CN1563007A - 9－(2－脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了阿昔洛韦的一类前体药物9－(2－脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体和制备方法。本发明采用的合成方法简单，并通过经济便易有效的纯化方法获得纯化合物，收率为70％以上，纯度为99％以上，通过脱氧胆酸钠法可以制备9－(2－脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体。所述合成和纯化方法具备大规模生产的潜力。经体外抗病毒试验证实，9－(2－棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体具有抗乙肝病毒和抗疱疹病毒药作用，其中脂质体9－(2－棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤抑制乙肝病毒的作用明显优于其母药阿昔洛韦。
Description
技术领域
本发明属药学领域，具体涉及阿昔洛韦的-类前体药物9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体，和制备方法。
背景技术
自从1898年Beijerinck首次提出病毒概念以来，病毒的种类由原来的几十种，发展到今天已有4000多种。尤其近年来HIV病毒、乙肝病毒以及SARS病毒和禽流感病毒等对全世界的公众健康造成了极为严重的危害，再次引起了全球对抗病毒药物研究的普遍重视。然而，抗病毒药物研究进展较慢，据报道，迄今为止开发出30多种药物，并且HIV病毒、乙肝病毒以及SARS病毒和禽流感病毒尚无真正的特效药，形势极为严峻。
阿昔洛韦(又称无环鸟苷，化学名：9-(2-羟乙氧甲基)鸟嘌呤，Acyclovir，ACV)为核苷类广谱抗病毒药物。它能被病毒的胸腺嘧啶核苷酶选择性地磷酸化，从而转化为单磷酸酯，后者受细胞酶的作用，再转化为二磷酸酯和三磷酸酯。已有研究报道阿昔洛韦的三磷酸酯可干挠病毒的DNA聚合酶，从而抑制DNA的复制。临床主要用于治疗1型和2型疱疹病毒等，它在体内生物利用度只有15％，这极大地限制了它的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一类阿昔洛韦的前体药物9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其制备方法。本发明的进一步目的是提供上述化合物的脂质体的制备方法。
本发明通过改变阿昔洛韦的溶解性改善其生物利用度。本发明对现有的抗病毒药物阿昔洛韦进行前药设计和改造，在羟基上连接上一条12，14或16碳的长链，合成它的亲脂性前体药物9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤，包括9-(2-月桂酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤[又名阿昔洛韦月桂酸酯，9-(2-laurate ethoxymethyl)guanine，acyclovir laurate]；9-(2-肉豆蔻酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤[又名阿昔洛韦肉豆蔻酸酯，9-(2-myristate ethoxymethyl)guanine，acyclovirmyristate]；9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤[又名阿昔洛韦棕榈酸酯，9-(2-palmitate ethoxymethyl)guanine，acyclovir palmitate]。进一步将上述前药制备成脂质体，经体外抗病毒试验证实，其抗病毒能力明显提高。
本发明采用阿昔洛韦和脂肪酰氯为原料，吡啶为溶剂，连续反应12-36h，反应产品经酸碱处理后用甲醇反复重结晶，干燥后得阿昔洛韦的前体药物9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤。
本发明采用脱氧胆酸钠法进一步制备其脂质体。
本发明通过下述方法和步骤进行：
1.合成
按式(I)的合成路线，将阿昔洛韦溶解于经KOH干燥的吡啶中，搅拌加入脂肪酰氯，上述反应液在50-70℃水浴中搅拌连续反应12-36h。反应结束加入5倍体积的去离子水，冷却至室温后过滤收集产品。
阿昔洛韦 脂肪酰氯
9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
其中R代表H或CH2CH3或CH2CH2CH2CH3。
(I)
2.纯化
将上述反应产品悬浮于0.01MHCl中，搅拌后过滤；将过滤沉淀再悬浮在0.01MNaOH中，搅拌后过滤，4℃去离子水洗涤，将过滤物用甲醇于60℃溶解至饱和，再冷却至4℃收集沉淀；重复以上操作5次后将沉淀干燥得纯品。
3.制备脂质体
取蛋卵磷脂和9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤溶于氯仿甲醇混合液(2∶1，v/v)中，旋转蒸发使之形成均匀薄膜。加脱氧胆酸钠溶液溶解薄膜后透析，结束透析得9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体。
4.体外抗病毒实验
常规培养乙肝病毒或疱疹病毒，加入阿昔洛韦的前体药物脂质体到培养液中，继续培养后，检测抑制病毒作用结果；同时作细胞对照。
本发明的阿昔洛韦的前体药物9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体，采用的合成方法简单，纯化方法经济、便易、有效，所得纯化合物收率为70％以上，纯度为99％以上，所述合成和纯化方法具备大规模生产的潜力。细胞试验结果证实，9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体具有抗乙肝病毒和抗疱疹病毒药作用，其中脂质体9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤抑制乙肝病毒的作用明显优于其母药阿昔洛韦。
附图说明
图1.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体电镜照片(×74000)，
图2.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的质谱图，
图3.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的紫外可见光扫描图，
图4.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的红外吸收光谱图，
