CN1563995A - 一种病毒检测系统及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种病毒检测系统及其检测方法，包括雾化系统、检测系统和报警系统；所述雾化系统通过所述检测系统与所述报警系统相连。本发明提供的病毒检测系统及检测方法通过将含SARS病毒的唾液样品完全雾化，实现了对生物大分子的直接气相检测，所用压电晶体传感器具有极强的特异性。该方法简便快速、可以早期诊断SARS病毒并且准确度较高。

Description

一种病毒检测系统及检测方法

技术领域

本发明涉及一种病毒检测系统和一种病毒检测方法，特别涉及一种SARS病毒的检测系统及检测方法。

背景技术

SARS(严重急性呼吸系统综合症，又名非典型性肺炎，以下简称SARS)是二十一世纪最新发现的一种非常严重的传染病。SARS与已知的由肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌及常见的呼吸道病毒所导致的肺炎不同。两者相比，SARS的主要传播途径是通过飞沫近距离传播，传染性极强。现已查明，SARS病毒是一种新型的冠状病毒，其结构是由蛋白质外壳包裹下的RNA病毒，其微粒比较大，直径约0.1至0.12微米。冠状病毒病毒体的分子质量为4×10⁸Da，在CsCl中的浮力密度为1.23-1.24克/厘米³；在蔗糖中的浮力密度为1.15-1.19克/厘米³，沉降系数为300-500S_20W。SARS病毒体在有Mg²⁺存在的情况下相对保持稳定，对热、脂溶剂、非离子去污剂、甲醛和氧化剂敏感。冠状病毒形状不规则，有包膜，包膜上有间隔约20nm的突起，使病毒颗粒外形如日冕或冠状。冠状病毒颗粒呈中等多形性的球形或椭圆形，基底窄，末端呈棒棍状。冠状病毒的结构蛋白包括N蛋白、M蛋白、E蛋白、S蛋白和HE蛋白。

人类对冠状病毒早有研究，其历史可追溯到1933年。Baudette等描述了小鸡的“哮喘病”，1937年首次从小鸡体内分离出冠状病毒，分离的病毒被鉴定为传染性支气管类病毒。1965年Tyrrell和Byhve首次在体外用人胎鼻和气管培养方法，从普通感冒病人鼻洗液中分离出一株病毒，命名为B814病毒。1967年Melntosh等用人胚气管培养从感冒病人中分离到一批病毒，其代表株是OC43。1968年June Almeida和Tyrell对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。1975年国际病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。

自SARS病原冠状病毒确定以后，全世界多家机构开始了诊断和检测技术的研究。目前SARS冠状病毒检测和诊断技术的研究和开发主要方向有两大类：基于病毒抗原和抗体反应的免疫学检测技术以及针对病毒RNA的核酸检测技术(也称为分子生物学检测技术)。

1、免疫学检测技术

目前，SARS免疫学检测主要是针对SARS冠状病毒感染所引起的抗体应答反应。目前正在研究和进行临床测试的方法主要有以下几种：

(1)ELISA(酶联免疫吸附反应)：用于SARS病人血清中IgM和IgG抗体测定，大约在发病后10～21天可以检测出来。

(2)IFA(荧光免疫测定法)：用于SARS病人血清中IgM抗体测定，大约在发病后10天可以检测到。这是一种可靠的测定方法，但需要借助于荧光显微镜进行测定。

现在主要的免疫学检测，如ELISA和IFA等，通过检测抗体，可以了解病毒感染以及疾病发生发展进程。然而这二种方法作为SARS临床诊断方法都存在局限性。第一种测试方法ELISA，虽然能够可靠地测定病毒抗体，但只能在临床症状发作20天后才能检测到，因此不能作为早期诊断以防止感染者把病毒传染给他人。第二种IFA方法，此法在感染后10天能准确地测定抗体，但该方法需要有固定的病毒(或病毒抗原)、荧光显微镜和有经验的检验技术人员。

最近，中山大学附属医院的李刚教授经过对21例SARS患者不同时期血清调查研究，发现了其变化规律。他们分别检测了IgM和IgG两种抗体，发现在发病一周内，两种抗体均未产生。IgM抗体在发病10-14天时出现并很快达到高峰，60天时约1/3的患者仍可检测到IgM抗体，90天时基本消失。IgG型抗体亦可在10-14天时检测到，但滴度较低，60天时达到高峰，90天时仍维持在高水平。同时发现，被调查的20多例患者在恢复期全部都有IgG型抗体。

依据上述SARS检测技术开发的商品有中国科学院和中国军事医学科学院依据ELISA法研制出的检测试剂盒和中国科学院北京基因组研究所研制的检测试剂盒；另外，中国疾病预防控制中心(CDC)还建立了与SARS病人血清中相关冠状病毒IgM和IgG抗体特异性酶联免疫方法。

