CN1544627A - 生物大分子组分相分离法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生物大分子组分相分离法，对需要分离的物质预处理后1)凝集：加足够量的缓冲溶液(硫酸铵，氯化铯，硫酸钠，乙二胺四乙酸中的一种)温和混匀；2)分相：加分相溶液(乙醇，异丙醇，异丁醇，丙酮中的一种或几种的混合物)温和混匀，离心，成上下两相；其中脂质在上相，蛋白质在相间沉淀，DNA质粒、病毒核酸、线粒体DNA在下相，总RNA在下相沉淀；基因组DNA或在下相或与蛋白质在相间共沉淀。本发明分离技术的组分得率和纯度高，为这些组分的纯化提供了便利的条件。

Description

生物大分子组分相分离法
技术领域
本发明涉及一种生物大分子组分两相分离法，它能将生物大分子中的蛋白质，脂质，DNA(质粒体，病毒核酸，线粒体，基因组)和总RNA等组分分开，供分离。
背景技术
色谱法和毛细管电泳法是目前最有效的生物大分子分离手段。传统的生物大分子纯化方法是用SDS(十二烷基磺酸钠)、TX-100、CTAB(cetyltrimethylammonium bromide，CTAB.十六烷基三甲基溴化铵)、盐酸胍、GuSCN(异硫氰酸胍)等试剂裂解细胞，使多糖、质粒DNA、RNA被抽提到上相，蛋白质变性沉淀在相间或部分分配到相间，但仍有少量亲水性强的蛋白质分配在上相，因而各组分不能迅速有效分离。基因组DNA及脂质等释放到上清中，然后用经酚、氯仿(有毒性)抽提去除蛋白质，上清中的质粒DNA经乙醇或异丙醇沉淀回收。但是这样纯化的质粒DNA中仍存留大量的蛋白质、脂多糖、多糖等物质，这些物质严重干扰了许多重要的生物学实验结果，尤其细胞转染、基因治疗、DNA疫苗免疫等生物学研究对质粒DNA的纯度要求更高，这种纯化方法已不能满足对质粒DNA纯度上的要求，需采用其它形式的纯化方法来分离纯化质粒DNA。
另有文献报道采用了DEAD-silica树脂(resin)来纯化质粒DNA。DNA分子上带有磷酸根基因，使DNA分子带负电荷。在silica上DEAE基团密度远高于传统多糖类树脂上的DEAE密度，使DNA更为牢固地结合到这种含高密度DEAE的树脂上的，而且需用很高的盐浓度才能将DNA洗脱下来，但蛋白质等其它杂质在较低的盐浓度时就被洗脱下来，DNA与其它杂质达到完全分离。但这种情况只有在生物大分子表面未结合SDS(十二烷基磺酸钠)等阴离子时才出现。但是，在含质粒DNA的上清中，实际上存留了大量与SDS结合的变性蛋白质、LPS、多糖。SDS分子带有硫酸根基因，带负电荷，能与蛋白质等分子牢固结合，造成这些分子表面带有大量负电荷，大大改变了原来的层析行为，使蛋白质、LPS和多糖的洗脱条件发生了根本变化，无法完全将DNA与蛋白质、LPS等杂质彻底地分离开来。
中国专利文献CN1378592A公开了“在无RNA酶和有机溶剂的条件下应用切向流过滤来纯化质粒DNA的方法”，该方法包括如下步骤：(a)消化所述细胞；(b)将细胞培养约4到24小时以进行裂解并溶解，但不对RNA进行酶促消化；(c)除去来自细胞的裂解物杂质以提供一种质粒DNA溶液；(d)使该溶液流经切向流过滤装置而过滤，以获得含有该质粒DNA的回流液；(e)回收该回流液。该法分离速度和效果不够理想。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，克服背景技术的不足，提供了一种能将生物大分子中的蛋白质，脂质，DNA(质粒体，病毒核酸，线粒体，基因组)和总RNA等组分一次分开的相分离法。
一种生物大分子组分相分离法，对需要分离的物质相应预处理，其特征在于按如下操作工序：
1)凝集：加足够量的缓冲溶液温和混匀，所述的缓冲溶液是硫酸铵，氯化铯，硫酸钠，乙二胺四乙酸中的一种；
2)分相：加分相溶液温和混匀，离心，成上下两相，相间及下相沉淀；其中脂质在上相，蛋白质在相间沉淀，DNA质粒、病毒核酸、线粒体DNA在下相，总RNA在下相沉淀；基因组DNA或在下相或与蛋白质在相间共沉淀；所述的分相溶液是乙醇，异丙醇，异丁醇，丙酮中的一种或几种的混合物；
其中为纯化总RNA的分离，2)工序前有预分相提纯工序：加预分相溶液异丁醇温和混匀，离心，成相，弃相间蛋白质，取下相进入2)工序。