图5.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的13C NMR核磁共振图，
图6.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的1H NMR核磁共振图，
图7.9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤及其脂质体的体外抗乙肝病毒作用。
具体实施方式
实施例1 制备9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
(1)合成9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
将2.252克(10mmol)阿昔洛韦溶解于80ml经KOH干燥的吡啶中，搅拌加入2.749克棕榈酰氯(10mmol)，将上述反应液密闭在60℃水浴中搅拌连续反应24h。反应结束加入5倍体积的去离子水，冷却至室温后过滤收集产品。
(2)纯化9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
将反应产品悬浮在100ml 0.01MHCl中，搅拌30min后过滤，将过滤沉淀悬浮在0.01MNaOH中，搅拌10min后过滤，用4℃去离子水洗涤过滤物，将过滤物用甲醇于60℃溶解至饱和，再冷却至4℃收；重复以上操作5次后将沉淀干燥得9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤。
(3)9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的性质
9-(2-棕榈酰酯乙氧甲基)鸟嘌呤在室温下为白色粉末。用熔点仪测定9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的熔点为202-204℃，9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤经水、氯仿、甲醇、异丙醇、丙酮、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、二甲亚砜和甲醇氯仿混合液(2∶1，v/v)等溶剂试验，9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤不溶于水，可溶于氯仿、甲醇、异丙醇、丙酮、乙醇、乙醚、乙酸乙酯等，极易溶于二甲亚砜和甲醇氯仿混合液(2∶1，v/v)。
(4)9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的结构表征
将9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤溶解在DMSO中，用Pharmacia 3300UV/Visible Spectrophotometer紫外可见光度计进行紫外可见光扫描得紫外可见光扫描谱，同时与阿昔洛韦紫外可见光扫描谱比较。将9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤溶解在DMSO中，用Perkin-Elmer Spectrum One FTIR红外光谱仪得红外光谱，同时与阿昔洛韦红外光谱比较。将9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤溶解在甲醇中，用Agilent 1100LC/MD质谱仪得出质谱，将9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤溶解在DMSO中，用Oxford核磁共振仪，得13CNMR(400MHz，DMSO-d6)，将9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤溶解在DMSO中，用Oxford核磁共振仪，得1H NMR(400MHz，DMSO-d6)。
实施例2 制备9-(2-肉豆蔻酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
(1)合成9-(2-肉豆蔻酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
将2.252克阿昔洛韦(10mmol)溶解在80ml经KOH干燥的吡啶中，将2.749克肉豆蔻酰氯(10mmol)边搅拌边加到上述溶液中，将上述反应液密闭在60℃水浴中搅拌连续反应24h。反应结束加入5倍体积的去离子水，冷却至室温后过滤收集产品。
(2)纯化9-(2-肉豆蔻酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
将反应产品悬浮在100ml 0.01MHCl中，搅拌30min后过滤，将过滤沉淀悬浮在0.01MNaOH中，搅拌10min后过滤，用4℃去离子水洗涤过滤物，将过滤物用甲醇于60℃溶解至饱和，再冷却至4℃收；重复以上操作5次后将沉淀干燥得9-(2-肉豆蔻酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤。
实施例3 制备9-(2-月桂酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
(1)合成9-(2-月桂酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
将2.252克阿昔洛韦(10mmol)溶解在80ml经KOH干燥的吡啶中，搅拌加入2.749克月桂酰氯(10mmol)，将上述反应液密闭在60℃水浴中搅拌连续反应24h。反应结束加入5倍体积的去离子水，冷却至室温后过滤收集产品。
(2)纯化9-(2-月桂酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤
将反应产品悬浮在100ml 0.01MHCl中，搅拌30min后过滤，将过滤沉淀悬浮在0.01MNaOH中，搅拌10min后过滤，用4℃去离子水洗涤过滤物，将过滤物用甲醇于60℃溶解至饱和，再冷却至4℃收；重复以上操作5次后将沉淀干燥得9-(2-月桂酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤。
实施例4 脱氧胆酸钠法制备9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体
(1)精密称取NaCl8.00g，KCl0.20g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.20g溶于900ml无菌水，用HCl调pH到7.4，加无菌水到1000ml。将此PBS缓冲液稀释20倍即为1/20 PBS；
