CN1570091A - 重组1型单纯疱疹病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组1型单纯疱疹病毒(Simplexvirus Herps simplexvirus 1rHSV－1Δ34.5/lacZ)，制备该重组1型单纯疱疹病毒的方法及重组1型单纯疱疹病毒作为抗肿瘤药物的应用。制备步骤是：β－半乳糖苷酶表达盒的获得与纯化，中间载体IpFL的构建，中间载体II pBL的构建，转移载体pIL的构建，重组病毒的获得。本发明凋亡抑制基因icp34.5也是神经毒基因被报导基因lacZ插入失活，该重组1型单纯疱疹病毒仅能在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中不复制，故重组1型单纯疱疹病毒能有效杀死肿瘤细胞，对正常细胞和组织安全，具有很好的靶向性和选择性。

Description

重组1型单纯疱疹病毒及其制备方法和应用

技术领域：

本发明属于分子病毒基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种重组1型单纯疱疹病毒，同时还涉及重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，还涉及重组1型单纯疱疹病毒在抗肿瘤中的用途。

背景技术：

病毒感染敏感宿主细胞并在其内大量复制，最终导致细胞裂解死亡。若病毒选择性地在肿瘤细胞内复制，而对正常细胞无害，则病毒可能成为高效杀肿瘤制剂。以毒攻毒是祖国医学的经典策略。随着病毒学、肿瘤学、细胞和分子生物学理论的发展与技术的进步，利用基因工程方法改造病毒，使其选择性地杀死肿瘤细胞，已经成为可能。

许多病毒基因组中存在凋亡诱发基因和凋亡抑制基因，且处于相对平衡状态。正是由于凋亡诱发基因的存在，病毒才导致细胞凋亡；另一方面，正是由于凋亡抑制基因的存在，病毒在细胞中才得以复制，产生子代病毒，感染周围的细胞。从整体上看，缺失凋亡抑制基因的病毒感染正常细胞仅能诱发细胞凋亡而不能抑制细胞凋亡，因而细胞死亡，病毒不能复制，不会对机体造成严重危害。由于肿瘤细胞呈无限增殖状态或“凋亡抑制”状态，它能支持缺失凋亡抑制基因的病毒的复制，因此这种病毒在肿瘤细胞内能选择性增殖，进而裂解杀死肿瘤细胞[Nurse，1997]。

已发现的病毒凋亡抑制基因有腺病毒(Adenovirus)的E1B[Rao，1992]、单纯疱疹病毒(HSV)的icp34.5[Chou，1992]、痘病毒的CrmA[Datta，1997]、人巨细胞病毒(HCMV)的IE1、IE2[Zhu，1995]、人乳头瘤病毒(HPV)的E6[Xu，1995]等基因。根据上述理论，缺失这些基因的病毒都可望用于肿瘤的生物治疗。

1996年10月，Science报道了美国ONYX制药公司的Bischoff等人用缺失凋亡抑制基因E1B55K的腺病毒治疗肿瘤的研究。这种腺病毒在正常细胞中不复制，但能在癌细胞中复制并最终裂解杀灭癌细胞。将这种腺病毒注入荷人宫颈癌的裸鼠瘤体内，发现所有肿瘤尺寸均显著减小，60％的实验肿瘤完全消退[Bischoff，1996]。1997年11月，Science又报道了一期临床试验结果：32例受试头颈癌患者中，12例肿瘤尺寸明显减小，减小幅度可达90％，未发现任何毒副作用。用其他肿瘤进行的安全性实验和用头颈癌进行的二期临床试验正在进行之中。据报道，在二期临床中，由于1例患者死亡，故以后的开发工作停止。

随着分子生物学、病毒学、免疫学等相关学科的发展和交叉渗透，基因治疗研究突飞猛进。基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段，将极大程度地改变人类疾病治疗的历史进程。基因治疗有可能率先取得突破的是发病机制明确的遗传病的治疗，如囊性纤维变性[Marshall，1995]。值得探索的研究是感染性疾病，如艾滋病和肿瘤的基因治疗。肿瘤患者数量繁多，缺乏有效的治疗手段，预后极差，对基因治疗提出了迫切要求，而且肿瘤基因治疗的伦理学问题较少，因此肿瘤基因治疗的研究成为备受关注的热点。

上世纪初，人们发现肿瘤患者在感染病毒或接种病毒疫苗后，肿瘤偶尔会消退，由此产生了用病毒治疗肿瘤的设想。几十年来，流行性腮腺炎病毒(Mumps virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、流感病毒(Influenza virus)和麻疹病毒(Measlesvirus)等三十多种野生型病毒(既未经基因工程改造)曾先后用于治疗肿瘤，结果大多是相似的：治疗初期，肿瘤明显消退，但随着治疗的继续深入，肿块恢复生长，由于这类野生型病毒都能感染正常细胞，因而均伴随有病毒感染和病毒感染引起的免疫反应带来的毒副作用[Sinkovics J and Horvath J，1993]。在经历了多次失败后，人们逐渐放弃了对野生型病毒治疗模式的探索[Sinkovics J and Horvath J，1993]。

二十世纪九十年代，随着分子生物学、肿瘤学及病毒学本身的发展，肿瘤发生的分子机制，细胞与病毒间的作用机制，信号传导通路，凋亡抑制与诱发机制等逐渐被阐明，这一思路重新成为研究热点。人们开始有目的地选择和改造一些病毒，例如改造人呼肠孤病毒(Reovirus)，单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)，腺病毒(adenovirus)，细小病毒(Parvovirus)等，使它们能选择性地在肿瘤细胞中复制，并进一步杀灭肿块，但对正常细胞不能造成裂解性感染。这一类病毒，被称为条件性复制病毒或选择性复制病毒(Conditional replicative viruses)，或溶瘤病毒(Oncolyticviruses)。然而它们制备方法复杂，且不能直观检测。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种重组1型单纯疱疹病毒，该病毒靶向性强，安全性好，可选择性地感染肿瘤细胞，而对正常细胞无毒害作用。

本发明的另一个目的在于提供一种制备重组1型单纯疱疹病毒的方法，该方法简单易行，而且检测直观明了。

本发明的再一个目的在于提供一种重组1型单纯疱疹病毒在抗肿瘤方面的应用，作为抗肿瘤药物，靶向性强，安全性好，提高了抗肿瘤效果。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

重组1型单纯疱疹病毒：Simplexvirus Herps simplexvirus 1 rHSV-1Δ34.5/lacZ(A Herpes Simplex Virus Type I with an Diplex Inactive icp34.5)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC No.V200402，保藏日：2004年4月1日。一种制备重组1型单纯疱疹病毒的步骤如下：

1)β-半乳糖苷酶(lacZ)表达盒的获得与纯化：猴病毒40(SV40)启动子(1bp-419bp)控制着载体pSV-β-Galactosidase(购自promega公司)上的lacZ基因(710bp-3755bp)的表达，pSV-β-Galactosidase上含有1个PolyA序列(4021bp-4156bp)；SV40启动子上游(6814bp)和lacZ编码序列的近3′末端(3701bp)各含有1个EcoRI位点，lacZ表达盒下游则含有1个BamHI位点(4151bp)；故用BamHI、EcoRI消化，DE81膜回收大片段，获得LacZ表达盒(4160bp)，其中含有SV40(启动子)-lacZ-polyA.

