CN1559614A - 一种多糖类纳米抗癌材料及其制备方法 - Google Patents

一种多糖类纳米抗癌材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的多糖类纳米抗癌材料是以壳聚糖为基础原料制备的，该多糖类纳米抗癌材料的纳米粒子粒径20－500nm，其中壳聚糖分子量为2～80kDa，脱乙酰度50～100％。它可以作为新型抗癌药物应用于胃癌、肠癌、肝癌等多种领域。

Description

一种多糖类纳米抗癌材料及其制备方法
                           技术领域
本发明涉及一种以壳聚糖为基础原料的多糖类纳米抗癌材料及其制备方法。
                           背景技术
壳聚糖是天然的高分子生物低聚物，其降解产物为具有弱碱性的氨基葡萄糖，对人体组织无毒、无害。它除具有优异生物相溶性外，还具有独特的生物活性，能调节动物机体免疫，抑制肿瘤细胞增殖，有较强的抑菌活性，并能调节动物体内胆固醇与脂质代谢。壳聚糖作为饲料添加剂、重金属螯合剂、吸附剂、药物缓释剂等多种功能性材料已应用于农业、工业及医药等领域。多种壳聚糖改性产物，如交联壳聚糖、壳聚糖微球、壳聚糖纳米粒子等也已得到较好应用。壳聚糖微球、珠状壳聚糖已被研究应用于抗癌药物与蛋白质的控释系统。制备珠状壳聚糖的方法有水油两相法、乳滴技术、喷雾干燥法等，通常这些制备过程复杂且需要使用有机溶剂与表面活性剂，由此制备的壳聚糖微球不适合物化性质表征观察。
Zhengrong Cui；Russell J Mumper.Chitosan-based nanoparticles fortopical genetic immunization.Journal of Controlled Release.2001，75(3)：409-419报道，CS(壳聚糖)-DNA纳米粒子通过CS与DNA在酸性溶液中凝聚作用制得，CS-DNA纳米粒子的粒径在100-250nm之间，合成的CS-DNA纳米粒子能应用于小鼠基因免疫。
Yong Hu；Xiqun Jiang，Yin Ding，et.al.Synthesis and characterizationof chitosan-poly(acrylic acid)nanoparticles.Biomaterials，2002，23：3193-3201报道，通过丙烯酸在壳聚糖溶液中模板聚合作用制备CS-PAA(多聚丙烯酸)纳米粒子，能够稳定分散于酸性介质中。但以上所制得的纳米粒子粒径通常较大，成品率较低，且形成的微粒粒径不均一。
壳聚糖具有增强抗肿瘤药物作用，能促进白细胞介素2(IL-2)的生成，IL-2对NK细胞、T细胞、B细胞活性均有增强作用。壳聚糖是一种带正电荷天然高分子生物聚合物，显示极强的生理活性。肿瘤细胞表面带有更高负电荷，聚阳离子电解质能吸附到癌细胞表面使电荷中和，抑制肿瘤细胞生长与转移。在酸性环境中能形成阳离子基团，与体细胞产生亲和性，活化体细胞，增强机体免疫力(Hiroshi Ueno，et.al Topical formulat ions and wound healingapplications of chitosan.Advanced Drug Delivery Reviews，2001，52：105-115)。壳聚糖具有清除体内自由基细胞毒素的能力，可作为早期癌症的治疗药物。
癌细胞会释放大量的癌毒素，低聚壳聚糖在肠道内形成的小分子容易被肠吸收，抑制癌毒素在体内的释放，同时壳聚糖吸附在血管壁细胞的表面，可抑制癌细胞的转移。
已有研究报道锌、钴等金属离子具有较高的抗癌活性。通过将此类金属离子负载于具有生物相溶性可降解的壳聚糖制备复合抗癌纳米材料，能够提高其抗癌活性，并能发挥缓释、长效、无残留作用。
                            发明内容
本发明的目的是提供一种可作为抗癌药物应用的多糖类纳米抗癌材料及其制备方法。
本发明的多糖类纳米抗癌材料是分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％的壳聚糖纳米粒子，粒径20-500nm。或者是载金属离子壳聚糖纳米粒子，粒径20-500nm，其中壳聚糖的分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％，金属离子含量(重量)为1～20％。
本发明的多糖类纳米抗癌材料有两种制备方法。
方法1，制备步骤如下：
在20-60℃搅拌下，于稀酸溶液中加入分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％壳聚糖，配置0.1％～5％壳聚糖酸溶液，然后向壳聚糖酸溶液加入0.1～5％交联剂溶液，交联反应形成纳米粒子微乳液，将纳米粒子微乳液离心分离，沉淀物蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥，即得多糖类纳米抗癌材料。
方法2，制备步骤如下：
在20-60℃搅拌下，于稀酸溶液中加入分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％壳聚糖，配置0.1％～5％壳聚糖酸溶液，然后向壳聚糖酸溶液加入0.1～5％交联剂溶液，形成微乳液，离心分离，沉淀物蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于浓度为100～1000mg/L金属离子溶液中，振荡吸附，将吸附后的纳米粒子置于烘箱中烘干，即得多糖类纳米抗癌材料。
本发明中，所说的稀酸为乙酸、醋酸或盐酸；交联剂为阴离子交联剂，包括多聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠等；金属离子溶液为锌离子的硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐水溶液或为钴离子的硝酸盐水溶液。
本发明的优点：
1)本发明提供了一种在常温、常压下(即温和条件下)制备多糖类纳米抗癌材料方法。制备过程中，不使用任何有机试剂和表面活性剂，很好的解决了壳聚糖纳米微粒的分离和纯化问题。
2)本发明制得的多糖类纳米抗癌材料粒径均匀，形态好。
3)本发明以具有抗癌活性的金属离子与壳聚糖为基质，通过引入多价阴离子交联剂制备纳米粒子，能够作为新型抗癌药物应用于胃癌、肠癌、肝癌等多种领域。
                           附图说明
图1为实例1制备所得多糖类纳米抗癌材料透视电镜图，粒径约为50nm，放大倍数50000倍；
图2为实例2制备所得多糖类纳米抗癌材料原子力显微镜图，粒径约为60nm；
图3为实例3制备所得多糖类纳米抗癌材料原子力显微镜图，粒径约为70nm；
图4为实例4制备所得多糖类纳米抗癌材料原子力显微镜图，粒径约为60nm；
图5为实例5制备所得多糖类纳米抗癌材料原子力显微镜图，粒径约为140nm；
图6为实例6制备所得多糖类纳米抗癌材料原子力显微镜图，纳米粒子为较规则球形结构，粒径约为70nm；
