CN1548557A - 用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物 - Google Patents

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CN1548557A CNA031369812A CN03136981A CN1548557A CN 1548557 A CN1548557 A CN 1548557A CN A031369812 A CNA031369812 A CN A031369812A CN 03136981 A CN03136981 A CN 03136981A CN 1548557 A CN1548557 A CN 1548557A
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方福德
强伯勤
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陈竺
黄薇
王姮
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SOUTHERN RESEARCH CENTER NATIONAL HUMAN GENE GROUP
Sinogenomax Co Ltd
Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
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SOUTHERN RESEARCH CENTER NATIONAL HUMAN GENE GROUP
Sinogenomax Co Ltd
Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
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Abstract

本发明涉及用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物，更具体地，本发明涉及利用新鉴别的2型糖尿病易感基因SAC的一个单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测2型糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及SAC基因在制备预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。

Description

用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物
技术领域
本发明涉及用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物，更具体地，本发明涉及利用新鉴别的2型糖尿病易感基因SAC(SolubleAdenylyl Cyclase)的一个单核苷酸多态性(SNP)位点设计的预测2型糖尿病易感性的试剂盒和引物。本发明还涉及SAC基因在制备预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
背景技术
大量流行病学资料表明，糖尿病是一种具有明显遗传倾向的复杂的多基因遗传病。遗传因素可明显影响机体对胰岛素的敏感性。最近几年，大多数研究者致力于通过定位克隆法寻找糖尿病相关基因，即寻找患病家系成员间共享的染色体DNA区域间的连锁。已发现2型糖尿病中的一些相对较少见的单基因形式，称为青年晚发型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young，MODY)，是由于突变导致了β细胞功能低下。这些病人通常在青春期到成人早期发病，表现为葡萄糖反应性胰岛素分泌缺陷。这些致病基因中有6个分别编码葡萄糖激酶、转录因子HNF1α、1β、4α及胰岛素启动因子(IPF1)，神经细胞分化蛋白(NeuroD1)。这些基因突变最终导致高血糖血症。这些单基因糖尿病的发病率还不确切，估计占所有2型糖尿病的5％。但是，单纯利用定位克隆的策略来确定多基因遗传病的成功报道还不多。
除了定位克隆法外，目前对多基因遗传病的相关基因进行研究还有一种方法最常用的方法，即候选基因法，即直接研究疾病候选基因的变异与疾病表型之间的关系。该法主要基于对家系或人群的病例-对照关联分析。关联分析不需要大的家系研究而是比较某个或某一套标记在患者和正常个体的分布程度。某种标记如果在患病个体中分布十分明显，那么就可以认为该标记与疾病表型相关联。但是，候选基因法中由于对致病基因所在位置没有足够了解，在选择候选基因上存在较大的盲目性，主要针对与疾病发生发展相关的一些代谢通路进行研究。将上述两种方法相结合的定位候选克隆法在一定程度上弥补了任何单一一种方法的局限性，为目前多基因遗传病研究中所普遍采用的策略。
同遗传病研究策略相对应，其研究工具—多态性标记也从第一代的限制性片段长度多态性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP)，第二代的微卫星标记(Microsatellite Marker)发展到第三代的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)。尤其在对多基因遗传病进行病例-对照关联分析中，需要利用大量高密度的标记物，前两代多态性标记已不能满足这种要求。因此，近年来，SNP作为第三代遗传图谱的构建者已越来越引起人们的广泛关注。
单核苷酸多态性(SNP)主要是指基因组水平上由单核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛分布，平均每500-1000个碱基中就有1个，其总数估计可达300万个甚至更多。近年来，随着人类基因组及遗传学研究的进展，SNP在全面深入地了解个体和群体间基因组的变异或多态性及疾病研究等方面也越来越显示出其重要意义。将SNP用于疾病易感基因定位的一个最大的优点就是它的分布广泛性。其次是它有比微卫星更高的稳定性，可以最大限度地减少遗传过程中由于序列变异所导致的信息遗失。另外，SNP很容易实现高通量的分型，短时间内可以产生大量的结果，这一点是微卫星所无法比拟的。SNP的上述特点决定了它非常适合于进行象糖尿病这样的多基因疾病，尤其是多个微效基因所导致的疾病的定位研究。选择合适的病例和正常对照，采取关联分析的研究方法，对SNP而言，是非常适合的。
本发明人近几年来一直从事中国北方汉族人群2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病，NIDDM)基因定位研究。在先前进行的全基因组扫描工作中，本发明人已经分别鉴定出多个易感基因位点，它们分别位于1号，12号，18号及20号染色体上。其中在1号染色体上共有5个存在易感基因的区域。在此基础上，本发明人尝试从定位区域选择合适的候选基因，利用SNP进行了病例-对照关联分析，最终终于鉴定了一个糖尿病易感基因(即SAC基因)，以及该基因上的一个与中国北方汉族人2型糖尿病特别相关的SNP位点。由此经过深入研究完成了本发明。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种预测2型糖尿病易感性的试剂盒，所述试剂盒包含基于图1B或图1A的序列设计的用于PCR扩增的特异引物以及通过核酸扩增进行检测的试剂盒所含的常规组件。所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18bp-25bp。优选地，所述引物选自SEQ ID NO：1-18组成的一组，更优选地，所述引物为具有SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20所示序列的单碱基延伸(SBE)引物。
根据本发明的另一方面，提供了用于预测2型糖尿病易感性的引物，所述引物为基于图1B或图1A的序列设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图中所示的SNP位点而设计，长度为18bp-21bp。优选地，所述引物选自SEQ ID NO：1-20组成的一组。根据本发明的一个更优选的实施方案，本发明的引物为SEQ ID NO：19，SEQID NO：20所示的单碱基延伸(SBE)引物。
根据本发明的再一方面，提供了SAC基因(可溶性腺苷酸环化酶)作为糖尿病易感基因在制备用于糖尿病诊断的诊断剂中的应用，SAC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
附图说明
图1A示出本发明的SNP位点(R)所在的SAC基因区域的核苷酸序列。
图1B为图1A序列的互补序列
图2A为SACN端部分包含的两个预测的催化结构域。
图2B为本专利保护的SNP所位于的外显子。
具体实施方式
定义：
单核苷酸多态性(SNP)：主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。
微卫星位点：把长度为2-6个核苷酸的串联重复序列(VNTR)称为微卫星(Microsatellite)，微卫星位点有两个最突出的优点：一是它出现频率很高，遍布于整个基因组，而且，由于短序列在进化上不受选择，因而在同一位点上可变重复单位数目变化很大，一个位点可能有多达几十种的等位基因，信息含量高；二是STR两侧的特异性单拷贝序列稳定性高，可作为检测其多态性的PCR引物。以PCR技术操作，可以实现自动化大规模操作
基因分型及等位基因频率分布：同一种群生物中，相同等位基因核苷酸序列顺序分析，在此表示相同SNP位点在不同个体中的组成成分的确定，为基因分型。等位基因频率是指所研究的同一种类等位基因里，所期望出现的等位基因占的比例，也就是出现变化的等位基因的所占比例。
疾病易感性(糖尿病易感性)：人群对疾病容易感受程度。
病例-对照关联分析：是一种由因及果的回顾性研究。它是先按疾病状态确定调查对象，分为病例和对照组，通过比较病例组与对照组间所研究的遗传标志出现频率的差异而获得该标志与疾病间关联的信息。
单碱基延伸(SBE)反应：它是指在缺乏四种dNTP、仅存在四种ddNTP的情况下，测序酶可以在引物的3’端加上一个ddNTP，但因为不能形成磷酸二酯键，故不会继续延伸，碱基延伸一个后即告终止。只需检测这一个碱基即可。又称微测序法(Minisequencing)。
参数连锁分析和非参数连锁分析：根据基因的重组率来计算两个基因之间的染色体图距即连锁分析，用分类变量(离散变量)来进行分析，把测量指标按某一标准归类，计数，然后进行分析为参数分析，用实际测量后的结果进行的分析为非参数连锁分析，
SAC基因编码一个与哺乳动物典型的腺苷酸环化酶不同的腺苷酸环化酶，定位于染色体的1q24。在人类基因组中位于PAC克隆Z97876中。(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝nucleotide&list_uids＝2582745&dopt＝GenBank)。现有技术未披露任何有关SAC基因是一种2型糖尿病易感基因的信息或提示。
cAMP是一个几乎普遍存在的第二信号分子，可以将信号传导到细胞内的cAMP依赖蛋白PKA，GEFs。很久以来，仅仅知道cAMP在哺乳动物中的产生是由激素相关的，跨膜腺苷酸环化酶tmACs的产物。这些环化酶的特征是有12个预测的跨膜结构域，并且对异源三聚体的G蛋白和非生理性的调控因子forskolin敏感。
可溶性腺苷酸环化酶(sAC)是哺乳动物中一类很重要的的腺苷酸环化酶。在分子结构上，生物化学上都与由G蛋白调控的，跨膜的腺苷酸环化酶有显著的区别。SAC没有跨膜结构域，并且对经典的跨膜腺苷酸环化酶tmACs的调节蛋白-G蛋白不敏感。因此，SAC是作为一种在哺乳动物里独立调控的cAMP信号传导系统。在体内和在体外SAC可以直接被碳酸根离子激活纯化的蛋白。SAC在哺乳动物的精子里边是占优势的腺苷酸环化酶的形式。它被碳酸根离子直接激活引发了在受精过程中的获能的过程。免疫定位研究也显示sAC在其他组织中有很丰富的表达，这说明它可能是在体内的一个普遍存在的对HCO2-/CO2的感受器。
从SAC cDNA预测到一个187kDa的蛋白，而从纯化的48kDa蛋白获得的序列表明这个48kDa蛋白是从一个187kDa前体分子通过蛋白的切割获得的。N端部分的SAC包含两个预测的催化结构域(图2A)。
在哺乳动物中，九个不同表达模式的跨膜腺苷酸环化酶，由G蛋白和其他信号分子介导的不同的调控模式，对诸如激素，和神经递质产生应答。一个可溶性的腺苷酸环化酶确定了一个重要的产生cAMP的途径，可能表明第二信使可以在远离膜而在其作用的位置附近产生。可溶性的腺苷酸环看起来是一个单拷贝的基因。这些发现表明全长的和缩短的SAC是通过选择性的剪切得到的。其中11号染色体就是被选择性剪切。本专利保护的SNP就位于这个被剪切的外显子上(图2B)。
2003发表的Sun等人研究发现，SAC在角膜内皮细胞中对CFTR基因有激活作用。CFTR基因的功能改变可以导致包括糖尿病在内的数种疾病。