2)中间载体IpFL的构建：载体pFastBac1(购自Gibco公司)用EcoRI/BamHI双酶切消化，与EcoRI/BamHI双酶切消化的lacZ表达盒连接，构建中间载体pFL，该中间载体pFL的lacZ表达盒上游具有载体自身的1个Not1位点。

3)中间载体IIpBL的构建：BamHI/XhoI酶切中间载体IpFL以切下lacZ表达盒；BamHI/XhoI酶切质粒pBluescript-M13；将lacZ表达盒与线性pBluescript-M13连接，以构建中间载体IIpBL，使lacZ表达盒下游也获得载体本身的1个NotI位点；于是，lacZ表达盒上下游均带有NotI位点。

4)转移载体pIL的构建：质粒p4789(由芝加哥大学Roizman B教授馈赠)带有完整的HSV-1的icp34.5基因(编号：M33699)(SEQ ID NO.1)及其侧翼序列；NotI酶切质粒p4789，以切去icp34.5基因第262位密码子(262bp)到终止子(1084bp)长823bp的序列；NotI酶切中间载体IIpBL，获得lacZ表达盒，并连接到经NotI酶切的质粒p4789上，构建转移载体pIL。该转移载体pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp并被lacZ表达盒插入双重灭活。

5)重组病毒的获得：转移载体pIL与野生单纯疱疹病毒F株(wt-HSV-F)(由芝加哥大学B.Roizman教授惠赠)共转染叙利亚仓鼠肾细胞系(BHK21细胞)(由湖北省医学科学院龚镇奎研究员馈赠)，经过同源重组，获得被NotI酶切缺失的icp34.5基因和lacZ表达盒插入双重灭活的重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ。用0.2mL病毒上清感染含Xga1软琼脂培养基的BHK21细胞，挑出蓝斑，进行有限稀释，再接种BHK21细胞，重复进行多次空斑纯化。

构建程序包括：

将含有lacZ表达盒的质粒载体pSV-β-Galactosidase用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因为lacZ中还含有一个EcoRI位点)并回收含有SV40启动子的4160bp的完整lacZ表达盒，插入到同样用BamHI/EcoRI双酶切的转座载体pFastBac1中，构建成中间载体IpFL；将含有lacZ表达盒的载体pFL用BamHI/XhoI双酶切并回收完整的lacZ表达盒，插入到同样用BamHI/XhoI双酶切的质粒载体pBluescript-M13中，构建成中间载体IIpBL；用NotI酶切p4789除去icp34.5基因从第262个密码子(262bp)到终止(1084bp)密码的823bp序列，但保留其左右侧翼序列，用NotI酶切pBL并回收完整的lacZ表达盒，将lacZ表达盒用T4DNA连接酶连接到用NotI酶切的p4789质粒载体中，构建成转移载体pIL。提取野生型HSV(wtHSV)DNA，与转移载体pIL共转染叙利亚仓鼠肾细胞系BHK21细胞，由于转移载体pIL上插入lacZ表达盒失活的icp34.5基因保留有左右侧翼序列，左翼650bp右翼1500bp，其与wtHSV的icp34.5基因左右侧翼序列同源，经过同源重组，等位双交换，获得含有缺失的icp34.5基因并被lacZ表达盒插入失活的重组单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的上清，用病毒上清感染含Xga1软琼脂培养基的BHK21细胞，挑出蓝斑，进行有限稀释，再接种细胞，进一步空斑纯化。用PCR扩增icp34.5基因进行重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的鉴定，即以人工合成的DNA序列CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC和CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC作引物，进行PCR鉴别重组病毒含有被lacZ表达盒插入失活的icp34.5基因。

本发明的用途是作为抗肿瘤药物，靶向性强，安全性好。

本重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ与其它重组1型单纯疱疹病毒、野生型1型单纯疱疹病毒及其它抗肿瘤药物相比，具有如下特点：

1)HSV-1基因组较大(150kb)，一级结构已经清楚，大约70个基因可被代替而仍能在某些细胞中进行复制，因而插入外源基因的容量可高达30kb，为提高治癌效率，可方便地插入细胞因子基因，突变型病毒容易包装[Roizman，1996]，是产品更新换代的基础。

2)HSV-1宿主范围较宽，包括分裂的和非分裂的细胞。可以说它可感染迄今研究过的所有类型的脊椎动物细胞。本发明构建的重组单纯疱疹病毒可望用于多种肿瘤的治疗[Fields，1990]。

3)本发明中，转移载体pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失和lacZ表达盒插入双重灭活。所以含有这种双重灭活icp34.5基因的重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ应该是一种非常稳定的突变型病毒，很难回复突变成野生型，保证了产品的安全性。

4)本发明的重组单纯疱疹病毒的icp34.5基因被lacZ插入失活，lacZ在SV40启动子驱动下高效表达，在X-Gal存在下，空斑成为兰色，因此，lacZ作为报道基因，可以监测  鉴定重组病毒，作为产品质量检测标准之一。

5)理论上和实验室研究已经证明，本发明构建的重组病毒能有效地靶向性杀死某些人癌细胞，不杀死人体正常细胞，具有安全性。

6)本发明构建的重组单纯疱疹病毒能像野生型HSV一样对抗疱疹病毒的有效药物阿昔洛韦敏感，为该重组病毒在人体内的应用提供保障。既是，倘若有个别病人因机体差异而出现病毒反应，则可以及时用阿昔洛韦进行治疗，绝对保障病人的安全。

7)实验研究已经证明，该重组单纯疱疹病毒用国家药典允许的Vero细胞生产，滴度较高，便于实现工业化生产。

8)HSV是嗜神经性病毒，icp34.5基因是其关键性基因和神经毒力基因[Thompson，1983]，缺失icp34.5基因的重组单纯疱疹病毒无神经毒性，对小鼠的半致死剂量下降10万倍，这是该重组单纯疱疹病毒特别适于脑癌治疗。

附图说明：

图1 重组1型单纯疱疹病毒的构建过程，其中lacZ：β-半乳糖苷酶基因；Amp^r：氨苄抗性基因；T7 promoter：T7启动子；T3 promoter：T3启动子。

图2 中间载体IpFL的结构和酶切鉴定图，其中A：λDNA/HindIII分子量参照；B：NotI酶切；C：EcoRI酶切；D.BamhI/HindIII酶切3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切产生4.1Kb和4.7Kb两个片。NotI酶切使pFL线性化，产生8.9Kb片段；lacZ含有两个EcoRI位点，以EcoRI酶切释放段。说明中间载体构建成功。

图3 中间载体IIpBL的结构和酶切鉴定图，其中A：λDNA/HindIII分子量参照；B：BamHI酶切；C：Not1酶切；D：BamHI/HindIII酶切。用BamHI酶切使pBL线性化，产生约7.1Kb片段；Not1酶切产生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切后得到3.3Kb和3.7Kb的片段。说明中间载体构建成功。

图4 转移载体pIL的结构和酶切鉴定图，其中A：λDNA/HindIII分子量参照；B：PstI酶切；C：XbaI酶切；D：NotI酶切。PstI酶切pIL得到9.4Kb；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb两个片段；NotI酶切产生4.1Kb和5.3Kb两个片段。说明转移载体构建成功。

图5 Xga1筛选重组单纯疱疹病毒，蓝斑表示含有该重组病毒。

图6 PCR鉴定重组1型单纯疱疹病毒，A：DNA分子量参照(1543、994、695、515、377bp)；B：重组病毒；C：野生病毒。PCR引物为icp34.5基因的缺失区，约1.7Kb，野生病毒检测到了1.7Kb的片段，而重组病毒没有。说明重组1型单纯疱疹病毒构建成功。

图7 rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV对阿昔洛韦(ACV)的敏感性， 代表wtHSV；代表rHSV-1Δ34.5/lacZ。说明阿昔洛韦(ACV)对rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV是一样敏感。

图8 rHSV-1Δ34.5/lacZ在肿瘤细胞和正常细胞中的复制效率， 代表人神经胶质瘤U251细胞； 代表正常羊膜wish细胞。说明该病毒靶向性强，安全性好，可选择性地感染肿瘤细胞，而对正常细胞无毒害作用。

图9 rHSV-1Δ34.5/lacZ对人神经胶质瘤U251细胞、人膀胱癌EJ细胞、人肺腺癌A549细胞、正常羊膜Wish细胞的杀伤效率，

代表正常羊膜wish细胞；代表人肺腺癌A549细胞；

代表人膀胱癌EJ细胞； 代表人神经胶质瘤U251细胞。说明该病毒对正常细胞羊膜Wish细胞无毒害作用，而对EJ细胞和U251细胞杀伤率强，特别是U251细胞，但对A549细胞无作用。