2、分子生物学检测技术

使用分子生物学检测技术(如PCR)可以检测出各种样本(血液、粪便、呼吸道分泌物、组织切片)中的SARS病毒的遗传物质RNA。引物(PCR实验的关键部分)的设计及其合成方法已在世界卫生组织(WHO)的官方网站公布，并被世界上许多国家所使用。

PCR方法的优点是可以测定SARS病毒的基因，实现早期诊断。但是它要求引物和模板之间有很强的特异性，而且其灵敏度不高，结果中有很多假阴性，这就意味着许多实际携带着病毒的人不能被检测到——对于很容易通过人与人之间的密切接触传播的疾病而言，假阴性的检测结果预示着极大的安全隐患。

依据PCR方法，由专业定量PCR试剂盒研制的生产厂商ARTUR公司与BernhardNocht研究中心合作开发了世界首个SARS冠状病毒定量检测试剂盒。解放军军事医学科学院亦研制了冠状病毒荧光RNA实时荧光RT-RNA检测试剂盒。

对SARS病毒的早期诊断是防治SARS病最重要的步骤之一，但是在这方面至今仍没有明显进展。仍需探索适用于病毒早期快速而简便的诊断方法。

由于SARS病毒主要靠飞沫传播，对其气态病毒直接检测具有重要的实用意义。对初期感染SARS病人的携带病毒进行直接检测是SARS病毒研究的难点，也是世界瞩目的关键课题。压电晶体免疫传感器利用抗原抗体间极强亲和力的特异性吸附，在气态生物大分子的检测上是极有潜力的。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种简便快速、可以早期诊断并且准确度高的病毒检测系统。

本发明的另一目的是提供一种利用上述病毒检测系统检测病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种病毒检测系统，包括雾化系统、检测系统和报警系统；所述雾化系统通过所述检测系统与所述报警系统相连。

所述雾化系统包含超声雾化发生装置、超声换能装置和雾化控制电路；所述检测系统包括质量测量式免疫传感器及检测电路装置；所述报警系统为单片机报警系统；所述单片机报警系统包括差频器电路、单片机处理电路和报警电路。

所述超声雾化发生装置为超声逻辑振荡仪；所述超声换能装置为压电陶瓷超声振荡晶片；所述超声逻辑振荡仪通过雾化控制电路与所述压电陶瓷超声振荡晶片相连；所述质量测量式免疫传感器为涂有抗体薄膜的压电晶体传感器，其两个电极插于所述检测电路装置上；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器上方的支架上放置所述压电陶瓷超声振荡晶片；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器与所述压电陶瓷超声振荡晶片及支架置于密闭容器中；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器与所述差频器电路、单片机处理电路和报警电路相连。

所述病毒可以是冠状病毒，最好为SARS病毒。由于抗体通过其两个Fab段与抗原的表位接合，这种结合需要很强的结构特异性，因此，所述压电晶体传感器只会对SARS病毒产生特异性吸附，对其他冠状病毒或其他病毒的吸附很弱。

一种病毒检测方法，其步骤如下：

(1)取各种含病毒样本(血液、粪便、呼吸道分泌物或组织切片)，经过处理，提取，培养，配制成溶液；

(2)取上述溶液，滴加至超声雾化发生装置；

(3)超声换能装置向所述超声发生装置传递能量，对其上的溶液进行超声气雾化；

(4)密闭容器内安装有涂有抗体薄膜的质量测量式免疫传感器和检测电路板，气雾化的病毒被吸附在所述质量测量式免疫传感器的芯片上；

(5)所述质量测量式免疫传感器与报警装置相连，被吸附病毒量达到一定程度，报警装置即发出报警信号。

所述超声雾化发生装置为超声逻辑振荡仪；所述超声换能装置为压电陶瓷超声振荡晶片；所述超声逻辑振荡仪通过雾化控制电路与所述压电陶瓷超声振荡晶片相连；所述质量测量式免疫传感器为涂有抗体薄膜的压电晶体传感器，其两个电极插于所述检测电路装置上；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器上方的支架上放置所述压电陶瓷超声振荡晶片；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器与所述压电陶瓷超声振荡晶片及支架置于密闭容器中；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器与所述差频器电路、单片机处理电路和报警电路相连。

一种优选技术方案，其特征在于：所述含病毒样本用量为0.5-1.5μL。

一种优选技术方案，其特征在于：所述超声换能装置向所述超声发生装置传递的能量为440mA的电流；所述压电陶瓷超声振荡晶片的振荡时间为0.09秒，振荡间隔为0.2秒，振荡次数为15次。

