CN1539407A

CN1539407A - 一种竹红菌脂质体固体粉末制剂及其制造方法

Info

Publication number: CN1539407A
Application number: CNA031106188A
Authority: CN
Inventors: 赵井泉; 靳玄烨; 谢杰; 顾瑛; 刘凡光
Original assignee: Institute of Chemistry CAS; Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Institute of Chemistry CAS; Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2003-04-21
Filing date: 2003-04-21
Publication date: 2004-10-27
Anticipated expiration: 2023-04-21
Also published as: CN1237957C

Abstract

本发明涉及一种竹红菌素脂质体水溶性固体粉末制剂及其制造方法。利用磷脂、胆固醇等药用材料制成竹红菌素脂质体，可作为竹红菌素光动力药物临床的使用的静脉注射针剂。本发明再添加表面活性剂增加药物包容量，并在冷冻保护剂存在下低温、真空条件下冷冻干燥，获得更易保存和更高稳定性的固体(粉末状)竹红菌素脂质体。本发明原料廉价易得、制造方法简单、易操作、不需特别设备、制备工艺成本低，包封率高；使用的材料生物可降解性好；所得到的固体竹红菌素脂质体稳定性高，可以容易地溶解于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液；脂质体尺度满足超滤除菌和静脉注射的要求；为竹红菌素光动力药物提供一类理想的新剂型。

Description

一种竹红菌脂质体固体粉末制剂及其制造方法

技术领域

本发明是一类竹红菌脂质体制剂及其制造方法。

背景技术

竹红菌素，包括竹红菌甲素(HA)和竹红菌乙素(HB)，是从特产于我国云南箭竹上的一种寄生真菌——竹红菌(Hypocrella bambusae(B.et Br.)Sacc.)中提取的一类天然光敏色素。具有单线态氧量子产率高、结构明确、化学修饰性好、暗毒性低、体内代谢快等理想光敏剂的特征，公认是一种最有前景的新型光动力光敏剂。民间曾用竹红菌素治疗胃痛和关节炎，皮肤疾病；现已证明在光动力抗艾滋病、抗肿瘤和微血管类疾病有潜在用途。

众所周知，光对人体组织的穿透深度和光波长成正比，所以通常把肿瘤的光动力医疗窗口规定为600nm-900nm的波长范围，此波长范围的光对组织的穿透深度约为几毫米到1厘米以上。竹红菌素类光敏剂的主吸收波长在500nm附近的范围，此波长范围光对组织的穿透深度约1毫米左右，不能满足实体肿瘤光动力治疗的要求；而以600nm以上的红光激发竹红菌素，则由于光吸收值低而大大降低其光动力效率。然而，微血管类疾病通常的病灶深度不超过1毫米，恰好与竹红菌素类光敏剂主吸收光穿透深度相符；而对这种浅表类型的疾病，以长波光照射反而可能会增加对深层正常组织的伤害。因此，竹红菌素短波长吸收的特性(相应长波光吸收值低)对于光动力医疗实体肿瘤是其劣势；而对医疗浅表肿瘤和微血管类疾病则成为其独特的优势。

竹红菌素本身是一类脂溶性有机分子，在极性溶剂和血液中会自发聚集，形成毛细血管栓塞；而通过化学修饰获得的水溶性衍生物在体内细胞摄取率低而大大降低甚至丧失竹红菌素特有的强光动力功能。因此，微血管疾病光动力药物必须满足在血液中的有效传输和在病灶上选择吸附的双重要求。另一方面，竹红菌素母体光物理性质和光敏化效率能很好的满足微血管类疾病的光动力医疗的要求，因此可以直接采用具有两亲性质的生物相容性材料与脂溶性竹红菌素分子组装来改善药物的物理化学性质，从而满足临床光动力药物的要求。