图10 rHSV-1Δ34.5/lacZ对人肝癌Hep3B细胞、人喉癌Hep2细胞、人肺癌SPC-A1细胞、小鼠骨髓瘤S-180细胞的杀伤效率，

代表小鼠骨髓瘤S-180细胞；

代表人肺癌SPC-A1细胞；

代表人肝癌Hep3B细胞；

代表人喉癌Hep2细胞。说明该病毒对Hep3B细胞杀伤率特强，Hep2细胞和S-180细胞较敏感，对SPC-A1细胞则无作用。

图11 rHSV-1Δ34.5/lacZ在小鼠体内的抗肿瘤效率，

代表用PBS注射组； 代表早期治疗组； 代表中期治疗组；

代表晚期治疗组。说明rHSV-1Δ34.5/lacZ使S-180肿瘤增长的速度显著减缓。

图12 治疗小鼠的组织切片，其中A：脑；B：肝；C：脾；D：肾；E：肺；F：心。说明小鼠各组织无病理变化，该重组病毒靶向性好。

图13 免疫组化结果，其中A：治疗肿瘤阳性；B：未治疗肿瘤阴性；C：治疗小鼠肝阴性；D：治疗小鼠大脑阴性。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对正常组织无害。

图14 PCR鉴定rHSV-1Δ34.5/lacZ，PCR引物为DNA聚合酶基因(UL30)和DNA聚合酶辅助蛋白基因。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对正常组织无害。

图15 电镜观察结果，其中A：正常大脑切片(×40,000)；B：治疗肿瘤切片，可见核中待包装的病毒颗粒及胞浆中少数包装成功病毒粒子(×20,000)；C：治疗肿瘤切片，可见核中待包装的病毒颗粒(×15,000)；D：治疗肿瘤切片，可见核中待包装的病毒颗粒(×20,000)。

图16 荷人肝癌细胞Hep-3B的裸鼠模型。

图17 rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠肿瘤与对照组裸鼠肿瘤的对比，其中A：空白对照组；B：低剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组；C：高剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组。说明高剂量治疗组和低剂量治疗组对人肝癌细胞有显著疗效，特别是高剂量治疗组有极显著疗效。

图18 各组裸鼠的肿瘤大小随时间变化的趋势图，其中 代表高剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组； 代表中剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组； 代表低剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组；

代表空白治疗组；

代表临床药物治疗组。说明空白对照组裸鼠的肿瘤体积随时间延长而持续大幅增加；各治疗组裸鼠的肿瘤体积在治疗初期上升幅度较大，但在治疗中，后期，治疗裸鼠的肿瘤体积上升幅度明显减小最终，各治疗组裸鼠肿瘤体积远远小于空白对照组；临床药物对照组裸鼠的肿瘤体积也是一直持续增加，但上升幅度小于空白对照组，最终治疗效果不及高，中剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组。

图19 聚合酶基因RT-PCR电泳检测。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对正常组织无害。

图20 tk基因RT-PCR电泳检测。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对正常组织无害。

图21 rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠各脏器病理切片(放大倍数：20×3.3)。说明该重组病毒只选择性的在肿瘤细胞中复制，而对正常组织无害。

图22 未治疗组裸鼠各脏器病理切片(放大倍数：20×3.3)。说明重组病毒对正常组织无害。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件并参考下列资料进行如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，“分子克隆实验指南”(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，“细胞实验指南”；E.哈洛等，科学出版社，2002，“抗体技术实验指南”等所述的方法，或接照制造厂商操作指南所建议的方法。

实施例1 重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的构建和获得

质粒载体pSV-β-Galactosidase购自promega公司，转座载体pFastBac1购自Gibco公司。载体pSV-β-Galactosidase上含有lacZ表达盒，SV40启动子控制其表达。质粒载体pBluescript-M13购自Stratagene公司。质粒p4789由芝加哥大学Roizman B教授馈赠，含有完整HSV icp34.5基因及其侧翼序列。叙利亚仓鼠肾细胞系BHK21细胞由湖北省医学科学院龚镇奎研究员馈赠，野生病毒HSV-1 F株由芝加哥大学B.Roizman教授惠赠的。

中间载体IpFL的构建：从含有lacZ表达盒的载体pSV-β-Galactosidase上用BamHI完全消化，EcoRI不完全消化(因lacZ中还含有一个EcoRI位点)并回收完整的带SV40启动子的lacZ表达盒(4160bp)，插入到同样用BamHI/EcoRI双酶切的转座载体pFastBac1中。取质粒DNA 1-5μl加入到50μl的大肠杆菌TG1感受态细胞中进行热休克转化，转化时提前1h将Xga1涂在含Amp的LB平皿上，37℃过夜培养，根据蓝色菌落挑选出转座载体pFL，以NotI、EcoRI、BamHI/HindIII酶切pFL来鉴定阳性克隆(图2)。NotI酶切使pFL线性化，产生8.9Kb片段；lacZ含有两个EcoRI位点，以EcoRI酶切释放3.1Kb和5.8Kb的片段；以BamhI/HindIII酶切产生4.1Kb和4.7Kb两个片段。说明中间载体I构建成功。

中间载体IIpBL的构建：从含有lacZ表达盒的中间载体IpFL上用BamHI/XhoI双酶切，并回收完整的带SV40启动子的lacZ表达盒，插入到同样用BamHI/XhoI双酶切的质粒载体pBluescript-M13中，构建中间载体IIpBL。取质粒DNA 1-5μl加入到50μl的大肠杆菌TG1感受态细胞中进行热休克转化，转化时提前1h将Xga1涂在含Amp的LB平皿上，37℃过夜培养，根据蓝色菌落挑选出转座载体，以BamHI、NotI、BamHI/HindIII酶切pBL来鉴定(图3)。BamHI酶切使pBL线性化，产生约7.1Kb片段；Not1酶切产生3Kb和4.1Kb片段；BamHI/HindIII酶切后得到3.3Kb和3.7Kb的片段。说明中间载体II构建成功。

转移载体pIL的构建：用Not1酶切p4789以除去icp34.5基因从第262个密码子(262bp)到终止密码(1084bp)的823bp片段，但保留其左右侧翼序列650bp和1500bp；pBL也用NotI酶切，并回收完整的带SV40启动子的lacZ表达盒，将lacZ表达盒连接到用Not1酶切的p4789中，构建转移载体pIL。取质粒DNA 1-5μl加入到50μl的大肠杆菌TG1感受态细胞中进行热休克转化，转化时提前1h将Xga1涂在含Amp的LB平皿上，37℃过夜培养，根据蓝色菌落挑选出转座载体，用PstI、XbaI、NotI酶切鉴定(图4)。PstI酶切pIL得到9.4Kb；XbaI酶切得到3.8Kb和5.6Kb两个片段；NotI酶切产生4.1Kb和5.3Kb两个片段。说明转移载体构建成功。

重组病毒的获得：提取野生HSV(wtHSV)的DNA，与转移载体pIL共转染BHK21细胞。质粒pIL与野生型HSV DNA的共转染：取两个预先加入200μL 1640培养基(未加血清)的EP管，一个加20ug pIL和20ug HSV-1 DNA，混匀；另一个加8μL Lipofectin转染试剂，混匀。将两管合并混匀，静置45min，使Lipofectin包裹DNA。临用前补加无血清培养液1640，以使转染混合液能均匀覆盖细胞层。取70-80％丰度的单层BHK细胞1瓶，弃培养液。用未加血清的培养液清洗瓶壁数次，然后加转染混合液。37℃温育6h后弃转染混合液，换常规1640培养基，37℃培养。

由于转移载体pIL上插入了lacZ表达盒，icp34.5基因失活，但保留有icp34.5基因的左右侧翼序列，它们与wtHSV的icp34.5基因左右侧翼序列同源；经过同源重组，获得含有icp34.5基因失活的且带有lacZ表达盒的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ；用病毒上清0.2ml感染含Xga1软琼脂培养基的BHK21细胞，37℃培养36-42小时，挑出蓝斑，进行有限稀释，再用0.2ml接种细胞，进一步进行空斑纯化。

