CN1566354A - 提高dna扩增反应效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种提高DNA扩增反应效率并提高寡核苷酸和DNA模板杂交特异性的方法。本发明提供了一种提高DNA扩增反应效率的方法，即在引物的5’末端添加一种化合物，如LC－Red 705，或一段至少具有四个碱基且GC含量至少为25％的寡核苷酸序列后作为引物；同时也提供了一种提高寡核苷酸和DNA模板杂交特异性的方法，即在寡核苷酸的5’末端连接一种化合物，如LC－Red 705，并用于和DNA杂交。

Description

提高DNA扩增反应效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高DNA扩增反应效率以及提高寡核苷酸和DNA模板杂交特异性的方法。

背景技术

DNA扩增在基因检测方面尤为重要，在DNA扩增领域内，PCR方法可以使DNA序列中的目标核苷酸序列得到大量扩增，而且该方法不仅可以应用于生物技术领域，还可以应用于很多其它领域。

然而，在设计特异的检测引物时，引物必须包含一段特异于目标序列的碱基序列。

不幸的是，包含这类位点的序列往往不适于作引物。换言之，在某些情况下，比如富含AT的序列或者是正反向引物的解链温度不相匹配，使扩增效率急剧下降，致使此类序列不适于作引物。在检测极微量DNA时，该问题就成为一个非常不利的因素。

而且为提高PCR的扩增效率，需首先确定最适的反应温度，然而，要确定最适的反应温度需要进行一系列复杂的预实验。

因此，本发明的一个目的是提供一种使确定最适的反应温度的操作简单化并使得DNA扩增反应效率提高的方法。

另外，本发明的另一个目的是提供一种提高寡核苷酸和DNA模板杂交特异性的方法。

发明概述

本发明的发明者发现了一个令人意外的现象：当在一简并引物的5’末端加上一段人工合成的非特异序列后，PCR的扩增效率会提高，当把这段人工合成的非特异序列从引物的5’末端消除后，PCR的扩增效率又会降低。

随后，发明者进一步研究发现，非常出人意料的是，在引物的5’末端不论添加一段人工合成的非特异序列还是连接一个化合物，如LC-Red 705，PCR的扩增效率都会提高，结果就使得DNA扩增反应效率得到提高，因此发明者完成了本发明。最适退火温度范围可以扩大，这意味着研究退火温度条件的预实验能够简化，从而使整个实验过程大大简化。

换言之，第一方面，本发明提供了一种提高DNA扩增反应效率的方法，其中，在5’末端添加一个来自下组的化合物：LC-Red 705，氨基，磷酸盐基团，生物素，DIG，DNP，TAMRA，Texas-Red，ROX，XRITC，若丹明，LC-Red 640，巯基，补骨脂(psoralen)，胆固醇，FITC，6-FAM，TET，cy3，cy5，BODIPY 564/570，BODIPY 500/510，BODIPY 530/550，BODIPY 581/591(下文表述为“特定化合物组”)以及至少具有四个碱基且GC含量不低于25％的寡核苷酸(下文表述为“特定碱基序列”)的引物来作为引物。

第二方面，本发明提供了一种提高寡核苷酸和DNA样品杂交特异性的方法，其中，在5’末端连接有选自上述特定化合物组中的某个化合物的寡核苷酸被用来与DNA杂交。

附图简要说明

图1.PCR循环数和60℃，0秒退火条件下的荧光强度关系图。

图2.PCR循环数和60℃，5秒退火条件下的荧光强度关系图。

图3.PCR循环数和60℃，10秒退火条件下的荧光强度关系图。

图4.PCR循环数和64℃，5秒退火条件下的荧光强度关系图。

发明详细描述

在本发明的第一和第二方面，既没有对连接或添加特定化合物组中的化合物和特定碱基序列的引物的特殊限制，也没有对连接有特定化合物组中的化合物的寡核苷酸的限制，只要它们代表了通常应用于DNA扩增中的引物或寡核苷酸。此外，由于本发明能够提高DNA扩增的效率，所以一些在通常条件下不能被用于DNA扩增的引物也可以被利用。