图7为实例7多糖类纳米抗癌材料处理胃癌细胞24h前后相差显微镜图，a为对照组，b为试验组。
                          具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实例1：
20℃磁力搅拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脱乙酰度85％的壳聚糖，配置0.1％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入0.1％多聚磷酸钠溶液，反应完全后，3000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗癌材料。
上述方法制备的纳米粒子平均粒径约为50nm，透视电镜图显示纳米粒子为较规则球形结构(见图1)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例2：
60℃磁力搅拌下，在0.5％醋酸溶液中加入分子量10kDa、脱乙酰度84％的壳聚糖，配置5％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入5％硫酸钠溶液，形成微乳液，4000rpm/min离心分离，蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于600mg/L钴离子溶液中，300rpm/min振荡吸附，吸附完全后，将吸附后壳聚糖纳米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖类纳米抗癌材料。
上述方法制备的载钴纳米粒子平均粒径约为60nm，其中钴含量约为10％，原子力显微镜图显示纳米粒子为较规则球形结构(见图2)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例3：
30℃磁力搅拌下，在1％盐酸溶液中加入分子量8kDa、脱乙酰度86％的壳聚糖，配置2％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入1％柠檬酸钠溶液，反应完全后，6000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗癌材料。
上述方法制备的纳米粒子平均粒径约为70nm，原子力显微镜图显示纳米粒子为球形结构(见图3)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例4：
35℃磁力搅拌下，在1％乙酸溶液中加入分子量9kDa、脱乙酰度100％的壳聚糖，配置1.5％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入0.5％柠檬酸钠溶液，反应完全后，3000rpm/min离心，沉淀物蒸馏水漂洗至中性后，冷冻干燥即得多糖类纳米抗癌材料。
上述方法制备的多糖类纳米抗癌材料平均粒径约为60nm，原子力显微镜图显示纳米粒子为较规则球形结构(见图4)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例5：
25℃磁力搅拌下，在0.5％乙酸溶液中加入分子量8kDa、脱乙酰度50％的壳聚糖，配置1％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入0.5％柠檬酸钠溶液，形成微乳液，4000rpm/min离心分离，蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于600mg/L钴离子溶液中，300rpm/min振荡吸附，吸附完全后，将吸附后壳聚糖纳米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖类纳米抗癌材料。
上述方法制备的多糖类纳米抗癌材料平均粒径约为140nm，其中钴含量约为20％，原子力显微镜显示多糖类纳米抗癌材料为较规则球形结构(见图5)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例6：
30℃磁力搅拌下，在0.5％醋酸溶液中加入分子量9kDa、脱乙酰度80％的壳聚糖，配置2％壳聚糖酸溶液，向壳聚糖乙酸溶液中加入1％柠檬酸钠溶液，形成微乳液，6000rpm/min离心分离，蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于800mg/L锌离子溶液中，400rpm/min振荡吸附，吸附完全后，将吸附后壳聚糖纳米粒子置于烘箱60℃烘干，即得多糖类纳米抗癌材料。
上述方法制备的多糖类纳米抗癌材料平均粒径约为70nm，其中锌离子含量约为8％，多糖类纳米抗癌材料原子力显微镜图显示形态较好球形结构(见图6)，能在pH值3～8内稳定保存。
实例7：
胃癌细胞株MGC803置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每2d更换细胞培养液，待细胞长满瓶底后再传代。
细胞悬液培养24h后，弃原培养液，加入新鲜培养液100ul，测定孔加11ul不同浓度多糖类纳米抗癌材料与阳性对照药物，对照孔加入等量RPMI-1640培养液，各设4个重复。重新放入培养箱培养24、48、72、120h后取出，每孔加入MTT20ul，继续培养4h，每孔加入DMSO100ul，震荡10min，使紫蓝色甲完全溶解，酶标仪490nm为检测波长，测各孔OD值，计算抑制率。抑制率＞30％为药敏阳性，反之阴性。表1给出了多糖类纳米抗癌材料对胃癌细胞毒性MTT试验。
抑制率＝(1-药物OD值/对照OD值)×100％。
         表1多糖纳米抗癌材料对胃癌细胞毒性MTT试验
    浓度(ug/ml)     A490nm(x±s)     抑制率(％)
    0     0.7573±0.0043
    1％乙酸     0.7560±0.0036
    ACA(100)     0.4230±0.0153**     44.14％
    12.5     0.4135±0.0026**++     45.40％
    25     0.3862±0.0279**++     49.00％
    37.5     0.3260±0.0401**++     56.95％
    50     0.2790±0.0193**++     63.16％
    75     0.1840±0.0142**++     75.70％
    100     0.1633±0.0057**++     78.44％
    150     0.1608±0.0087**++     78.77％
    200     0.1530±0.0241**++     79.81％
n＝4，**与0ug/ml组1％乙酸相比P＜0.01，++与ACA(100)组相比P＜0.01，ACA为壳聚糖醋酸溶液，其余为不同浓度的壳聚糖纳米粒子水溶液。