实施例2 重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的鉴定

供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ以及由芝加哥大学B.Roizman教授惠赠的野生病毒HSV-1 F株。icp34.5基因引物由上海生工(SANGON)公司合成。

正向引物：5’-CTCTGCAGTCACGCCCCTTCCGCCTTCC-3’

反向引物：5’-CCGGATCCGCTCCTGCCATCGTCTCTCC-3’

用PCR技术扩增icp34.5基因进行鉴定。反应体系：10×buffer 5μL，dNTP(2.5mM)5μL，正向引物(10pmol/ul)2.5μL，反向引物(10pmol/ul)2.5μL，HSV DNA 5μL，MgCl₂(25mM)5μL，ddH₂O 25μL，Taq DNA聚合酶(5U/ul)0.5μL。扩增条件：94℃，90秒；56℃，90秒；72℃，120秒；循环35次。预变性5分钟(94℃)，终延伸10分钟(72℃)。结果证明：重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ缺失了野生病毒wtHSV中的icp34.5基因(图6)。

实施例3 重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的扩增

供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ。非洲绿猴肾Vero细胞系由武汉大学医学院董长垣教授惠赠。

用DMEM培养液在35mm培养板上培养Vero细胞，待Vero细胞长成单层后，弃去DMEM培养液，用PBS洗细胞表面，接种病毒0.2ml，37℃吸附1-2小时，弃去上清，同时设一瓶不加病毒的细胞作对照；加入2％小牛血清的培养基，37℃培养；80％的细胞出现病变后，反复冻溶三次，收获病毒；在4℃以8000rpm离心30分钟，收集上清，置于4℃短期保存；若需要长期保存，则加入10％甘油，置于-80℃。

实施例4 重组单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ的安全性

供试病毒为实施例1构建的重组病毒，由芝加哥大学B.Roizman教授惠赠的野生病毒HSV-1 F株。

选择对单纯疱疹病毒敏感的昆明种小鼠作受试对象，比较了rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV的半数致死剂量(LD₅₀)。实验第21天的死亡情况及两种病毒的LD₅₀见表1。结果表明icp34.5基因的缺失大大地降低了HSV的毒性，rHSV-1Δ34.5/lacZ的LD₅₀为wt HSV的10万倍，即毒力降低10万倍，说明rHSV-1Δ34.5/lacZ有较好的安全性。

抗疱疹药物阿昔洛韦(ACV)是毒性极低的药物前体，HSV tK基因表达产物TK(胸苷激酶)使ACV磷酸化激活成为细胞毒性药物而杀死细胞。虽然缺失icp34.5基因，但HSV的tK基因完整，能有效表达TK酶蛋白，以活化抗疱疹药物ACV，发挥杀细胞作用；由于rHSV-1Δ34.5/lacZ感染复制是靶向性的，所以正常细胞中没有rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖，即没有tk基因的表达，ACV不会被激活，所以正常细胞既不会由于rHSV-1Δ34.5/lacZ杀死，也不会被活化的ACV毒杀；而对容许rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖的恶性肿瘤细胞来说，不仅会因rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖而被有效裂解杀死，而且由于rHSV-1Δ34.5/lacZ有效增殖而使tk基因有效表达，产生TK酶蛋白，激活ACV前体成细胞毒性药物，与rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖裂解杀癌细胞协同，杀死癌细胞。所以，当用ACV后，只要有rHSV-1Δ34.5/lacZ基因表达，ACV便被激活，rHSV-1Δ34.5/lacZ感染的细胞便被杀死，rHSV-1Δ34.5/lacZ也就失去了增殖的条件，rHSV-1Δ34.5/lacZ死亡，毒性消除；若没有应用ACV，rHSV-1Δ34.5/lacZ便会无限制地增殖并裂解肿瘤细胞，同时释放子代rHSV-1Δ34.5/lacZ，子代rHSV-1Δ34.5/lacZ再感染、裂解新的肿瘤细胞，如此循环，以至所有肿瘤细胞彻底消灭；所有肿瘤细胞彻底消灭了，子代rHSV-1Δ34.5/lacZ也就失去了繁衍下一代rHSV-1Δ34.5/lacZ的场所，也就被机体作为异物排斥掉。

实验证明：用对rHSV-1Δ34.5/lacZ敏感的神经胶质瘤U251细胞接种重组型和野生型病毒，换用含不同浓度(0、0.5、0.7、1.0、1.5ug/ml)ACV的培养基培养。计算两种病毒对ACV的半耐受浓度EC₅₀，比较其敏感性，结果表明：rHSV-1Δ34.5/lacZ和wtHSV一样，对抗疱疹药物ACV敏感(见图7)。所以在用rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗肿瘤的过程中，可用阿昔洛韦(ACV)对万一出现的重组病毒的副作用进行有效控制。

        表1.wtHSV和rHSV-1Δ34.5/lacZ半数致死剂量(LD₅₀)

	使用病毒浓度(PFU/小鼠)						LD50(PFU/小鼠)
								101	102	103	105	106	107
	wt HSV	1/3	3/3	4/4	ND	ND								ND	1.8×101
rHSV-1Δ34.5/lacZ							ND	ND	ND	0/3	1/3	3/4	2.8×106

                                                  注：ND为没有进行实验

实施例5  重组单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ在细胞中的选择性杀瘤测定

供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ以及由芝加哥大学B.Roizman教授惠赠的野生病毒HSV-1 F株。

以人神经胶质瘤U251细胞为肿瘤细胞的代表，以正常羊膜wish细胞为对照，比较重组单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ在肿瘤细胞和正常细胞中的复制效率，结果见图8。可以看出rHSV-1Δ34.5/lacZ选择性地在人神经胶质瘤U251细胞中复制；而对正常细胞基本上不复制，表明病毒感染正常细胞后诱发其凋亡，病毒不能复制，随后自然降解。

用MTT法定量测定重组单纯疱疹病毒对人神经胶质瘤U251细胞、人膀胱癌EJ细胞、人肺腺癌A549细胞、正常羊膜Wish细胞、人肝癌Hep3B细胞、人喉癌Hep2细胞、人肺癌SPC-A1细胞、小鼠骨髓瘤S-180细胞的杀伤效率。结果见图9、10。试验结果表明，U251、EJ、Hep3B、Hep2和S-180五种肿瘤细胞对rHSV-1Δ34.5/lacZ敏感，但对这些敏感细胞的增值动力曲线各异。在这些敏感细胞中，Hep3B细胞对rHSV-1Δ34.5/lacZ感染反应最为迅速，U251细胞次之，EJ和Hep2细胞也比较敏感，A549、SPC-A1和正常细胞对感染不敏感，感染后基本无细胞病变，亦无细胞死亡。

实施例6 荷S-180小鼠肉瘤动物模型建立

供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ以及由芝加哥大学B.Roizman教授惠赠的野生病毒HSV-1 F株。供试BALB/c小鼠购自武汉试验动物中心，4-5周龄(20g左右)使用。小鼠肉瘤细胞系S-180由华中科技大学同济医学院药学院提供。

建立荷S-180小鼠肉瘤的动物模型，用S-180细胞(浓度为1×10⁵/mL)0.1mL接种健康BALB/c小鼠腹腔，7天后，鼠腹腔被腹水涨大，抽出腹水，以PBS将细胞浓度调整为1×10⁵/mL，接种0.1mL于健康小鼠前肢腋下，3天后即可见绿豆粒大小肿瘤块长出。