脂质体是一种类似微型胶囊的新剂型，这一概念的提出始于1965年(Bangham AD，Standish MM，Watkins JC.Diffusion of univalent ions acrossthe lamellae of swollen Phosphilid.J MolBiol，1965，13：238.)第一次提出脂质体作为药物载体是在1974(Gregoriadis G，Swain CP，Wills EJ，etal.Drug carrier potential of liposomes in cancer chemotherapy.Lancet，1974，1(7870)：1313.)，脂质体是将药物包封于类脂质双分子层形成的超微型球状载体制剂。本载体被酶类分解而释放药物从而释放药物发挥作用，具有很高的靶向性和药物缓释特性。由它们所形成的“人工生物膜”易被机体消化分解，脂质体颗粒，大小在20～100nm之间，可由蛋白、聚合物、磷脂、胆固醇等大分子物质构成并作为药物载体。其结构原理：磷脂的结构式中含有一个磷酸基和一个含氨的碱基(季铵盐)，均为亲水基团，还有两个较长的烃链为亲油基团；胆固醇的结构是亲油性较亲水性强，用磷脂与胆固醇作脂质体膜材时，常先将类脂溶于有机溶剂中配制成溶液，然后蒸发除去有机溶剂，在器壁上使成均匀的类脂膜，此脂质膜是有磷脂和胆固醇混合分子相互间隔定向排列的双分子层组成。磷脂与胆固醇排列方式，磷脂分子的极性端呈弯曲的弧形，形似“手杖”，与胆固醇分子的极性基团相结合，使亲水基团上接有两个亲油基团。加入缓冲溶液振荡或超声形成单室或多室的脂质体，凡由一层脂质双分子构成的是单室脂质体，其粒径为20～100nm，由多层类脂质双分子层构成的是多室脂质体，其粒径为100～1000nm，脂质体的某些物理性质可根据治疗上的需要加以改进。例如其半径大小与给药途径及药物的释放速度有关，可以调节在几十纳米米至几微米之间；通过渗入两性带电物质，可改变脂质体表面所带电荷；对作膜材用的类脂成分的改变，可以控制被携带药物的通透性和稳定性。

经文献检索证明，国内外对于竹红菌—脂质体的研究如下：邹伟(邹伟等，生物化学与生物物理学报，1995，27(6)：685；邹伟等，中国科学(B辑)26(3)：206)等人对竹红菌甲素脂质体进行了研究：选用的包封材料为卵磷脂，测定竹红菌甲素(HA)在脂质体中的光谱特性和分析竹红菌甲素荧光的影响因素，并系统研究了竹红菌甲素(HA)和卵磷脂结合后的光动力作用，报道了光敏HA产生单重态氧，测定了单重态量子产率为0.80，研究了HA在无氧条件下的光还原反应；余彩兰(C.L.Yu，Photochem.Photobiol.2001，73(4)；C.L.Yu，J.Photochem.Photobiol.B：Biol.)等人对竹红菌乙素脂质体进行了研究：HB包裹在脂质体后紫外吸收光谱有稍许红移，荧光发射光谱峰性峰位不变，但荧光强度显著降低，荧光寿命变化不大，证实了光敏HB产生单重态氧，测定量子产率0.76，分析了HB在脂质体产生单重态氧机制；马江华(马江华博士论文)采用薄膜超声法制备了竹红菌乙素脂质体，其选用的包封材料为卵磷脂、胆固醇，并观察其稳定性在3个月左右。

用于制造脂质体的包封材料有天然磷脂、胆固醇以及可生物降解的高分子聚合物等。脂质体的制法一般可归纳为下述四种(奚念朱，药剂学(第三版)，人民卫生出版社：370)：超声分散法、薄膜分散法、高压乳匀法、注入法等。

脂质体包封技术已经成为一种比较成熟的药物制剂技术，对实现药物的双亲性特征、靶向性特征、可控的药物释放特征等方面大大增加了药物的应用性。但是，脂质体本身所具有的半流动性质决定了其本身作为液体制剂的不稳定性而导致药物泄露，前期研究表明：竹红菌脂质体单单选用磷脂制成的脂质体稳定时间不超过两周；以增加胆固醇含量可以使脂质体稳定性更高，但至多只能保存2-3个月；另一方面，液相脂质体稳定性的增加可以导致药物释放的减缓，对一般药物可能是有利条件，但对于光动力药物则成为不利因素，因为光动力疗法中给药和光照的时间间隔越小越好。因此，寻求满足以上条件的竹红菌素-脂质体制剂是实现这类临床光动力药物开发的前提。

综上所述：上面所提到竹红菌液相脂质体是为了实验研究，主要缺点有选用进口试剂、制备方法复杂、成本过高、粒径较大，最主要的还是脂质体包封率低、易变质、易渗漏、不易存储、稳定性差等问题。