1)、2)工序为新型的相分离体系。在这个体系中，首先必需含有在乙醇，异丙醇，异丁醇，丙酮中的一种或几种的混合溶剂中高度不溶解的盐，而且蛋白质，LPS(细菌脂多糖)，RNA以及脂质在该盐中将变性析出或不溶解，相反DNA必须完全溶解。硫酸铵，氯化铯，硫酸钠，乙二胺四乙酸具备这样的特性。由于硫酸铵价格低廉，而且又是蛋白质LPS，RNA的有效变性剂，可以作为首选。在这个体系中细胞经SDS/NaOH，CATB，盐酸胍，GuSCN，脲素等溶解并释放出质粒DNA后，用含硫酸铵的溶液中和，使蛋白质变形并与基因组DNA形成紧密的不溶性复合物(当溶液体系为碱性时，基因组DNA转入下相)。但是这时溶液体系中硫酸铵浓度不足以使其他杂质都有效沉淀下来。在加入乙醇和异丙醇混合有机溶剂后，水份被抽提到了有机相(上相)中，使无机相中的硫酸铵浓度几乎达到了饱和状态，呈高度的脱水状态。除了质粒DNA、基因组DNA、线粒体DNA、病毒DNA仍呈溶解状态位于下相外，细胞脂溶性成分被抽提到上相，所有其他的细胞成份由于与饱和硫酸铵和乙醇和异丙醇混合溶剂都不相容而被变性沉淀出来，RNA由于密度大，被离心沉淀在管底，蛋白质沉淀在相间。
加入乙醇和异丙醇混合溶剂使含硫酸铵溶液中的水份被抽提走，使下相达到近饱和状态的硫酸铵溶液。形成这两相体系的关键是(1)含一定浓度硫酸铵的溶液；(2)一定体积和一定比例的乙醇和异丙醇混合溶剂。如果硫酸铵浓度过低，不易形成两相，而且硫酸铵会析出。浓度太高，硫酸铵也会析出。实验证明，仅当加入适当比例体积的乙醇和异丙醇混合溶剂时才能形成两相系统，并使下相中的硫酸铵的浓度达到近饱和的状态。当加入的乙醇和异丙醇混合溶剂体积过小，不能成相，反而导致硫酸铵沉淀。体积过大，也形成沉淀，尽管DNA并不析出，但不利于后续的操作。乙醇也可以与硫酸铵的溶液形成两相体系，但所需的乙醇体积过大，而且比例稍有偏差，会导致或者不能成相，或者造成硫酸铵沉淀析出。加一定量的异丙醇，硫酸铵溶液与乙醇加异丙醇有机溶剂的两者的比例范围大大加宽。
根据分离目的需要纯化的组分不同，所述的缓冲溶液的组分和分相液中两醇的配比也有所不同，以提高得率和纯度。溶液体系pH值可以通过磷酸盐、乙酸盐的添加量进行调整和控制。
一、为纯化质粒DNA的分离。所述的缓冲溶液为硫酸铵或氯化铯380～480克，磷酸二氢钠14～18克，加水至1升；纯化质粒DNA所用的分相溶液为乙醇∶异丙醇(v/v)＝2～10∶1；溶液体系为酸性。
所述的缓冲溶液中加有促使盐析的乙酸铵10～60克，则效果更好。
溶液体系为酸性，pH值以5～6.7为宜。
在实际操作中，以悬浮步骤结束时体积为1个体积时，在1)、2)工序中加缓冲溶液∶分相溶液(v/v)＝1.6～2.4∶2.6～3.2，就能达到所需效果。
二、为纯化基因组DNA的分离。缓冲溶液为硫酸铵330克，加水至1升；分相溶液为无水乙醇∶异丙醇(v/v)＝0.5～2∶1；溶液体系为碱性，pH值7.5～9.0为宜。
所述的分相溶液中还有冰乙酸2～5ml/L。
三、为纯化总RNA的分离。预分相溶液为异丁醇，经过预分相提纯工序后，总RNA的得率可提高10～50％；所用的缓冲溶液为硫酸铵398克，硫酸铵96克，Na2HPO4·12H2O 4克，加水至1升；所用的分相溶液为乙醇∶异丙醇(v/v)＝7∶5～7；溶液体系为酸性，pH值6.8±0.05为宜。
四、蛋白质的分离。缓冲溶液为90～100％饱和度的硫酸铵；分相溶液为无水乙醇∶异丙醇(v/v)＝1∶3～10。
缓冲溶液中还含有80mM磷酸二氢钠和80mM磷酸氢钠；所述的分相溶液中还有冰乙酸2～5ml/L。
对上述所加分相溶液进行预冷，可以使分相效果更好，预冷通常不高于10℃。
本发明独特的相分离只需要一步即将不同的细胞组分同时分离开来，是本发明技术的创新点。在该相分离体系中，RNA在离心过程中沉淀于管底4，变性蛋白质形成不溶性复合物位于相间2，多糖、脂多糖、脂质、细菌代谢产物和色素被抽提到上相1中，质粒DNA仍呈溶解状态位于下相3，而基因组DNA则因溶液体系为碱性在下相或因溶液体系为酸性而与蛋白质在相间共沉淀，见图1。
附图说明
图1是相分离结果示意图。
图2-1是从南开大学提供的细菌中提取的超纯质粒DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。1.2.3.4表示样品的取样体积分别为1ml.2ml.3ml.4ml。
图2-2是从含pPic-91C质粒的细菌提取的超纯质粒DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。1.2.3.4表示样品的取样体积分别为1ml.2ml.3ml.4ml。
图2-3是从脓杆菌提取的超纯质粒DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。1.2.3.4表示样品的取样体积分别为1ml.2ml.3ml.4ml。