实施例7 重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ对荷S-180肉瘤小鼠的杀瘤效应测定

供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ。供试小鼠为实施例6建立的荷S-180肉瘤小鼠模型。抗HSV-1的抗体(DAKO，B0114)购自DAKO公司。PCR引物在基康生物公司合成，第一对引物针对DNA聚合酶基因(UL30)，序列为：(5’-atcaac ttc gac tgg ccc tt-3’)和(5’-ccg tac atg tcg atg ttc ac-3’)，产物为189bp(Lakemany et al.，1995)；第二对引物(5’-acg acg acg tcc gac ggc ga-3’)和(5’-gtg ctg gtg ctg gac gac ac-3’)，针对DNA聚合酶辅助蛋白基因，扩增产物为279bp片段(Puchhammer et al.，1993)，PCR反应体系为100ul，含200mMdNTP，2 U Taq酶。94℃1min，58℃1min，72℃2min，共35个循环进行扩增。

在荷瘤小鼠的生存期试验中，于每只BALB/c小鼠(4-5周龄；22-25g)左前肢腋窝处接种新鲜制备的1×10⁵S-180细胞(0.1ml)。4天后，当肿瘤平均直径达到4mm，将荷瘤小鼠随机分为早期治疗组、中期治疗组、晚期治疗组和对照组，30只/组。注射的剂量、时间和分组情况见表2。治疗后每两天用两脚规量肿瘤直径一次，肿瘤体积按公式0.53×长×宽计算(Yamamura H et al，2001)。每天观察小鼠，记录死亡日期，解剖死亡小鼠，取其瘤块，称重并测量体积。结果见表3。从PBS组和治疗组小鼠肿块解剖看出，晚期治疗组和对照组小鼠肿瘤体积较大，早期和中期治疗组则肿瘤体积相对较小。

             表2.rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗荷瘤小鼠分组情况

分组	治疗时间	剂  量(仅注射一次)	荷瘤小鼠数量(只/组)
				早期治疗组(E)	荷瘤后4天	0.5×106PFU rHSV-1Δ34.5/lacZ	40
中期治疗组(Ma)	荷瘤后7天	0.05×106PFU rHSV-1Δ34.5/lacZ	40
				中期治疗组(Mb)	荷瘤后7天	0.2×106PFU rHSV-1Δ34.5/lacZ	40
中期治疗组(Mc)	荷瘤后7天	0.5×106PFU rHSV-1Δ34.5/lacZ	40
				晚期治疗组(L)	荷瘤后10天	0.5×106PFU rHSV-1Δ34.5/lacZ	40
对照组(C)	荷瘤后4天	0.1ml PBS	40

表3.rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗荷S-180肉瘤的小鼠的生存期试验结果

分组	平均生存期(天)	治愈率(％)	荷瘤后第24天时平均肿瘤体积(mm3)
				早期治疗组	55.8	10.5	306.5
中期治疗组	47.6	5.0	422.3
				晚期治疗组	35.0	0	549.5
PBS组	34.0	0	562.6

通过肿瘤体积及小鼠生存时间来评价rHSV-1Δ34.5/lacZ的抗肿瘤效率，结果表明：与PBS对照组相比，rHSV-1Δ34.5/lacZ使S-180肿瘤增长的速度显著减缓(见图11)。

t-检验结果表明：与PBS对照组相比，早期治疗组和中期治疗组平均生存期、治愈率、肿瘤体积各项指标p＜0.01，有显著性差异；晚期治疗组各项指标p＞0.05，无显著性差异。

rHSV-1Δ34.5/lacZ注射入瘤内后，每隔14天处死10只小鼠，分离其肿瘤、脑、心脏、肺、肾和肝，固定于10％甲醛溶液中，石蜡包埋，切片，HE(苏木精-伊红)染色，光镜下病理分析。在处死日期前濒死的小鼠，立即处死，如上处理其组织；已死亡的小鼠，丢弃不用，结果见图12。上述切片中留一部分不染色，做免疫组化实验，结果见图13。免疫组化检测发现在治疗小鼠的肿瘤细胞中有细胞质和细胞核着色(表明有rHSV-1Δ34.5/lacZ抗原表达)，但在脑和其它组织中无。在所有检测过的动物中，仅在治疗过的肿瘤细胞中有rHSV-1Δ34.5/lacZ抗原表达，在相邻的正常组织中没有。由于我们使用的抗体可以检测出HSV-1主要表面糖蛋白和至少一种核心蛋白，阳性反应说明病毒在被感染的肿瘤细胞中复制增殖(Kerasi et al.，1998)。在治疗14天的动物中肿瘤坏死已很明显，在坏死部位无抗原表达。抗原仅局限于治疗过的肿瘤结节中，提示肿瘤坏死是由病毒复制引起的。病理学分析显示除肿瘤外，包括脑、心、肝、脾、肾和肺器官在治疗4周后，无病理学变化(图12)。用Fisher精确法对各个治疗组肿瘤坏死程度进行了统计学分析，并在中期治疗组设了剂量对照，结果见表4-12。表4结果表明，治疗2周后，肿瘤坏死程度主要是轻度，治疗时间延长至第4周和第6周，肿瘤坏死发展成中度或重度，故认为rHSV-1Δ34.5/lacZ杀伤肿瘤4周后效果明显(ρ＜0.01)，到第6周全部肿瘤达到重度坏死。表5的结果表明在中期治疗组中，给予不同剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ，所致肿瘤坏死程度不一样，差别有高显著性(ρ＜0.01)，中剂量和高剂量使肿瘤坏死效率较低剂量高，表明增加重组病毒剂量，即使在治疗的第2周，肿瘤也能显示中度和重度坏死。表6表明在中期治疗中，不同剂量组经过4周的治疗后，肿瘤坏死程度明显增大，高剂量致使全部肿瘤达到重度坏死。表7统计分析表明，晚期治疗的效果随时间推移，没有显著性变化。表8、9、10是中期治疗组不同剂量在2周、4周的观察结果，中剂量与高剂量均是4周比2周肿瘤坏死严重，这表明随着病毒的复制，肿瘤坏死程度越来越严重，但低剂量治疗组没有表现出这种明显差异。表11、12的p值是各治疗组的肿瘤坏死例数与对照组的相应数据F-检验分析的结果。结果表明，治疗期间，各治疗组和对照组均有不同程度的肿瘤坏死，与对照组相比，早期治疗组和中期治疗组的坏死程度有显著性差异，这说明rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗可以造成肿瘤坏死，在排除了肿瘤在生长过程中自身会产生一定坏死的基础上，肿瘤坏死程度可以反映治疗效果。

               表4.早期治疗组不同时段(周)肿瘤坏死程度的比较

治疗时段(第n周)	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	p值
							轻	中	重
		2	8	8						0	0	170.89	＜0.01
4	5				0	4	1
		6	6	0				0	6

          表5.中期治疗各组治疗2周后肿瘤坏死程度比较

分组	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	p值
							轻	中	重
		低剂量	6	4						2	0	9.08	＜0.01
中剂量	8				1	7	0
		高剂量	6	0				4	2
合计	20				5	13	2			-	-

                表6.中期治疗各组治疗4周后肿瘤坏死程度比较

分组	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	p值
							轻	中	重
		高剂量	8	1						7	0	13.31	＜0.01
中剂量	7				2	1	4
		低剂量	7	0				0	7
合计	22				3	8	11			-	-

          表7.晚期治疗各组不同时段(周)肿瘤坏死程度的比较

治疗时段(周)	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	p值
							轻	中	重
		2	7	3						2	2	0.42	＞0.05
4	4				2	1	1
		合计	11	5				3	3	-	-

          表8.中期低剂量治疗组不同时段(周)肿瘤坏死程度的比较

治疗时段(周)	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	p值
							轻	中	重
		2	6	4						2	0	0.87	＞0.05
4	8				1	7	0
		合计	14	5				9	0	-	-

          表9.中期中剂量治疗组不同时段(周)肿瘤坏死程度较

时段分组(周)	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	p值
							轻	中	重
		2	8	1						7	0	3.84	＜0.05
4	7				2	1	4
		合计	15	3				8	4	-	-

      表10.中期高剂量治疗组不同时段(周)肿瘤坏死程度的比较

时段分组(周)	观察例数(n)	肿瘤坏死程度			F值	P值
							轻	中	重
		1	6	0						4	2		＜0.05
2	7				0	0	7
		合计	13	0				4	9	-	-