一种优选技术方案，其特征在于：所述含病毒样本的浓度为0.6-4μg/μL。

本发明中所用的压电晶体传感器是在压电晶体的电极上固定抗体，制成抗体薄膜。当抗体薄膜遇到空气中的病毒抗原时，抗原与抗体发生结合产生免疫反应而使压电晶体的质量增加导致频率发生改变，而达到检测的目的。抗原和抗体结合的生物力都是分子间的非共价键力，如氢键、范德华力、静电作用、疏水作用。因而，压电晶体传感器在解析充分后能重复使用。

压电晶体传感器是最常见的一种质量测量式免疫传感器。它的原理是石英晶片在振荡电路中振荡时有一基础频率，当样品中的抗原或抗体与包被在晶片上的抗体或抗原结合时，由于负载的增加，晶片的振荡频率会相应减少，其减少值与吸附上去的质量有相关性，其选择性是依赖于抗原和抗体的特异性反应。

下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1是本发明病毒检测系统结构示意图；

图2是空白晶片基线稳定性曲线；

图3对氧磷免疫传感器基线稳定性曲线；

图4是空白晶片对对氧磷的响应曲线；

图5是蛋白A膜对对氧磷的响应曲线；

图6是对氧磷压电传感器对对氧磷的检测曲线；

图7是SARS压电晶体传感器基线稳定性曲线；

图8是蛋白A膜对PBS中SARS病毒的检测曲线；

图9是蛋白A+SARS抗体膜对PBS中SARS病毒的检测曲线；

图10是SARS压电晶体传感器对PBS水溶液的响应曲线；

图11是SARS压电晶体传感器对PBS中SARS病毒的响应曲线；

图12是SARS压电晶体传感器对PBS中SARS病毒的工作曲线；

图13是SARS压电晶体传感器对广州01号病毒水溶液的检测曲线；

图14是SARS压电晶体传感器对PBS的检测曲线；

图15是SARS压电晶体传感器对A1号流感病毒的检测曲线；

图16是SARS压电晶体传感器对PBS的检测曲线；

图17是SARS压电晶体传感器对唾液的响应曲线；

图18是SARS压电晶体传感器对唾液中病毒的响应曲线；

图19是SARS压电晶体传感器对唾液中病毒的工作曲线；

图20是不同人群唾液响应值分布图。

具体实施方式

如图1所示，一种SARS病毒检测系统，包括Agilent 53131A型频率计8；北京707厂制造的石英压电晶体传感器3——9MHz石英倍金电极压电晶体(外径×厚度为12.5×0.2mm，电极直径为6mm)；DPS-3015双直流稳压电源1；亚都科技股份有限公司制造的亚都超声波逻辑振荡仪7；镀钛压电陶瓷振荡晶片4(直径2cm，振荡电流440mA，振荡时间0.09秒，间隔时间0.20秒，振荡次数15次)；气室5；玻璃支架6及检测电路板2组成。

DPS-3015双直流稳压电源1与检测电路板2相连；检测电路板2上方置一玻璃罩，玻璃罩内放置一石英压电晶体传感器3与检测电路板2相连；石英压电晶体传感器3上方设置一玻璃支架6；玻璃支架6上置一压电陶瓷超声振荡晶片4；压电陶瓷超声振荡晶片4与所述亚都超声逻辑振荡仪7相连接；检测电路板2通过Agilent 53131A型频率计8与一计算机相连接。

生物压电传感器以特制的压电石英晶体为基片，这种晶体同其它压电石英晶体相比个头稍大，因生化稳定性的需要，电极采用纯金的所谓“倍金”工艺，晶体谐振频率一般在9-10MHz。

压电晶体传感器的电路实际上是一石英晶体稳频的高频振荡电路，其基本结构为一块石英晶体和两个高速CMOS双输入端与非门电路组成；两个与非门组成高频放大电路，石英晶体与电容C₂串联后，形成放大电路的强烈正反馈，从而产生稳定的高频振荡，经过一块与非门电路缓冲放大后输出至主机电路，由于采用高速CMOS集成电路，容易起振，且振荡信号非常稳定。

压电晶体传感器上的抗体薄膜遇到抗原后，由于抗原与抗体发生结合而使压电晶体的频率发生改变，通过频率计可以将这种频率的变化转变为数字信号而被计录下来。Agilent 53131A频率计8提供了RS-232端口，通过此端口可以将以字符形式给出的数字值传输给计算机。