在本发明的第一和第二方面，特定化合物组中的化合物与通过DNA扩增技术被扩增的目标序列之间没有特定的对应关系。DIG是地高辛配基的缩写，DNP是二硝基苯基的缩写，TAMRA指的是四甲基羧基若丹明，Texas-Red是指1H，5H，11H，15H-Xantheno[2，3，4-ij：5，6，7-i’j’]diquinolizin-18-ium，9-[2(或4)-[[[6-(2，5-dioxo-1-pyrrolidinyl)oxy]-6-oxohexyl]amino]sulfonyl]-4(或2)sulfophenyl]-2，3，6，7，12，13，16，17-octahydro-，inner salt，ROX是若丹明X的缩写，XRITC指异硫氰酸根若丹明X，FITC是异硫氰酸根荧光素的缩写，6-FAM指6-羧基荧光素，TET是四氯荧光素的缩写，BODIPY564/570是4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸，琥珀酰亚胺脂，BODIPY 530/550是4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸，琥珀酰亚胺脂，BODIPY 581/591是4，4-二氟-5-(4-苯基-1，3-丁二烯基)-4-硼-3a，4a-二氮-s-indacene-3-丙酸，琥珀酰亚胺脂。

根据本发明的第一个方面，特定碱基序列可特异或非特异于要杂交的核苷酸序列。此处所应用的“特异”不仅包括此附加到引物上的序列与模板的互补区段和引物与模板的杂交区段并不相邻近的情况，还包括此附加到引物上的序列与模板的互补区段和引物与模板的杂交区段相毗邻的情况(尤其是模板的3’区段要与引物的5’区段相一致)。后一种情况在现有技术中被用来调整引物的Tm值，然而，在本发明中则被用以提高扩增的效率。

“非特异”包括一种引物和模板之间并不存在联系的情况，即附加的序列含有一种不能通过GC和AT碱基配对而形成连续的双链结构的核苷酸序列。即使在这种非特异的情况下，也可能通过本发明来提高某个引物的最高退火温度。因此，在本发明的第一个方面，特定碱基序列对要杂交的核苷酸序列(模板DNA)来说，可以是特异的或非特异的。然而，更优选非特异的特定序列来提高扩增的效率。

在本发明的第一个方面，可使用特定化合物组中的一个，两个或多个化合物以及特定碱基序列。

在本发明的第二个方面，可使用特定化合物组中的一个，两个或多个化合物。

在本发明的第一和第二方面，寡核苷酸或引物也可以通过一个接头与选自特定化合物组中的化合物相连接。适合的接头包括2-16个碳原子的碳氢化合物。

在本发明的第一个方面，附加到引物5’端的寡核苷酸(附加序列)最好含有高的GC含量。确切地说，此寡核苷酸的GC含量必须至少是50％，并且优选不少于四个碱基的附加序列。DNA扩增反应的效率随着GC含量的增加而增大，GC含量达到60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，甚至100％是最理想的。任何本领域普通技术人员能够根据附加序列的长度以及附加序列和被扩增序列或引物间的非互补情况来确定GC含量。如果附加序列太长就会使得DNA扩增反应的效率下降，典型的不超过40个碱基的附加序列是更适合的。此外，为了防止引物二聚体的形成，G或C的含量最好不低于50％，A或T的含量最好不低于50％。

下面列出了优选的核苷酸序列的特别例子。此外，大于或等于9个碱基的序列能够从以下2-8个碱基的核苷酸序列的恰当的组合产生。在以下序列中，S代表C或G，W代表A或T。G或C的含量最好不低于50％，A或T的含量最好不低于50％。

SS，SW，WS，SSS，SSW，SWS，WSS，SSSS，SSSW，SSWS，SWSS，WSSS，SSSSS，SSSSW，SSSWS，SSWSS，SWSSS，WSSSS，SSSSSS，SSSSSW，SSSSWS，SSSWSS，SSWSSS，SWSSSS，WSSSSS，SSSSSSS，SSSSSSW，SSSSSWS，SSSSWSS，SSSWSSS，SSWSSSS，SWSSSSS，WSSSSSS，SSSSSSSS，SSSSSSSW，SSSSSSWS，SSSSSWSS，SSSSWSSS，SSSWSSSS，SSWSSSSS，SWSSSSSS，WSSSSSSS，SSSSSSWW，SSSSSWSW，SSSSWSSW，SSSWSSSW，SSWSSSSW，SWSSSSSW，WSSSSSSW，SSSSSWWS，SSSSWSWS，SSSWSSWS，SSWSSSWS，SWSSSSWS，WSSSSSWS，SSSSWWSS，SSSWSWSS，SSWSSWSS，SWSSSWSS，WSSSWSS，SSSWWSSS，SSWSWSSS，SWSSWSSS，WSSSWSSS，SSWWSSSS，SWSWSSSS，WSSWSSSS，SWWSSSSS，WSWSSSSS，WWSSSSSS