图2-4是从含pET-2a质粒的细菌提取的超纯质粒DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。1.2.3.4表示样品的取样体积分别为1ml.2ml.3ml.4ml。
图3-1是从15mg小鼠肌肉组织中提取的基因组DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。
图3-2是从培养细胞中提取的基因组DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，2μl电泳。
图3-3是从100mg冬青叶子中提取的基因组DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，2μl电泳。
图3-4是从150μl猪全血中提取的基因组DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。
图3-5是从含pUC-19质粒的细菌中提取的基因组DNA电泳图。60μl洗脱纯化的质粒DNA，4μl电泳。
图4-1是从0.4×104培养细胞中提取的总RNA电泳图。40μl溶解纯化的总RNA，4μl电泳。
图4-2是从200mg冬青叶子中提取的总RNA电泳图。200μl溶解纯化的总RNA，分别用20μl和10μl电泳。
图4-3是从250μl小鼠全血中提取的总RNA电泳图。40μl溶解纯化的总RNA，分别用20μl和10μl电泳。
图4-4是从3ml大肠杆菌中提取的总RNA电泳图。40μl溶解纯化的总RNA，20μl电泳。
图4-5是从4ml酵母菌中提取的总RNA电泳图。60μl溶解纯化的总RNA，20μl电泳。
图4-6是从100mg小鼠肝脏中提取的总RNA电泳图。100μl溶解纯化的总RNA，10μl电泳。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步详细描述。
实施例1——以纯化质粒DNA为目的的相分离。
悬浮液：含有RNase A1的25mM Tris-HCl缓冲溶液，10mM EDTA，pH8.0；
裂解液：1％十二烷基磺酸钠/0.18～0.2M NaOH；
缓冲溶液：硫酸铵或氯化铯380～480克，磷酸二氢钠16～18克，乙酸铵36克，加水至1升；
分相溶液：乙醇∶异丙醇(v/v)＝2～10∶1；
一般采用，悬浮液∶裂解液∶缓冲溶液∶分相溶液：＝1∶1∶1.6～2.4∶2.6～3.2。
RNase A1是100μg/ml的RNA酶组分A1；
Tris是三羟甲基氨基甲烷；
实施例1-1——超纯质粒DNA小量纯化
一、实验准备
1.第一次使用时，将随试剂盒携带的RNase A1(100μg/ml的RNA酶分)全部加入细菌悬浮液中，混合均匀，4℃密闭贮存。
2.使用前注意观察细菌裂解液中是否有白色沉淀出现，如有沉淀，请于37℃温育溶解，并冷却至室温再使用。
3.4℃预冷中和缓冲溶液和分相溶液。
二、操作步骤
预处理：收集1～4ml LB培养基中培养过夜的质粒菌液，12000×g离心30秒，弃尽上清。用250μl已加了RNase A1的细菌悬浮液充分悬浮细菌沉淀。
注意：细菌过量会影响裂解、中和效率。若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少。
注意：悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则会影响菌体的裂解。
加入250μl裂解液(1％十二烷基磺酸钠/0.2M氢氧化钠)，温和但充分地上下翻转混合4～6次，此步骤不宜超过5分钟。
注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
1)凝集：加入450μl 4℃预冷的缓冲溶液(硫酸铵420克，磷酸二氢钠16克，加水至1升)，立即温和地上下翻转8～10次，充分混合均匀。
注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
2)分相：加入650μl 4℃预冷的相分离液(乙醇∶异丙醇＝3∶1)，温和地上下翻转10次，再稍用力混合数次使溶液形成混浊的乳浊液，12000×g离心1分钟。得蓝色上相，无色下相，乳白色相间沉淀，由于加了RNase A1对RNA实施消化降解，通常看不到管底RNA沉淀。其中质粒DNA在下相待纯化。
