发明内容
本发明的目的就在于揭示MPZ11基因及其多态性位点与精神分裂症的相关性,及其在检测精神分裂症方面的用途。
首先,本发明提供了一种检测MPZ11基因的单核苷酸多态性的方法,它包括如下步骤:
(a)确定MPZ11基因中rs3767444和rs2051656的单核苷酸多态,即SEQID NO:1所示序列的第1001位和SEQ ID NO:2所示序列的第925位的核苷酸。
(b)采用等位基因特异的实时聚合酶链反应技术检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性以及单核苷酸多态的类型。
其次,本发明提供了两种MPZ11基因的核酸序列,其一具有SEQ ID NO:1所示的序列,且第1001位为C;其二具有SEQ ID NO:2所示的序列,且第925位为A。
SEQ ID NO:1
ggccgagggg acccagccca tggggaacgc gggcctccgc gactggccgg 50
gaaggcgcag agcctctttc ttctctttcc tggatcctgg agtgcggagg 100
aggaggggag agtgctttac cttgctcctt cccggggggc ggtccagggg 150
agcggacccg gcgggcggct gcggtgagcc ctcgcggcgc accctgccct 200
ctcctcgtgg tgactctgga tcgtctaggc cctcccggat tctgactcag 250
gaactagggt tctggcgttc ttcacctttg ggaggtggcg gaaagttgca 300
ggtttttcat ttgtagggcc tttgttgatt tgtttcctgt taagccaggg 350
ttttgttgta agttcccttt cccatgctct cattcagttt taagtctccg 400
taataaaaga gtctcatttc cgtggtctgc aaaacgccaa taaaaaaata 450
ttgttacttc taggttagaa tgcaaagagc ttggaatacc agtgagatgg 500
cctggcttaa aagaatttgg tcaaatccat cataattcca gacgtagcca 550
ccataatttg acaagacata gagcattaaa aagcataatt ttcctaaagg 600
aaaaaaaaag ctcctttttc ttaccaaata ttgtgactca agcttaaggt 650
aaacctcggg ctcaatttat gggaattgga tgacttgttt tatggacatc 700
tgaagtggta tctgccacag gacttttctg tgttgttgtt caaagcaaag 750
tacttgttgc tgtctccgaa tttagttaaa taatagttat aaagagggcc 800
agctgctaag aaaccacgta gatttttttc attccctttg ttttcaaaat 850
gtcagttatg atttagcatc acagtatctg aataccagag tttactcagt 900
aatttctttc ttcatggaaa agttcttaat ataatccttg gatcagggaa 950
actaggtgaa gttctgttgg atcaccaact gttccactta aacagtgatt 1000
ccaggggctg taaagcataa atgtaaaagt ctccctaccc tccaggggtt 1050
gacagatgat gacacacttt gtgtaagaca caatccattc tgtattttgt 1100
cttagaaaaa aaggttaaaa gtgtgtttgt tggtggtggt atttgtgttt 1150
aatcaaacaa gtagaaaata gcctaaaatt aaggtttatc agaaatatgc 1200
ttcagacaga attgttatgc atgagaggtc agacattgct atggaggaca 1250
aagcagttag ggtgatctta attaaaatca gggtattaaa cgtagaagga 1300
gtgcaaaact acatagtagt gaaaagatca ctagagtaat agccccatac 1350
aacttggacg taactcttca gtaatgaaga tgaatgttga tatgtaaaaa 1400
tcagcagctg atgttattgg ttcaacttag aaaattattg aatctaaaat 1450
tcttgccaaa tcacctcttt tctggtcatg gatactgcac ataagagttt 1500
atcttttaca ggatagcttc taaagtttta tcaagacagt tactcagcaa 1550
acattcactg agcacctttt aagtgcttaa cacttaaaag gtgggaggtt 1600
aggtctcact gtgttgccca ggctgctctg gaactgaaac tcctgggctc 1650