发明内容

一种竹红菌脂质体固体粉末制剂及其制造方法所述制造竹红菌脂质体固体粉末，其特征在于如下组分及含量(重量％)的配方：

竹红菌素 0.1～2.5％

包封材料 1.0～10.0％

表面活性剂 1.0～10.0％

冻干保护剂 80.0～95.0％

本发明所用的竹红菌素，其中包括：竹红菌甲素(HA)、竹红菌乙素(HB)以及两种母体的脂溶性衍生物，均属于4，9-二羟基-3，10-苝醌衍生物，HA和HB分子式分别为C₃₀H₂₆O₁₀、C₃₀H₂₄O₉，分子量分别为546、528，其结构式如下图所示：

本发明所用的包封材料包括：蛋黄磷脂酰胆碱(卵磷脂)、大豆磷脂酰胆碱(豆磷脂)、双肉豆蔻磷脂酰胆碱(DMPC)、双肉豆蔻磷脂酰甘油(DMPG)、双鲸蜡磷脂酸(DCP)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、心磷脂(CL)、鞘磷脂(SPH)、磷脂酰乙醇胺(PE)、烷基醚磷脂酰胆碱类似物、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、硬脂酰胺(SA)或二甲基溴铵(DDAB)。

本发明所用的非离子表面活性剂选自：吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、司盘-60、司盘-65、司盘-80、司盘-85、曲拉通-100、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯芳基醚或聚氧乙烯脂肪酸酯。

本发明所用的冻干保护剂选自：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或纤维素。

本发明所用的缓冲溶液选自蒸馏水、生理盐水、磷酸盐缓冲溶液等，PH为6.5～7.8。

本发明所用的溶解竹红菌素所用的溶剂选用氯仿；乳化剂选自氯仿，无水乙谜、无水乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、丙二醇或多聚甘油。

本发明所用的灭菌采用过滤除菌，选用微孔滤膜其孔径为0.22um～0.5um。

本发明所用的竹红菌素脂质体制造采用逆向蒸发-冷冻干燥法，具体如下：将竹红菌素0.1～2.5％与包封材料5.0～20.0％按比例溶于氯仿中，加入1.0～20.0％的表面活性剂，在20～30℃、0.1MP下旋转蒸发除去氯仿，用氩气吹干，并按乙醚1～4与缓冲溶液3～9比例溶解薄膜并加入80.0～95.0％冻干保护剂，在20～30℃、0.01～0.1MP下旋转蒸发除去乙醚，超声分散5～15分钟得到液相脂质体，用孔径为0.22um～0.5um微孔滤膜过滤除菌，然后将上面所得的液相脂质体放在冷冻干燥机上在降温速率为5℃～50℃/min、温度为-10℃～-60℃条件下预冻1～5小时，在-30℃～-80℃、真空度为10～50Pa的条件下一次干燥5～20小时，然后在温度-10℃～-30℃、真空度为10～30Pa的条件下进行二次干燥5～10小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末。

本发明目的在于克服了竹红菌母体这一脂溶性化合物在血液内聚集的缺点，获得一类可以实现长期保存、临床使用方便的竹红菌素类光动力药物的新剂型，该制剂易溶于水，可以满足光动力药物可以在血液中顺利传输和在细胞表面吸附的双重要求，发展一种稳定的新剂型和制备方法，为竹红菌素类光敏剂作为光动力药物的实用化上铺平道路。

本发明冷冻干燥制成竹红菌单室脂质体(粉末状)，其优点是配方简单、易操作、不需要特殊设备、成本低、灭菌简单、冻干后的脂质体颗粒细腻，外观饱满疏松、存储时间长、复水后迅速溶解成清澈透明状，因此选用为脂溶性竹红菌素类光敏剂水溶性改造制成冻干粉的方法，改善了药物的理化特性，大大提高了存储时间，解决了脂质体易变质、易泄露、不易存储等问题，有很广泛的发展前景。

本发明制造的脂质体优于其他微粒制剂之处在于：其颗粒极细(可以制备工艺调控粒子的尺寸)，能很快分散于水中成透明的分散体系，适宜配制注射针剂供静脉注射；；成品稳定性较好，尺寸适当，便于加工灭菌；选用适当的材料可达到生物相容，毒副作用小并能在体内生物降解。