                                        超纯质粒DNA小量制备
样品 超纯质粒DNA OD值 洗脱体积 稀释倍数 电泳图
南开细菌   细菌体积(ml)   1.0   2.0   3.0   4.0 60μl 4倍 图2-1
  OD260   0.360   0.758   1.262   1.754
  OD280   0.190   0.389   0.650   0.909
  OD260/OD280   1.89   1.95   1.94   1.93
  浓度(ng/μl)   18.0   38.0   62.0   87.0
  DNA得率(μg/管) 4.3 9.1 14.8 20.8
pPic-91C细菌   细菌体积(ml)   1.0   2.0   3.0   4.0 60μl 4倍 图2-2
  OD260   0.093   0.208   0.292   0.416
  OD280   0.054   0.116   0.170   0.237
  OD260/OD280   1.72   1.79   1.72   1.76
  浓度(ng/μl)   4.0   10.0   14.0   20.0
  DNA得率(μg/管) 1.0 2.4 3.4 4.8
脓杆菌   细菌体积(ml)   1.0   2.0   3.0   4.0 60μl 4倍 图2-3
  OD260   0.166   0.351   0.478   0.529
  OD280   0.101   0.202   0.262   0.288
  OD260/OD280   1.65   1.74   1.83   1.84
  浓度(ng/μl)   8.0   17.0   23.0   26.0
  DNA得率(μg/管)   1.9   4.1   5.5   6.2
  pET-2a细菌   细菌体积(ml)   1.0   2.0   3.0   4.0 60μl 2倍 图2-4
  OD260   0.092   0.141   0.205   0.246
  OD280   0.056   0.087   0.123   0.140
  OD260/OD280   1.66   1.63   1.67   1.75
  浓度(ng/μl)   4.0   7.0   10.0   12.0
  DNA得率(μg/管)   0.48   0.84   1.20   1.40
实施例1-2——超纯质粒DNA中量纯化
操作步骤
预处理：收集40ml LB培养基中培养过夜的高拷贝质粒菌液，或100mlLB培养基中过夜培养的低拷贝质粒。≥3000×g离心8min，弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟，除尽上清。用4.5ml已加入RNase A1的细菌悬浮液充分悬浮细菌。
注意：细菌过量会影响裂解、中和效率及质粒DNA的得率。若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少。
注意：不应留有小的菌块。否则会影响菌体的裂解。
加入4.5ml细菌裂解液，温和但充分地上下翻转混合4～6次，此步骤不宜超过5分钟。
注意：避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
1)凝集：加入8ml 4℃预冷的中和缓冲溶液(氯化铯480克，磷酸二氢钠18克，加水至1升；乙酸铵36～45克)，温和并充分上下翻转混合均匀，直至沉淀形成紧实的凝集块。
注意：加入中和缓冲溶液后，应立即混合，以避免形成局部的凝结块；避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。
2)分相：加入12ml 4℃预冷的相分离液(乙醇∶异丙醇＝5∶1)，温和地上下翻转10次，再稍用力上下混合数次使溶液形成混浊的乳浊液，4℃，≥10000×g离心8分钟，得到上相，相间，下相和沉淀；其中质粒DNA在下相待纯化。
实施例2——以纯化基因组DNA为目的的相分离。
裂解溶液：1～2％CTAB和/或0～7M盐酸胍，100mM Tris，pH8.5，1M NaCl，10mM乙二胺四乙酸，0.5％2-巯基乙醇，
