CN1548456A - 肝脏特异的与肝癌分化和进展相关的基因和蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种肝脏特异的与肝癌分化、进展相关的新蛋白和编码该种蛋白质的基因，尤其是基因HCC－C11及其3个剪切变异体，并进一步公开了这种新蛋白和新基因在原发性肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

Description

肝脏特异的与肝癌分化和进展相关的基因和蛋白

技术领域

本发明涉及一种肝脏特异的与肝癌分化、进展相关的新蛋白和编码该种蛋白的基因，尤其涉及基因HCC-C11及其3个剪切变异体，并进一步涉及这种蛋白和基因在原发性肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

背景技术

原发性肝细胞癌是人类原发性肝癌中最常见的一种类型，也是全世界最常发生的恶性肿瘤之一，尤其在东南亚及非洲，它的发病率更高。除了极高的发病率外，肝细胞癌还以高恶性度和高死亡率著称，如果不进行治疗，从诊断到死亡的预期寿命约是6个月，5年存活率小于3％；若单纯行手术治疗，小肝癌的五年存活率为62.7％，大肝癌的仅为37.1％。就中国而言，每年约有110,000人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人数的四分之一。这种高死亡率，主要是由于早期肝癌缺乏特异临床症状，导致大部分患者就诊迟，而又缺乏有效治疗手段及术后易复发所致。发病率高、恶性度高、诊断迟、治疗方法少、预后差，是肝癌的几大特点。尽管国内外科研人员都对肝癌进行了多方面的研究，但目前肝癌发生发展的分子机理还不太清楚，对肝癌的治疗也主要是采取手术治疗及局部或全身化疗，少数病人辅以肿瘤生物疗法，但术后生存期仍不尽人意。为此，对肝癌发生发展机理的研究成为当前的迫切要求，希望籍此早日阐明肝癌发生发展的分子基础，并找到特异的分子标志，或与肝癌发生发展密切相关的分子，以便随访高危人群，有效预防、早日诊断、综合治疗、减少复发。

以前的研究表明，肝癌的发生是一个多阶段、多步骤的过程，这一过程中伴随着机体许多的细胞学、遗传学的改变，出现多种基因表达异常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因灭活，激发异常的信号转导通路，导致细胞周期及细胞凋亡异常，从而使得细胞恶性转化，并随着各种分子异常的累积，肿瘤出现进展、转移。此外，肝癌在分子水平的改变是异质性的，可能存在多个基因，多个途径交叠作用。所以，明确这些差异表达的基因，对于肝癌发生发展机制的阐明和对肝癌的临床诊断、治疗都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝脏特异的与肝癌分化、进展相关的蛋白质和编码这种蛋白质的新基因，并进一步提供了这种蛋白质和基因在原发性肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种肝脏特异的与肝癌分化、进展相关的蛋白质HCC-C11，它具有图4A中的氨基酸序列。进一步涉及包含上述蛋白质的融合蛋白。

本发明的另一个方面，提供了一种编码上述蛋白质的基因序列。优选该基因序列为HCC-C11基因或HCC-C11基因的剪切变异体；HCC-C11的剪切变异体优选为基因HCC-C11_V1，基因HCC-C11_V2或基因HCC-C11_V3。

本发明还提供了所述的蛋白质在肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

本发明又提供了一种所述的基因在肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

本发明表明，我们克隆出的新基因HCC-C11及其剪切变异体是一个肝脏特异表达的与肝癌组织分化及进展相关的基因，对于它的功能的研究，将有助于肝癌发生发展机理的阐明。目前对于肝癌的术后诊断，主要依赖于肿瘤的大小、转移的远近及组织学检查。但由于肿瘤细胞的侵袭、转移在早期是一个微观的过程，仅凭目前的检查手段及临床观察，对于肿瘤的临床分期，难于做出精确的诊断。并且由于肿瘤的异质性，即便是组织学上相同的肝癌，它们之间的遗传学改变也可能明显不同。HCC-C11及其剪切变异体mRNA表达与肝癌组织分化和进展的关系，可望作为肝癌的临床分期及组织分化诊断的分子标志，从而精确诊断肝癌的分期及组织分化，指导肝癌手术后的相应辅助治疗。HCC-C11及其剪切变异体基因组织表达的特异性，以及在中低分化肝癌及中晚期肝癌中的低表达，可视为肝脏特异的抑癌基因，并且这四种基因编码同样的蛋白质HCC-C11，这些基因和蛋白都可能为将来发展肝癌的肝脏特异的治疗提供一个较好的靶点。晚期肝癌中的HCC-C11及其剪切变异体mRNA的低表达及不表达，也可作为肝癌预后判断的一个指标。

附图说明

图1A为HCC-C11的5’RACE

其中泳道MK为DNA分子量标准；泳道1为用下游外侧引物C11RTA与上游引物UPM扩增的RACE-PCR产物；泳道2为用下游内侧引物C11-4与上游引物UPM扩增的RACE-PCR产物。箭头所指为每个PCR反应中的扩增条带。

图1B为HCC-C11的5’RACE和3’RACE

其中泳道MK为DNA分子量标准；泳道1为5’RACE用下游引物C11-8与上游引物AUAP进行巢式RACE-PCR的产物；泳道2为3’RACE用上游外侧引物C11S与下游引物UPM扩增的第一轮RACE-PCR的产物；泳道3为3’RACE用上游内侧引物C11-1与下游引物UPM扩增的巢式PCR的产物。箭头所指为每个PCR反应中的扩增条带。

图2A为HCC-C11基因及其变异体全长的PCR扩增

其中泳道MK为DNA分子量标准；泳道1为HCC-C11基因及其变异体全长的PCR扩增产物。

图2B为HCC-C11基因及其变异体Northern blot验证图

其中所用肝癌标本为最初用于消减杂交的早期高分化肝癌，每个泳道上样40μg总RNA，Ca指示此泳道上样的为肝癌组织的RNA，Adj指示此泳道上样的为癌旁组织的RNA。用G3PDH杂交做为上样对照。