cagtgattcc tctgcctttt cctcgcaagc agctggggct acaggtgtgt 1700
gccactgtgt agggtcagaa gcacattggt aaagatgtac tgtgggagct 1750
tgaaggaggg tcattatctc agactgtagt tcaggctact ggaggaaggg 1800
agtttaaact gggtaggcat gggggagggg cagaagtaca tacagagtta 1850
tgaatgaacc tgttggtagt tcagtatagt gggaggttgg agtgtatata 1900
aggggaatgg tgggagttga ggcaggagag cctgccaagg gcaccagctt 1950
acaaagggcc ttgtctgcca cacttaatcc aatgaggatt tctctgtcta 2000
SEQ ID NO:2
ttgtaaactg ggttgaagag gttgtaccat atttgtttct gtgcctcccc 50
cagtgatgag ttcattgact tagaagaatg agtgagtgtc aggtatagaa 100
aatagtttaa aaacatgtga tcattttgac acccattgtt atgttgtctt 150
ttgtttttat atatctgttg cttcatcttg ccgtcagttg catttctata 200
tttttgtttc tatttattta ttattattat tttttacatt tgttcttcaa 250
attgccaatt catcagctgc agtacatcag agagtttgtc accagttaag 300
caggctcctc ggaagtcccc ctccgacact gagggtcttg taaagagtct 350
gccttctgga tctcaccagg taatggctga ttgcgattct gcccactgca 400
ctgttcccta cagcttggtg ctctgtcact tccttgggtg tggaaaagaa 450
tactgagcta tgagagacag agacagagac agacagacag agacaaagag 500
agagtgggag tgaggaatta aagggctggc ctaggaagac cacaggaaaa 550
tatgtggtga agaatctgct tgagtaaaga tttccatgaa accaccaata 600
acataaattg tttactaacc atgtagcttc cttgcctcaa gcagaattag 650
gaaatggctt tgtcagtaaa agattcttta attgcccaag gaaatgaatc 700
taatgaagga gattctttct gtattgaggt actctaagat aagaaattag 750
caaggaaaag ttggtattct tagtattgat aataaaacca aaattatttt 800
ctgtggattc tttagaaaaa atggaaagta agcatttatc tgaataatta 850
ataggcttga tgaacaagga atggttttgg tttctacttg tagaaagtac 900
agaagagaaa caggttttat ttggaagtta gcatataatc tagctttgtg 950
tgttttggct gtagtatttt aattataact gtggcttggc aaaaattcca 1000
tagcttagtt cagtttgatt tttctggggt agaaagcatg ctaaagaatt 1050
tggccagtta tagctttgtc ctaaaaaggt gttagctggt gggaatggat 1100
ttaagaggaa ataaagagag taacagtgtt ttgtgggaaa agtacccata 1150
gtcttattcc atagttgtta tatgtggtga ggaaactaag gcattgtgat 1200
gttaaattac taaaagcaca cacccagtta gtgacagaac tggggctaga 1250
acccaggtgt ctagatagca tgttctctac cacagcatca ggctcattac 1300
ttgttcctgt tctatctgtc tgtctctctc tcacattaca taatatatgt 1350
cagatacctc agtctactaa tttgggttgt gaacaggaat atggttgtaa 1400
atgaagacat gaaagttaca tacacatagg catagcatct aaaaaagcat 1450
tggaacattt ttattccgcc cttgaagcac tatggaagtt gcttttttgc 1500
tgaaaacaaa ccagaaaaaa gaaaaagaaa ctgtggtttt caagacagtg 1550
gaacacaaat tatgcagcac tgtcatcccc aaaagaaagg aaacagacaa 1600