预处理：通常选用CTAB或盐酸胍中的一种即可裂解细胞并有效释放基因组DNA，两者合用，大大加速裂解细胞/组织的速度和效率。对于植物动物组织，组织在液氮中碾磨后，宜用2％CTAB溶解，然后在60～80℃水浴中加热10～60分钟，使基因组DNA得到充分释放。如需加热促进基因组DNA释放，则不应在裂解溶液中加入盐酸胍，因为高温下盐酸胍会造成基因组DNA的水解。从血细胞中提取基因组DNA时不应加热，否则形成胶冻状凝集块，严重影响DNA的提取。
裂解溶液为碱性，pH值8.0～9.0为最适。如pH值小于7，则基因组DNA容易与蛋白质一起形成相间沉淀，严重影响DNA的得率。
凝集：加入缓冲溶液(硫酸铵330克，盐酸胍290克，加水至1升)，促使蛋白质絮凝沉淀。
分相：在体系中加入分相溶液(无水乙醇∶异丙醇(v/v)＝1∶1，冰乙酸2～5ml/L)溶液后，迅速形成两相，CTAB、血红素、叶绿素及脂质成分被完全抽提到上相中，同时相分离进一步促使蛋白质变性析出，有效将蛋白质沉淀在相间，而基因组DNA则分配在下相。
                                    基因组DNA小量制备
  样品及其用量 基因组DNA OD值 洗脱体积 稀释倍数 电泳图
  15mg小白鼠肌肉   1   2   3   4   5 60μl 3.5倍 图3-1
  OD260   0.520   0.459   0.408   0.416   0.365
  OD280   0.302   0.248   0.223   0.225   0.199
  OD260/OD280   1.73   1.85   1.83   1.85   1.84
  浓度(ng/μl)   26.0   23.0   20.4   20.8   18.3
  DNA得率(μg/管)   5.5   4.8   4.3   4.4   3.8
  培养细胞   1   2   3   4   5 60μl 7倍 图3-2
  OD260   0.696   0.725   0.562   0.718   0.620
  OD280   0.377   0.380   0.302   0.380   0.329
  OD260/OD280   1.85   1.91   1.86   1.89   1.88
  浓度(ng/μl)   34.8   36.3   28.1   35.9   31.0
  DNA得率(μg/管)   14.6   15.2   11.8   15.1   13.0
  100mg冬青叶子   1   2   3   4   5 60μl 3.5倍 图3-3
  OD260   1.114   1.016   1.049   1.030   1.232
  OD280   0.600   0.550   0.566   0.557   0.668
  OD260/OD280   1.86   1.85   1.85   1.85   1.85
  浓度(ng/μl)   55.7   50.8   52.5   51.5   61.6
  DNA得率(μg/管)   11.7   10.7   11.0   10.8   12.9
80μl猪血   1   2   3   4   5 60μl 2.5倍 图3-4
  OD260   0.329   0.279   0.362   0.309   0.367
  OD280   0.191   0.155   0.206   0.167   0.216
  OD260/OD280   1.72   1.80   1.76   1.84   1.70
  浓度(ng/μl)   16.5   14.0   18.1   15.5   18.4
  DNA得率(μg/管)   2.5   2.1   2.7   2.3   2.8
  pUC-19细菌   1   2   3   4   5 60μl 7倍 图3-5
  OD260   0.735   0.761   0.683   0.612   0.585
  OD280   0.382   0.393   0.353   0.318   0.303
  OD260/OD280   1.93   1.94   1.93   1.92   1.93
  浓度(ng/μl)   36.8   38.0   34.2   30.6   29.3
  DNA得率(μg/管)   15.5   15.9   14.3   12.9   12.3
实施例3——以纯化总RNA为目的的相分离。
裂解溶液：7M盐酸胍，或4M异硫氰酸胍，5mM Na2HPO4，10mM EDTA，乙酸铵10克0.1％2-巯基乙醇，pH值6.3～6.8。