Claims (9)

1.一种多糖类纳米抗癌材料，其特征在于它是分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％的壳聚糖纳米粒子，粒径20-500nm。
2.根据权利要求1所述的多糖类纳米抗癌材料的制备方法，其特征是在20-60℃搅拌下，于稀酸溶液中加入分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％壳聚糖，配置0.1％～5％壳聚糖酸溶液，然后向壳聚糖酸溶液加入0.1～5％交联剂溶液，交联反应形成纳米粒子微乳液，将纳米粒子微乳液离心分离，沉淀物蒸馏水洗涤至中性，冷冻干燥，即得多糖类纳米抗癌材料。
3.根据权利要求2所述的多糖类纳米抗癌材料的制备方法，其特征是所说的稀酸为乙酸、醋酸或盐酸。
4.根据权利要求2所述的多糖类纳米抗菌材料的制备方法，其特征是所说的交联剂为阴离子交联剂，包括多聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。
5.一种多糖类纳米抗癌材料，其特征在于它是载金属离子壳聚糖纳米粒子，粒径20-500nm，其中壳聚糖的分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％，金属离子含量(重量)为1～20％。
6.根据权利要求5所述的多糖类纳米抗癌材料的制备方法，其特征是在20-60℃搅拌下，于稀酸溶液中加入分子量为2～80kDa，脱乙酰度为50～100％壳聚糖，配置0.1％～5％壳聚糖酸溶液，然后向壳聚糖酸溶液加入0.1～5％交联剂溶液，形成微乳液，离心分离，沉淀物蒸馏水漂洗至中性，冷冻干燥得壳聚糖纳米粒子，将壳聚糖纳米粒子干粉置于浓度为100～1000mg/L金属离子溶液中，振荡吸附，将吸附后的纳米粒子置于烘箱中烘干，即得多糖类纳米抗癌材料。
7.根据权利要求6所述的多糖类纳米抗癌材料的制备方法，其特征是所说的稀酸为乙酸、醋酸或盐酸。
8.根据权利要求6所述的多糖类纳米抗菌材料的制备方法，其特征是所说的交联剂为阴离子交联剂，包括多聚磷酸钠、硫酸钠或柠檬酸钠。
9.根据权利要求6所述的多糖类纳米抗菌材料的制备方法，其特征是所说的金属离子溶液为锌离子的硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐水溶液或为钴离子的硝酸盐水溶液。
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