d)基本相同。由此说明，用被液体培养基所饱和的脱脂棉可以代替琼脂培养器皿用于盾壳霉的固态培养研究。
在脱脂棉一膜培养器皿可以得到与琼脂培养器皿相似的研究结果，且其操作更为简便，更适用于实验室条件下固态补料/连续培养过程的研究。具体表现如下：
①在这种培养器皿中，菌体在生长或发酵过程中产生的亲水性代谢物质一般都会进入脱脂棉中的液体里，培养结束时，只要将脱脂棉中的液体挤出，就可以达到发酵液与菌体分离的目的。这比从琼脂培养体系进行分离要容易得多，且易于获得高浓度的产物溶液。
②在用这种器皿进行固态补料/连续培养过程研究时，只要更换脱脂棉中的液体成分就可以实现中间补料或连续培养。与琼脂培养体系相比，该器皿简化了操作步骤；与天然基质的固态培养体系相比，该器皿则排除了由表面积变化所带来的影响。
③在这种培养器皿中，脱脂棉支撑体具有强大的吸水能力，它能束缚住足量的水分与营养液，在为菌体供给营养物的同时，减小了培养基水分的散失速度，从而有效地解决了常规固态培养器皿中不可避免的水分散失问题，又不会对菌体的生长及孢子形成产生不利影响。
因此，这种经隋性支撑体改良的培养器皿在实验室条件下丝状菌固态培养过程的定量研究中具有很大的应用潜力与优势，特别是在菌体或产物的高密度培养方面。
Claims (5)
1.一种用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，包括一培养器皿(1)以及和培养器皿(1)相配合的盖子(2)，培养器皿(1)内放置有与培养皿大小一致的用于充满培养液的圆形脱脂棉饼(5)；其特征在于，在脱脂棉饼(5)上有一层滤纸(8)，滤纸(8)上覆盖有一层微孔滤膜(4)；培养器皿(1)的圆周上，设置有培养液入口(7)和培养液出口(6)。
2.如权利要求1所述的用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，其特征在于，所述微孔滤膜(4)为亲水性无菌醋酸纤维膜。
3.如权利要求1所述的用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，其特征在于，所述脱脂棉饼(5)和微孔滤膜(4)中间还设置有一层滤纸。
4.如权利要求1所述的用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，其特征在于，所述培养液入口(7)和培养液出口(6)分别设置在位于培养器皿内圆形脱脂棉饼(5)的上面和下面。
5.如权利要求1所述的用于丝状菌固态培养的膜培养器皿，其特征在于，所述脱脂棉可以用海绵替代。
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