tgtgagccgt gttattgccc cagtgtactg ccttgaagca gtttccacac 1650
tgcagtgtag gtggggaaaa tggaaactgg gcccagctgt ctcactcaat 1700
tgagaaggcg gaaatcagaa tttggggagg tcaaggaggc taagatttat 1750
gaggctgagt accaaagaag gaaccataga gagagcgtgc taggatgagc 1800
acgagcactt cagagatttg gagcggggtc cccttgagtc tttgtctgat 1850
tacagagttg tatacacata ggagaacact ctctgaaacc aggggaagaa 1900
ctacctgaaa tgcagtaggt tgcacaatgc ctggtgctca cacaggtgag 1950
ggactagttt gtgttcctaa gagccagagt agagagactt ataatacaca 2000
再次,本发明提供了两组检测MPZL1基因单核苷酸多态时应用到的等位基因特异性的核酸引物,长度为16-25bp,且分别特异性地扩增出rs3767444 SEQID NO:1所示序列中第1001位和rs2051656 SEQ ID NO:2所示序列的第925位单核苷酸多态性的扩增产物。
SNP位点rs3767444扩增引物如下:
反向引物1:5’-GCTTTACAGCCCCTGG-3’ (SEQ ID NO:3);
反向引物2:5’-TGCTTTACAGCCCCTGA-3’(SEQ ID NO:4);
正向引物:5’-GGATCACCAACTGTTCCACTTAAAC-3’(SEQ ID NO:5)。
SNP位点rs2051656扩增引物如下:
正向引物1:5’-AGAGAAACAGGTTTTATTTGGA-3’(SEQ ID NO:6);
正向引物2:5’-GAGAAACAGGTTTTATTTGGG-3’(SEQ ID NO:7);
反向引物:5’-TACAGCCAAAACACACAAAGC-3’(SEQ ID NO:8)。
最后,本发明提供了一种检测精神分裂症的诊断试剂盒。包括:
(1)特异性扩增MPZ11基因单核苷酸多态性位点的引物两组;
(2)检测扩增产物与正常的MPZ11基因相比是否存在变化所学的试剂。以获得所述的SEQ ID NO:1所示序列中第1001位和SEQ ID NO:2所示序列的第925位单核苷酸多态性的类型。
利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列,构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒;作为药物设计靶点来进行药物的筛选,寻找出具有调节MPZ11表达的活性分子,促进新的抗精神疾病药物的发现;应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判,从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
具体实施方式
以下结合具体实施例,以进一步说明本发明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本实施例中先进行样本的收集和基因组抽提,从上海,安徽,吉林省的精神病院采集到的精神分裂症核心家系523个,患者平均年龄27.3±7.9岁(标准差),其中298为女性;所有患者均符合精神分裂症的DSM-IV(diagnostic andstatistical manual of mental disorders,fourth edition)诊断标准,每例病人的诊断均经两位以上的精神病专家复诊后确诊。所有患者均具有幻想、幻觉、妄想、思维紊乱和认知障碍的临床表现。全体参与者均为汉族,并在正式的知情同意书上签字。以常规酚氯仿法从人的血液中提取DNA,浓度校正至10ng/ul。
步骤1:确定目标位点,MPZ11基因中rs3767444和rs2051656的单核苷酸多态,即为MPZ11基因的SEQ ID NO:1所示序列的第1001位和SEQ ID NO:2所示序列的第925位的核苷酸。
步骤2:检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性以及单核苷酸多态的类型。
本发明采用等位基因特异的实时聚合酶链反应技术(allele specificreal time PCR)对MPZ11基因的SNP位点rs3767444(其等位位点对为C/T),SEQ ID NO:1第1001位和rs2051656(其等位位点对为A/G)SEQ ID NO:2第925位在核心家系中的频率分布情况进行了检测。PCR反应以及检测都是在ABI PRISM 7900序列检测仪上同时进行。
SNP位点rs3767444扩增引物如下:
反向引物1:5’-GCTTTACAGCCCCTGG-3’(SEQ ID NO:3);
反向引物2:5’-TGCTTTACAGCCCCTGA-3’(SEQ ID NO:4);
正向引物:5’-GGATCACCAACTGTTCCACTTAAAC-3’(SEQ ID NO:5)。
SNP位点rs2051656扩增引物如下:
正向引物1:5’-AGAGAAACAGGTTTTATTTGGA-3’(SEQ ID NO:6);