                    表11.治疗2周后各实验组肿瘤坏死程度比较

试验分组		观察例数(n)	肿瘤坏死程度			荷瘤(天数)	P值
								轻	中	重
			早期治疗组		8						8	0	0	18	＜0.05
中期	低剂量组	6				4	2	0	21	＜0.05
			中剂量组	8	1						7	0	21	＜0.05
	高剂量组	6				0	4	2	21	＜0.05
			晚期治疗组		7						3	2	2	24	＞0.05
对照组		8				6	1	1	18	-
			合计		52						22	16	5	-	-

                    表12.治疗4周后各实验组肿瘤坏死程度比较

治疗组		观察例数(n)	肿瘤坏死程度			荷瘤(天数)	P值
								轻	中	重
			早期治疗组		5						0	4	1	32	＜0.05
中期	低剂量组	8				1	7	0	35	＜0.05
			中剂量组	7	2						1	4	35	＜0.05
	高剂量组	7				0	0	7	35	＜0.05
			晚期治疗组		4						2	1	1	38	＞0.05
对照组		3				1	0	2	32	-
			合计		34						6	13	15	-	-

以上结果说明：本发明构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ对小鼠的治疗有显著效果，并有如下规律：

1.rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗与肿瘤发生时间有关，早期治疗优于中期治疗，晚期治疗效果更差；

2.rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗与病毒剂量有关，随着病毒剂量增加，治疗效果显著增加，高剂量的重组病毒在任何情况下的治疗效果远优于中、低剂量；

3.rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗肿瘤与时间进程有关，不管是早期治疗还是中期治疗，甚至剂量达到中等程度，注射后的2周无显著效果(因为病毒复制需要时间)，到第4周，病毒大量增殖，产生临近效应，不管是哪一个治疗组，不管是哪一个剂量组均显示显著的治疗效果。

4.rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗肿瘤的关键是重组病毒的剂量，为了病人的及早康复，最好的治疗方案是用高剂量重组病毒(5×10⁶pfu/mL)，一次注射，2周后疗效显著，甚至1周后也表现一定效果。

提取小鼠各组织DNA，用HSV-1特异的引物扩增，PCR鉴定rHSV-1Δ34.5/lacZ的存在。结果显示：仅在治疗的肿块中，而未在其它组织中扩增出相应片段(见图14)，说明rHSV-1Δ34.5/lacZ仅能在肿瘤细胞中复制，并不能扩散到其他组织中。

电镜观察肿瘤组织和脑组织切片，发现在治疗的肿瘤组织中，有包装好的和未包装的病毒颗粒，直径约140nm；相形之下，脑组织切片正常，未见病毒样颗粒(图15)。

实施例8 荷人肝癌Hep-3B裸鼠模型的建立

人肝癌Hep-3B细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)，并经体外培养实验证明rHSV-1Δ34.5/lacZ能在Hep-3B细胞上复制增殖，产生细胞病变效应(CPE)；用MTT技术证实了rHSV-1Δ34.5/lacZ对Hep-3B细胞的毒杀作用。

实验裸鼠由湖北省实验动物研究中心提供并负责全程管理和饲养。

大量培养Hep-3B细胞，待细胞形成致密单层时，消化收集细胞在无菌离心管中，1000rpm，离心5min；收集细胞沉淀，加入10ml新鲜MEM培养基重悬细胞沉淀；取100ul细胞悬液稀释，混匀后滴加在细胞计数板上计数细胞；1000rpm，5min，离心沉淀细胞；加入新鲜MEM培养基重悬细胞沉淀，使终剂量为5×10⁸cells/ml。

将1ml Hep-3B细胞浓缩液用无菌注射器注射到5只裸鼠的腋下(0.2ml/只)，一星期后，裸鼠注射部位长出绿豆大小瘤状突起；30天后，瘤状突起物增大；处死荷瘤裸鼠，切下瘤状物，并用解剖刀完全切碎，然后用套筒针管将切碎的瘤状物全部等量移植到另外的5只健康裸鼠腋下。30天后，移植的裸鼠腋下均出现直径约0.8cm的瘤状物；处死其中1只移植裸鼠，取瘤状物作病理检查和作原代细胞培养，证实瘤状物为Hep-3B肿瘤块。另4只实验裸鼠20天后，移植肿瘤生长至直径3.5cm左右；处死之，切下肿瘤，并捣碎成米粒大小，用套筒针管第二次移植至180只裸鼠腋下；15天后，80％的移植裸鼠出现移植肿瘤，直径在0.5cm-1.5cm之间(图16)；选取125只作rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗实验。

实施例9 rHSV-1Δ34.5/lacZ对荷人肝癌Hep-3b裸鼠的杀瘤效应测定

供试病毒为实施例1构建的重组病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ，供试裸鼠为实施例8建立的荷人肝癌Hep-3b裸鼠模型。TRIzol试剂购自Invitrogen公司。PCR引物在基康生物公司合成，单纯疱疹病毒DNA多聚酶基因Pol(215bp)，Pol正向引物：GCT CGAGTG CGA AAA AAC GTT C，Pol反向引物：CGG GGC GCT CGG CTA AC；单纯疱疹病毒tk基因(335bp)，tk正向引物：GAC CAG CGC CCA GAT AAC AA，tk反向引物：CCA GCATAG CCA GGT CAA GC。PCR反应体系：95℃ 30sec，62℃ 30sec，72℃ 30sec共30个循环进行扩增。血液学指标用日本东亚医用电子公司生产的F-820型血球计数仪测定；血液生化指标用德国产Eppendorf FG124型半自动生化分析仪测定，试剂盒由北京中生生物制品有限公司提供。

将选取的125只裸鼠按肿瘤大小分组，保证每组裸鼠的平均肿瘤大小基本一致，一共分为5个组：rHSV-1Δ34.5/lacZ高剂量(5×10⁶pfu/mL)治疗组，rHSV-1Δ34.5/lacZ中剂量(5×10⁵pfu/mL)治疗组，rHSV-1Δ34.5/lacZ低剂量(5×10⁴pfu/mL)治疗组，空白对照组(注射不含rHSV-1Δ34.5/lacZ的Vero细胞悬液)，临床药物阿霉素ADM对照组(3.333mg ADM/ml)。分组后当天，按上述分组施以不同的处理；瘤内注射0.1ml/次/鼠处理用试剂，病毒组每周注射一次，共3次，ADM对照组每间隔三周作一次注射。

治疗期间，观察受试动物生活状态，记录裸鼠死亡数，隔天测量裸鼠肿瘤大小及体重，绘制裸鼠肿瘤体积/时间变化曲线。在第三次瘤内注射治疗后一个星期开始分三批(每周一批)处死裸鼠；眼球取血，做血常规以及血液生化检查；取全部肿瘤组织、心、肝、脾、肺、肾和大脑，分别测量重量、用RT-PCR技术检测重组病毒的mRNA和组织病理学检测等。

部分解剖后的rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠肿瘤与空白对照组裸鼠肿瘤照相，结果见图17。结果表明，空白对照组裸鼠的瘤块体积大、颜色鲜艳、血管丰富；高剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠的瘤块体积最小，血管不丰富；低剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠瘤块体积比空白对照组要小，且肿瘤块血管没有增生。

各组裸鼠的肿瘤大小随时间变化的趋势如图18。结果表明，空白对照组裸鼠的肿瘤

分组	死亡率(％)	肿瘤平均体积(mm3)	肿瘤平均重量(g)	肿瘤重量抑制率(％)	肿瘤体积抑制率(％)
						空白对照组	29.17	557.1	6.41	/	/
药物对照组	15.22	297.6	4.03	38.33	45.10
						高剂量组	0	161.8	2.45	61.78	70.96
中剂量组	0	244.7	3.51	45.24	56.08
						低剂量组	0	358.7	4.33	32.45	35.61