本发明的病毒检测系统可使用压电晶体传感器对气态抗原进行实时检测：涂有抗体薄膜的压电晶体传感器的两电极插于检测电路板上，压电晶体传感器上方的玻璃支架上置一压电陶瓷超声振荡晶片，压电晶体传感器与超声振荡晶片及支架同时置于玻璃气室中，玻璃气室为Φ85×100mm的筒状玻璃钟罩(体积为500mL)，用微量进样器将液体样品置于超声振荡晶片上，盖好玻璃钟罩，启动超声逻辑振荡仪，超声振荡将液体样品雾化成气雾，在气室内扩散，气体中扩散的病毒在抗体膜上发生免疫反应会产生选择性吸附，使压电晶体质量增加，导致频率降低，频率变化由频率计记录。通过实时检测软件，由计算机记录并显示图形。

实验例1

1、对氧磷压电晶体传感器

1.1试剂

(1)、对氧磷抗体，解放军军事医学科学院提供；

(2)、对氧磷(分子量：275，蒸气压1599×10^-6Pa/20℃，解放军军事医学科学院提供；

(3)、可溶性蛋白质A，Sigma公司；

(4)、聚乙烯亚胺，Acros公司；

(5)、3一氨基丙基三乙氧基硅烷，Acros公司；

(6)、戊二醛，北京化学试剂公司。

1.2对氧磷压电晶体传感器

1.2.1电极预处理

9MHz金电极压电晶体，分别用1.2mol/L的NaOH，1.2mol/L的HCI浸泡5min，然后分别用二次蒸馏水、乙醇各洗二次，并用乙醇浸泡。室温下晾干。

1.2.2成膜

将一定量的蛋白质A用微量注射器涂于晶片表面，室温晾干后测定频率，然后将0.5μL的抗体涂于晶片上，室温晾干后测频率。

在图1的压电晶体传感器检测系统和上述的测试条件下，将未涂膜空白压电晶片置于电路中，检测三十分钟，频率变化仅14Hz，如图2所示，这是由晶片的电致噪声和环境噪声对检测的影响，说明晶片受环境与电路影响较小，稳定性较好。

将制好的对氧磷压电晶体传感器连入电路，测试其基频稳定性，如图3所示，二十分钟后频率仅下降了40Hz，该频率下降值与其对对氧磷的响应值相比可以忽略不计。

用空白晶片检测对氧磷的响应信号，结果如图4所示，40分钟内频率仅漂移7Hz，说明空白晶片对对氧磷没有吸附，基本上对检测没有影响。

蛋白A、聚乙烯亚胺、3一氨基丙基三乙氧基硅烷是常用的生物样品固定化试剂。为了选择较好的固定化试剂，分别使用这三种不同膜基质固定抗体，比较其固定化效果。

从对抗原的检测来看，三种基质的检测结果以蛋白A为好。在下面的实验中我们选择使用蛋白质A来固定抗体。

蛋白A膜对对氧磷的检测：

图5为蛋白A膜对对氧磷的响应曲线。从图中可见，蛋白A膜对对氧磷的响应频率只有48Hz，说明只涂蛋白A不涂对氧磷抗体的膜，对检测基本上没有影响。

对氧磷压电晶体传感器对对氧磷的检测：

用超声波雾化器将对氧磷气化，气化后的对氧磷与传感器上的固定的对氧磷抗体发生选择性吸附，使质量增加而引起频率下降。图6是蛋白A为膜基质固定对氧磷抗体对气态对氧磷的检测结果，从图6中可见，响应频率因不断吸附对氧磷而呈缓慢下降趋势，在5分钟时达到最低值，最低下降频率为3978Hz。与只有蛋白A膜的晶片的检测结果相比，无对氧磷抗体时，传感器基本没有响应，而固定抗体后，响应频率有了很大的提高，信号明显。响应频率达到最低值后，传感器缓慢解析，使频率逐渐增加。

从以上实验结果可以看出，用蛋白A做交联剂，固定化对氧磷抗体做成的压电晶体传感器，可以方便地对被超声雾化器雾化后的气态对氧磷进行检测，反应迅速，可在6分钟内完成，且可逆性强。实验说明，压电晶体传感器可对气态小分子抗原进行实时检测。

实验例2

SARS压电晶体传感器

1、样品和试剂

(1)、唾液样品制备：漱口后，静音15分钟，取2mL新鲜唾液，置离心机上以3000转/分的速度离心15分钟，取上层清液备用。

(2)、SARS病毒唾液制备：SARS病毒冻干粉制成唾液标准溶液，浓度分别为4，3，2，1.5，1，0.5mg/mL；

(3)、PBS溶液：将8.0g NaCI，0.2g KCI，1.44gNa₂HPO₄，1.44gK₂HPO₄溶解于800mL蒸馏水中，调整其PH值至7.4，稀释为1.0L，分装，高压蒸气灭菌，室温保存；