另外，寡核苷酸的特殊例子包括那些由AGTC，AAGT，GGAC或GGGC重复单元所构成的多达20个碱基的寡核苷酸序列。

此外，附加序列最好不含有能形成阻碍扩增反应的二级结构的核苷酸序列。显然，在附加序列3’末端之间能形成配对的碱基越少越好，最好是没有能形成配对的碱基。最低的优选要求是不能有连续的碱基配对的情况发生。另外，具有附加序列的引物间能形成配对的碱基越少越好，最好是没有配对的碱基形成。

在本发明的第一个方面，从前文提到的特定化合物组中的化合物或特定碱基序列能以标准的方法连接或添加到引物的5’末端。为了连接或添加两个或多个不同的选自特定化合物组中的化合物或特定碱基序列，可采用先连接一个化合物，再合成一个包含特定碱基在内的寡核苷酸序列，或者选择先合成一个包含特定碱基在内的寡核苷酸序列，再连接一个化合物的方法。一个具有两个或多个选自特定化合物组中的化合物或添加了特定碱基序列的引物的例子是具有添加了双倍重复序列的GGGC的FITC。

在本发明的第二个方面，从前文提到的选自特定化合物组中的化合物能以标准的方法连接到一段寡核苷酸序列的5’末端。为了连接两个或多个不同的从特定化合物组中选择的化合物或特定碱基序列，可采用先连接一个化合物，再合成一个包含特定碱基在内的寡核苷酸序列，或者选择先合成一个包含特定碱基在内的寡核苷酸序列，再连接一个化合物的方法。

在本发明的第一个方面，通过将选自特定化合物组中的化合物连接到一条引物上或者在一条引物上添加特定碱基序列，引物与扩增产物的退火速度及退火稳定性均能得以提高，意味着该引物非常适用于常规PCR。引物与扩增产物的退火速度及退火稳定性的提高在特定碱基序列与模板DNA不能完全配对时也能被观察到(见表2所示结果)。

另外，本发明也能很好地应用于不对称PCR。

不对称PCR指的是一种快速扩增单链DNA的方法，比如在需要对目标DNA片段直接进行测序的情况下。换言之，尽管在常规PCR反应中所使用的引物对的浓度相等，但在不对称PCR反应中，引物对中的一条引物的浓度比另一条引物的浓度提高数倍或数十倍。通过这种操作，低浓度的引物首先被消耗掉，接下来的PCR反应只是由剩下的高浓度引物来进行，从而产生大量的与高浓度引物相对应的单链DNA。此外，温度不对称PCR，一种特殊类型的不对称PCR，其所使用的引物对的Tm值相差至少10℃，且首轮PCR反应是在具有较低Tm值的引物也发生退火的条件下进行的，随后的PCR反应是只在具有较高Tm值的引物发生退火的条件下进行的。

然而，不对称PCR受到下述各类问题的困扰。也就是说，如果模板DNA与引物的浓度条件不是最优化的，那么单链DNA的扩增量会很低(Production of Single Stranded DNA by Asymmetric PCR，PCR Protocols，Aguide to Methods and Applications，Academic Press Inc.1990)。但是，此类优化选择过程需要繁杂的预实验。

此外，在温度不对称PCR中，必须准备一套退火温度差异至少有10℃的特异引物，而这未必是一项简单的工作。

另一种快速扩增单链DNA的方法利用了引物对内扩增能力的不同。例如，可以利用DNA与RNA的混合引物。在延伸反应中RNA引物所起的作用要弱于DNA引物，因此如果PCR反应是以这种混合型引物进行的，那么纯DNA的扩增产物就多，就可以产生单链DNA。

然而，该方法中单链DNA的获得是由于RNA引物的低扩增能力所导致的，而非由于DNA引物扩增能力的提高所引起的。

相反地，在本发明的第一个方面，只在引物对中的一条引物上连接从特定化合物组中选择的化合物或添加特定碱基序列，两引物间的扩增效率就会有很大不同，这意味着使模板DNA与引物的浓度条件达到最优化的复杂操作是不必要的。因此，将本发明的第一个方面应用于不对称PCR，就可使单链DNA的扩增效率得到显著提高。此外，本发明的第一个方面也可使引物的最适退火温度范围扩大，从而使本发明也可以应用于温度不对称PCR中。