体积随时间延长而持续大幅增加，且在治疗期间呈加速上升趋势，肿瘤体积由最初的30mm³增大接近20倍至最终的557mm³；rHSV-1Δ34.5/lacZ各治疗组裸鼠的肿瘤体积在治疗初期上升幅度较大，但仍远远低于空白对照组的上升幅度，且在治疗中、后期，治疗裸鼠的肿瘤体积上升幅度明显减小，最终各rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠肿瘤体积远远小于空白对照组；临床药物阿霉素对照组裸鼠的肿瘤体积也是一直持续增加，但上升幅度小于空白对照组，最终治疗效果不及高、中剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组，只是略优于低剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组。各组肿瘤大小变化趋势说明，在治疗初期，rHSV-1Δ34.5/lacZ增殖尚不占优势，癌细胞增加数目大于rHSV-1Δ34.5/lacZ杀死癌细胞数目，所以肿瘤体积仍在增大；随着rHSV-1Δ34.5/lacZ在肿瘤细胞中复制直至rHSV-1Δ34.5/lacZ趋于对数增殖，在治疗的中、后期，rHSV-1Δ34.5/lacZ杀死癌细胞数大于癌细胞自身增殖数，以至肿瘤平均体积迅速减小、乃至消失。

rHSV-1Δ34.5/lacZ对荷人肝癌Hep-3B裸鼠的治疗效果见表13。rHSV-1Δ34.5/lacZ对在体Hep-3B肿瘤有非常显著的抑制作用；rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠生活状态正常，高、中、低剂量治疗组裸鼠均没有因rHSV-1Δ34.5/lacZ副作用引起死亡。空白对照组因没有得到治疗，有将近30％的裸鼠死于快速生长的肿瘤；而其余的裸鼠肿瘤体积增长得很大，并且生活状态极差。临床药物对照组裸鼠经ADM治疗后肿瘤体积和重量有所减少，但是有明显的副作用，裸鼠生活状态不好，死亡率达15％。rHSV-1Δ34.5/lacZ显示了极好的抗癌效果和安全性。

    表13.rHSV-1Δ34.5/lacZ对荷Hep-3B裸鼠治疗效果一览表

分组	死亡率(％)	肿瘤平均体积(mm3)	肿瘤平均重量(g)	肿瘤重量抑制率(％)	肿瘤体积抑制率(％)
						空白对照组	29.17	557.1	6.41	/	/
药物对照组	15.22	297.6	4.03	38.33	45.10
						高剂量组	0	161.8	2.45	61.78	70.96
中剂量组	0	244.7	3.51	45.24	56.08
						低剂量组	0	358.7	4.33	32.45	35.61

用RT-PCR技术鉴定rHSV-1Δ34.5/lacZ在组织内的分布。迅速解剖各组实验裸鼠，收集肿瘤、心、肝、脾、肺、肾和大脑等组织，立刻将其置于-20℃保存。取材结束后，立即分别用TRIzol提取肿瘤和各脏器细胞的总RNA。分别以单纯疱疹病毒多聚酶基因(215bp)和tk基因(335bp)引物对提取的裸鼠各组织总RNA进行RT-PCR。结果见图19、20。实验结果显示，rHSV-1Δ34.5/lacZ基因转录仅见之于治疗组裸鼠的肿瘤组织中，而两个对照(空白对照组和ADM对照组)裸鼠肿瘤组织和所有实验动物的心、肝、脾、肺、肾和脑组织都没有扩增出相应核酸序列条带，从而证明了rHSV-1Δ34.5/lacZ只在治疗组裸鼠的肿瘤组织中复制。这就说明了：rHSV-1Δ34.5/lacZ不感染实验动物正常组织，即对实验动物正常组织无害，rHSV-1Δ34.5/lacZ具有极好的靶向性抗癌效果。

试验在中期和结束时分别对受试动物进行了血液学和血液生化学指标检测分析。血液学分析共有白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白剂量(MCHC)、血小板计数(PLT)、红细胞体积分布宽度变异数(RDW-CV)、血小板体积分布宽度(PDW)、血小板平均体积(MPV)等11项指标；血液生化分析共有尿素氮(BUN)、白蛋白(ALB)、三酸甘油脂(TRI)、胆固醇(CHO)、总蛋白(TP)、谷丙转氨酶(GOT)、谷草转氨酶(GPT)、肌酐(CRE)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBI)等10项指标。计算了各试验组裸鼠的血液学和血液生化检测均值和标准差，并进行了显著性检验(见表14、15)。

结果(表14)表明：rHSV-1Δ34.5/lacZ各治疗组与空白对照组比较，11项血液学指标均无显著性差异(P＞0.05)；而ADM药物对照组与空白对照组比较，白细胞计数(WBC)显著减少(P＜0.05)，此外，其它10项血液学指标均无显著性差异(P＞0.05)。

结果(表15)表明：rHSV-1Δ34.5/lacZ各治疗组与空白对照组比较，10项生化指标均无显著性差异(P＞0.05)。从而可以得出结论：rHSV-1Δ34.5/lacZ对受试动物的肝功能、肾功能、酶类、以及血脂等项目均无不良影响；而化疗药物阿霉素对照组与空白对照组比较，总胆蛋白(TBI)指标比空白对照组指标显著增高(P＜0.05)，表明对肝功能有毒副作用，而rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗不产生毒副作用。

                                       表14.血液学指标检测结果

检测项目          对照组                高剂量组                中剂量组               低剂量组                药物对照组
						WBC(109/l)RBC(1012/l)HGB(g/l)HCTMCV(fl)MCH(pg)MCHC(g/l)PLT(109/l)RDW-CVPDW(fl)MPV(fl)	10.33±4.105.79±0.85122.50±21.210.25±0.1454.90±18.1016.32±0.79361.33±25.54598.20±214.600.196±0.0356.59±0.606.60±0.28	9.30±3.307.49±2.33123.8±19.250.23±0.1859.7±21.614.87±1.53355.00±61.45619.90±184.700.184±0.0416.75±1.136.63±0.57	9.41±3.986.64±2.61105.25±29.060.20±0.1558.70±21.0015.40±1.77344.88±35.12695.60±176.400.209±0.0766.52±0.696.62±0.45	11.11±4.023.24±3.92123.85±15.960.14±0.1667.40±21.4015.74±1.17376.20±17.70633.30±161.500.168±0.0226.60±0.846.62±0.36	6.26±2.676.68±1.89117.70±28.360.17±0.1666.20±20.0016.10±0.97342.00±33.18599.30±92.550.198±0.0276.46±0.656.67±0.38

                                       表15.血液生化指标检测结果

检测项目               对照组                 高剂量组             中剂量组             低剂量组               药物对照组
						BUN(mmol/L)ALB(g/L)TRI(mmol/L)CHO(mg/dl)TP(g/L)GOT(U/L)GPT(U/L)CRE(U/L)ALP(U/L)TBI(umol/L)	10.42±5.1124.23±2.621.63±2.301.78±0.5952.20±4.76297.75±107.5564.57±28.3234.02±14.3976.69±7.090.56±0.36	9.84±1.4926.43±7.091.15±0.561.91±0.3757.28±4.75230.31±38.3859.74±14.3143.446±29.2473.51±39.030.45±0.21	11.04±3.3821.00±2.850.19±0.521.83±0.3052.63±8.58248.58±64.3957.89±19.3136.14±13.4974.00±11.580.80±1.15	12.71±4.8224.33±12.751.01±0.782.03±0.7760.03±18.38366.46±383.81111.49±135.1947.62±41.3884.47±34.920.51±0.35	11.19±6.6728.04±8.371.66±2.141.89±0.6848.64±13.78243.37±83.3167.00±26.7141.42±18.3887.20±62.631.03±1.32