缓冲溶液：硫酸铵398克，盐酸胍96克，Na2HPO4·12H2O 4克，加水至1升。
预处理：2-巯基乙醇可以阻止细胞内的氧化物对RNA分子的损害作用。EDTA为Ca2+、Mg2+离子铬合剂，减少细胞内Ca2+、Mg2+对分离RNA的影响。
1)凝集：加缓冲溶液(蛋白质絮凝液)为398克硫酸铵/升，1M盐酸胍，12mM磷酸氢二钠。溶液中的硫酸铵能促使蛋白质絮凝析出，并与长链基因组DNA形成不溶性复合物，并且硫酸铵为以后的两相形成创造了必备的条件。在此步骤中，硫酸铵的浓度至关重要，既要达到一定浓度促使蛋白质变性，保证后面的相形成，又要保持RNA的溶解性，如硫酸铵浓度过高，RNA会与蛋白质一起变性析出。浓度过低，起不到变性蛋白质的效果，在后面的步骤中也不能形成两相体系。在蛋白质絮凝液中加入一定量的盐酸胍，能进一步增加RNA的游离性，使RNA不至包裹在蛋白质沉淀中。磷酸氢钠用于保持溶液体系在pH6.8±0.05范围内，过低pH影响RNA得率，但pH≥7.0时，容易造成过多的基因组DNA溶解在下相中，溶液粘稠性增加，以致RNA分子比较难以沉淀或造成基因组DNA污染。
预分相提纯：在预处理过的溶液中加入异丁醇后，蛋白质进一步变性析出，而RNA仍呈游离状态，离心后，绝大多数蛋白质与基因组DNA一起形成相间沉淀而被分离清除。脂溶性成份则被抽提到异丁醇中弃去，取下相进入2)分相工序。
2)分相：加分相溶液(乙醇∶异丙醇(v/v)＝6∶7)后，形成两相，水份被抽提到有机相(上相)中，不仅使RNA分子在下相中得到浓缩，而且使下相的硫酸铵浓度几乎达到饱和状态。在下相中含有总RNA和游离的DNA(小片段基因组DNA、线粒体DNA、转染的真核载体、病毒DNA分子)。DNA分子在高饱和状态硫酸铵的溶液(下相)中仍呈游离状态，而RNA分子在高饱和度的硫酸铵，5M以上乙酸铵中均不溶解。但是NH4AC与乙醇、异丙醇呈互溶状态，不能成为成相介质，而只能选用在乙醇/异丙醇高度不溶的硫酸铵作为成相介质。
                     培养细胞、细菌、酵母、动植物组织RNA小量制备
样品及其用量 RNA OD值 洗脱体积(μl) 稀释倍数 电泳图
  培养细胞0.4×104   1   2   3   4 40 10× 图4-1
  OD260   0.848   0.852   1.025   1.031
  OD280   1.396   0.416   0.502   0.486
  OD260/OD280   2.14   2.05   2.04   2.12
  浓度(ng/μl)   33.92   34.08   41.00   41.24
  RNA得率(μg/管) 13.57 13.63 16.40 16.49
  200mg冬青叶子   1   2   3   4 200 20× 图4-2
  OD260   1.543   1.421   1.444   1.514
  OD280   0.721   0.663   0.794   0.767
  OD260/OD280   2.14   2.14   1.82   1.97
  浓度(ng/μl)   61.72   56.84   57.76   65.60
  RNA得率(μg/管)   246.9   227.4   237.0   262.4
  250μl小白鼠血   1   2   3   4 40 20× 图4-3
  OD260   0.610   0.639   0.665   0.589
  OD280   0.338   0.355   0.375   0.326
  OD260/OD280   1.81   1.80   1.77   1.81
  浓度(ng/μl)   24.4   25.6   26.6   23.5
  RNA得率(μg/管)   19.52   20.45   21.28   18.85
  细菌3ml        pCwp1f1        pUC-19 40 40× 图4-4
  OD260   0.198   0.139   0.370   0.292
  OD280   0.104   0.072   0.198   0.154
  OD260/OD280   1.91   1.94   1.86   1.89
  浓度(ng/μl)   7.92   5.56   14.80   11.68
  RNA得率(μg/管)   12.67   8.90   23.68   18.69