通常地，不对称PCR通过抑制引物对中的一条引物的延伸进行，更确切地说，是通过有效降低整个PCR反应的效率实现。相反地，本发明的第一个方面可以使不对称PCR在提高引物对中的一条引物的扩增效率的条件下进行。换言之，与常规PCR相比，应用本发明的不对称PCR不会使扩增反应效率降低。因此，本发明的第一个方面在产生单链DNA并维持高水平的扩增效率的情况下是尤为有效的，例如在检测像病原体这样含有极微量DNA的生物，并将它们快速而容易地分类的情况下。

此外，本发明也能被很好地应用于简并PCR。在简并PCR中，几百和几千条不同引物的混合物的使用，意味着混合物中每条引物最适的退火温度是不同的，结果就使扩增反应温度的设定变的相当困难。然而，这类问题亦可由本发明解决。而且由于可设定一个相对高的退火温度，非特异扩增得到抑制，从而获得更高的扩增效率。

在本发明的第一个方面，连接有选自特定化合物组中的化合物的引物可被用来作为探针使用。

在本发明的第二个方面，使用5’末端连接有选自特定化合物组中的化合物的寡核苷酸可以提高该寡核苷酸与DNA的杂交效率。换言之，与没有结合特定化合物的寡核苷酸相比，结合有特定化合物的寡核苷酸既能提高与DNA杂交的速度，又能提高杂交的稳定性。

实施例

下文是基于一系列实施例上的对本发明的更加详尽的描述。然而，本发明却不会局限于下述实施例。

实施例1

扩增反应中退火温度上限的比较

用5’末端连接有选自特定化合物组中的化合物的引物来检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，采用的是Hybaid公司生产的，带有梯度阻隔模块的PCR反应仪，扩增反应中退火温度的上限是由下文所述条件下的受控PCR来测量的。

检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)所利用的引物是以序列1所示的核苷酸序列作为正向引物，以序列2所示的核苷酸序列作为反向引物。

序列1：aagaagacct agaagatgat

序列2：gttaccagta atagggca

表1中所示的特定化合物组中的每一种化合物均被连接到正向与反向引物的5’末端。另外还需准备的工作是，从副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的菌株(IFO12711T)中提取染色体DNA作为模板，PCR反应采用rpoD基因的通用扩增引物(参考日本未经审查的专利申请，公开号：Hei 8-256798：序列3和4)来获得扩增产物。随后，利用该扩增产物作模板，在许多不同的退火温度条件下，以前文提及的添加有选自特定化合物组中的化合物的引物来进行PCR实验。

序列3：yatgmgngar atgggnacng t

序列4：ngcytcnacc atytcyttyt t

(y代表T，C或U碱基；m代表A或C碱基；n代表A，C，G，T或U碱基)

PCR反应条件如下：(1)Taq聚合酶(AmpliTaq Gold，由ApplideBiosystems公司生产)的激活：95℃，10分钟。(2)变性：94℃，1分钟。(3)退火：55.1℃、55.5℃、56.3℃、57.7℃、59.4℃、61.4℃、63.3℃、65.3℃、67.6℃、69.0℃、69.7℃和70.2℃，30秒。(4)延伸反应：72℃，1分钟。步骤(2)至(4)重复进行40个循环。(5)延伸反应：72℃，10分钟。(6)冷却：降至4℃。

随后，利用琼脂糖凝胶电泳分析所获得的扩增片段，以决定退火温度的上限。利用5’末端未连接有选自特定化合物组中的化合物的引物作为对照。退火温度上限的结果以及和对照相比退火温度上限升高的温度值见表1。