本课题组的先期工作表明，1、12、18和20号染色体上均存在有中国北方汉族人2型糖尿病的易感基因位点，其中1号染色体上有4个区域(1p36、1p31、1q22及1q42-43)显示与2型糖尿病相连锁(本组前人作出，不需要文献)。如下述实施例所示，进一步对该区域进行的精细扫描结果显示，其中有3个区域(1p36.33-36.23、1q24.3-25.1及1q42.12-42.13)仍存在连锁。
目前有多个公共数据库储存了几百万条SNP信息，人们可以通过多种方式，如以基因名、登记号、染色体号、功能级别等，进行查寻。但是，这些数据库中的SNP绝大多数只是“候选者”，而非经过验证的真正SNP。它们是利用计算机在对多个克隆序列进行比对时发掘出来的，其中必然存在一部分假阳性SNP。另外，这些SNP大多数是利用高加索人和黑人测序寻找的SNP，在中国人群中的分布有些不一定相同，我们利用中国北方汉族人群的糖尿病患者和正常对照，重新测序寻找SNP。并利用我们在中国北方汉族糖尿病人群中发现的高频的SNP进行基因分型。
为寻找2型糖尿病易感基因，本发明人根据美国国家生物信息学(National Center for Biotechnology Information)  中心公布的信息选取位于1p36.23-36.33、1q24.3-25.1及1q42.12-42.13区域的2型糖尿病34个候选基因，对这些基因的外显子，Promotor区2kb，以及临近的内含子的区域进行测序筛查中国北方汉族人群中的SNP。并对其中部分高频的SNP进行基因分型，通过SBE反应(包括直接的SBE反映，SnapshotTM试剂盒，SnupeTM试剂盒)，酶切，序列测定等方法对其在病例组及对照组进行分型及病例-对照关联分析。
如以下实施例所详细讨论的，所选择的80个高频的SNP位点中，SAC基因内选取了11个位点进行基因分型，发现1个位点和糖尿病相关，位于第10号内含子的3，130位置处的一个SNP位点(K，即T/G)，NCBI中的编号是rs203826，其等位基因频率分布在病例组和对照组中的差异有统计学意义(P＜0.05)，提示这一SNP位点与2型糖尿病相关，进一步得出结论，其所在基因SAC基因为中国北方人群2型糖尿病的易感基因。
因此，本发明的一个方面涉及糖尿病易感基因SAC基因在预测糖尿病易感性中的应用。基于SAC基因，可以获得各种诊断剂和试剂盒以用于预测糖尿病易感性。
SAC所在基因组序列如SEQ ID NO：21所示，全长为104,424bp，本发明所揭示的SNP位点(K)位于该序列的38,004-39,443位之间，这一区域的核苷酸序列如图1A所示，图中K为SNP位点，其代表碱基T/G多态性，即该位点可以为T，也可以为G。这一区域的互补序列如图1B所示，图中M代表本发明的SNP位点的互补碱基，其代表碱基A/G。
本发明还涉及用于预测2型糖尿病易感性的引物。优选地，所述引物基于图1B的序列而设计，由此，PCR扩增后的产物测序可以直接测得SNP位点。当然，本发明的引物也可以基于图1A的序列设计，这样PCR扩增后的产物测序得到SNP的互补碱基。优选地，本发明的引物具有SEQ ID NO：1-20所示的序列，特别优选的是SEQ IDNO：19 SEQ ID NO：20所示的SBE引物。下表1举例示出了本发明的引物的一些组合，引物的解链温度(Tm)以及这些组合得到的产物大小。本领域技术人员能够理解，本发明的引物不限于这些列出的引物及其组合。
表1
    SEQ IDNO：             引物序列及Tm   产物大小
    12 有义：tcccagaaagtttccttctca(60.66℃)反义：tctttgcaggatgtgtgactc(60.79℃) 274bp
    13 有义：tcccagaaagtttccttctca(60.66℃)反义：tttgagcaattggtggaatct(61.30℃) 292bp
    14 有义：tcccagaaagtttccttctca(60.66℃)反义：gaatctttgcaggatgtgtga(60.58℃) 277bp
    56 有义：ccataccaaacatgctgaaga(60.44℃)反义：tatcaggtgtctgatctcccc(60.80℃) 315bp
    57 有义：ccataccaaacatgctgaaga(60.44℃)反义：ccagaaaggggtttctctacc(60.76℃) 296bp
    86 有义：acctacccagcaaagggtaat(60.53℃)反义：tatcaggtgtctgatctcccc(60.80℃) 363bp
    82 有义：acctacccagcaaagggtaat(60.53℃)反义：tctttgcaggatgtgtgactc(60.79℃) 413bp
    96 有义：ctacccagcaaagggtaatcc(61.49℃)反义：tatcaggtgtctgatctcccc(60.80℃) 361bp
    102 有义：cctacccagcaaagggtaatc(61.49℃)反义：tctttgcaggatgtgtgactc(60.79℃) 412bp
    92 有义：ctacccagcaaagggtaatcc(60.49℃)反义：tctttgcaggatgtgtgactc(60.79℃) 411bp
    811 有义：acctacccagcaaagggtaat(60.53℃)反义：tgatgcatgtaaagcacttgg(61.55℃) 503bp
    1011 有义：cctacccagcaaagggtaatc(61.49℃)反义：tgatgcatgtaaagcacttgg(61.55℃) 502bp
    911 有义：ctacccagcaaagggtaatcc(61.49℃)反义：tgatgcatgtaaagcacttgg(61.55℃) 501bp
    812 有义：acctacccagcaaagggtaat(60.53℃)反义：gacacatagcatgtgctccaa(61.62℃) 472bp
    1012 有义：cctacccagcaaagggtaatc(60.23℃)反义：gacacatagcatgtgctccaa(59.15℃) 471bp
    1311 有义：gctgcacagttatcattgatgt(59.56℃)反义：tgatgcatgtaaagcacttgg(61.55℃) 581bp
    1411 有义：agctgcacagttatcattgatgt(60.51℃)反义：tgatgcatgtaaagcacttgg(61.55℃) 582bp
    1312 有义：gctgcacagttatcattgatgt(59.56℃)反义：gacacatagcatgtgctccaa(61.62℃)     550bp
    1412 有义：agctgcacagttatcattgatgt(60.51℃)反义：gacacatagcatgtgctccaa(61.62℃) 551bp
    1415 有义：agctgcacagttatcattgatgt(60.51℃)反义：acacatagcatgtgctccaat(59.94℃)     550bp
    1316 有义：gctgcacagttatcattgatgt(59.56℃)反义：acctcgtgatctgcccac(61.68℃)     693bp
    1416 有义：agctgcacagttatcattgatgt(60.51℃)反义：acctcgtgatctgcccac(61.68℃) 694bp
    1317 有义：gctgcacagttatcattgatgt(59.56℃)反义：ctcgtgatctgcccacct(61.82℃) 691bp
    1417 有义：agctgcacagttatcattgatgt(60.51℃)反义：ctcgtgatctgcccacct(61.82℃) 692bp
    1816 有义：tctgcatgttttgttttagttcaa(60.47℃)反义：acctcgtgatctgcccac(61.68℃) 666bp
本发明进一步涉及包含本发明的一或多种引物的试剂盒，该试剂盒用于检测糖尿病的易感性。除了本发明的引物之外，所述试剂盒还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。
以下将参照实施例进一步描述本发明。
实施例1 中国北方汉族人群2型糖尿病易感基因的精细定位
1、2型糖尿病家系的收集
收集中国北方汉族人群中满足以下要求的2型糖尿病家系：
1)家系中连续2代或2代以上出现2型糖尿病患者，每代至少有一个患者、一个正常人。
2)糖尿病患者应是在正规医院确诊的、对胰岛素不敏感者(除外1型糖尿病)。入选的对照个体年龄应在35岁以上(以尽量排除尚未发病的家系成员)。
3)除糖尿病外，不合并其它明显器质性疾病，如高血压、冠心病(除外糖尿病所导致的并发症)等。
在采集家系前应确保所有家系成员都了解采血目的，即有知情权，血样提供人在了解了所有情况后，若同意，要在“知情同意书”上签字，才能实施抽血和其它个人情况的调查。若不同意，则尊重其个人意见。将收集的资料严格保密，不对外公布供血成员的姓名、年龄、疾病等所有资料。
对入选家系的每一个成员，除已明确诊断的2型糖尿病患者外，均应进行口服葡萄糖糖耐量试验(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)，以确认每一个成员是否可作为正常对照。OGTT试验过程：抽取空腹静脉血及口服75g葡萄糖(5分钟内喝完)后30分钟、60分钟、120分钟及180分钟的静脉血，观察血糖浓度的动态变化情况。此外，记录每一个体一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、发病年龄、身高、体重、心率、呼吸、血压、用药情况、有无合并症、以及血脂、血电解质等项目，必要时行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬化等疾病的家系。
2型糖尿病的诊断严格按照WHO于1985年颁发的标准执行。即：空腹血葡萄糖浓度≥7.8mmol/L或餐后2小时血糖≥11.1mmol/L为糖尿病。OGTT的判断标准为：服糖后2小时血葡萄糖浓度＜7.8mmol/L为正常，≥11.1mmol/L为糖尿病，在7.8-11.1mmol/L之间为糖耐量低减(Impaired Glucose Tolerance，IGT)。
共采集到60个符合以上条件的2型糖尿病家系，成员共计367人。其中2型糖尿病患者180例，正常人171例，IGT患者16例。这些家系分别来自北京、山东、河北、内蒙古、河南等地的汉族人群。绘制所有家系的家系图，并对每一家系及家系成员进行编号，此编号同DNA入库号一致。在所收集到的家系中，15％(9/60)为三代家系，85％(51/60)为二代家系。患者中男性为83人，女性为97人；IGT者16人。家系成员平均年龄为50.03岁，其分布情况(分患病和正常)见表2：
         表2  2型糖尿病家系成员年龄构成
    年龄段   病例组   正常组     IGT     总计
    ＜30     10     17     2     29
    31-40     26     45     2     73
    41-50     51     56     7     115
    51-65     42     26     3     70
    ＞65     51     27     2     80
    总计     180     171     16     367
取所有家系每一成员的外周血样备用。
2、PCR扩增微卫星片段、基因分型
常规方法提取上述血样中的基因组DNA，提取后的DNA均溶解于TE缓冲液中，注明样品所属家系、编号等资料，-20℃保存待用。
在以往全基因组扫描阳性区(1p36，1p31，1p12，1q22，1q42-43区，20p12，20q13区，12p12区及18q23区)选择杂合度较高、分布较为均匀的微卫星位点进行第二轮扫描。共选择了60个位点，其中：1号染色体5个阳性区域内34个，平均密度3.2cM；12号染色体4个，平均密度2.2cM；18号染色体4个，平均密度1.9cM；20号染色体上3个区域内18个，平均密度2.6cM。这些微卫星位点的最低杂合度为0.64，最高为0.88，平均值0.748。部分微卫星位点的遗传学位置自http：//www-genome.wi.mit.edu查找所得(在“Human PhysicalMapping Project”栏下)，部分自法国Genethon的人类多态性中心的资料上获得。在所用的60个微卫星位点中，16个在ABI公司Version2.0试剂盒中已有引物，46个需新设计合成引物。新合成的一对引物中的一条用荧光物质FAM或HEX标记。所有引物在合成时综合考量PCR扩增片段长度的大小及可能的合理分组情况来确定荧光标记的颜色。反应所用的引物序列参见法国Genethon遗传图谱的Microsatellite Markers Data Set。各微卫星位点扩增片段长度及引物信息见表3。
                 表3  60个微卫星位点的大小范围与标记荧光
位点名称    片段大小(bp)    标记荧光    位点名称    片段大小(bp)    标记荧光
D1S243      142-170         HEX         D1S2709     191-197         FAM
