CN1544653A - 一种精神分裂症相关基因synapsin Ⅱ及其多态性位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与精神分裂症相关的基因synpasinII及其多态性位点。本发明还提供了一种分析synpasinII基因的单核苷酸多态性的方法，以及在诊断精神分裂症方面的用途。本发明的SNP是具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列的位于3p25区域定位在内含子8上的rs795009位点，是synapsinII基因上的常见型单核苷酸多态性位点T等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点，是产生精神分裂症的一个危险等位位点。

Description

一种精神分裂症相关基因synapsin II及其多态性位点及其应用

技术领域

本发明属于生物技术的基因领域，具体地说，本发明涉及一种与精神分裂症相关的基因synapsin II及其多态性位点，本发明还涉及分析synapsin II基因等位基因突变的方法，以及synapsin II基因单核苷酸多态性在诊断精神分裂症方面的用途。

背景技术

精神分裂症是一种复杂的且具有破坏性的脑功能紊乱，发病率约为1％，是严重影响人类精神和躯体健康的疾病之一，消耗了大量人力、物力和财力(Hyman SE.The NIMH perspective：next steps in schizophrenia research.Biol.Psychiatry 2000b；47：1-7.)。虽然精神分裂症的确切病因还没有找到，但是同胞对分析，家系分析以及寄生子研究一致表明，遗传因素在发病机制中起了重要的作用(Barkur S，Shastry.Schizophrenia：A genetic perspective(Review).Int JMol Med 2002；9：207-212.)。基因组遗传连锁筛选鉴别出了染色体上许多位点有阳性LOD值，这样就排除了精神分裂症的发生是由单一主要的位点导致的(Pulver AE，Lasseter VK，Kasch L，et al.Schizophrenia：a genome scan targetschromosomes 3p and 8p as potential sites of susceptibility gene.Am J Med Genet1995；60：252-260.)。进行全基因组的关联分析是一个具有良好前景的精神分裂症分子遗传学研究方法。SNPs(单核苷酸多态性)即某一物种中，在基因组的特定位置上存在着的单个核苷酸的序列变化。普遍认为SNPs在人类基因组中每1Kb就有1个，总数可达2～3百万个，是人类基因组多态性的主要来源，约占人类DNA多态性的90％(Collins，F.S.，Brooks，L.D.& Chakravarti，A.，A DNApolymorphism discovery resource for research on human genetic variation，Genome Res，1998，8(12)，1229-31.)。由于SNPs密度很高，数量众多，非常稳定，并且绝大多数情况下只有两种等位基因型，可进行自动化的大规模检测，所以它是很好的遗传标记。位于3p25的synapsin II(突触蛋白II)编码一种神经元特异的磷蛋白，它在前突触神经末梢选择性的连接到小突触囊泡，并与细胞骨架相连，调节突触囊泡在释放池的量，从而影响神经递质的释放(Greengard P，Valtorta F，Czernik AJ，Benfenati F.Synaptic vesicle phosphoproteins andregulation of synaptic function.Science 1993；259：780-785.)。在精神分裂症患者的脑部发现synapsin II的mRNA和蛋白质的表达都明显减少(Vawter MP，Thatcher L，Usen N，Hyde TM，Kleinman JE，Freed WJ.Reduction of synapsin inthe hippocampus of patients with bipolar disorder and schizophrenia.MolPsychiatry 2002；7(6)：571-8.； Mirnics K，Middleton FA，Marquez A，Lewis DA，Levitt P.Molecular characterization of clinical study schizophrenia viewed bymicroarray analysis  of gene expression in prefrontal cortex. Neuron2000；28(1)：53-67.)。由于synapsin II神经递质的释放有着密切的关系，它们的表达异常可能与精神分裂症的病理机制相关。

经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有synapsin II基因与精神分裂症相关联的研究报道，也没有synapsin II基因多态性位点与精神分裂症的相关性报道。