图3为HCC-C11基因及其变异体的基因结构图

其中方框代表外显子，方框内的数字为外显子的编号，每个外显子的大小见方框上的指示。

图4A为HCC-C11基因的核苷酸序列及其编码的HCC-C11蛋白的氨基酸序列。

图4B为HCC-C11_v1基因的核苷酸序列。

图4C为HCC-C11_v2基因的核苷酸序列。

图4D为HCC-C11_v3基因的核苷酸序列。

图5A为HCC-C11 mRNA在16种正常组织中的表达

其中Po(positive control)：阳性对照；He(heart)：心脏；Br(brain)：脑；Pl(placenta)：胎盘；Lu(lung)：肺；Li(liver)：肝脏；Sk(skeletal muscle)：骨骼肌；Ki(kidney)：肾脏；Pa(pancreas)胰腺；Sp(spleen)：脾脏；Th(thymus)：胸腺；Pr(prostate)：前列腺；Te(testis)：睾丸；Ov(ovary)：卵巢；In(intestine)：小肠；Co(colon)：结肠；Le(leucocytes)：白细胞；Ne(negative control)：阴性对照。

图5B为HCC-C11 mRNA在6种肝癌细胞系、胎肝、胆囊中的表达

其中Po(positive control)：阳性对照；7701：QGY7701细胞系；7702：QGY7702细胞系；7703：QGY7703细胞系；7721：SMMC7721细胞系；HLE；Hep2G；FL(fetal liver)：胎肝；GB(gall bladder)：胆囊。

图6A为HCC-C11基因及其3个剪切变异体的mRNA在5对人原发性肝癌中的表达

其中T代表模板为来自于癌组织标本(tumorous tissue)的cDNA，N代表模板为来自于癌旁组织标本(non-tumorous tissue)的cDNA；数字编号代表标本来自不同病例，编号相同的T和N代表标本来自于同一个病例。

图6B为HCC-C11基因及其3个剪切变异体的mRNA在10份肝硬化组织中的表达

其中C代表模板为来自肝硬化组织标本(cirrhotic liver tissue)的cDNA，数字编号代表标本来自不同病例。

图6C为HCC-C11基因及其3个剪切变异体的mRNA在9份正常肝及1份睾丸组织中的表达。

其中L代表模板为来自正常肝组织(liver tissue)标本的cDNA，数字编号代表不同标本。Te代表模板为来自正常睾丸组织(testis tissue)的cDNA。

其中图6A-6C中的G3PDH作为参照基因，检测每份标本的质量以及实验体系和结果的可信度。

图7为HCC-C11基因的原位杂交图(40×)

其中A为早期中分化肝癌的癌组织用反义探针杂交的结果。

B为肝癌细胞系BEL7402细胞用反义探针杂交的结果。

C为早期中分化肝癌的癌旁组织用反义探针杂交的结果。

D为癌旁组织用正义探针杂交的对照。图7中黑色的信号为阳性信号。图8重组pET32(a)-C11融合蛋白的诱导表达结果

其中泳道1为蛋白分子量标准。

泳道2为空pET32(a)载体诱导后4小时的菌体裂解物。箭头所指示的条带为pET32(a)载体表达的硫氧还原蛋白(Thioredoxin，trxA)。

泳道3-7为pET32(a)-C11融合蛋白的对照及不同时间的诱导产物。其中泳道3为重组质粒诱导前，即0小时的表达产物作为对照。泳道4为不诱导下重组质粒的表达产物作为对照。

泳道5为重组质粒诱导4小时的表达情况。泳道6为重组质粒诱导6小时的表达情况。泳道7为重组质粒诱导10小时的表达情况。箭头所指示trxA-C11融合蛋白。

具体实施方式

实施例1.HCC-C11基因及3个剪切变异体的克隆过程

(1)肝癌中差异表达cDNA片断C11的发现

寻找癌与癌旁组织中差异表达的基因，目前已经成为了解细胞恶性表型的分子基础的一个重要手段。近年来发展了多种筛选差异表达基因的方法，包括差异显示PCR，消减杂交，代表性差异显示(representational differenceanalysis)，Microarray等，各有其优缺点。抑制消减杂交技术(suppressionsubtractive hybridization，SSH)是一个敏感性高，能够筛选低丰度基因的有效方法，它通过两轮杂交，两轮抑制PCR，有效平衡高丰度和低丰度的基因，从而使低丰度的差异表达基因得以克隆，并可能发现组织特异的一些基因。自SSH问世以来，国内外科研人员已利用此技术在生命科学的多个领域克隆了许多基因。

为了筛选原发性肝细胞癌中差异表达的基因，我们利用Clontech公司的SSH试剂盒(PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit)，选取了一例早期高分化肝癌标本作为材料，采用抑制消减杂交技术，以肝癌组织作为检测者(tester)，相应的癌旁组织作为驱赶者(driver)，进行了抑制消减杂交。

首先按TRIzol试剂盒(Gibco公司)的操作说明提取肝癌及癌旁组织总RNA：1)组织匀浆：在液氮浴中把组织标本研磨为粉状，加入适量TRIzol试剂(50-100mg组织加入1ml TRIzol)，继续研磨至匀浆液清亮为止，分装1ml每管(1.5ml eppendorf)室温孵育5分钟。2)抽提：每管加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，剧烈震荡15秒，室温孵育2-3分钟，4ε，12,000g离心15分钟。3)RNA沉淀：吸取上清至新管(每1ml TRIzol约有600μl上清)，加入等体积异丙醇(约1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇)，上下颠倒混匀。室温孵育10分钟(为最大量沉淀RNA，-20ε沉淀2小时以上)。4ε，12,000g离心15分钟。4)RNA洗涤：弃上清，每管用1ml 75％乙醇洗涤沉淀，4ε，7500g离心5分钟。5)RNA溶解：空气干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量的DEPC处理过的超纯水溶解沉淀。紫外分光光度计测定样品的OD260和OD280值，甲醛变性凝胶电泳检测RNA质量(28S和18SrRNA的比例)。