(4)、SARS马血清抗体(效价1∶12800，ELISA法分析；PBS溶液)，37.5mg/mL，解放军军事医学科学院；

(5)、北京01号SARS灭活病毒(PBS溶液)，4mg/mL，解放军医学科学院；

(6)、广州01号SARS灭活病毒(PBS溶液)，1.88mg/mL，解放军医学科学院；

(7)、A1号沪防流感灭活病毒，效价为1∶128，中国疾病预防控制中心病毒研究所；

(8)、可溶性蛋白A，Sigma公司；

(9)、二次蒸馏水。

2、SARS压电晶体传感器的制备

取9MHZ金电极，先用5mL1.2mol/L的NaOH溶液浸泡5min，洗净后再用5mL1.2mol/L的HCI浸泡5min，用二次蒸馏水洗净后于乙醇中浸泡15min，于空气中晾干待用。

将一定量(具体的体积和浓度受所需要固定的抗体数量的影响)蛋白A用微量进样器涂于晶片表面，室温晾干，再将0.5μLSARS抗体浓度为15.00mg/mL的SARS抗体用微量进样器涂于蛋白A薄膜上，室温晾干。

3、气化方式的选择

实现气相条件下检测SARS病毒，关键而重要的一步是将处于溶液中的SARS病毒完全气化成气体，对气化方法的要求是：(1)、气化要完全；(2)、速度快；(3)、样品用量少；(4)、不改变病毒结构，不损伤病毒；(5)、方法简便易行。

根据以上要求，试验比较了自然挥发法和超声雾化法。

自然挥发法

(1)将含有及未含有SARS病毒的PBS溶液，在相同条件下分别与压电晶体传感器同置于密闭气室，比较二者由于液体自然挥发成气体，导致频率的下降。实验结果说明，二者频率变化未见差异，说明在自然挥发情况下水中病毒很难挥发出来。

(2)将含有及未含有SARS病毒的唾液溶液，在相同条件下分别与压电晶体传感器同置于密闭气室。由于唾液的自然挥发，导致频率下降。实验结果说明，二者频率未见明显差异，说明用自然挥发方法唾液中的病毒亦难以挥发。

超声雾化法

本发明使用亚都科技有限股份公司研制的亚都超声振荡仪及直径为2cm镀钛PZT压电陶瓷晶片对水、唾液等液体样品进行雾化，并对检测气室的结构、雾化条件如超声振荡时间、振荡电流大小、振荡间隔、振荡次数以及液体样品用量进行了详细的实验。

实验结果说明，当液体样品用量大时，超声雾化时会产生液滴飞溅现象，液体不能完全雾化，使测定结果不可靠。当样品用量为1μL时，样品可以完全雾化，不会在超声雾化时产生飞溅现象，经实验证明最佳超声雾化电流为440mA，振荡时间为0.09秒，振荡间隔为0.2秒，振荡次数以15次为宜；检测气室的结构以雾化片置传感器上方可得较好的测试效果。

SARS压电晶体传感器的基线稳定性曲线：

实验测试了SARS压电免疫传感器基线稳定性，从图7中可以看出，十分钟后，SARS压电晶体传感器的频率变化基本上趋于稳定，三十分钟内其频率漂移相差41Hz。实验说明SARS压电晶体传感器具有很好的稳定性。

SARS压电晶体传感器对PBS中SARS病毒的检测和蛋白A膜与蛋白A+SARS抗体膜对SARS病毒的检测：

为比较抗原与抗体的选择性反应，研究了固定与不固定SARS抗体的蛋白A压电晶体传感器对PBS中SARS病毒的响应(浓度为3mg/mL)。从检测结果来看，用仅有蛋白A的压电晶体传感器对PBS溶液中的SARS病毒进行检测，频率变化为762Hz(如图8所示)，而涂有SARS抗体的压电晶体传感器的频率变化为4758Hz(如图9所示)，二图比较说明蛋白A对检测信号影响不大，主要是膜层上的抗体与病毒结合使晶片质量增加而引起频率下降。为了进一步验证是否是抗体与抗原的结合反应，本发明的发明人又做了下面一组对比实验。

SARS压电晶体传感器对PBS及其中的SARS病毒的检测：

为比较SARS压电晶体传感器对病毒的响应，分别对PBS水溶液与含病毒PBS水溶液(浓度为3mg/mL)进行了检测，结果如图9、图10，从二图比较可看出，SARS压电免疫传感器对PBS的响应值为2251Hz，远小于对SARS病毒的响应值(4758Hz)，这说明频率的下降主要是抗体与病毒结合引起的(2507Hz)，因此可以对病毒进行检测。该实验也说明了SARS压电晶体传感器对水蒸气有吸附，PBS水溶液对检测有一定的影响。