发明内容

本发明的目的就在于揭示synapsin II基因及其多态性位点与精神分裂症的相关性，及其在检测精神分裂症方面的用途。

首先，本发明提供了一种检测synapsin II基因的单核苷酸多态性的方法，它包括如下步骤：

(a)确定在synapsin II基因的SEQ ID NO：1所示序列的第1007位的核甘酸；

(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。

其次，本发明提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第1007位为G。

再次，本发明提供了一种等位基因特异性的核酸引物，长度为22-23bp，且特异性地扩增出SEQ ID NO：1所示序列中第1007位的单核苷酸多态性的扩增产物。

最后，在本发明提供了一种检测精神分裂症的诊断试剂盒。包括：

(1)特异性扩增synapsin II基因的引物对；

(2)检测扩增产物与正常的synapsin II基因相比是否存在变化所学的试剂，所述的SEQ ID NO：1所示序列中第1007位单核苷酸多态性。

附图说明

图1为位于3p25的synapsin II基因结构及多态位点示意图，附图中包含有14个外显子。Rs795009位点在synapsin II基因图中的相应位置。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：基因的收集和抽提

从河北，吉林，安徽，浙江省的精神病院采集到散发性的精神分裂症患者654例，平均年龄33.7±11.8岁(标准差)，其中251为女性；所有患者均符合精神分裂症的DSM-IV(diagnostic and statistical manual of mental disorders，fourth edition)诊断标准，每例病人的诊断均经两位以上的精神病专家复诊后确诊。所有患者均具有幻想、幻觉、妄想、思维紊乱和认知障碍的临床表现。同样来自河北，吉林，安徽，浙江省无血缘关系的健康自愿对照组628例，平均年龄34±9.9岁(标准差)，其中328为女性。全体参与者均为汉族，并在正式的知情同意书上签字。

用常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA，浓度校正至10ng/ul。

实施力2：SNP的获得

本发明采用等位基因特异的实时PCR技术(allele specific realtime PCR)对synapsin II基因的SNP位点rs795009(其等位位点对为T/G)等位位点在病例组和对照组中的频率分布情况进行了检测。PCR反应以及检测都是在ABI PRISM 7900序列检测仪(Applied Biosystems)上同时进行。

扩增引物如下：

正向引物1：5’-TGAACTAAAATTCTGGAAAGTTG-3’(SEQ IDNO：2)；

正向引物2：5’-TGAACTAAAATTCTGGAAAGTTT-3’(SEQ IDNO：3)；

反向引物：5’-GATAGGACAGGCAGTGAGCCAC-3’(SEQ IDNO：4)。

PCR扩增试剂：

反应分两孔，每孔反应体系总体积为5ul，其中

ddH₂O       1.35ul    灭菌双蒸水

MasterMix    2.5ul     TaqManuniversal PCR master mix(AppliedBiosystems)，

SYBR green I 0.05ul     SYBR green I荧光

20uM反向引物       0.05ul

20uM正向引物1或2   0.05ul

10ng DNA    1.0ul    10ng人体DNA扩增摸板

PCR反应条件：(PCR反应是在ABI PRISM 7900检测仪上进行)

50℃激活uracil-N-glycosylase(UNG)，95℃12 min，50X(95℃15秒，58℃30秒，)；dissociation：95℃15秒，60℃15秒，95℃15秒。

看图分析软件ABI PRISM SDS2.1(ABI PRISM 7900检测仪自带)。

实施力3：synapsin II基因SNP与精神分裂症的相关性

统计：利用CLUMP 1.6 version卡方分析( http：//linkage.rockefeller.edu/soft/list.html)，模拟次数超过10000次。计算等位位点、基因型的分布和Hardy-Weinberg平衡，并计算Odds ratio(OR)及其95％的可信区间( http：//www.hutchon.freeserve.co.uk/ConfidOR.htm)，采用G*Power program( http：//www.psycho.uni-duesseldorf.de/aap/projects/gpower/)计算所用样本量的统计学力度，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为p＜0.05。