采用Promega公司PolyATract mRNA分离试剂盒(Promega，Madison，WI)分离mRNA，其基本原理是用带有亲和素的磁珠在磁场的作用下贴壁于管壁的同时，可与生物素化的oligo(dT)结合，通过oligo(dT)与mRNA3’端的PolyA尾互补杂交使mRNA得到分离纯化。操作流程如下：1)探针退火：在一个1.5ml的无RNA酶的eppendorf管中，用无RNA酶的水把1mg总RNA稀释至500μl。将此eppendorf管置于65℃水浴中10分钟。在管中加入3μl生物素化的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC，轻轻混匀，室温孵育直至冷却。此过程约需10分钟，在此期间准备下列液体。2)准备液体：0.5×SSC 1.2ml：在一个1.5ml的无RNA酶的eppendorf管中加入1.170ml无RNA酶的水和30μl的20×SSC，混匀；0.1×SSC 1.4ml：在一个1.5ml的无RNA酶的eppendorf管中加入1.393ml无RNA酶的水和7μl的20×SSC，混匀。3)洗涤链亲和素结合的磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles(SA-PMPs))：冲悬SA-PMPs，用手指轻弹eppendorf管直至磁珠完全悬浮，用磁架收获磁珠(约30秒)；吸出上清，注意勿搅动磁珠；用0.5×SSC洗涤磁珠3次，每次300μl，用磁架收获及弃上清；用100μl的0.1×SSC悬浮磁珠。4)Oligo(dT)-mRNA杂交体的捕获及洗涤：将退火的Oligo(dT)-mRNA加入到有洗涤过的磁珠的管中；室温孵育10分钟，每1-2分钟轻轻混匀一下；用磁架收获磁珠，弃上清；用0.1×SSC洗涤磁珠3次，每次300μl，最后一次洗涤后，尽量弃除上清，勿搅动磁珠。5)mRNA的洗脱：用100μl无RNA酶的水悬浮磁珠，用手指轻弹混匀；用磁架收获磁珠，将上清(mRNA)吸到一个无RNA酶的管中；用150μl无RNA酶的水重复洗脱一次。紫外分光光度检测mRNA的浓度和纯度。

SSH操作流程按试剂盒说明，以2μlmRNA合成cDNA第一链及第二链，继而用RsaI酶消化双链cDNA，酚/氯仿抽提纯化cDNA片断，tester cDNA分为两份，分别与两种接头(adaptor)于16℃连接过夜，取1μl连接产物稀释于200μl水中，检测连接效率。将连接有不同接头的tester双链DNA各1.5μl分别与1.5μl driver双链DNA及1μl 4×杂交液98℃变性1.5分钟，68℃杂交8小时。然后混合两份杂交样品及过量的新鲜变性的driver，68℃杂交16小时。杂交结束后加入200μl稀释液稀释后作为模板，进行两轮PCR扩增(引物PCR Primer 1：5’CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C  3’；Nested PCR Primer1：5’TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG T 3’；NestedPCR Primer 2R：5’AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT 3’)，第一次PCR循环参数为：75℃5分钟，30循环：94℃30秒，66℃30秒，72℃1.5分钟。将第一轮PCR产物1∶10稀释后，取1μl作模板进行巢式PCR(nested PCR)：15循环：94℃10秒，68℃30秒，72℃1.5分钟。各取第一、二次PCR产物8μl用2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。用试剂盒提供的G3PDH(glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase，甘油醛3-磷酸脱氢酶)5’及3’引物按试剂盒说明检测消减杂交效率。

将第二轮PCR产物按常规方法克隆入pGEM-T Easy vector，转化入感受态E.coli TOP10F’菌，构成消减文库，随机挑选47个克隆，提取质粒后用EcoRI酶切，或用SP6，T7引物扩增鉴定插入片断大小，结果显示大部分克隆的大小不同。

为了筛选真正的差异表达基因，采用Reverse northern blot筛选克隆。稀释由消减文库提取的质粒，取2ng质粒作模板，用SP6，T7引物进行PCR扩增30循环，电泳检测扩增产物后，取5μl产物稀释至100μl体积，加入100μl 0.6M NaOH变性PCR产物，通过BIO-RAD点杂交加样器点样于尼龙膜上，每孔加样相当于2μl PCR产物(80μl变性产物)，平行点两张膜。采用3份肝癌及癌旁组织总RNA分别混合后提取mRNA，取2μg用AdvantageRT-for-PCR试剂盒(Clontech)逆转录合成地高辛标记的cDNA探针，检测探针质量后进行杂交。杂交条件为含50％去离子甲酰胺的标准杂交液，42℃水浴杂交18小时，杂交后用2×SSC，0.1％SDS室温洗膜2次，每次1 5分钟，再用0.1×SSC，0.1％SDS 68℃洗膜两次，每次30分钟，随后用CSPD(Rhoche公司)进行检测。杂交信号用Bio-Rad Quantity one软件扫描分析。结合反向Northern blot筛选，得到多个差异表达的基因，选取有明显差异的片断，送上海基康公司测序，所得结果用Blast软件与GenBank中的核酸序列进行同源比对，多数为已知基因。C11为肝癌组织中高表达的cDNA片断，长为289bp，仅有同源的EST(expressed sequence tag，表达序列标签)片断，无已知基因。

(2)HCC-C11及其3个剪切变异体全长基因的克隆

为了得到C11的全长基因，根据其同源EST设计引物，采用SMARTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech.Palo Alto，CA)进行5’RACE和3’RACE(rapid amplification of cDNA ends，cDNA末端的快速扩增)扩增基因的5’和3’末端。对于5’RACE，先利用下游外测引物C11RTA(5’GGC AAC TGATCC AGG GTC ACC 3’)和上游引物UPM(Universal Primer Mix，试剂盒提供，5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3′)进行扩增，PCR条件为94℃2分钟，35循环：94℃30秒，68℃30秒，72℃2分钟。扩增结果得到明显的3条带(480bp，800bp，980bp)。利用下游内侧引物C11-4(5’GCT TGT TAGCCT GAT GTG CAG 3’)和上游引物UPM进行扩增，PCR条件同上，得到相应减小的片断(见图1A)，将此片断凝胶回收后连接入pGEM-T Easy vector，测序，C11向5’端延伸了66bp，命名为HCC-C11，同时得到两个剪切变异体HCC-C11_v1和HCC-C11_v2。