SARS抗体浓度的影响：

表1为蛋白质A的量一定，涂有0.5μL不同浓度SARS抗体的压电晶体传感器对病毒检测的响应。

                      表1响应下降频率与SARS抗体浓度关系表

SARS抗体浓度(mg/mL)	37.50	17.75	15.00	12.50
					对PBS下降频率Δf1(ΔHz)	超出测量频率	4018	1320	1880
对SARS病毒下降频率Δf2(ΔHz)	5209	4050	2809
				f2-f1(ΔHz)	1191		2730	929

由上表可以看出，当抗体浓度为37.5mg/mL时发生乱频现象，无法进行检测，抗体浓度为17.75mg/mL时，对病毒的响应达5709Hz，但对本底PBS信号也高达4018Hz，本底信号较大。综合考虑扣除本底后，SARS抗体浓度以15.00mg/mL较佳，其对病毒的响应信号可达2700Hz。

SARS压电晶体传感器对PBS中SARS病毒检测的工作曲线：

配制含不同浓度的SARS病毒的PBS水溶液，每次样品量为1μL，分别检测病毒浓度为5，3，2，1.5和1mg/mL时的响应信号，扣除PBS本底信号，病毒的响应曲线如图12所示。

为测试SARS压电晶体传感器对水及对病毒检测的精密度，在同一检测条件下，使用同一传感器对相同浓度的病毒(1mg/mL)和PBS水溶液进行十次实验，结果如表2和表3所示。

                            表2同一晶片对PBS水溶液的检测精密度

次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	X	δ	RSD
														响应信号(Hz)	2277	2071	2518	1859	1901	2338	2579	2439	1933	2038	2195	258	0.1221

                            表3同一晶片对PBS中同一浓度病毒的检测精密度

次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	X	δ	RSD
														响应信号(Hz)	2823	2695	3164	2475	2503	3194	3035	2959	2430	2549	2783	278	0.0998

由上表可以看出，对PBS十次检测的相对标准偏差为12.21％，对病毒检测十次的相对标准偏差为9.98％。根据S/N＝2计算，最低检出限为0.61μL。

为测试压电晶体传感器检测的平行性，在同一条件，使用不同压电晶体传感器对相同量的病毒(1mg/mL)及PBS水溶液进行十次实验，结果如表4所示。

                 表4不同晶片对PBS及其中的SARS毒的检测平行性(Hz)

序号	基频	涂蛋白A后Δf	涂抗体后Δf	对PBS的响应	含病毒的PBS响应	响应差值
							1	9013354	12785	25160	1853	2393	540
2	8998427	12191	23806	1671	2374	703
							3	9010992	12937	27136	2206	2708	502
4	9002158	11838	20513	2174	2718	544
							5	9015014	11588	25308	1848	2549	701
6	9013634	12835	28679	1950	2400	450
							7	8990958	12167	28251	2258	2889	631
8	9008701	12166	27581	2264	2916	652
							9	9002316	12280	24278	1954	2407	453
10	9016836	13288	27652	2240	2885	645
							X	9007239	12408	25836	2042	2624	582
RSD		0.0430	0.0979	0.1041	0.0860	0.1657

由上表可以看出，制备十个不同的传感器时，涂蛋白A后的频率变化相对标准偏差为4.30％，涂抗体后的频率变化相对标准偏差为9.79％，传感器对PBS十次检测的相对标准偏差为10.41％，对含相同浓度病毒的PBS水溶液检测十次的相对标准偏为8.60％。扣除本底后对病毒响应的相对标准偏差为16.57％。相对标准偏差均小于20％。

SARS压电晶体传感器对不同株的病毒响应：

迄今为止，世界范围内已发现十余种不同的SARS病毒株，国内亦有多种，如北京01、02、03号，广州01、02、03号等。本发明SARS压电晶体传感器是根据北京01号病毒株诱导而得的马血清抗体来研制的，为实验该传感器对不同株病毒的响应，图13为压电晶体传感器对广州01号病毒PBS水溶液(1.88mg/mL)测试结果，频率变化为2903Hz。如图14所示，同一传感器在相同条件下对相同量PBS测试频率变化值为2209Hz。从二图比较，频率差值为694Hz。而北京01号SARS病毒吸附曲线上可知，1.88mg/mL病毒可引起的频率差值为1602Hz。这说明该传感器可以用于检测广州01号SARS病毒，但响应值低于对北京01号病毒的检测。