正向引物2:5’-GAGAAACAGGTTTTATTTGGG-3’(SEQ ID NO:7);
反向引物:5’-TACAGCCAAAACACACAAAGC-3’(SEQ ID NO:8)。
PCR扩增试剂:
反应分两孔,每孔反应体系总体积为5ul,其中
ddH2O 1.35ul 灭菌双蒸水
MasterMix 2.50ul TaqMan universal PCR master mix(AppliedBiosystems),
SYBR green I 0.05ul SYBR green I荧光
20uM反/正向引物 0.05ul
20uM正/反向引物1或2 0.05ul
10ng DNA 1.00ul 10ng人体DNA扩增摸板
PCR反应条件:(PCR反应是在ABI PRISM 7900检测仪上进行)
50℃激活uracil-N-glycosylase(UNG),95℃12min,50X(95℃ 15秒,58℃30秒,);dissociation:95℃15秒,60℃15秒,95℃15秒。
看图分析软件ABI PRISM SDS2.1(ABI PRISM 7900检测仪自带)。
MPZ11基因SNP与精神分裂症的相关性
统计:利用ETDT软件进行单个位点传递不平衡检验(http://linkage.rockefeller.edu/soft/list.html)。计算等位位点频率和Hardy-Weinberg平衡,选用卡方检验进行统计学分析,统计学的显著性水平设定为p<0.05。
结果:位于1q23.3区域MPZ11基因上的rs3767444(其等位位点对为C/T)和rs2051656(其等位位点对为A/G)等位位点在核心家系中的频率分布情况请见表1。
表1:ETDT分析单个SNP结果。
标记 多态 频率(第二个等位基因) 传递∶不传递 X2(P值)
rs3767444 C/T 0.8904 147∶107 6.299(0.0121)
rs2051656 A/G 0.3581 164∶266 9.856(0.0017)
从上表中可见:位于1q23.3区域MPZ11基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs3767444的C等位位点,即在其DNA互补链上为T等位位点;位点rs2051656的A等位位点,即在其DNA互补链上为G等位位点,二者在核心家系传递不平衡检验中传递和不传递的等位基因间存在显著型差异P值分别为0.0121和0.0017,因此是产生精神分裂症的两个个危险等位位点,其中rs2051656的危险性更高。样本量具有大于90%的统计学强度来检测到“弱小的”基因效应。与精神分裂症显著相关的rs3767444位点和rs2051656位点,均位于内含子区域,可能影响RNA的转录和剪切。
检测试剂盒
制备检测精神分裂症易感性的试剂盒,其中含有下列可扩增出SEQ ID NO:1所示序列中第1001位和SEQ ID NO:2所示序列的第925位单核苷酸多态性引物组:
SNP位点rs3767444扩增引物如下:
反向引物1:5’-GCTTTACAGCCCCTGG-3’(SEQ ID NO:3);
反向引物2:5’-TGCTTTACAGCCCCTGA-3’(SEQ ID NO:4);
正向引物:5’-GGATCACCAACTGTTCCACTTAAAC-3’(SEQ ID NO:5)。
SNP位点rs2051656扩增引物如下:
正向引物1:5’-AGAGAAACAGGTTTTATTTGGA-3’(SEQ ID NO:6);
正向引物2:5’-GAGAAACAGGTTTTATTTGGG-3’(SEQ ID NO:7);
反向引物:5’-TACAGCCAAAACACACAAAGC-3’(SEQ ID NO:8)。
在ABI PRISM 7900上对产物与正常对照进行分析,可轻易地检测出SEQ IDNO:1所示序列中第1001位的T>C型SNP和SEQ ID NO:2所示序列的第925位的A>G型SNP。
本发明的具有实用性的例证:
1)所建立的方法可用于分析人体的位于1q23.3区域MPZ11基因上的常见型单核苷酸多态性位点rs3767444的C等位位点和rs2051656的A等位位点在其DNA互补链上为T等位位点和G等位位点有无,来应用于对精神分裂症的辅助诊断和对个体是否具有精神分裂症的易感性进行评判。从而有利于疾病的预防、早期诊断和治疗。
2)可以利用本发明所介绍的方法以及上述1所述和rs3767444的C等位等位位点(即在其DNA互补链上为T等位位点)及rs2051656的A等位位点(即在其DNA互补链上为G等位位点)作为药物设计靶点来进行药物的筛选,寻找出具有调节MPZ11表达的活性分子,促进新的抗精神疾病药物的发现。
3)利用本发明提供的精神分裂症相关的基因及其多态性位点的核酸序列,构建对精神分裂症进行遗传学诊断的试剂盒。
4)采用本发明提供的引物序列可以特异、高效的检测出SEQ ID NO:1所示序列中第1001位和SEQ ID NO:2所示序列的第925多态性位点。
5)由于MPZ11对中枢神经系统少突胶质细胞功能的影响,因此它很可能还参与了其他神经、精神性疾病的病理过程。因此,本发明为今后对MPZ11基因与其他中枢神经系统性疾病关系公开了前期最宝贵的经验、实验基础和应用技术。
此外,位于rs3767444和rs2051656多态性位点上下2000bp的DNA序列中还有不少SNP位点,这些位点可能同样对MPZ11的表达具有调节作用。期望在不久的将来进一步加强和完善这一发明。