对于3’RACE，先利用上游外测引物C11S(5’AGC AGG AAT GAG CTCTCC GAC 3’)和下游引物UPM进行PCR扩增，得到明显的4条带：500bp，700bp，750bp，和1.0kb，再用上游内侧引物C11-1(5’AGA TAG AGG CCCTGG AGC TGG 3’)和下游引物UPM进行PCR扩增(两轮PCR的参数同5’RACE)，得到单一一条片断，大小约350bp(见图1b)，测序后见有明显的加尾信号和多聚腺苷酸尾巴，证实HCC-C11基因的3’末端已经获得。

因无明显的编码蛋白质的开放读码框架存在，推测基因HCC-C11的5’端未到头，但利用SMART^TMRACE cDNA Amplification Kit做了多次5’RACE均未使得5’端向前延伸，故采用了另外一种5’RACE系统(Invitrogen，SanDiego，CA)，先用1μg mRNA，以C11-2(5’CAC TTG CTG TTC ATG CCC TCCG3’)为引物，用ThermoScript^TM Reverse Transcriptase(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD，USA)，60℃60分钟合成cDNA第一链，用QIAqicknucleotide removel kit(Qiagen)纯化后，按Invitrogen 5’RACE系统说明加尾，先用上游引物Abridged anchor primer(5′-GGC CAC GCG TCG ACT AGTACG GGI IGG GII GGG IIG-3)′和下游引物C11-6  (5’CAG AGA CCT CTGATC ACC ACC 3’)进行PCR扩增，未见明显条带。然后再用下游巢式引物C11-8(5’GAG CCC TCT TAT CCT CTA TGG 3’)和上游引物AUAP(Abridged Universal Amplification Primer，5’GGC CAC GCG TCG ACT AGTAC 3’)进行PCR扩增，反应体系加入10％DMSO(二甲基亚砜)。两轮PCR的参数相同，94℃2分钟，35循环：94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分钟。巢式PCR后得到一条150bp大小的片断，连接入pGEM-T Easy vector，测序，HCC-C11基因再向5’端延伸了98bp(见图1b)。至此，已经得到628bp大小的片断，定位于基因组序列AC018992。

根据Northern blot的结果，HCC-C11基因的转录本大小约为840bp，考虑缺失的5’端可能就在AC018992上已克隆出来的序列的5’端，故在上游相应位置设计了上游引物C11gsp1(5’CGC TAATGG ATG GTG AGG CAC 3’)，并在基因的3’端设计了下游引物C11gsp2(5’GAC TTT AAT AAG GAT TTA ATC TTTATG 3’)。以1μg mRNA为模板，以oligo(dT)为引物，用ThermoScript^TMReverse Transcriptase在60℃，反应60分钟，逆转录合成cDNA第一链。以1μl此cDNA为模板，以C11gsp1为上游引物，C11gsp2为下游引物，反应体系中加入10％二甲基亚砜(V/V)，反应条件如下：94℃变性2分钟；35循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟。PCR结果得到4条明显的扩增带，大小与预计相符合(见图2A)。四条扩增带的大小为：HCC-C11为790bp，HCC-C11_v1为1129bp，HCC-C11_v2为1318bp，HCC-C11_v3为1543bp。将得到的片断克隆、测序，cDNA序列长度与Northern blot的结果一致，并含有预测的蛋白编码序列。

至此，克隆到了C11及其3个剪切变异体的全长，将全长基因命名为HCC-C11基因(GenBank Number：AY211906)，同时克隆到了它的3个剪切变异体HCC-C11_v1基因(GenBank Number：AY211907)，HCC-C11_v2基因(GenBank Number：AY211908)，HCC-C11_v3基因(GenBank Number：AY225521)。

(3)Northern blot检测和验证转录本的大小

为检测和验证HCC-C11基因及其变异体的转录本的大小，采用了Northernblot方法。本方法是一个比较经典的方法，其原理是将细胞或组织的总RNA或mRNA电泳，转到尼龙膜上，用待检测基因特异的探针与膜进行杂交，再经过严格的洗膜条件，通过酶联抗体及酶底物显色，使特异的杂交信号显于膜上。根据杂交条带的位置，参照RNA marker或28S，18S RNA，计算出待测基因的大小。杂交信号的强弱显示基因表达的丰度的高低。

用于Northern blot的DNA探针位于HCC-C11基因的494-790核苷酸的位置，用上游引物C11-1及下游引物C11gsp2从3’RACE质粒中扩增、纯化cDNA片断，用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II(BoehringerMannhein，Germany)标记。采用建消减文库的肝癌标本的总RNA为样品，40μg来自癌组织及癌旁组织的总RNA分别上样于含1％琼脂糖的甲醛凝胶，Ca指示此泳道上样的为肝癌组织的RNA，Adj指示此泳道上样的为癌旁组织的RNA，用G3PDH杂交做为上样对照。电泳后转印到尼龙膜上，80℃干烤2小时，先在含50％甲酰胺的标准杂交液(50％甲酰胺，5×SSC，0.1％N-lauroylsarcosine(w/v)(十二烷基肌氨酸钠)0.02％SDS，2％封闭试剂，100μg/ml剪切的鲑鱼精DNA)中42℃杂交3小时，然后在含地高辛标记的cDNA探针的标准杂交液中，42℃杂交18小时。洗膜条件为(1)：在2×SSC，0.5％SDS的液体中，室温洗膜2次，每次30分钟。(2)：在1×SSC，0.1％SDS的液体中，65℃洗膜2次，每次30分钟。在高严谨的条件下洗膜后，用CSPD试剂，化学发光法检测膜上的信号(x光片曝光时间为6-12小时)。杂交结果显示，癌组织中检测到两个转录本，大小为840bp(相当于HCC-C11)和1350bp(相当于HCC-C11_v2)，以前者为主。癌旁组织中检测到一个转录本，为840bp(相当于HCC-C11)。癌和癌旁中其它剪切变异体未检测到为表达丰度低所致。同样制备G3PDH深针和杂交作为参照，在癌组织和癌旁组织中都检测到预计的信号。以上实验，证实了HCC-C11及HCC-C11_v2转录本的大小(见图2B)。