D1S468      173-191         HEX         D1S2800     195-225         FAM
D1S2845     193-233         FAM         D1S235      175-195         FAM
D1S214      122-152         NED         D1S2850     145-153         FAM
D1S2663     183-205         FAM         D12S1625    264-280         FAM
D1S472      228-244         FAM         D12S77      163-193         FAM
D1S2892     93-129          FAM         D12S336     117-135         NED
D1S2722     195-223         FAM         D12S89      254-288         HEX
D1S463      223-233         HEX         D18S465     233-251         HEX
D1S211      170-198         HEX         D18S61      213-243         NED
D1S2627     265-279         FAM         D18S1125    268-286         FAM
D1S2868     210-224         FAM         D18S488     239-264         HEX
D1S497      250-278         FAM         D20S906     229-247         FAM
D1S206      208-226         NED         D20S842     156-180         HEX
D1S495      138-164         FAM         D20S889     93-129          FAM
D1S2707     137-159         FAM         D20S849     214-236         FAM
D1S2878     152-178         NED         D20S95      82-100          FAM
D1S196      322-338         HEX         D20S892     205-223         FAM
D1S2815     210-237         FAM         D20S115     238-250         NED
D1S218      266-286         NED         D20S851     128-150         FAM
D1S466      155-175         FAM         D20S901     260-268         FAM
D1S2692     187-217         HEX         D20S186     121-143         HEX
D1S245      235-253         FAM         D20S852     152-176         HEX
D1S205      94-112          FAM         D20S112     217-241         FAM
D1S425      336-360         NED         D20S912     267-283         FAM
D1S419      162-194         FAM         D20S857     204-220         FAM
D1S2860     168-184         FAM         D20S840     141-165         FAM
D1S2880     113-135         FAM         D20S120     213-241         FAM
D1S213      107-133         NED         D20S100     213-239         HEX
D1S2833     92-108          FAM         D20S102     169-177         FAM
PCR扩增后，在377电泳仪(ABI公司)上进行电泳，用377电泳图象收集软件(ABI PrismTM 377-96 Collection或ABI PrismTM377XL Collection)收集结果，在GENEHUNTER2.0软件(美国麻省理工学院遗传系编写，从http：//cmag.cit.nih.gov上可自由下载)上运算，计算相关的位点与表型连锁的P值、Z值。结果显示在所研究的10个区域中有3个区域继续显示出与糖尿病连锁的证据，如表4所示：
        表4  3个阳性区域内有意义位点的遗传位置、P值及Z值
位点名称    距p末端距离(cM)    细胞遗传学位置    统计P值    统计Z值
D1S243      0.0                1p36.33           0.00834    1.653
D1S468      6.2                1p36.33           0.0015     2.135
D1S2845     11.1               1p36.32           0.033      1.292
D1S214      16.4               1p36.31           0.0025     2.005
D1S2663     16.9               1p36.23           0.00205    1.996
D1S2815     193.8              1q24.3            0.00126    2.17
D1S218      196.5              1q25.1            0.043      1.2
D1S2800     256.2              1q42.12           0.0128     1.579
D1S235      258.7              1q42.13           0.0547     1.363
从上表可以看出，1p36.33-36.23区有意义(P＜0.05)的阳性位点最多，共有5个，最低的P值为0.0015，Z值2.135，5个位点分布在长达16.9cM的区域内。1q24.3-25.1区有2个位点，1q42.12-42.13区有1个位点满足P＜0.05的标准，另外D1S235的P值虽然略高于0.05，但其Z值已达统计学界值(Z＞1.36)，因此可以认为该位点与糖尿病还是有连锁关系的。这两个区域已分别精细定位至2.7cM(D1S2815-D1S218)和2.5cM(D1S2800-D1S235)的狭窄范围内。引人注目的是在1p36.33-36.23区，连续5个位点都出现了P值小于0.05的情况，因此下一步选择此区域克隆易感基因。
实施例2 糖尿病易感基因SAC的鉴定及该基因内SNP的相关研究
1、中国北方汉族人群2型糖尿病患者及正常对照标本的收集
正常组及2型糖尿病组人群外周血样本均采自北京协和医院内分泌科门诊。标本来源均为我国北方地区，包括北京、山东、河北、内蒙古自治区等地，以北京为主。糖尿病可为散发，也可为糖尿病家系的成员(但此时每一家系中通常只有一个患者入选，同一家系中没有任何血缘关系的成员可以选择一个以上)；正常对照来自正常人群，要求其家庭三代以内没有糖尿病患者(包括I型糖尿病)，对照组与患病组年龄及性别相匹配。
2型糖尿病诊断同实施例1。入选的每个成员记录一般情况，包括性别、出生年月、籍贯、发病年龄、身高、体重、心率、呼吸、血压、用药情况、有无合并症等，对每个成员检查血脂、血电解质等项目，必要时行特殊检查，以排除合并有高血压、心脏病、动脉粥样硬化等疾病。入选的每个成员都应在“知情同意书”上签字。
共采集到325份标本，其中病例组173份，对照组152份。两组在性别、年龄上相匹配，糖尿病患者的平均年龄为51.99岁，正常对照采样时的平均年龄为48.8岁。在所有成员中，男女的比例为169∶156，病例组男性92人，女性81人；对照组男性77人，女性75人。两组成员的年龄分布情况如下：
表5患病组和对照组成员的年龄构成
    年龄段     病例组     对照组
    ＜30     2     4
    30-39     12     18
    40-49     30     54
    50-65     91     62
    ＞65     38     14
    总计     173     152
2、候选基因的确定及候选基因中用于基因分型的SNP位点的选择
基于实施例1的结果，即染色体1p36.33-36.23区域与2型糖尿病相连锁，利用生物信息学方法从NCBI SNP数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)中选出位于这一区域或其附近的34个与葡萄糖代谢相关基因测定基因的promotor区2kb，外显子及其邻近的内含子区，和3’非翻译区。并对其中的124个高频的SNP进行基因分型，所述的34个候选基因如下：
(1)CASPASE-9位于染色体的1p36.3-p36.1，是caspase家族成员的半胱氨酸精氨酸蛋白酶，caspase蛋白的顺序活化在凋亡的执行阶段起到重要的作用。caspase蛋白以无活性的前体蛋白形式存在，通过在保守的精氨酸残基处断裂产生两个亚基，这两个亚基结合成有活性的蛋白酶。
(2)CDC2L2基因编码p34Cdc2蛋白激酶家族成员，位于1p36.3。该激酶家族成员对真核细胞的细胞周期调控起着关键的作用。
(3)磷酸葡萄糖脱氢酶(PGD)是戊糖磷酸旁路途径中的第二个脱氢酶，位于人染色体的1p36.3-p36.13。
(4)PRKCZ是蛋白激酶Cζ成员，位于染色体的1p36.33-p36.2位置。是丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶家族中的ζ成员，它参与数种细胞代谢过程，
(5)SAC基因编码一个与典型的哺乳动物不同的腺苷酸环化酶，位于染色体的1q24。
(6)Urotensin II基因位于染色体1p36，编码一个成熟的多肽具有活性的环12肽，从七腮鳗到人类具有很高的保守性。
(7)GNB1基因位于染色体1p36.33，在信号接受分子和效应分子之间传递信号，由三个不同的亚基组成，这个基因编码beta亚基。
(8)GPR52基因位于染色体1q24，G蛋白耦联的受体家族成员。
(9)氨氯吡咪敏感性钠离子通道δ亚基(dNaCh，SCNN1D)基因：位于1p36.32区NT_002209中，编码产物属非电压敏感型通道蛋白，可被利尿剂氨氯吡咪抑制，介导腔内电离子的扩散，以异源四聚体的形式存在于膜上。
(10)乙酰CoA硫酯水解酶(HBACH)基因：位于1p36.23区NT_002530中。编码产物属乙酰辅酶家族成员之一，可水解棕榈酸CoA的CoA硫酯及其它长链脂肪酸。
(11)Urotensin II：位于1p36.23区NT_002530中。目前对其蛋白功能所知甚少，但已知其保守性很高。一个G蛋白偶联受体GPR14可作为其受体。
(12)DJ-1(RNA结合蛋白调节亚基)：位于1p36.23区NT_002163中。
(13)5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因：位于1p36.21区AL354994克隆中。5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶参与叶酸代谢，是同型半胱氨酸叶酸依赖的再甲基化过程的关键酶，以同源二聚体形式发挥催化活性，受S-腺苷蛋氨酸别构调节。
(14)氯离子通道B(CLCNKB)基因：位于1p36.13区bA254I4.00143(长47068bp，属unfinished sequence)中，编码电压门控型氯离子通道蛋白B型，主要在肾中表达，它和A型有94％的同源性。氯离子通道可参与调节细胞体积、膜电位稳定性、信号传导及跨上皮转运等。
(15)TNFSF4位于染色体的1q25，编码一个肿瘤坏死因子受体超家族的个体。
(16)TNFSF6位于染色体的1q23，编码一个肿瘤坏死因子受体超家族的个体。
(17)SLC19A2位于染色体的1q23.3，编码维生素b1的转运蛋白，属于叶酸转运超家族的成员。
(18)CDC42BPA又叫做PK428，位于染色体1q42.11，和肌强直性营养不良相关的蛋白激酶相似，丝氨酸，苏氨酸蛋白激酶，和cAMP依赖的蛋白激酶相似。