为了研究其他病毒是否会对SARS压电晶体传感器的测量造成干扰，本发明的发明人用A1号流感病毒做了实验，对流感病毒的实验结果如图15所示，响应信号为1853Hz。图16为SARS压电晶体传感器对PBS的检测曲线，响应信号为1850Hz。由此可知，流感病毒对检测没有明显影响。

SARS压电免疫传感器对唾液及唾液中SARS病毒的检测结果：

为比较同一SARS压电晶体传感器对唾液及含病毒的唾液的检测结果，做了下述实验。图17为SARS免疫传感器对唾液的响应曲线，其频率下降2520Hz，图18为相同条件下同一传感器对病毒(溶剂为同一人的唾液，浓度为4mg/mL)的响应曲线，其频率下降5758Hz，扣除唾液本底，由病毒与抗体结合引起的频率下降为此3238Hz，说明响应信号明显，响应时间约为1分钟。

图19为同一传感器对不同浓度的SARS病毒(同一人的唾液)的工作曲线，每次进样量为1μL，病毒的浓度分别为4，3，2，1，0.5mg/mL，扣除唾液本底信号。

为测试传感器检测的精密度，在同一条件，使用同一传感器对同一人的唾液配制的同一浓度的病毒(1mg/mL)及唾液进行十次检测，结果如表5、表6所示。

                                        表5同一晶片对唾液的检测精密度

次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	X	δ	RSD
														响应信号(Hz)	1825	2231	2469	2160	2453	2057	2433	2109	1827	1870	2143	254	0.1096

                            表6同一晶片对唾液中1mg/mL病毒的检测精密度

次数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	X	δ	RSD
														响应信号(Hz)	2539	2821	3051	2900	3205	2539	3312	2879	2522	2422	2819	309	0.1183

由上表可以看出，对PBS十次检测的相对标准偏差为1.22％。对病毒十次检测的相对标准偏为10.39％。根据S/N＝2计算，最低检出限为0.6μg/μL。

为测试传感器检测的平行性，在同一条件，使用不同的传感器对唾液中相同浓度的病毒(1mg/mL)及唾液本底进行十次实验，结果如表7所示。

                     表7不同晶片对唾液及唾液中病毒的检测平行性(Hz)

序号	基频	涂蛋白A后Δf	涂抗体后Δf	唾液响应	唾液中病毒响应	响应差值
							1	9013354	12785	25160	2219	2874	655
2	8998427	12191	23806	1748	2510	762
							3	9010992	12937	27136	1757	2641	884
4	9002158	11838	20513	2420	2959	539
							5	9015014	11588	25308	2538	3173	635
6	9013634	12835	28679	1844	2334	490
							7	8990958	12167	28251	1813	2547	734
8	9008701	12166	27581	1974	2574	600
							9	9002316	12280	24278	1751	2448	697
10	9016836	13288	27652	2006	2667	661
							X	9007239	12408	25836	2007	2673	666
RSD		0.0430	0.0979	0.1446	0.0959	0.1697

由上表可以看出，对唾液十次检测的相对标准偏差为14.46％。对含病毒的唾液检测十次的相对标准偏差为9.59％。对病毒响应的相对标准偏差为16.97％。

同一SARS压电免疫传感器对50个人的唾液进行检测。总体平均值为2128Hz；其中男性37人，平均值为2070Hz；女性13人，平均值为2298Hz。从年龄阶段来看，其检测结果如表8所示。

                        表8不同年龄阶段受试者检测结果

年龄	0-10	10-20	20-30	30-40	40-50	50-60	60-70
								人数	6	3	21	6	3	3	8
平均值(Hz)	2464	1934	2030	2028	2364	2379	2102

图20为岁数不同的人群唾液响应值分布图，从图20可见，响应值在1600-2700Hz之间，绝大多数响应值在1700-2500Hz(84％)之间。

将SARS压电晶体传感器密封放入冰箱冷藏室(4-6℃)保存，每隔5天测试其对病毒(浓度为4mg/mL)及PBS本底的响应，测试结果见表9。

                              表9传感器活性测试结果

放置时间(天)	0	5	10	15	20	25	30
								对病毒响应频率(ΔHz)	5912	5984	5400	5672	5419	5295	4976
对PBS响应频率(ΔHz)	2300	2343	2060	2376	2277	2195	1998
								响应变化	3612	3641	3440	3296	3142	3100	2978

由上表可知，用蛋白质A固定后的抗体性质稳定，一个月后活性未见明显下降。

SARS压电晶体传感器可多次使用，一般能连续使用数十次。但每次使用后要充分解析，一般以解析到其涂膜后的基频为宜。

从上述实验结果可得出以下结论：

1、使用上述超声雾化方法，可将1μL PBS水溶液和唾液中SARS病毒完全雾化。

2、以蛋白A为交联剂，用马血清SARS抗体制成的压电免疫传感器，可在约2分钟内快速检测出水、唾液中所含的SARS病毒。对PBS中SARS病毒检测限为0.6μg/μL，对唾液中SARS病毒检测限为0.6μg/μL。