实施例2.基因分析

根据生物信息学分析，HCC-C11基因定位于人基因的8号染色体上，具体位置为8q24.2。HCC-C11由2个外显子组成，HCC-C11_v1由3个外显子组成，HCC-C11_v2由2个外显子组成，HCC-C11_v3仅由1个外显子组成，它们的第一个及最后一个外显子相同(见图3，所示的基因大小为实验中PCR扩增出来的大小，不包含Poly(A)尾巴)。图3显示HCC-C11基因及其变异体利用了不同的外显子。HCC-C11利用的是1、5外显子；HCC-C11_v1利用的1、3、5外显子；HCC-C11_v2利用的是1、3、4、5外显子；HCC-C11_v3利用的是1、2、3、4、5外显子。四个转录本共用第1个和第5个外显子。预测的开放读码框架位于第1个外显子，mRNA加尾信号位于第5外显子，因此HCC-C11基因及其3个变异体编码的蛋白序列相同，加尾信号也完全相同。HCC-C11及其3个变异体的转录本大小分别为807bp，1146bp，1335bp，1560bp(包含Poly(A)尾巴)，它们的最长开放阅读框架相同，均为234bp，编码77个氨基酸。图4A为HCC-C11基因的核苷酸序列及其演绎的氨基酸序列，在氨基酸序列中，潜在的糖基化位点用加方框表示，磷酸化位点加圆圈表示；图4B为HCC-C11_v1的核苷酸序列，cDNA全长为1146bp，开放读码框架与HCC-C11完全相同；图4C为HCC-C11_v2的核苷酸序列，cDNA全长为1335bp，开放读码框架与HCC-C11完全相同；图4D为HCC-C11_v3的核苷酸序列，cDNA全长为1560bp，开放读码框架与HCC-C11完全相同；其中图4A-4D的核苷酸序列中带下划线的核苷酸序列为加尾信号，加边框表示的ATG为预测的蛋白翻译起始密码，TAA为预测的翻译终止密码。

实施例3.HCC-C11及其3个剪切变异体的mRNA的组织分布

用RT-PCR方法检测了HCC-C11 mRNA在人的17种正常组织(心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨胳肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、白细胞、胆囊)，6种肝癌细胞系(QGY7701、QGY7702、QGY7703、SMMC7721、HLE、HepG2)及胎肝中的分布，结果显示HCC-C11mRNA在正常肝中强表达，在睾丸中弱表达，在所检测的肝癌细胞系中均不表达，是一个肝脏特异表达的基因。(见图5A和图5B)。所用引物为：上游引物C11-1B(5’TAC TGA GAT AGA GGC CCT GGA G 3’)，下游引物C11RTA(5’GGC AAC TGATCC AGG GTC ACC 3’)，用PE9700 PCR仪进行扩增，PCR反应条件如下：94℃变性2分钟；30循环：94℃变性15秒；68℃退火20秒；72℃延伸20秒；最后72℃延伸6分钟。用2.0％的琼脂糖/溴乙锭凝胶电泳检测PCR产物的片断大小及特异性。以G3PDH作为参照基因，上游引物为：5’ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3’，下游引物为：5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’。

检测HCC-C11的3个剪切变异体所用的引物为：上游引物C11S(5’AGCAGG AAT GAG CTC TCC GAC 3’)，下游引物同上，为C11RTA。PCR条件也同上。见图6A-6C：图6A为HCC-C11及其3个剪切变异体的mRNA在5对人原发性肝癌中的表达，其中T代表模板为癌组织的cDNA，N代表模板为癌旁组织的cDNA。图6B为HCC-C11及其3个剪切变异体的mRNA在10份肝硬化组织中的表达，其中C(cirrhotic liver tissues)代表肝硬化组织。图6C为HCC-C11及其3个剪切变异体的mRNA在9分正常肝及1分睾丸组织中的表达。HCC-C11的RT-PCR循环数为32，G3PDH的RT-PCR循环数在(A)和(B)中为28，在(C)为29。以上结果表明，HCC-C11的3个剪切变异体的mRNA与HCC-C11表达一致，但是在肝来源的组织中以HCC-C11及HCC-C11_v2为主，在睾丸中以HCC-C11 HCC-C11_v3为主。

实施例4.HCC-C11 mRNA的表达丰度与肝癌的临床病理的联系

用Real-time RT-PCR检测了HCC-C11在51份肝癌，10份肝硬化，10份正常肝组织中的表达，结果表明，HCC-C11 mRNA在肝癌中的表达与肝癌的组织分化程度及临床分期有关。肝癌的组织分化程度越低，临床分期越晚，癌组织中HCC-C11 mRNA表达越低(见表1，表2，表3)。在早期高分化肝癌(I-II期)中，HCC-C11 mRNA在癌组织中的表达比癌旁高。在中晚期高分化肝癌(III-IV期)，HCC-C11 mRNA在癌组织中的表达比癌旁低。在早期中分化肝癌中，HCC-C11 mRNA在癌组织中与癌旁组织中的表达基本相同。在中晚期中分化肝癌及所有的低分化肝癌中，HCC-C11 mRNA在癌组织中的表达均明显比癌旁组织的低，且有相当一部分病例(28.2％)的肝癌组织中不表达HCC-C11 mRNA。此外，HCC-C11 mRNA在肝硬化组织中的表达也比正常肝组织中的表达低(表4)。

表1：肝癌中不同HCC-C11 mRNA表达指数(EI)的频率

                                      病例数n(％)

                   癌组织         癌旁组织      肝硬化        正常肝

EI^d(AU)0-10       38(75)         16(31)        0(0)         0(0)

       10-100      6(12)          23(45)        8(80)        0(0)

       ＞100       7(13)          12(24)        2(20)        10(100)

总病例数(100％)    51             51            10           10

P值^c   癌旁组织   0.000^a

        肝硬化     0.000^b        1.0^b

          正常肝    0.000^b    0.000^b    0.001^b

^a为Pearson Chi-Square检验的结果。

^b为Fisher’s精确检验的结果。

^c表中的P值为相应的行和列两组统计检验的结果。

^dEI值由real-time RT-PCR的结果计算得到。

EI值＝(HCC-C11 mRNA的分子拷贝数/G3PDH mRNA的分子拷贝数)×

1000AU(AU，arbitrary unit)