(20)KCNK1位于染色体的1q42-q43，这个基因编码一个钾离子通道蛋白超家族的成员，包含有2个形成孔蛋白的p结构域，这个基因的产物看起来不是一个功能性的通道，他需要其他的蛋白的参与才具有活性。
(21)ATP2B4位于染色体的1q25-q32，这个基因编码一个质膜钙离子泵。
(22)CACYBP位于染色体的1q24-q25，这个基因编码一个钙结合蛋白的结合蛋白，这个蛋白的结合的作用还不清楚。
(23)氯离子通道A(CLCNKA)基因，位于1p36.13区bA254I4.00143(长47068bp，属unfinished sequence)中，编码电压门控型氯离子通道蛋白A型，主要在肾中表达。
(24)ENO1位于染色体的1p36.3-p36.2，这个基因编码哺乳动物中的3个烯醇化酶异构酶中的一个，它编码一个alpha烯醇化酶，一个同源二聚体可溶性酶。
(25)DFFA位于染色体的1p36.3-p36.2，这个基因编码一个DNA片段化因子DFF，这个是个异源二倍体蛋白包括DFFB和DFFA两个亚基。
(26)G蛋白伽马4蛋白(GNG4)，是异源三聚体的G蛋白复合体中的一个组分，三聚体蛋白从G蛋白耦联的受体产道信号到细胞内的效应器。
(27)ICMT异戊基半胱氨酸羰基甲基转移酶，位于染色体的1p36.21，这个基因编码一个翻译后修饰蛋白的转移酶。
(28)RE2是G蛋白耦联的受体，位于染色体的1q23.2，这个基因是视紫质家族的G蛋白耦联受体，协助调控攻击和进食。
(29)PKLR是肝脏丙酮酸激酶的L型的糖分解酶，位于染色体的1q23.2，将磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸，并且生成ATP。
(30)ALPL是一种非组织特异性的碱性磷酸酶，位于染色体的1p36.1-p34，在肝脏，骨骼，肾脏都有分布。准确的生理功能现在未知。
(31)PLA2G2D是磷酸酯酶A2，IID组，位于染色体的1p36.12，优先水化磷脂的sn-2酯键，也许在感染的过程中有重要的功能。
(32)CA14是羰基脱水酶家族中的一个，位于染色体的1q21，催化二氧化碳的可逆性水化，参与数种不同的生理过程。
(33)CA6是羰基脱水酶家族中的一个，位于染色体的1p36.2，催化二氧化碳的可逆性水化，主要在唾液腺里边发现。
(34)PANK4是泛酸酯激酶家族的成员，位于染色体的1p36.23，在细菌和哺乳动物中催化辅酶A的生物合成。并受到辅酶A的反馈调节。
所选择的用于基因分型的80个SNP位点如表6所示。
基因名称 片断名 位点 位置 Snp类型 位点功能     Pvalue
 等位基因频率
    CDC2L2 L11N1     SNP1     Intron11     A/G     Intron     0.181
    SNP2     Intron11     T/C     Intron     0.942
    SNP3     Intron12     T/C     Intron     0.158
    SNP4     Intron12     T/C     Intron     0.746
  L13N1     SNP1     Intron17     A/G     Intron     0.331
    SNP2     Exon18     C/T     Intron     0.234
    SNP3     Exon18     C/T     Intron     0.217
    SNP4     Exon18     C/T     Intron     0.280
    SNP5     Exon18     A/G     Intron     0.670
  L5N1     SNP1     Exon4     T/C     Tyr→Arg     0.493
SNP2     Splicingsite A/G     Splicingsite 0.421
  L6N1  DELETION     Intron5     A/     Deletion     0.269
L9N1     SNP1     Splicingsite A/G     Splicingsite 0.024
    SNP2     Intron9     C/G     Intron     0.035
    SNP3     Intron9     A/T     Intron     0.112
    GNG4   L3N1     SNP1     Intron1     G/A     Intron     0.477
    SNP2     Intron1     C/A     Intron     0.865
    SNP3     Intron1     G/A     Intron     0.606
    SNP4     Intron1     G/C     Intron     1.000
    SNP5     Exon2     G/A     Ala→Ala     0.863
    PGD   L13N2     SNP1     Exon12     G/A     Ser→Ser     0.073
SNP2 Intron10 G/A     Splicingsite 0.021
    SNP3   Intron     G/C     Intron     0.539
  L1N2     SNP1   Promotor     A/T     Intron     0.496
    SNP2   Promotor     C/T     Intron     0.226
    SNP3   Promotor     A/G     Intron     0.247
   SAC L1N2     SNP1   Intron12     A/C     Intron     0.017
    SNP2   Intron12     C/T     Intron     0.137
    SNP3   Intron12     G/C     Intron     0.011
    SNP4   Intron12     A/T     Intron     0.034
  L6N1     SNP1   Intron16     A/G     Intron     0.126
    SNP2   Exon17     C/T     Phe→Ser     0.832
    SNP3   Exon17     G/A     Val→Ile     0.739
  L10N2     SNP1   Exon11     T/C     Gly→Gly     0.003
  L26N1     SNP1   Intron28     A/C     Intron     0.202
L17N1     SNP1   Intron18     G/A     Intron     0.243
    SNP2   Intron18     C/T     Intron     0.595
   ALPL   L8N1     SNP1   Exon7     T/C     Tyr→His     0.685
L9N1     SNP1   Intron8     C/T     Intron     0.474
    SNP2   Intron8     G/T     Intron     0.360
    SNP3   Intron8     G/A     Intron     0.254
    SNP4   Intron8     C/T     Intron     0.528
   CASP9 L3N1     SNP1   Intron2     A/T     Intron     0.878
    SNP2   Intron2     C/T     Intron     0.829
  L2N4     SNP3   Intron1     G/T     Intron     0.358
  L8N1     SNP4   Intron7     G/A     Intron     0.386
  L9N1     SNP5   Exon8     T/C     Phe→Phe     0.256
  L4N1     SNP6   Intron8     A/G     Intron     0.795
  L2N4     SNP7   Intron1     A/C     Intron     0.014
SCNN1D   L1N1     SNP1   Exon13     A/G     Arg→Gly     0.741
  L1N3     SNP2   Intron10     C/T     Intron     0.157
INSRR   L7N4     SNP1   Intron13     G/A     Intron     0.106
  L1N2     SNP2   Promotor     G/T     Intron     0.437
   KCNJ9   L4N4     SNP1   Exon3     C/T     Intron     0.280
ATP2B4 L13N1     SNP1   Exon12     C/T     Asn→Asn     0.513
    SNP2   Intron11     C/T     Intron     0.749
  L17N1     SNP1   Intron16     C/T     Intron     0.387
  L6N1     SNP1   Intron5     C/T     Intron     0.979
PK428 L4N1     SNP1   Intron4     C/T     Intron     0.171
    SNP2   Intron5     C/T     Intron     0.065
   TNFSF6   L3N1     SNP1   Promotor     C/T     Intron     0.104
   CACYBP   L6N2     SNP1   3’UTR     C/T     Intron     0.600
   SLC19A2   L1N1     SNP1   Promotor     A/G     Intron     0.943
   MTHFR L6N3     SNP1   Intron4     A/C     Intron     0.399
    SNP1   Exon6     A/C     Glu→Ala     0.595
L4N1     SNP1   Intron3     A/G  Intron     0.979
    SNP2   Intron2     C/T  Intron     0.570
PANK4   L4N2     SNP1   Intron3     C/T  Intron     0.304
  L1N1     SNP1   Promotor     C/T  Intron     0.487
L9N1     SNP1   Exon13     C/T  Val→Ala     0.063
    SNP2   Intron13     A/G  Intron     0.537
  L8N2     SNP1   Intron12     C/T  Intron     0.962
  L11N3     SNP1   Exon18     A/G  Gln→Arg     0.609
  CA6   L3N1     SNP1   Exon1     C/T  Intron     0.656
  L3N1     SNP2   Exon2     C/T  Thr→Met     0.971
  L3N1     SNP3   Exon2     A/C  Met→Leu     0.780
  L3N1     SNP4   Exon2     G/C  Gly→Ala     0.957
  L3N1     SNP5   Exon2     G/C  Gly→Gly     0.641
  L5N1     SNP1   Exon4     A/G  Gly→Ser     0.501
  L9N1     SNP1   Exon7     C/T  Asn→Asn     0.641
3、SNP位点基因分型分析
主要采用3种方法进行SNP的分型：长度多重性单碱基延伸(LengthMultiplexed-Single Base Extension，LM-SBE)反应，SnaPshot法，限制性片段长度多态性(Restrictive Fragment Length Polymorphism，RFLP-PCR)及测序分型。
1).LM-SBE反应进行SNP分型
1.1)引物设计与合成：针对上述23个SNP位点中的每一个SNP位点设计3条引物，其中的2条为PCR引物，用于扩增包含SNP位点的一段序列，另外一条是SBE引物，用于单碱基延伸反应。PCR引物通过Primer 3.0程序在线设计，扩增片段长度为150～300bp。