结果：位于3p25区域synapsin II基因上的rs795009(其等位位点对为G/T)和等位位点在病例组和对照组中的频率分布情况请见表1。

表1：rs795009等位位点、基因型和单倍体型频率在精神分裂症患者和健康对照群体中的分布和分析结果。

分组     样本数           基因型(频率％)            等位位点数(频率％)

                     TT         GT         GG          T          G

患者      654    187(28.6)  345(52.8)  122(18.7)  719(55.0)  589(45.0)

正常人    628    138(22.0)  308(49.0)  182(29.0)  584(46.5)  672(53.5)

  P                         ＜0.0000001                  0.000018

Odd Ratio

                                                     1.405(1.202-1.641)

(95％CI)

备注：OR：odds ratios；CI：confidence intervals

从上表中可见：位于3p25区域synapsin II基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs795009的T等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点，在患者群体中的分布频率远远大于其在健康对照组(p＝0.000018)，因此是产生精神分裂症的一个危险等位位点。样本量具有大于90％的统计学强度来检测到“弱小的”基因效应。与精神分裂症显著相关的rs795009位点，位于剪切点附近，可能影响DNA的二级或三级结构，从而影响DNA的转录和剪切。

实施力4：检测试剂盒

制备检测精神分裂症易感性的试剂盒，其中含有下列可扩增出1007位rs795009的SNP的引物对：

正向引物1：5’-TGAACTAAAATTCTGGAAAGTTG-3’(SEQ IDNO：2)

正向引物2：5’-TGAACTAAAATTCTGGAAAGTTT-3’(SEQ IDNO：3)

反向引物：5’-GATAGGACAGGCAGTGAGCCAC-3’(SEQ IDNO：4)

在7900上对产物与正常对照进行分析，可轻易地检测出1007位的T-＞G型SNP。

本发明的具有实用性的例证：

1)所建立的方法可用于分析人体的位于3p25区域synapsin II基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs795009的T等位位点，即在其DNA互补链上为A等位位点有无，来应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判。从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。

2)可以利用本发明所介绍的方法以及上述1所述和rs795009的T等位位点(即在其DNA互补链上为A等位位点)作为药物设计靶点来进行药物的筛选，寻找出具有调节synapsin II表达的活性分子，促进新的抗精神疾病药物的发现。

3)利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列，构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒。

4)采用本发明提供的引物序列可以特异、高效的检测出1007位SNPrs795009多态性位点。

5)由于synapsin II对中枢神经系统的突触结构和功能均有影响，因此它很可能还参与了其他神经、精神性疾病的病理过程。因此，本发明为今后对synapsin II基因与其他中枢神经系统性疾病关系公开了前期最宝贵的经验、实验基础和应用技术。

此外，位于rs975009多态性位点上下2000bp的DNA序列中还有不少SNP位点，这些位点可能同样对synapsin II的表达具有调节作用。目前，我们正在加紧对此进行研究。期望在不久的将来进一步加强和完善这一发明。

                                  序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院、上海交通大学

<120>一种精神分裂症相关基因synapsin II及其多态性位点及其应用

<130>031120

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2000

<212>DNA

<213>human

<220>

<221>1

<222>(1)..(2000)