表1

连接的化合物	接头	效果	退火温度上限	温度的提高(与对照引物相比较)
					BODIPY564/570		AA(最高)	63.3℃	5.6℃
LC-Red 705	无	AA	63.3℃	5.6℃
					氨基C3	C3	A	61.4℃	3.7℃
磷酸根基	无	A	61.4℃	3.7℃
					生物素	C10	A	61.4℃	3.7℃
DIG	C6	A	61.4℃	3.7℃
					DNP	C14	A	61.4℃	3.7℃
TAMRA	C6	A	61.4℃	3.7℃
					Texas-Red	C6	A	61.4℃	3.7℃
ROX	C6	A	61.4℃	3.7℃
					XRITC(若丹明600)	C6	A	61.4℃	3.7℃
若丹明	C6	A	61.4℃	3.7℃
					LC-Red 640	C6	A	61.4℃	3.7℃
BODIPY500/510		A	61.4℃	3.7℃
					BODIPY530/550		A	61.4℃	3.7℃
BODIPY581/591		A	61.4℃	3.7℃
					氨基C6	C6	B	59.4℃	1.7℃
SH(硫羟)	无	B	59.4℃	1.7℃
					补骨脂C2(Psoralen C2)	C2	B	59.4℃	1.7℃
补骨脂C6(Psoralen C6)	C6	B	59.4℃	1.7℃
					胆固醇		B	59.4℃	1.7℃
FITC	C6	B	59.4℃	1.7℃
					6-FAM	C6	B	59.4℃	1.7℃
TET	C6	B	59.4℃	1.7℃
					cy3	C3	B	59.4℃	1.7℃
cy5	C3	B	59.4℃	1.7℃
					没有标记(对照)		-	57.7℃	-

AA：优良

A：好

B：中等

连接有选自特定化合物组中的化合物的引物使退火温度上限升高，并使扩增反应的效率提高。

实施例2

扩增反应中退火温度上限的比较

以序列3所示的核苷酸序列作为正向引物，以序列4所示的核苷酸序列作为反向引物，以表2所示的核苷酸序列作为重复单元，以4聚体至20聚体的量添加到上述引物的5’末端。扩增反应中退火温度上限的确定与例1中的PCR反应条件相同，采用Hybaid公司生产的，带有梯度阻隔模块的PCR反应仪，以从副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的菌株(IFO12711T)中提取染色体DNA作为模板，退火时间为1分钟，以未添加寡核苷酸序列的引物作为对照。此外，还利用GC含量为0％的重复单元AAAT，以4聚体至20聚体的量来进行比较。退火温度上限的结果以及和对照(括弧内所示)相比退火温度上限升高的温度值见表2。

表2

	重复序列
								AGTC	AAGT	GGAC	GGGC	AAAT	无
x1(4聚体)	633(+1.9)	63.3(+1.9)	65.3(+3.9)	67.6(+6.2)	61.4(±0)
							x2(8聚体)	63.3(+1.9)	63.3(+1.9)	65.3(+3.9)	69(+7.6)	59.4(-2.0)
x3(12聚体)	65.3(+3.9)	63.3(+1.9)	67.6(+6.2)	63.3(+1.9)	59.4(-2.0)
							x4(16聚体)	63.3(+1.9)	63.3(+1.9)	63.3(+1.9)	没有扩增	57.7(-3.7)
x5(20聚体)	65.3(+3.9)	63.3(+1.9)	57.7(-3.7)	没有扩增	57.7(-3.7)
							GC％	50％	25％	75％	100％	0％	61.4

添加GC含量必须不低于25％，并且不少于四个碱基的寡核苷酸序列的引物可使得扩增效率提高，并且添加高的GC含量的寡核苷酸序列的引物能非常显著地提高扩增反应的效率。

实施例3

5’末端连接有选自特定化合物组中的化合物或特定碱基序列的引物的扩增效率的研究

以序列1所示的核苷酸序列作为正向引物，以序列2所示的核苷酸序列作为反向引物。将Cy3，cy5，生物素，12聚体的GGAC重复单元或者12聚体的AAGT重复单元添加(连接)到正、反向引物的5’末端，利用一光循环系统(RocheDiagnostics公司制造)并以从副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的菌株(IFO12711T)中提取的染色体DNA作为模板，在下述条件下进行实时PCR反应来分析扩增反应的动力学。

PCR反应条件如下：(1)预变性：95℃，1.5分钟。(2)变性：95℃，0秒。(3)退火：60℃，0秒、5秒或10秒；或64℃，5秒。(4)延伸反应：72℃，15秒。

步骤(2)至(4)重复进行40个循环。

每轮循环后的扩增产物都进行了荧光强度检测。以未添加寡核苷酸序列的引物作为对照。结果如图1到图4所示。此荧光强度不是从连接到引物上的选自特定化合物组中的化合物中得来的，而是从插入到双链DNA间的cyber green得来的，而荧光强度则显示了扩增DNA的积累量。