SBE引物设计原则：引物要位于SNP位点的5′端，其3′端的最后一个碱基恰好是与SNP紧邻的前一个碱基。引物长度在18～46base之间，Tm值在55～80℃之间。预备同组的几个位点为不同类型交替出现，其长度相差4个(或其倍数)碱基，且它们之间不能形成发卡结构，较长的SBE引物不能形成回折等二级结构。参照文献(Lindhlad-Toh K，Winchester E，Daly MJ，et al.Lange-scale discoveryand genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse.Nat.Genet..2000，24：381-386)。
另外，设计用作分子量大小标准的FAM标记的DNA片段，其大小分别为：19bp、23bp、27bp、31bp、35bp、39bp、43bp、47bp，所有序列均为AT重复而成。
1.2)PCR反应及产物鉴定：将不同类型及不同SBE引物长度的多个SNP位点(一般为3-5个)组合为一组，先进行多重PCR扩增包含SNP位点的相应数目DNA片段。反应体系5μl，各组分如下：
名称         原液浓度      加样量(μl)      体系终浓度
Mg2+        25mM          0.6              3mM
缓冲液       10×                      0.5              1×
dNTP         2mM           0.075            30nM
引物         10μM         0.05×n          各0.1μM
AmpliGold    5U/μl        0.05             0.05U/l
模板         50ng/μl      1                5ng/μl
ddH2O                     补齐至5μl
采用Touch-down PCR，其程序如下：94℃、12分钟后，进行15个循环的94℃ 30秒、63℃ 30秒(每一循环温度下降0.5℃)、72℃50秒，随后24个循环的94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 50秒，最后72℃10分钟两次。反应结束后用1％琼脂糖电泳鉴定，在UV灯下观察有无产物，并在紫外凝胶成像仪拍照，记录时间、位点名称、样品号等。
1.3)PCR产物纯化：PCR反应后体系中残存的dNTP及没有参与反应的单链引物会影响下一步的SBE反应，故用作SBE反应模板的PCR产物需要清除这两者。虾碱性磷酸酶(Shrimp AlkalinePhosphatase，SAP)可以将dNTP 5′端的磷酸基团去除，使之不能形成磷酸二酯键，从而不能参与DNA链的延伸；核酸外切酶I(Exonuclease I，ExoI)可从单链DNA的3′端到5′端方向逐个降解核苷酸，从而避免PCR反应剩余的引物影响下一步的SBE反应。
在每5μl PCR产物中加入2μl酶混合液，其中含SAP 0.5U/μl，Exo I 1U/μl，混匀，置入37℃水浴箱消化1小时，取出后离心，85℃ 15min灭活SAP及Exo I，用作SBE反应模板。
1.4)LM-SBE反应：由于体系中只有荧光标记的ddNTP(本实验中分别为JOE-ddATP，FAM-ddGTP，TAMRA-ddCTP，ROX-ddUTP)，使用对荧光标记ddNTP掺入率比较高的热测序酶(ThermoSequenase)来进行反应，可使每个SBE引物在反应中仅延伸一个碱基即告终止。尽管扩增只是线性增长的，但40个循环后，在ddNTP足量的情况下，其总量也达到了模板的40倍，足以进行检测。
反应体系为5μl，各组分如下：
名称                 原液浓度      加样量(μl)      体系终浓度
Mg2+                25mM          0.5              2.5mM
缓冲液               10×                      0.5              1×
JOE-ddATP            0.12μM       0.1              2.4nM
FAM-ddGTP            0.12μM       0.1              2.4nM
TAMRA-ddCTP          0.12μM       0.1              2.4nM
ROX-ddUTP            0.60μM       0.1              12nM
SBE引物              2μM          0.05×n          40nM
Theromo Sequenase    10U/μl       0.025            0.05U/μl
模板                               1
ddH2O                             补齐至5μl
反应程序为：95℃、3分钟后，进行40个循环的95℃ 30秒、50℃ 30秒、60℃ 40秒，最后60℃2分钟。
1.5)电泳：SBE产物1μl与上样缓冲液等比例混合，在377测序仪上进行电泳。加样时可分别于电泳时及加样后30分钟2次加样，在加样孔的两端分别各加一个孔的大小标准。电泳结束后通过观察SBE产物电泳位置并与大小标准比较，即可判断是哪一个位点。
1.6)基因型判定及数据整理：根据条带颜色判定SNP基因型，蓝色为G/G，绿色为A/A，黄色为C/C，红色T/T，蓝/绿色为A/G，黄/红色为C/T。将各位点分型结果整理为Excel格式以进行统计处理。
2)SnaPshotTM进行基因分型：
SnaPshotTM是PE公司基于单碱基延伸(SBE)的原理开发的基因分型的试剂盒，多重引物特异性延伸用于多个SNP位点同时做基因分型，必须在ABI3700测序仪上运行。
2.1)需要分型的SNP位点，一般把7～8个位点放入同一个体系中，引物的3’末端必须设计在SNP位点的上游或下游的邻近位点，规则同普通的PCR反应。各引物的Tm值最好接近，不能低于50℃；
2.2)在引物前加上适当长度的polyT，使各个位点之间至少相差4bp，并尽可能使邻近的两个位点没有重合的碱基，(例如3个位点依次是C/T，A/G，C/T)；
2.3)分别用常规方法PCR含有各SNP位点的DNA片段，标定浓度后等量混合、纯化；
2.4)将各个SNP位点的延伸引物等量混合并稀释到分别为0.5μM。将SNaPshot反应混合物2μl、引物混合物2μl和纯化后的PCR产物混合物1μl混匀，96℃ 10s，50℃ 5s，60℃30s，30个循环进行引物特异性延伸。反应产物中加入9倍体积的70％乙醇，常温下静置20分钟，4℃4000转离心45分钟，弃上清，再加入9倍体积的70％乙醇，静置20分钟，同样条件离心，弃上清，1300转倒置离心。空20分钟，4℃4000转离心45分钟，弃上清，再加入9倍体积的70％乙醇，静置20分钟，同样条件离心，弃上清，1300转倒置离心。空气中晾干30分钟，加入6μl双蒸水。
2.5)SNaPshot上样和判读：每孔加甲酰胺(Hi-Di Formamide)9μl，长度标记0.2μl，SNaPshot反应产物3μl，95℃变性5分钟，冷却后在在ABI PRISM 3700 DNA测序仪上进行毛细管电泳，运行Genescan 3.7进行数据分析，Genotyper3.7输出各样本各位点的基因型。
3)RFLP-PCR进行SNP分型：对于改变酶切位点的SNP，可先进行PCR扩增，扩增产物用相应的内切酶消化，电泳后根据条带位置判定基因型。完全酶切或不能被酶切的为两种不同的纯合型，不完全酶切的为杂合型。
4)测序分型：对于不适合用以上两种方法分型或分型结果不理想的位点进行测序分型。
以上各SNP位点的分型均先在96个随机选取的正常对照个体中进行。
在病例组和对照组中，上述80个分型的SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡。经SPSS统计软件10.0版(免费下载于http：//linkage.rockefeller.edu/soft/)分析，有1个SNP位点位于sAC基因的第11号外显子的第16位，在NCBI的SNP数据库中的编号是(rs203826)，等位基因频率分布在两组中差异有统计学意义(P＜0.05)，如表7所示。
表7病例组与对照组SNP分型SPSS统计分析结果
                             等位基因
SNP                   C      T      A      G      总计      P值
rs203826    病例组    383           103           486       0.016
            对照组    267           45            312
            总计                                  798
位于SAC基因的XL1N2片断中的1个SNP位点rs203826的等位基因频率在病例组和对照组存在显著差异，因此提示这一位点与2型糖尿病相关。进而提示SAC基因为一种新的糖尿病易感基因。
SAC的基因组序列如SEQ ID NO：17所示，全长为104,424bp，所揭示的SNP位点(Y)位于该基因的38,004-39,443位之间，这一区域的核苷酸序列如图1A所示，图中K为SNP位点，其代表碱基G/T多态性，即该位点可以为G，也可以为T。这一区域的互补序列如图1B所示，图中M代表所述SNP位点的互补碱基，其代表碱基A/C。
基于这一SNP位点，可以设计适当长度的引物，用于经PCR扩增而预测糖尿病易感性。
实施例3 预测糖尿病易感性引物的设计及糖尿病易感性的预测
1.SBE引物
引物要位于SNP位点的5’端，其3’端的最后一个碱基恰好是与SNP紧邻的前一个碱基。该引物有一条。长度为18-46个碱基之间。要避免含有过多的G+C，Tm值在50～65℃之间。由于SNP位点中转换型较多，因此应避免连续几个出现相同的序列类型(如连续几个C/T型)，如遇到准备放入同一个组的几个位点都是C/T型时，可以将其中的数个从反链设计，即变为A/G型，最好是C/T与A/G间隔出现。另外预备同组的几个位点之间不能有发卡等形成，较长的SBE引物不能形成回折等二级结构。根据以上原则设计的一个引物为：5’TTT TGG CGT TTG CGA CCC 3’(SEQ ID NO：19)，或者5’CTA ACA AGA GTCTATC CCC TGA CTC A 3’(SEQ ID NO：20)。其为该链的同序引物，即与其互补链结合。以此SBE引物对待测个体基因组DNA进行SBE反应检测SNP位点的序列。
2、普通PCR扩增引物
根据SNP位点所在的序列(图1A和1B)，设计如SEQ ID NO：1-21所示的引物。如表1所示进行各种组合。以所述组合为引物，以得自待测个体血样的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行测序检测所述SNP位点的单核苷酸多态性。
                         SEQUENCE LISTING
<110>中国医学科学院基础医学研究所
     北京诺赛基因组研究中心有限公司
     国家人类基因组南方研究中心
     中国医学科学院北京协和医院
<120>用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒及引物
<130>I20030512CB
<160>21
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tcccagaaag tttccttctc a                                               21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tctttgcagg atgtgtgact c                                               21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tttgagcaat tggtggaatc t                                               21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gaatctttgc aggatgtgtg a                                               21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccataccaaa catgctgaag a                                               21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tatcaggtgt ctgatctccc c                                               21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccagaaaggg gtttctctac c                                               21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