竹红菌素脂质体的表征：

(1)光谱测定结果：竹红菌素脂质体的吸收光谱和荧光光谱与它们在微球、胶束、蛋白分子微环境中的相似，即吸收光谱基本形状与自由竹红菌素在有机溶剂中相似，465nm处吸收强度无太大变化，但在长波范围内的吸收值有明显的增加，反映了光敏剂分子与脂质、表面活性分子或蛋白微环境之间的弱相互作用特征；而荧光光谱表明荧光量子产率有较大的降低，说明溶剂中水分子对竹红菌素荧光的猝灭作用，同时观察竹红菌乙素脂质体在冷冻前、后的吸收和荧光光谱可知竹红菌光物理性质不变。

(2)细胞试验测定结果：体外培养的鼠肺血管内皮细胞(EC)，按5.0×10⁴个/ml的细胞密度接种于96孔细胞培养板，孵育24小时后，加入光敏剂，选取的光敏剂孵育浓度为1μg/ml，继续孵育内皮细胞4小时后，采用铜蒸汽激光照射，激光照射的能量密度为20J/cm²；功率密度为20mw/cm²；照射时间为1000秒。其后采用MTT的方法，测定各孔的光密度值。求其细胞存活率和细胞杀伤率如下式得到：

细胞存活率(％)＝(实验组OD-本底组OD)/(完全空白组OD-本底组OD)×100％

细胞杀伤率(％)＝1-细胞存活率

计算直接制备的竹红菌乙素脂质体系细胞光动力杀伤率约为74％；而冷冻干燥后再复水的竹红菌乙素脂质体体系的细胞杀伤率越为78％。证明冷冻干燥后的制剂保持了原制剂的物理化学特性和竹红菌乙素的光动力活性。(3)竹红菌素脂质体的透射电镜观察结果：冻干前的竹红菌素脂质体为单室脂质体，粒径范围为25～70nm，粒子圆整，分布均一，有较好的形态。冻干复水后的竹红菌素脂质体清澈透明，未见聚集和沉淀，电镜观察未发现破裂，其粒径范围为50～150nm，分布均一，形态未发生变化。

具体实施方案

下面实施例进一步说明本发明，但并非限制本发明权利要求所保护的范围。

实施例1

1mg的竹红菌甲素(HA)加入10mg的卵磷脂(EPC)，4mg的胆固醇(CHO)，10mg吐温-40置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用2ml乙醚溶解脂质，加入200mg蔗糖和2ml磷酸盐缓冲溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为5℃/min、真空度为10Pa、预冻温度为-10℃)5小时，再干燥20小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，-4℃密封且避光保存。

实施例2

0.5mg的竹红菌甲素(HA)加入20mg的硬脂酰胺(SA)，7mg的胆固醇(CHO)，15mg吐温-80置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用3ml乙醚溶解脂质，加入200mg纤维素和1ml蒸馏水溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为30℃/min、真空度为10Pa、预冻温度为-30℃)5小时，再干燥5小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，4℃密封且避光保存。

实施例3

1mg的竹红菌甲素(HA)加入20mg的大豆磷脂酰胆碱(豆磷脂)，7mg的胆固醇(CHO)，15mg吐温-60置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用8ml乙醚溶解脂质，加入200mg甘露糖和2ml生理盐水溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声10分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为15℃/min、真空度为10Pa、预冻温度为-20℃)1小时，再干燥20小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，4℃密封且避光保存。

实施例4

1mg的竹红菌乙素(HB)加入10mg的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，4mg的胆固醇(CHO)，15mg司盘-65置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用6ml乙醚溶解脂质，加入200mg甘油和2ml生理盐水溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为15℃/min、真空度为10Pa、预冻温度为-20℃)1小时，再干燥20小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，4℃密封且避光保存。

实施例5

1mg的竹红菌甲素(HB)加入20mg的卵磷脂(EPC)，7mg的胆固醇(CHO)，15mg司盘-80置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用2ml乙醚溶解脂质，加入200mg蔗糖和2ml生理盐水缓冲溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为25℃/min、真空度为20Pa、预冻温度为-30℃)2小时，再干燥5小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，4℃密封且避光保存。