3、压电晶体传感器具有极强的特异性，并要求抗体有较高的效价。实验说明，从小汤山SARS定点医院得到12个SARS康复病人血清，从中用(NH₄)₂SO₄沉淀法提取得到抗体，用该抗体制成的压电晶体传感器对SARS病毒无响应。而用该SARS病毒直接诱导产生的马血清抗体因具有很高的效价，制成的压电晶体传感器对SARS病毒检测结果说明效果良好。

4、用同一压电晶体传感器对不同年龄段的50人唾液检测结果说明，不同年龄，不同生理状况的人的唾液检测结果是有差异的。但84％的人检测值是在1700Hz-2500Hz之间(检测平均值为2128Hz)。

5、同一压电晶体传感器对同一人的唾液平行检测十次，结果说明检测相对标准偏差为11.83％。十个压电晶体传感器对同一人唾液检测结果说明，虽然传感器基频及膜厚略有差别，但其检测结果偏差在20％范围之内。

6、因水对检测有干扰，SARS压电晶体传感器的贮存应在硅胶或其它干燥剂等存在下密封于冰箱的冷藏室中保存。使用前，应在测量环境中放置一段时间，使传感器上抗体薄膜与环境空气中的小分子达到完全平衡，频率稳定后再使用。

7、压电晶体传感器可重复使用数十次，但每次使用前应充分解析，使其恢复到基频，解析时间以十分钟为宜。

9、用北京01号SARS病毒诱导的马血清多克隆抗体做成的压电晶体传感器不仅可对北京01号SARS病毒检测，而且可以对不同株的广州01号SARS病毒进行检测。

Claims (10)

1、一种病毒检测系统，其特征在于：包括雾化系统、检测系统和报警系统；所述雾化系统通过所述检测系统与所述报警系统相连。

2、根据权利要求1所述的病毒检测系统，其特征在于：所述雾化系统包含超声雾化发生装置、超声换能装置和雾化控制电路；所述检测系统包括质量测量式免疫传感器及检测电路装置；所述报警系统为单片机报警系统；所述单片机报警系统包括差频器电路、单片机处理电路和报警电路。

3、根据权利要求2所述的病毒检测系统，其特征在于：所述超声雾化发生装置为超声逻辑振荡仪；所述超声换能装置为压电陶瓷超声振荡晶片；所述超声逻辑振荡仪通过所述雾化控制电路与所述压电陶瓷超声振荡晶片相连；所述质量测量式免疫传感器为涂有抗体薄膜的压电晶体传感器，其两个电极插于所述检测电路装置上；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器上方的支架上放置所述压电陶瓷超声振荡晶片；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器与所述压电陶瓷超声振荡晶片及支架置于密闭容器中；所述涂有抗体薄膜的压电晶体传感器与所述差频器电路、单片机处理电路和报警电路相连。

4、一种病毒检测方法，其步骤如下：

(1)取含病毒的样本，经过处理，提取，培养，配制成溶液；

(2)取上述溶液，滴加至超声雾化发生装置；

(3)超声换能装置向所述超声发生装置传递能量，对其上的溶液进行超声气雾化；

(4)密闭容器内安装有涂有抗体薄膜的质量测量式免疫传感器和检测电路装置，气雾化的病毒沉积在所述质量测量式免疫传感器的芯片上；

(5)所述质量测量式免疫传感器与报警装置相连，被吸附的病毒量达到一定程度，报警装置即发出报警信号。

5、根据权利要求4所述的病毒检测方法，其特征在于：所述质量测量式免疫传感器为涂有抗体薄膜的压电晶体传感器。

6、根据权利要求5所述的病毒检测方法，其特征在于：所述超声雾化发生装置为超声逻辑振荡仪；所述超声换能装置为压电陶瓷超声振荡晶片。

7、根据权利要求6所述的病毒检测方法，其特征在于：所述病毒为SARS病毒。

8、根据权利要求7所述的病毒检测方法，其特征在于：所述超声换能装置向所述超声发生装置传递的是440mA的电流；所述压电陶瓷超声振荡晶片的振荡时间为0.09秒，振荡间隔为0.2秒，振荡次数为15次。

9、根据权利要求4-8中任一项所述的病毒检测方法，其特征在于：所述含病毒样本用量为0.5-1.5μL。

10、根据权利要求9中所述的病毒检测方法，其特征在于：所述含病毒样本的浓度为0.6-4μg/μL。

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