acctacccag caaagggtaa t                                               21
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ctacccagca aagggtaatc c                                               21
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
cctacccagc aaagggtaat c                                               21
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tgatgcatgt aaagcacttg g                                               21
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
gacacatagc atgtgctcca a                                               21
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
gctgcacagt tatcattgat gt                                              22
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
agctgcacag ttatcattga tgt                                             23
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
acacatagca tgtgctccaa t                                               21
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
acctcgtgat ctgcccac                                                   18
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
ctcgtgatct gcccacct                                                   18
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
tctgcatgtt ttgttttagt tcaa                                            24
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
ttttggcgtt tgcgaccc                                                   18
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
ctaacaagag tctatcccct gactca                                          26
<210>21
<211>104424
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>21
gacagacatg gcgcttcagc tgtcttcaga ataatgtcac ccggcctcct ctcctgtctt     60
ctgcagtctt aaaagaccta gtccctaact gaggtctggc ttttcctcag ccctggatga    120
agtggaggta tgtggaagta agagtctcag cagaaagatt gattgcagag ctgaagatga    180
gggcgaccgt caggaaagaa gacagctatt gcagaggagt gggaagcctg gggctagaag    240
tcagggttca agtttgtgta tacctctgtg tcagtccctt acatgagctt agaagcttga    300
aggcttaaat attgcctcac cttctcaacc tggatgctct gtctttctag cttactttct    360
ttatttgcct cttttctgca gtttctcacg tgatatcctc ctttttatca gtcaacaact    420
accaagtgcc tacctcttga agggggctct ggcaaggtgc tgtggagtaa acaaagatat    480
gtagaagatg gttccaaacg gggagcttac aattcagatg aagacaaaat agaagcaatt    540
caaaagataa tcaaggatat ttgtatggga aataagccac ttaagtgtag acattaagag    600
ccacaatagc tcagaagaaa aattaccatg gctagagtag gcaagcaagc tttcatgaca    660
ggtaacactg tgcctttaag ttcagagtat ctccctcttt ggactcgtga aacctgactt    720
tacatgtagg tgaaaagttg aatataaaat ctattaggaa attctagagg agagatttag    780
agaaactgat gaatataatc gaaccctaat ttctcttttc atttttgggt actactgagt    840
tttctttact cacactccgc attcaggaat ccttcttggt ttatctttcg ggcctcattc    900
gcctgcttgc cttttgactc aggtatcctc atttctcatt ccaaggtgct tccgcgcttt    960
gtcagtaccc atgctgttca tgctgtattc ttgatgtgat agaattggct gaacagttga   1020
taagggtacc atcaacatgc attgaaagtg ctcttaaatt aaacctacat cttttgtcta   1080
ggtcatatac atccccaaag tgctataaag cgtatacaaa tgggatatag catgatatag   1140
tagaaacaac agggactttc aagtcccaca gacctggata ttccagcttt ataacccaga   1200
gcaagttaat acctctgtgc ttcagttttc atatctatag aaatcaggtc tacttcatag   1260
cgctgtttgg atgattaaat gaggcaacct atgtagaatt gatacggctc cgatgagtgg   1320
aggaacacca aggttcttag tcctcatccc ggtttagata aaacgacaca gacacatgtg   1380
gagtgatttt aaggatcgga gagtttaata ggcaagaagg aagaggaaag agggaagaag   1440
ctcccccata cagagacaga gggagggggg ctccaaagcc gagagaggga acccccagtg   1500
gggtggacgt cagctaggta tatattacag acgctggagg aggcagtgtc tgatttgcat   1560
agggttcagg ggattggttt gaccaggcat gtcattcaca aagcccttga aaaagctagc   1620
cctctcaccc tagcctttta atatgcaaat gcagggtgcc atgatgttct acacacgtgg   1680
gagtatgtgg aggtggccat gttgccagga acatgtgggg caagggaaag aaggcctccg   1740
gaatcgccat gttgggtggg ccctgtttct aatggccttc atttgcttat caaaggttgc   1800
cggcctggct ctaagagcca aggctttaca agaaattttc tggagatgct ttaaaaaatg   1860
aaaatttccc aaggacccct tttcctctct atctgcctaa aataatttct taataactcc   1920
tacaatagaa tgcttcacat aaaaaggtca taataaatta taattacaat gtggtatgtg   1980
cctgtagaaa ggtaaataca gctatcacta atcattttgt gatgttgcag aacttaaagc   2040
agaaaactat atcttcaaaa atagaaaatt tctattgtct tttatgggtg ttcataagaa   2100
actcccagat atttatttta gatctccctg ccttttaaac ctatcatttt cttcttttag   2160
tttcacatct acatatgcca tcttaatctc aaaatgcatg tactttcctt gtttggtcat   2220
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ctccaatgcc ataaagaaat agcacttgaa cataaattta tttagtaagg gcatttttac   2400
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ggagagggaa gaatagagct acgccctgct cagttctgct cagtcctatc ttagttctct   3360
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ctcaaggaga aggtagggaa gttgttcttt gattgcaggg tcccacatta caccttgcat   3600
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gaggtcccca aagaaacagt tcctggccct tttaagggct tagagctgtg aggggttcca   4080
cgtgaaaggg tcataataga ttgagatctg tagatagcac atgtggttag aatgggggtt   4140
aatcttttaa cctcagacct ggtcatcagt ggcgccggct ggtcttgcca ctgacttcat   4200
tcctgtgttt ttcagctttt acttcctctt tctcttcaga gacaagagac agtaagagaa   4260
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aaaataagtg ttggctgaga tatgtagcaa ctgaactgtc ataccttgcc tgagggagtg   4380
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aatctttcgg cttccctggg gcacaattgg aagaggaaga atcatcttgg gccacacata   4500
aaataatact aacaataatg atagctgatg agctaagaaa aaaaaatcac aaaaaaatct   4560
cataatgttt taagaaagtt tacaaatttg tgttgggctg cattcaaagc catcctggac   4620
cgcatgtggc ccacaggaca tagcttggac aagcctgtac taaagtttaa catgtgtata   4680
ccctatgacc cagcaattcc actcctgtgt atatacccag gagaaatgca tacatctttt   4740