实施例6

0.25mg的竹红菌乙素素(HB)加入20mg的二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，7mg的胆固醇(CHO)，15mg曲通-100置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸15分钟成一薄层，氩气吹干，用6ml乙醚溶解脂质，加入200mg纤维素和2ml磷酸盐缓冲溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为5℃/min、真空度为25Pa、预冻温度为-10℃)1小时，再干燥15小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，-4℃密封且避光保存。

实施例7

1mg的竹红菌乙素(HB)加入12mg的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，4mg的胆固醇(CHO)，10mg吐温-20置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用2ml乙醚溶解脂质，加入200mg葡萄糖和2ml磷酸盐缓冲溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为5℃/min、真空度为15Pa、预冻温度为-10℃)5小时，再干燥5小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，-4℃密封且避光保存。

实施例8

1mg的竹红菌乙素(HB)加入20mg的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，4mg的胆固醇(CHO)，10mg吐温-40置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用2ml乙醚溶解脂质，加入200mg二甲基亚砜(DMSO)和2ml蒸馏水溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声10分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为5℃/min、真空度为15Pa、预冻温度为-10℃)5小时，再干燥5小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，-4℃密封且避光保存。

实施例9

1mg的竹红菌甲素(HA)加入10mg的磷脂酰甘油(PG)，4mg的胆固醇(CHO)，10mg司盘-85，置于梨形瓶中用氯仿溶解，旋转蒸发15分钟成一薄层，氩气吹干，用6ml乙醚溶解脂质，加入200mg蔗糖和3ml磷酸盐缓冲溶液，旋转蒸发除去乙醚，超声5分钟，用微孔薄膜作灭菌滤器(孔径选用0.3um)灭菌，将液相脂质体放在冷冻干燥机上预冻(降温速率为30℃/min、真空度为50Pa、预冻温度为-10℃℃)5小时，再干燥20小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末，4℃密封且避光保存。

Claims

1、一种竹红菌脂质体固体粉末制剂，其特征在于包括如下组分及含量(重量％)的配方：

竹红菌素 0.1～2.5

包封材料 5.0～20.0

表面活性剂 1.0～20.0

冻干保护剂 80.0～95.0

2、如权利要求1所述的竹红菌素脂质体固体粉末制剂，其特征在于所述的竹红菌素为竹红菌甲素结构式如下HA、竹红菌乙素结构式如下HB、竹红菌甲素脂溶性衍生物或竹红菌乙素脂溶性衍生物。

3、如权利要求1所述的竹红菌素脂质体固体粉末制剂，其特征在于所述的包封材料为蛋黄磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油或硬脂酰胺。

4、如权利要求1所述的竹红菌素脂质体固体粉末制剂，其特征在于所述的表面活性剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、司盘-60、司盘-65、司盘-80、司盘-85或曲拉通-100。

5、如权利要求1所述的竹红菌素脂质体固体粉末制剂，其特征在于所述的冷冻干燥保护剂为甘油、二甲基亚砜、蔗糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮或纤维素。

6、如权利要求1所述的竹红菌脂质体固体粉末制剂制造方法，其特征在于：将竹红菌素0.1～2.5％与包封材料5.0～20.0％按比例溶于氯仿中，加入1.0～20.0％的表面活性剂，在20～30℃、0.1MP下旋转蒸发除去氯仿，用氩气吹干，并按乙醚1～4与缓冲溶液3～9比例溶解薄膜并加入80.0～95.0％冻干保护剂，在20～30℃、0.01～0.1MP下旋转蒸发除去乙醚，超声分散5～15分钟得到液相脂质体，用孔径为0.22um～0.5um微孔滤膜过滤除菌，然后将上面所得的液相脂质体放在冷冻干燥机上在降温速率为5℃～50℃/min、温度为-10℃～-60℃条件下预冻1～5小时，在-30℃～-80℃、真空度为10～50Pa的条件下一次干燥5～20小时，然后在温度-10℃～-30℃、真空度为10～30Pa的条件下进行二次干燥5～10小时，封装即得竹红菌素脂质体固体粉末。

7、如权利要求6所述的竹红菌脂质体制造方法，其特征在于降温速率为15℃～30℃/分钟。

8、如权利要求6所述的竹红菌脂质体制造方法，其特征在于预冻温度为-30℃～-60℃。

9、如权利要求6所述的竹红菌脂质体制造方法，其特征在于一次干燥温度为-50℃～-80℃。