表2：HCC-C11 mRNA表达与肝癌临床分期的关系

Edmondson   TNM 分    病例数(n)             N/T比值^a              P值

分级        期        (分析的例数^e/总例   (均数±标准差)

                       数)

G1        I-II         4/4                  0.078±0.036

          III          2/2                  33.700±19.799         0.017^b

G2        I-II         6/6                  0.709±0.257

          III          8/8                  29.850±10.743         0.001^b

          IV           6/8                  255.567±81.867        0.000^c   0.000^d

G3        I-II         3/5                  7.753±2.608

          III          5/8                  59.350±16.288         0.003^b

          IV           6/10                 421.650±130.874       0.001^c   0.001^d

^a N/T比值，由real-time RT-PCR计算出的HCC-C11 mRNA在癌旁组织中的EI值比癌组织的EI值。

^bP为I-II期与III期之间比较的统计检验结果。

^cP为III期与IV期之间比较的统计检验结果。

^dP为I-II期与IV期之间比较的统计检验结果。

^e为HCC-C11 mRNA在癌组织及癌旁组织均表达的病例数。在余下的病例中，

HCC-C11 mRNA只在癌旁组织中表达，而在癌组织中不表达，这些病例无法做N/T分析。

表3：HCC-C11 mRNA表达与肝癌组织分化程度的关系

TNM分期    Edmondson      病例数(n)        N/T比值^a       P值

       分级      (分析的例数^e/总 (均数±标准差)

                 例数)

I-II    G1        4/4             0.078±0.036

        G2        6/6             0.709±0.257        0.003^b

        G3        3/5             7.753±2.608        0.003^c   0.002^d

III     G1        2/2             33.700±19.799

        G2        8/8             29.850±10.743

        G3        5/8             59.350±16.288      0.008^c

IV      G2        6/8             255.567±81.867

        G3        6/10            421.650±130.874    0.025^c

^aN/T比值，由real-time RT-PCR计算出的HCC-C11 mRNA在癌旁组织中的EI值比癌组织的EI值。

^bP为G1与G2之间比较的统计检验结果。

^cP为G2与G3之间比较的统计检验结果。

^dP为G1与G3之间比较的统计检验结果。

^e为HCC-C11 mRNA在癌组织及癌旁组织均表达的病例数。在余下的病例中，HCC-C11mRNA只在癌旁组织中表达，而在癌组织中不表达，这些病例无法做N/T分析。

表4：HCC-C11 mRNA在肝硬化组织及正常肝组织中的表达的比较

组别    病例数      EI(AU)(均数±标准差)        P值

正常肝    10        190.680±85.169

肝硬化    10        56.420±37.542              0.000

实验方法：用Bio-Rad iQ/iCycler Real-Time PCR系统(BioRad，Hercules，CA，USA)进行HCC-C11在mRNA水平表达的定量检测。其原理是将荧光染料SYBR green加入PCR反应体系，随着PCR反应中双链DNA的产生，SYBRgreen嵌入到双链中，由相应的检测系统实时检测出荧光强度，与标准样品(由PCR产物做成的质粒)产生的标准曲线比较而得到未知cDNA样品的模板数。用HCC-C11特异的引物C11-1B和C11RTA进行PCR扩增。先做熔点曲线确定收集荧光信号的温度。定量反应中的PCR循环参数为：50℃2分钟，95℃10分钟；45循环：95℃变性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸20秒，88℃10秒收集荧光信号。1∶10梯度稀释的标准质粒同时进行反应以产生标准曲线(每反应管的模板数为10⁸到10²)。标准曲线的相关系数至少在0.98以上，以保证数据的精确性。同样制备G3PDH的标准质粒及做每份样品的定量检测(引物同前)，作为HCC-C11的参照。计算每份病例中HCC-C11 mRNA在癌旁组织中的表达量(N)比上在癌组织中的表达量(T)的比值(N/T)，分析HCC-C11 mRNA的表达水平与肝癌的组织分化程度及临床分期的关系。计算每个样品的HCC-C11 mRNA的表达指数(mRNA EI)，分析HCC-C11mRNA的表达在肝癌、肝硬化、正常肝中的差异。mRNA EI＝(HCC-C11 mRNA的拷贝数/G3PDH mRNA的拷贝数)×1000AU(AU为arbitrary unit)。PCR产物行2.0％的琼脂糖凝胶电泳，以证实PCR的特异性。

实验结果以SPSS10.0软件进行统计检验。EI值的差异的显著性用Pearson卡方检验及Fisher’s精确检验。N/T比值的差异的显著性用非配对t检验。P＜0.05认为差异有显著性。

实施例5.原位杂交

为了确定HCC-C11 mRNA表达的细胞定位，从而进一步证明该基因与肝癌关系的相关性。以肝癌组织切片及肝癌肿瘤细胞系BEL7402(RT-PCR证实有HCC-C11 mRNA表达)的培养细胞爬片为材料，进行了原位杂交。

以上游引物C11-1B(5’TAC TGA GAT AGA GGC CCT GGA G 3’)及下游引物C11RTA(5’GGC AAC TGA TCC AGG GTC ACC 3’)扩增的PCR产物构建成质粒(Real time PCR中的标准品质粒)，测序证实。用DIG RNA labelingKit(T7/SP6)(Roche)按试剂盒说明分别标记正义及反义RNA探针。

简要操作步骤如下：制备8μm厚的冰冻切片，及BEL7402的培养细胞爬片，50℃干烤2小时。用DEPC处理过的PBS水化，0.2M的盐酸室温处理10min，PBS洗涤2×5秒，用20μg/ml的蛋白酶K在37℃消化30分钟。PBS洗涤2×5秒，用4％多聚甲醛固定10分钟。PBS洗涤3×5秒，70％，95％，100％梯度乙醇脱水。每个切片滴加30μl预杂交液(50％甲酰胺，10％dextran sulfate，1×Denhard’s溶液，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，300mM NaCl，1mM EDTA，250μg/ml酵母tRNA)，37℃预杂交60分钟。然后用含0.5μg/ml的探针的杂交液，42℃杂交16小时。杂交后用2×SSC，50％甲酰胺37℃洗涤30分钟，然后用2×SSC37℃洗涤2×15分钟，0.1×SSC 37℃洗涤2×15分钟。以碱性磷酸酶耦连的地高辛标记的抗体(1∶500稀释)检测杂交信号。蓝紫色的信号为阳性信号。