caccaaaaca catgaataag aatgttctta gcaccattat tcataatggt ctaaaagtgg   4800
gaacaaccca caggtcaata gtatagtgga taaatgtttt gtggtatatt ccatcaggtg   4860
atggaatact atatagcatt gaaaatgaac aattattgat atacaacaac atggatgaat   4920
atcacaaaca caaaatatgt agtatgattt catttatata aagtttgaaa actggcaaag   4980
gtgatctatg ttgttagaaa taagaaaggt taccttcagg gaaaagagaa gggtagtgac   5040
ttgaaggtgg catgagaaaa acttctggaa agctggtaat gttttccttc ttgctatgaa   5100
tgggtattac acggatttgc tcaccttaga gtaattcaag ctatacactt atgatttgta   5160
cattttccta catgtatgtt atgcttcaat aaaagttttt taaaagatag cactaatttg   5220
cagtaaatct agttttttag cacctcgtgc ttatgcattt gattttgtta aaaactctaa   5280
acacagcact ttgcacttat tcttttgaaa tttcattatt ttggttgatt aagatgtatt   5340
aaaatcctag ctctgtcatc agtgcattag ttctctcact atattttcaa attttatttt   5400
ccctcagctt tattaaggca aaaatgacaa aaagtgtaca tatttatggt gtacaatgtg   5460
atgttttaat atatgtatac attatgaaat aattaaatca aggtaattaa cgtatcatct   5520
cacatactta acatttttgt gtggtgagaa cagttaagat ctactctctt agccattttg   5580
aagtatataa tactttatta actgtattca ccttgctcta ggttagatct ccaggacttt   5640
ttcattgggt ctaattgaaa ctttgtatcc ttcagccacc aacatctcat tccacccacc   5700
caaccccagc ctcaggcatc accattctac tctgcttcta tgattttgac ttttttagat   5760
tccatatata agtgagatcg ttcaatattt ttgtctttct gtggccggct tatttcactt   5820
aacataaggc cctccaggtt catccacact atcatacaag aaagaatttc cttctgtttt   5880
acggctgaat agtactccat tgtatacatt atccaatgtt ttctttatcc attcatatgt   5940
tgatgaacaa ttaggttggt tccatatctt ggctattgtg aatagtgctg aaataaacat   6000
gggagtgcag ggatactgat ttcaattcct ttgggtatat acccagatgt gggattgtta   6060
gatcatatgg tagttctatt tttaattttt taggaacctg catattattt tccataatgg   6120
ccgtactttc aattatatct ttatcaaagt cttctatcgt gcccatggag gcttacctct   6180
gagttgacac cagaatacta atcaatttcc attaggtgtg attgctaacc agccaattat   6240
attttcttta ttcctataat tttgtatatt ttactcacaa ggatatgaga aatttggcca   6300
aatgccttaa agtcaatata tacattgtct atagcagtct cttgatttaa aagtttaata   6360
actcttccaa aataggaaat aatgttggct tgctcttggc tctgaatcca tttgactcct   6420
tttaatcacc tcttgctaat ctaaataacc attgaggctg ctcccaaata ttccaactct   6480
ctttcctatt gtgcacatgg taggagtgca cttccctgtc tacttgaaac taggcatggt   6540
catgtaattt gctttggtca atgccatgag taaaagtgaa atacgtcact tctgggagta   6600
gaatgagtat actccactac atcctctttc ccactacctt gacaaccaga atattccagt   6660
ttgggtccca aagtgaaggc aaaaacagag gagaacccca tacaacccac aagggacatg   6720
tagtgtgagc aagaaatgaa caagaaataa gcctttgtta tttcaagcca ttgagatttc   6780
aaagttattt gataatgaaa cataacctgt attatctcaa caaatacatt atgtttactg   6840
gtctgtgttt tctgggatcc atgagtagcc tcatcttttg aaattcaaaa gagaatgtgc   6900
ccatctatgg tattccagcc catctcttgt tctccatggt tttttgagat tactgacatt   6960
acacctgtca gttctttcag tatctgtaga tatatgttgt ctgggactag ctagaattta   7020
tttaaaatga ctgtgtgctt tagcactact tatcttggat ttcaattctt tcttagcaat   7080
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agttaagcat gtagctatta tggtcatacc cttaaggaag gagatgaatg ctaaggttct  92940
aaaatgggtc agaacagaac attcattaaa ttatttccat gactatcccc aagactgaaa  93000
atcgccccct attattttat ttcctatctt aattatatgc aaccgtatgg tctatcagag  93060
gtttgtgatg agactaaatg acaatatgaa gacattccta tataaaatgc tacaagttag  93120
aacagctcca aattggaata gaaatccacc ccttccttct ttctgagaca gtcttgctgt  93180
gtcacccagg ttggagtccc gtggtgcgat cgcggatcac tgcagcctcg ccttcccagg  93240
ctcaagtgat cctcccaaac acctcagctt cctgagtagc tggagttgca ggcacatacc  93300
accacgcctg gctaatttta atcttttgta gagatgggat gtcgtgatgt tgcccaggct  93360
ggtctccaac tcctgggctc aggtcccgtc tacctcagcc ttcccaaatg ctgggattac  93420
aggcatgagc cactgcacct ggcaagaaat cccctcttat tattaaaatt aatgaggaga  93480
aattaaaatc caaaaattga ttactcttgc caattaaagt tcaaaatcaa ataacttacc  93540
aatgtgagtt aaaggttaag gaatctaaag tccagaaatc atccaaattt atttttcttg  93600
tctatctcag caggagaatt ttttaaacag ctgtgtccta ggccaatgct gctcagactt  93660
tagtgggcat aaaaatcacc tggagggcag tcggccagct ctcggggtgc tgagccaggc  93720
gggctaggcg aggcgcgggc tggccccgcc cctctggccg gccccgcccc tcaaggccgg  93780
ctagtcccct tcccagagac ttggctaggc ggccggcgct gcggcgccag cagccctgtg  93840
gtggcgacga cgatggacca ggacccagtg ggccctgtgg aacgaggaga agccgtcgca  93900
gcctcgggag ctgcggccgc cgcggcattc ggggaatctg cggggcagga aattaaggga  93960
tccaaaaagc tgagtcatgg tccaaaagga aacgttgatg tcaggacaac catagccaaa  94020
ttttatctca aggatgagta acgaaagagg ctttgaaacg tagaactggg agtcatagga  94080
aaaaagaaga aagtcccaag gagagtcatc cactttgtta gtggcaaaac aatggaagaa  94140
tacagcacag atgaagatga agttgatggc ctggagaaga tgttttgcct actgttgatc  94200
cgatttggct ttaaatattt ggctattaga aaatcatgcc gggcgcggtg gctgacacct  94260
gtaatcccag cactttggga ggccgaggcc ggcagatcac ctgaggtcgg gagttcaaga  94320
ccagcctgac caacatggag aaaccccatc tctactaaaa atacaaaaaa attagccagg  94380
catggtggcg catgcctgta aacccagcta cctgggaggc tgaggcagga gaattgtttg  94440
aacccaggag gcgaaggttg cggtgagcca agatcgcgcc attgcactcc agcctgggca  94500
acaagagcaa aacttgggtc tcaaaaaata aaaaaaaata aaaaataaaa aaatcataag  94560
caggccagga gcagtggctc acgcctgtaa tcgcagcact ttgggaggct gaggtgggtg  94620
gatcacctga ggtcaggagt tcgagaccag cctggccaat atggtgaaac cgtgtctcta  94680
ctaaaaatat aaaaaattag gcaggcgtga tggcaggcgc ctgtaatccc agcgaggcag  94740
gagaattgct tcaaccaggg aagcagaggt tgcagtgggc tgagatcgtg ccattgtact  94800
ccagcctggt caacaagggt gaaactccat ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaatcggatt  94860
ttctacacag aaaatattca aaggattgta ccatatactc tgaaggtagt tccaaatgca  94920
ggtagaatat taaagaggta tttcatgcaa tgtaagaatt gttggaataa atgtcttatt  94980
tttaattact ttgaagggtt aaaaaaaaaa tcacctggag agcttgttaa ctcagagatg  95040
ccacaccccc agagcctgtc tgattcagta gacctggact gaaccagaga acctgcatta  95100
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cctaaatcat ctctctttgg tattggaaca atttcttcaa gccccagaat ccacagctcc  95220