图1为PCR循环数和60℃，0秒退火条件下的荧光强度关系图。图2为PCR循环数和60℃，5秒退火条件下的荧光强度关系图。图3为PCR循环数和60℃，10秒退火条件下的荧光强度关系图。图4为PCR循环数和64℃，5秒退火条件下的荧光强度关系图。

在所有的扩增条件下，连接有选自特定化合物组中的化合物或特定碱基序列的引物(经修饰引物)比未连接有选自特定化合物组中的化合物或特定碱基序列的引物(未经修饰引物)在扩增反应中产物增加的更早。换言之，当使用经修饰引物时，获得某一特定的荧光强度所需的循环数会减少(参考图2和图3)。

如果保持同样的退火温度的同时缩短退火的时间(从10秒(图3)到5秒(图2)到0秒(图1))，那么由未经修饰引物所致的起始扩增的循环则会大大延迟(也就是说，扩增会减弱)。例如，为获得超过10的荧光强度，在退火时间为10秒的情况下(图3)，需要14个循环，而在退火时间为5秒的情况下(图3)，则需要20个循环，在退火时间为0秒的情况下，甚至在40个循环后，荧光强度也不会超过10。相反地，在使用经修饰引物时，由退火时间的缩短而引起的起始扩增的循环的延迟要大大少于由未经修饰引物所导致的延迟。换句话说，当被用于检测系统时，经修饰引物会增加其灵敏度。这种修饰效应在退火时间为0秒的情况下尤为显著，而且在不同的修饰引物中，添加了带有12聚体GGAC重复单元的引物引起的该效应尤其明显。

利用经修饰引物，即使在利用未经修饰引物无法实现扩增的退火温度与退火时间(参考图4)的条件下，扩增反应仍具有实用性。该效应也在添加了带有12聚体GGAC重复单元的引物情况下尤其明显。

利用经修饰引物在经过40个循环后可以获得比未经修饰引物显著提高的扩增产物的终产量(参考图1至图4)。在常规PCR中，由于扩增反应一般不会超过40个循环，在有实用性的循环数范围内，经修饰引物具有绝对的优势。

上述结果揭示了在温度增加和退火时间缩短的情况下的变化效应，普遍认为此类效应归因于引物与模板DNA的杂交温度稳定性的增加，即结合强度的增加。

依据本发明的第一个方面，研究退火条件等一系列条件的预实验可被大大简化，而且还可提高PCR的扩增效率。这些效应在不对称PCR或简并PCR中尤为明显。

此外，依据本发明的第二个方面，可以提高寡核苷酸与DNA模板的杂交特异性。

Claims (5)

1、一种提高DNA扩增反应效率的方法，其中，在5’末端添加一个选自下述化合物的化合物：LC-Red 705，氨基，磷酸根基，生物素，DIG，DNP，TAMRA，Texas-Red，ROX，XRITC，若丹明，LC-Red 640，巯基，补骨脂，胆固醇，FITC，6-FAM，TET，cy3，cy5，BODIPY 564/570，BODIPY 500/510，BODIPY 530/550，BODIPY 581/591，以及G和C含量总和至少为25％的且至少具有四个碱基的寡核苷酸引物作为引物。

2、按照权利要求1所述的提高DNA扩增反应效率的方法，其中，所述的GC含量至少为25％的且至少具有四个碱基的寡核苷酸具有至少50％的GC含量，包括不超过40个碱基，且具有一个使G和C含量的总和至少为50％的更多数量的G和C的碱基量，以及一个使A和T含量的总和至少为50％的更多数量的A和T的碱基量。

3、按照权利要求1或2所述的提高DNA扩增反应效率的方法，它是一种提高PCR扩增效率的方法。

4、按照权利要求3所述的提高DNA扩增反应效率的方法，其中，所述的PCR是不对称PCR或简并PCR。

5、一种提高寡核苷酸和DNA杂交特异性的方法，其中，在5’末端连接一个选自下组化合物：LC-Red 705，氨基，磷酸根基，生物素，DIG，DNP，TAMRA，Texas-Red，ROX，XRITC，若丹明，LC-Red 640，巯基，补骨脂，胆固醇，FITC，6-FAM，TET，cy3，cy5，BODIPY 564/570，BODIPY 500/510，BODIPY 530/550，BODIPY 581/591的寡核苷酸被用于与所述的DNA杂交。

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