结果：在所检测的早期中分化肝细胞癌的癌组织中，几乎所有癌细胞中均见有HCC-C11 mRNA表达。癌旁组织中，几乎所有肝细胞中均有表达。BEL7402的培养细胞爬片中，所有癌细胞均见HCC-C11 mRNA表达。而用正义对照探针杂交未见到阳性杂交信号(见图7)。

以上结果说明，HCC-C11是一个肝脏特异的表达于正常肝细胞及分化相对比较好或早期肝癌细胞、肝癌细胞系的基因。

实施例6.重组蛋白的表达

(1)重组pET32(a)-C11质粒的构建

根据HCC-C11的基因序列设计引物如下：上游引物5’GCG

GAT GGT GAG GCA CAG TTT G 3’，下游引物：5’GCG

TTT ATTTGT GAA CTT GAT TAG 3’。PCR扩增后，纯化PCR产物，分别用引物上加载的酶切位点(引物中加边框的核苷酸)的内切酶(BamH I和PstI)进行酶切，同时用同样的酶切载体pQE30，分别凝胶回收目的基因片断及载体片断(QIAquick Gel Extraction Kit，Qiagen)，用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，转化入TOP10F’菌，挑取克隆酶切鉴定后送测序，测序证实无突变后，用BamHI和Hind III亚克隆到表达载体pET32(a)，然后转化TOP10F’菌，挑取转化菌落经限制性内切酶图谱分析筛选插入正确的重组菌落，然后将鉴定正确的重组质粒pET32(a)-C11转化入表达菌BL21 rare coden。

(2)重组蛋白的诱导表达

挑取分隔良好的单个菌落，用3ml LB细菌培养基(每升含：10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，10克氯化钠，pH7.0)，加入氯霉素(终浓度34μg/ml)和氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)，37℃空气浴摇床震摇过夜。第二天取3个新摇菌管，加入含氯霉素和氨苄青霉素的新鲜2YT细菌培养基(每升含：16克胰蛋白胨，10克酵母提取物，5克氯化钠，pH 7.0)，将过夜培养的菌液1∶20稀释，37℃空气浴摇床震摇培养，到菌液OD600＝0.7时开始用IPTG诱导，诱导剂的终浓度为1mM。分别于诱导前(0hr)，诱导后4、6、10小时取菌液1ml，同时设1管不诱导对照，于相应时间取菌液1ml。将留取的菌液离心，加入100μl SDS-PAGE上样缓冲液，冲悬菌体，沸水浴煮10分钟，4℃离心5分钟。取20μl上清电泳。同样诱导含有空pET32(a)载体的表达菌，取10μl电泳作为诱导对照。

结果见空载体对照在预计位置20kDa处见表达条带，重组pET32(a)-C11融合蛋白在预计位置30kDa处见表达条带，4小时诱导已经达高峰，6小时、10小时表达逐渐下降。而诱导前(0小时)及不诱导对照(4小时)未见有目的蛋白表达(见图8)。

虽然现有的生物学数据库中未见有HCC-C11蛋白的同源蛋白，但是分析HCC-C11基因的启动子时，我们发现，HCC-C11基因和甲胎蛋白(AFP)及白蛋白(Albumin)基因在启动子区域有许多共同的转录因子结合位点，主要是一类称为homeoprotein的转录因子，包括肝细胞核因子1(HNF1)和6(HNF6)、OCT1，NKX 3.1，EN1，CSX，PDX1，POU factor Brn-2，CDX2。Homeoprotein是一类在肿瘤中常发生异常表达的转录调节因子，它的主要功能主要分为两类：促进细胞增殖，抑制细胞分化；或促进细胞分化，抑制细胞增殖。有研究已表明HNF1能够转录激活许多肝脏特异的基因表达，HNF-1alpha的表达水平与肝癌的组织分化程度有关，在高分化肝癌中，HNF-1 alpha在癌组织中的表达高于癌旁组织，而在中分化及低分化肝癌中，HNF-1 alpha在癌组织中的表达低于癌旁组织。HNF6也与肝细胞的特化(Specification)有关。我们知道，甲胎蛋白是目前的一个最通用的肝癌的标志物，它一般只在胚胎时期及出生后的短时间内表达，正常成人不表达，而在肝癌发生时，许多病人又出现高表达。白蛋白是一个肝脏特异的标志，主要表达于分化的肝癌细胞，在肝癌病人中，白蛋白在癌组织中的表达低于癌旁组织。

由此可知，HCC-C11蛋白是一个肝脏特异的蛋白，它象甲胎蛋白和白蛋白一样，受homeoprotein转录因子的调节，作为homeoprotein转录因子的下游基因，执行肝脏特异的功能；或者作为转录调节者，调节其它肝脏特异的基因。而最终的表现为，HCC-C11促进肝细胞的分化，抑制肝细胞的增殖。在肝癌中则表现为促进肝癌细胞分化，抑制肝癌细胞的增殖，从而抑制肝癌的侵袭和转移。HCC-C11蛋白可望作为肝癌的特异治疗的靶点而对肝癌进行相应治疗，该蛋白同样可用于临床分期中的分子诊断。

实施例7.HCC-C11 mRNA在人原发性肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用

人原发性肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断的应用：

1)取肝癌手术后的癌组织及癌旁组织标本(约0.5-1克)提取总RNA(可用Gibco公司的TRIzol试剂盒)；

2)分别以1μg总RNA为模板，20μl反应体系逆转录合成cDNA第一链，加水稀释至100μl(Clontech公司的Advantage RT for PCR Kit)；