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ataatttcac tgggtaaaga attctaggga tttttttcct gtcaacaggt catggcactg  97440
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ttacagcttt ttcattcctc atttcctgaa ctagtgtctt attttgcatt taatttttca 100080
tagtggaaca tttaagttct ttccccattt tcttttgtat atattctata gctattttcc 100140
ttatggttac catgaggatt acatttagca tcctaaagtt aacttcagta atgcacaaag 100200
aactccactc ctttaatagc ttcccacccc tttcagttgt tgatgtcaca gaattacatt 100260
tttgtacatt atatgcccca aaacataaat gaataattat tttaaatgat cagtctcttc 100320
aattatgtag aaaacaaact gtggagttac aacccaaagt tacaatacta ctagcttttg 100380
ggctactaaa ttttaaaaac gtattaatct cttaaaaacg tagaaaacaa aacaagttac 100440
aaactgttat tacaataaca cttaattgtc catgtattta cctttgttga gatctttatt 100500
tcttcttaga gctttgactg tcctttcatt ttaccctaca gggctccttt aggtatttct 100560
tgtctttctt tcttttcttt tctttctttt ttttaaggcg tgggcatttt ttggaagaaa 100620
gtcctggtgg taattaactt tgtttttgat tgtctgggaa tgtcttaatt tctcccttat 100680
cttcgaagga cgcttttgct gaatagaaga ctcttggttg acgggttttt ttttgttttt 100740
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ctgctcatga tcttattgaa gatgtcttgt atgtgattag ttgcttctct cactgctttc 100860
aagttttgtg tctttcactt ttcaaaagtg attatatttg tctcagtgtg tatctcttta 100920
agtttatctt acttggagtt tgttgagctt cttggatgtt tatattcatg tcttttatca 100980
aatttggaaa gtttttaacc attatttctt caaatattct ttctagtcct ttctctctct 101040
cttcttcttc agggacttcc acaatgcatt tattggttca cttcttggtg ttccacaagt 101100
cccttaggct ctgttaactt ttcttcaatc ttttttcttt ctgttcatca gactcaataa 101160
tttccattgt cttatcttca agtctgctcc ctgtttaatt ctgcctttga atccctctag 101220
tgattttttt aaattttagt tattgcagtt ttcacctcca gaatttcttt ttggtatatt 101280
tttaggtttt ctgtcacttt actgttattt ccattatttt catacatcaa ttacttgact 101340
ttatccacat tttcctttag ttctttgatt atctttagag ttgtttaaaa atctttgtgt 101400
aggatatctg ccattaggtc tttttcaggg acagtttctc ttgatatttt ttcccccttg 101460
ggatgagcca tgctttcctg tttcttggta tgcctttttg ttgttattat tggaaactag 101520
acctttgaat ctaataatat cacagctctg gatatcaaat tctccctctt ccccagggtt 101580
ttctgggttt tgttgttgtt tttgtttttt attgttgtag gctgtctcta tgccaaggat 101640
cagcctgagg tgcaaactta aggtcttccc agatcttttc tgagcctgtg cctttcccta 101700
aggcatgcac agtcactttc taattttcct tttataggca gttgcttttg aatgtcctag 101760
tatttaatgt ctggctgtca aggtggtgga gggtgggtgg agaaaaaaat aaagttgggg 101820
gaggaaaggg caatagccct ttaaatccac tggaagtcac ttcaactgga gtgggagggg 101880
cttgcaatga cggggagagg tgcaacaatg actgcctacc tcttccatca gaagcagcaa 101940
ttggtgatca gagcacagat ccctgatatc tcagacaggg tcctttttgc ccacccttgt 102000
tcccacaagt tgtacgcagg ttcttcagga gcatgtgcac aacaactgtc tgccacaggt 102060
tttgaggctg ggggacaggc agctgtgcta agagctgaaa ctgaaattaa cctcagttta 102120
ccatccaagc cttcctctgg tatttacaag ccttcagtag actccagagt tctaaaatag 102180
ttacattctg acagattctg ccagtgtaat gatagtctag gtggggctac agatagttgg 102240
tacttcctac tctgccgtct ctccagaatc ctcttctccc tagagttttt aactcccaga 102300
ccggtccagt ctgagtttct agcaattcat caattacagt tcaggttttt ctagcctggc 102360
actggttccc acagtggttt ccacttgtga gtctccatct gtttgtctct ccagtcttag 102420
gggcagcagt ttgccctgtg ttctcacttc tcttatggat ccaagaatag ttgttgatct 102480
tccagtctgt tcagctttat ttatttattt atttttgaga tggagtctca ctctgtcaca 102540
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gattctcctg cctcagcctc ctgagtagct gggactacag gcgtgcacga ccatgcctgg 102660
ctaatttttg tatttttagt agagacggag tttcaccatg ttggccagga tggtcttgat 102720
ctcttgacct tgtgatccac ccacctcggc ctcccaaagt gctgggatta taggcatgag 102780
ccactgcgcc cagcctgttc agctttttac ttgtttctag gaccaagtgg ttatttccaa 102840
gctccttaca tgcagaaatg gccaattttt tttcctaatt tttcaacaat taacttgtac 102900
tgccttaata atcataataa tcaaaataat tttttaaaaa aagttattgc agagaagtaa 102960
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catttattgt cttatctcca atacctactg tgtatgtctc tataatgtat tttctcactt 103080
gattgcttaa atccttgaaa tgttcccaaa tcatctgtga aggaaataac ttacagtcaa 103140
ggacccctgt ttaattctaa tatactgttg tgggtttttt ttctttagaa cttggagaat 103200
ctggtggctc aaaataccac tggccctgtc ttttgcccaa ggctctacca cctgatggct 103260
tacgtctgta tattaatggg agatgggcag aaatgtggcc tcttcctgaa cacagccttg 103320
cggctctctg aaacacaggg gaatatactg gagaaatgct ggctgaacat gaacaaagta 103380
tgtatcatca gctagcaaac cggggtggcg atgctcaccc atataaagaa gcccagaagc 103440
ctactgcctg gttaggtttc accaggctgc cattaacaaa atatcttaga ctgggtcatt 103500
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acatgtcaaa aggatggaaa aagaaaattt gctccctcca gcccttttat gagggcagag 103680
ccctcatgac ctaattacct tccaaaggcc caactcttaa taccattacc ttgggggtta 103740
attttcaaca tatgaatttc aggagatgcc aacattcaga ccatagcagt caccataggc 103800
ctttctggat tcttaccaga aagggtgaca tgtccatagt tcaggattgt gagcttcctc 103860
ttccccttta agttctcatg gtctctctcc ctcatccaaa tcccccttag catgccctct 103920
ctctgccctt ctttgtggcc actttccact ttgtgttaca tctgtctgcg tgtctttcct 103980
ctccttgaga atgtgaactc tttgaaagca aaaaccacac ttagtgccta gcacagagcc 104040
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gggctgtgtc agtatcctag tttggacagc aagattcgtt tttgtctatg ggttcacatg 104160
gtttttacca aagatgtttt gccttgtttg atattggact aaccttgatt acaaaagtca 104220
agaagcacta atgatttctt tgttctgttt ctttcctctc aggaatcatg gtactcaacc 104280
tctgagttaa aagaagacca atggcttcag acgatcttga gtctcccatc atgggaaaaa 104340
attgtagcag gcagggtaaa cattcaggat cttcaaaaaa acaaattcct gatgagagct 104400
aataccgtgg acaatcattt ctaa                                        104424

Claims (5)

1、用于预测2型糖尿病易感性的引物，所述引物为基于图1B或图1A的序列而设计的用于PCR扩增的特异引物，所述引物针对图中所示的SNP位点R而设计，长度为18-46个核苷酸。
2、如权利要求1所述的引物，其包含选自SEQ ID NO：1-20组成的一组的一种序列。
3、如权利要求2所述的引物，其为具有SEQ ID NO：19 SEQ IDNO：20所示的序列的单碱基延伸引物。
4、用于预测2型糖尿病易感性的试剂盒，其包含如权利要求1-3任一项所述的引物。
5、SAC基因在制备用于预测2型糖尿病易感性的诊断剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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