(2)精密称取蛋卵磷脂100mg、9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤10mg溶于6ml氯仿甲醇混合液(2∶1，v/v)中，于37℃水浴中旋转蒸发使之形成均匀薄膜；
(3)以氮气流吹尽残余有机溶剂后加入5ml溶有适量脱氧胆酸钠的1/20PBS，将薄膜溶解充分混匀后于24℃水浴中摇荡30min；
(4)将上述混合液对1/20 PBS缓冲液透析，22小时后结束透析得9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体；
(5)用Waters1525高效液相色谱仪测定9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤的浓度。
实施例5
9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体形态的电镜观察及大小的测定
(1)取一滴待测脂质体混悬液于点滴反应反应瓷板的凹槽内，并将喷碳铜网置于试液上，2分钟后取出铜网，置染液(2％的磷钨酸溶液，pH7.0)上负染，干燥后，透射电镜观察脂质体的外观形态，同时照相，
(2)用Pass.nicomp 380zls纳米粒度仪测定脂质体的粒径。粒径大小为61nm，粒径分布在20-100nm之间
实施例6 9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤体外抗乙肝病毒作用
(1)24孔板培养HepG2.2.2.15细胞(卫生部医学分子病毒学重点实验室)，72小时加入9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体、9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤和阿昔洛韦到培养液中；
(2)继续培养9天，收集上清液，测定乙肝病毒HBsAg和HBeAg含量；同时作细胞空白对照。
(3)比较9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体、9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤和阿昔洛韦对乙肝病毒HBsAg和HBeAg的抑制作用。表1是抗乙肝病毒作用结果。
表1
药物量浓度 抗乙肝病毒作用
HBsAg抑制率 HBeAg抑制率
阿昔洛韦 0.444μmol/ml 18.0％ 27.0％
9-(2-棕榈酰酯乙氧甲基)鸟嘌呤 0.444μmol/ml 3.7％ 5.8％
9-(2-棕榈酰酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体 0.044μmol/ml 20.3％ 29.3％
9-(2-棕榈酰酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体 0.088μmol/ml 52.6％ 42.6％
9-(2-棕榈酰酯乙氧甲基)鸟嘌呤脂质体 0.222μmol/ml 68.4％ 53.5％
实施例7 9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤体外抗疱疹病毒作用
(1)将Vero细胞(单纯疱疹病毒(HSV)标准毒株1型sm44株)培养在24孔板上，10TCID50病毒感染2小时后，加入9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤和阿昔洛韦到培养液中。
(2)结果显示30-40μg的9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)鸟嘌呤与10-20μg阿昔洛韦均能有效抑制单纯疱疹病毒。
Claims (8)
1.9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤，其特征在于具有如下通式结构，
其中R代表H或CH2CH3或CH2CH2CH2CH3。
2.根据权利要求1所述的9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤，其特征在于所述化合物是9-(2-月桂酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤，或9-(2-肉豆蔻酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤，或9-(2-棕榈酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤。
3.权利要求1所述的9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以阿昔洛韦为原料，以吡啶为溶剂，与脂肪酰氯进行合成反应，加入去离子水终止反应，过滤获得沉淀物；
(2)将沉淀物悬浮在稀盐酸中，搅拌过滤后再悬浮在稀NaOH中，搅拌、过滤，去离子水洗涤过滤物，甲醇溶解过滤物，再重结晶，得9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述步骤(1)其中合成反应温度为50-70℃，反应时间为12-36小时，阿昔洛韦与脂肪酰氯反应摩尔比为1∶0.5-1。
5.根据权利要求3的方法，其特征是所述步骤(2)中稀盐酸浓度为0.01M，稀NaOH浓度为0.01M，所述去离子水温度为0-4℃，所述甲醇温度为50-70℃，结晶甲醇温度为4-10℃。
6.根据权利要求1或2所述的9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤脂质体，其特征是通过脱氧胆酸钠法制备，包括下述步骤，
(1)将蛋卵磷脂和9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤溶于氯仿甲醇混合液(2∶1，v/v)中，旋转蒸发使之形成均匀薄膜；
2)加入脱氧胆酸钠溶液溶解薄膜，混匀，透析，得9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤脂质体。
7.权利要求1或2的9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤，在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
8.权利要求1或2的9-(2-脂肪酸酯乙氧甲基)-鸟嘌呤，在制备抗疱疹病毒药物中的用途。
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