酵母4ml   1           2   3               4 60 60× 图4-5
  OD260   1.022   1.092   1.496   1.526
  OD280   0.576   0.585   1.808   0.801
  OD260/OD280   1.77   1.87   1.85   1.90
  浓度(ng/μl)   40.88   43.68   59.84   61.04
  RNA得率(μg/管)   147.17   157.25   215.42   219.74
  鼠肝100mg   1           2   3           4 60 60× 图4-6
  OD260   1.188   1.130   1.693   0.751
  OD280   0.620   0.586   0.908   0.394
  OD260/OD280   1.92   1.93   1.86   1.91
  浓度(ng/μl)   47.52   45.20   67.72   30.04
  RNA得率(μg/管)   171.1   162.7   243.8   108.14
  鼠脑100mg   1           2   3           4 40 40× 图4-7
  OD260   1.279   1.244   0.611   1.472
  OD280   0.692   0.656   0.322   0.781
  OD260/OD280   1.85   1.90   1.90   1.88
  浓度(ng/μ1)   51.16   49.76   24.44   58.88
  RNA得率(μg/管)   81.86   79.62   19.55   94.21
实施例4——以纯化蛋白质为目的的相分离。
凝集溶液：90～100％饱和度的硫酸铵；
取0.5ml含蛋白质的溶液，加入到2ml离心管中，加凝集溶液0.2ml，混合均匀后冰浴5分钟；加0.65ml 4℃预冷的分相溶液(乙醇∶异丙醇＝1∶5)，立即混合均匀；4℃，12000×g离心1分钟，这时蛋白质沉淀在两相界面上。

Claims (9)

1、一种生物大分子组分相分离法，对需要分离的物质预处理，其特征在于按如下操作工序：
1)凝集：加足够量的缓冲溶液温和混匀，所述的缓冲溶液是硫酸铵，氯化铯，硫酸钠，乙二胺四乙酸中的一种；
2)分相：加分相溶液温和混匀，离心，成上下两相，相间及下相沉淀；其中脂质在上相，蛋白质在相间沉淀，DNA质粒、病毒核酸、线粒体DNA在下相，总RNA在下相沉淀；基因组DNA或在下相或与蛋白质在相间共沉淀；所述的分相溶液是乙醇，异丙醇，异丁醇，丙酮中的一种或几种的混合物；
其中为纯化总RNA的分离，2)工序前有预分相提纯工序：加预分相溶液异丁醇温和混匀，离心，成相，弃相间蛋白质，取下相进入2)工序。
2、根据权利要求1所述的相分离法，其特征在于：纯化质粒DNA所用的缓冲溶液为硫酸铵或氯化铯380～480克，磷酸二氢钠14～18克，加水至1升；纯化质粒DNA所用的分相溶液为乙醇∶异丙醇(v/v)＝2～10∶1；溶液体系为酸性。
3、根据权利要求2所述的相分离法，其特征在于：所述的缓冲溶液中加有乙酸铵10～60克。
4、根据权利要求1所述的相分离法，其特征在于：纯化基因组DNA所用的缓冲溶液为硫酸铵330克，加水至1升；  纯化基因组DNA所用的分相溶液为无水乙醇∶异丙醇(v/v)＝0.5～2∶1；溶液体系为碱性。
5、根据权利要求4所述的相分离法，其特征在于：所述的缓冲溶液中还含有盐酸胍290克；所述的分相溶液中还有冰乙酸2～5ml/L。
6、根据权利要求1所述的相分离法，其特征在于：纯化总RNA所用的缓冲溶液为硫酸铵398克，硫酸铵96克，Na2HPO4·12H2O 4克，加水至1升；纯化总RNA所用的分相溶液为乙醇∶异丙醇(v/v)＝7∶5～7；溶液体系为酸性。
7、根据权利要求1所述的相分离法，其特征在于：所述的预分相溶液为异丁醇。
8、根据权利要求1所述的相分离法，其特征在于：蛋白质所用的缓冲溶液为90～100％饱和度的硫酸铵；蛋白质所用的分相溶液为无水乙醇∶异丙醇(v/v)＝1∶3～10。
9、根据权利要求8所述的相分离法，其特征在于：所述的缓冲溶液中还含有80mM磷酸二氢钠和80mM磷酸氢钠；所述的分相溶液中还有冰乙酸2～5ml/L。
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