系统临床病检在实验裸鼠处死后立即进行。先观察各组实验裸鼠的胸腔、腹腔、颅腔及各脏器的位置、形状、大小、质地、色泽等情况，均未发现异常；再对心、肝、脾、肺、肾、脑等器官和肿瘤称重并计算脏器和肿瘤系数，对各给药组与空白对照组间进行显著性检验(t检验)，结果见表16。研究结果表明，rHSV-1Δ34.5/lacZ各治疗组与空白对照组比较，各脏器重量及脏器系数均无显著性差异(P＞0.05)，定量的说明了rHSV-1Δ34.5/lacZ对治疗裸鼠各正常脏器无任何影响和副作用；而rHSV-1Δ34.5/lacZ各治疗组与空白对照组比较，肿瘤显著缩小，rHSV-1Δ34.5/lacZ各治疗组与空白对照组之间肿瘤重量和肿瘤系数均有显著性差异(P＜0.05)，其中高、中剂量rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组之间有极显著性差异(P＜0.01)，反映了rHSV-1Δ34.5/lacZ对荷Hep-3B裸鼠肿瘤存在极有效的抑制作用。

                                        表16.系统临床病检结果

检测项目          对照组             高剂量组           中剂量组             低剂量组             药物对照组
						心(g)肝(g)脾(g)肺(g)肾(g)脑(g)肿瘤(g)体重(g)心系数肝系数脾系数肺系数肾系数脑系数肿瘤系数	0.14±0.041.45±0.360.25±0.150.18±0.030.36±0.060.38±0.056.41±2.2525.76±4.000.01±0.000.06±0.010.01±0.010.01±0.000.01±0.000.02±0.000.25±0.07	0.13±0.021.29±0.220.20±0.100.17±0.030.32±0.040.37±0.052.46±1.7521.43±2.280.01±0.000.06±0.010.01±0.000.01±0.000.01±0.000.02±0.000.11±0.08	0.12±0.021.24±0.300.29±0.220.16±0.030.31±0.040.39±0.043.51±1.3120.36±1.790.01±0.000.06±0.010.01±0.000.01±0.000.02±0.000.02±0.000.17±0.05	0.12±0.021.19±0.220.21±0.140.16±0.020.30±0.050.36±0.054.33±2.3721.38±3.960.01±0.000.06±0.000.01±0.010.01±0.000.01±0.000.02±0.000.20±0.09	0.13±0.031.26±0.230.18±0.070.16±0.030.31±0.040.36±0.084.03±1.9619.87±3.600.01±0.000.06±0.000.01±0.000.01±0.000.02±0.000.02±0.000.19±0.08

对实验各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑进行病理切片检查，结果见图21、22。结果表明rHSV-1Δ34.5/lacZ治疗组裸鼠与空白对照组裸鼠的各脏器均正常，说明rHSV-1Δ34.5/lacZ不影响受试裸鼠的正常组织。

                             SEQ ID NO.1

   1  tttaaagtcg cggcggcgca gcccgggccc cccgcggccg agacgagcga gttagacagg

  61  caagcactac tcgcctctgc acgcacatgc ttgcctgtca aactctacca ccccggcacg

 121  ctctctgtct ccatggcccg ccgccgccgc catcgcggcc cccgccgccc ccggccgccc

 181  gggcccacgg gcgccgtccc aaccgcacag tcccaggtaa cctccacgcc caactcggaa

 241  cccgcggtca ggagcgcgcc cgcggccgcc ccgccgccgc cccccgccag tgggcccccg

 301  ccttcttgtt cgctgctgct gcgccagtgg ctccacgttc ccgagtccgc gtccgacgac

 361  gacgatgacg acgactggcc ggacagcccc ccgcccgagc cggcgccaga ggcccggccc

 421  accgccgccg ccccccgccc ccggtcccca ccgcccggcg cgggcccggg gggcggggct

 481  aacccctccc accccccctc acgccccttc cgccttccgc cgcgcctcgc cctccgcctg

 541  cgcgtcaccg cagagcacct ggcgcgcctg cgcctgcgac gcgcgggcgg ggagggggcg

 601  ccggagcccc ccgcgacccc cgcgaccccc gcgacccccg cgacccccgc gacccccgcg

 661  acccccgcga cccccgcgac ccccgcgacc cccgcgaccc ccgcgcgggt gcgcttctcg

 721  ccccacgtcc gggtgcgcca cctggtggtc tgggcctcgg ccgcccgcct ggcgcgccgc

 781  ggctcgtggg cccgcgagcg ggccgaccgg gctcggttcc ggcgccgggt ggcggaggcc

 841  gaggcggtca tcgggccgtg cctggggccc gaggcccgtg cccgggccct ggcccgcgga

 901  gccggcccgg cgaactcggt ctaacgttac acccgaggcg gcctgggtct tccgcggagc

 961  tcccgggagc tccgcaccaa gccgctctcc ggagagacga tggcaggagc cgcgcatata

1021  tacgctggga gccggcccgc ccccgaggcg ggcccgccct cggagggcgg gactggccaa

1081  tcggcggccg ccagcgcggc ggggcccggc caaccagcgt ccgccgagtc ttcggggccc

1141  ggcccactgg gcgggagtta ccgcccagtg ggccgggccg cccacttccc ggtatggtaa

1201  ttaaaaactt acaagaggcc ttgttccgct tcccggtatg gtaattagaa actcattaat

1261  gggcggcccc ggccgccctt cccgcttccg gcaattcccg cggcccttaa tgggcaaccc

1321  cggtattccc cgcctcccgc gccgcgcgta accactccct tggggttccg ggttatgcta

1381  attgcttttt tggcggaat

Claims (3)

1.一种重组1型单纯疱疹病毒，单纯病毒，1型单纯疱疹病毒(Simplexvirus Herpssimplexvirus 1)rHSV-1Δ34.5/lacZ，CCTCC NO.V200402。

2.一种实现权利要求1所述的重组1型单纯疱疹病毒的制备方法，包括下列步骤：

1)β-半乳糖苷酶表达盒的获得与纯化：猴病毒40启动子，1bp-419bp，控制着载体pSV-β-Galactosidase上的lacZ基因710bp-3755bp的表达，pSV-β-Galactosidase上含有1个PolyA序列，4021bp-4156bp，SV40启动子上游6814bp和lacZ编码序列的近3′末端3701bp各含有1个EcoRI位点，lacZ表达盒下游则含有1个BamHI位点4151bp；故用BamHI、EcoRI消化，DE81膜回收大片段，获得LacZ表达盒4160bp，其中含有SV40启动子、lacZ、polyA；

2)中间载体I pFL的构建：载体pFastBac1用EcoRI/BamHI双酶切消化，与EcoRI/BamHI双酶切消化的lacZ表达盒连接，构建中间载体I pFL，该中间载体I pFL的lacZ表达盒上游具有载体自身的1个Not1位点；

3)中间载体II pBL的构建：BamHI/XhoI酶切中间载体I pFL以切下lacZ表达盒，BamHI/XhoI酶切质粒pBluescript-M13，将lacZ表达盒与线性pBluescript-M13连接，以构建中间载体II pBL，使lacZ表达盒下游也获得载体本身的1个NotI位点，于是，lacZ表达盒上下游均带有NotI位点；

4)转移载体pIL的构建：质粒p4789带有完整的HSV-1的icp34.5基因及其侧翼序列，NotI酶切质粒p4789，以切去icp34.5基因第262位密码子262bp到终止子1084bp长823bp的序列，NotI酶切中间载体II pBL，获得lacZ表达盒，并连接到经NotI酶切的质粒p4789上，构建转移载体pIL，该转移载体pIL中的icp34.5基因被NotI酶切缺失824bp并被lacZ表达盒插入双重灭活；

5)重组病毒的获得：转移载体pIL与野生单纯疱疹病毒F株共转染叙利亚仓鼠肾细胞系，经过同源重组，获得被NotI酶切缺失的icp34.5基因和lacZ表达盒插入双重灭活的重组1型单纯疱疹病毒rHSV-1Δ34.5/lacZ，用病毒上清感染含Xgal软琼脂培养基的BHK21细胞，挑出蓝斑，进行稀释，再接种BHK21细胞，进行空斑纯化。

3.一种重组1型单纯疱疹病毒在抗肿瘤中的应用。

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