3)以2.5μl的cDNA第一链为模板，以C11-1B(5’TAC TGA GAT AGA GGCCCT GGA G 3’)为上游引物，以C11RTA(5’GGC AAC TGATCC AGG GTCACC 3’)为下游引物，25μl反应体系进行PCR反应，循环参数如下：94℃变性2分钟；30循环：94℃变性15秒；68℃退火20秒；72℃延伸20秒；最后72℃延伸6分钟。用2.0％的琼脂糖/溴乙锭凝胶电泳检测PCR产物的片断大小及特异性。以G3PDH作为参照基因，上游引物为：5’ACC ACA GTCCAT GCC ATC AC 3’，下游引物为：5’TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA 3’。

4)结果判定：凝胶扫描后半定量分析或定量PCR检测，结合病理组织学检查，准确诊断，判断病情及预后。

高分化肝癌：若HCC-C11 mRNA在癌组织中的表达比癌旁高，为早期肝癌，术后预后相对好。若癌组织中的表达比癌旁组织低，为晚期肝癌，手术后应该辅助予化疗、免疫治疗等预防复发。

中分化肝癌：若HCC-C11 mRNA在癌组织中的表达与癌旁基本一致，为早期肝癌；若癌组织中比癌旁低，或癌组织中不表达，为中晚期肝癌。结合临床指针行手术后的治疗。

低分化肝癌：无论早期或中晚期肝癌中均为癌组织中的表达比癌旁低，甚至在癌组织中检测不到HCC-C11 mRNA的表达。大部分晚期肝癌中癌组织中的表达非常低，此类病人预后很差。

                                 PI034449-sequence list.txt

                  SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>肝脏特异的与肝癌分化和进展相关的基因和蛋白

<130>PI034449

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(6)..(236)

<223>

<400>1

cgcta atg gat ggt gag gca cag ttt gaa aaa ctg cat tct ttc agg aca     50

      Met Asp Gly Glu Ala Gln Phe Glu Lys Leu His Ser Phe Arg Thr

      1               5                   10                  15

ctg aat ggt cag aac cca atg tgc ttt tat tca ttc att caa caa ata       98

Leu Asn Gly Gln Asn Pro Met Cys Phe Tyr Ser Phe Ile Gln Gln Ile

                20                  25                  30

ttt gtg gcc atg tat aat gta tca ggt gct gta ttt act gta ctt cat      146

Phe Val Ala Met Tyr Asn Val Ser Gly Ala Val Phe Thr Val Leu His

            35                  40                  45

gcc agg aaa gca aca gag aag aaa aca tac cca gtc cag tcc ctg acc      194

Ala Arg Lys Ala Thr Glu Lys Lys Thr Tyr Pro Val Gln Ser Leu Thr

        50                  55                  60

tca tgt cat tta caa tct cgg cta atc aag ttc aca aat aaa              236

Ser Cys His Leu Gln Ser Arg Leu Ile Lys Phe Thr Asn Lys

    65                  70                  75

taattccaaa tcatgatggg agtgaagcca tagaggataa gagggctcgg ggtggtgatc    296

agaggtctct gaggcaatga tctggaagct gccacctaca agataaagag taagcaagat    356

agagacagca ggaatgagct ctccgacgga gggcatgaac agcaagtgca aaggccctgc    416

gactcgaaag agcatgaaag actgaggaag cggccagtgt ggctccaaca cagtggagga    476

gtggggggat cctactgaga tagaggccct ggagctggct cctccacagc tctcaggaat    536

gacagtaaac acagacggcc ctgcatgtat tccggctgtg gcagecttcc tcctgggctg    596

cacatcaggc taacaagccc agccctcagc ttcacaggga ttggagagct ggtgacccta    656

gtcaaggaag ctggtgaccc tggatcagtt gcctcccctc tctgtgccta aatcccccac    716

cccacttctg tcaattagga ggatgatgcc ttcttcaaag tgttgtcata aagattaaat    776

ccttattaaa gtctaaaaaa aaaaaaaaaa a                                   807

<210>2

<211>77

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Asp Gly Glu Ala Gln Phe Glu Lys Leu His Ser Phe Arg Thr Leu

1               5                   10                  15

                                      PI034449-sequence list.txt

Asn Gly Gln Asn Pro Met Cys Phe Tyr Ser Phe Ile Gln Gln Ile Phe

            20                  25                  30

Val Ala Met Tyr Asn Val Ser Gly Ala Val Phe Thr Val Leu His Ala

        35                  40                  45

Arg Lys Ala Thr Glu Lys Lys Thr Tyr Pro Val Gln Ser Leu Thr Ser

    50                  55                  60

Cys His Leu Gln Ser Arg Leu Ile Lys Phe Thr Asn Lys

65                  70                  75

<210>3

<211>1146

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

cgctaatgga tggtgaggca cagtttgaaa aactgcattc tttcaggaca ctgaatggtc      60

agaacccaat gtgcttttat tcattcattc aacaaatatt tgtggccatg tataatgtat     120

caggtgctgt atttactgta cttcatgcca ggaaagcaac agagaagaaa acatacccag     180

tccagtccct gacctcatgt catttacaat ctcggctaat caagttcaca aataaataat     240

tccaaatcat gatgggagtg aagccataga ggataagagg gctcggggtg gtgatcagag     300

gtctctgagg caatgatctg gaagctgcca cctacaagat aaagagtaag caagatagag     360

acagcaggaa tgagctctcc gacggagggc atgaacagca agtgcaaagg ccctgcgact     420

cgaaagagca tgaaagactg aggaagcggc cagtgtggct ccaacacagt ggaggagtgg     480

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Claims (7)

1.一种肝脏特异的与肝癌分化、进展相关的蛋白质，具有图4A中的氨基酸序列。

2.一种融合蛋白，其特征在于该融合蛋白包含权利要求1所述的蛋白质序列。

3.一种编码权利要求1所述蛋白质的基因序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于该基因为HCC-C11或HCC-C11的剪切变异体。

5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于剪切变异体为HCC-C11-V1，HCC-C11-V2或HCC-C11-V3。

6.一种权利要求1所述的蛋白质在肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

7.一种权利要求4所述的基因在肝细胞癌的组织分化及临床分期的分子诊断中的应用。

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