<223>

<400>1

gttcctcagt gtctgaaatc agatctctgg ggaggacact ctctaacagt attgaatgat    60

aagggcagca tatgaggggc tctgtcgaca gtgtaagcag gactcttctg tcccctaggc   120

tatctccttc ctcttgactg tgtctggatg aaggctgata attaaaaaga catattttgg   180

gtgtttatag ttaatttaaa cctgtatcaa ttggtctttc tgacagccct gtgttaacag   240

ataacaggct cagaggggtg aaatgactct ctgaaggtca cccagcccat caagagcaaa    300

tccagaacca gaaaccaagt aatccacctc ctatttagtc taagactagt tgacaccaac    360

acatattcat ggatggaggg tgccgtgggc acagcagaga agaagctgat ggcttgatgc    420

catcggctcc atttgacaga caaggcaact taaccctgaa gagttaattg acttccccag    480

agtcacattg ctaatattat agtggccttc agaagttaat aatgaatgag tgagtgagcc    540

agtaaagaag atattggaag atattcataa agaaccctgc gggagtttca ggattgatgg    600

aattcagttt gtatgtatca agtcagtata gatactgaat gggtaggcgt ctgggaacac    660

aagacacgat atgtaccttc aagtggtttt caggcttgtg gaaaaatcta agcttaagac    720

tcagatcaaa taactaaaat aaaaagtaga tttaagattg aaaatcaggc agaagcaaag    780

tcctgtagaa gttctaagga cagtgaaagg tcatccggtt gagagatcag ggcaggctct    840

gtggagccag agctgtctgg gcaagaccct tgtagagagg aggagggcat tgcaggtggg    900

gatttggcag aggcacccag gctctaggct cagcagacag acccctgggc tacttgtggg    960

agaagcaggt gtggaaagca acagtgaact aaaattctgg aaagttgcat gccctcctct   1020

tgctggtgtg gctcactgcc tgtcctatcc tggtgggatc ttgttgcagg aggacatcga   1080

tctcagggaa ctggaagacg aacactggct ctgcgatgct ggagcagatt gccatgtcag   1140

acaggtgagt tgagagaagg agtccagttt ccagcccagt gagagggagg cttccttaga    1200

tgaagaagtt taggaattaa gctctgtcca aagggagtca tggagcaaac cggacagata    1260

aaacacaaaa ggcccaagta gcccatttag caagatcagg caggactgat gatagagaaa    1320

gatgatagag ttaaagactg cacataccat aggtaaaagc ttcctgaggc ctcaccagaa    1380

gcagatgctg gcaccatgct ttttgtacag tctgcagaac catgagccaa aataaacctt    1440

tttttttttt ataattacct agcctcaagt attcctttat agcaacacaa aacagactaa    1500

tcaaggagtg aggtgttgct ataaagatag ttgaaaatgt ggaattggct ttggaactgg    1560

gtaagaggca gaggttagaa gagtttgaag ggctcagaag aagacaggaa gccaagggaa    1620

agttcagaac ttcttagaga ctggttaagt ggttgtgacc aaaatgctga taaaaatatg    1680

gacggagaag gccaggctaa caggtctcag atggaaataa ggaacttgtt gggaactgaa    1740

gcaaaggtca cccttgccac tccatagcaa agaacttggc cgcattgtgt ccgtgccctg    1800

gggatttatg gaaggctgaa tttaggattg atggcctaga gtacctggtg gaagaagttt    1860

ctaagcagca agtggtcaag aagtagcatg gcttcttcta acagcctatg ggaaaagact    1920

gtacatacca tagaagctcc aagaaaggag taattggcat gggctggaat agccaaggag    1980

gccttctaga tatggtgaga                                                2000

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>正向引物1

<220>

<221>2

<222>(1)..(23)

<223>

<400>2

tgaactaaaa ttctggaaag ttg                                23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>正向引物2

<220>

<221>3

<222>(1)..(23)

<223>

<400>3

tgaactaaaa ttctggaaag ttt                                23

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>反向引物

<220>

<221>4

<222>(1)..(22)

<223>

<400>4

gataggacag gcagtgagcc ac                                        22

Claims (5)

1、一种检测synapsin II基因的单核苷酸多态性的方法，其特征在于：它包括步骤：

1)确定在synapsin II基因的SEQ IDNO：1所示序列的第1007位的SNPrs7925009的核甘酸；

2)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性是在第1007为存在T，在其DNA互补链上为A等位位点。

3、一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQIDNO：1所示的序列，且第1007位为T。

4、一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为22-23bp，且特异性地扩增出含synapsin  II基因的SEQ ID NO：1所示序列中第1007位单核苷酸多态性的扩增产物。

5、一种精神分裂症的诊断试剂盒，其特征在于，它包括：

1)特异性扩增synapsin II基因的引物对；

2)检测扩增产物与正常的synapsin II基因相比是否存在变化所需的试剂，所述的SEQ ID NO：1所示序列中第1007位单核苷酸多态性。

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