CN1514737A

CN1514737A - 血管再生疗法

Info

Publication number: CN1514737A
Application number: CNA02811549XA
Authority: CN
Inventors: 滨田洋文; 伊藤克礼; 山内昭彦; ֮; 森川雅之
Original assignee: Dnavec Research Inc
Current assignee: Dnavec Research Inc
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2002-06-04
Publication date: 2004-07-21
Also published as: EP1402902A4; KR20040004681A; EP1402902A1; WO2002100441A2; JPWO2002100441A1; CA2449687A1; US20040234502A1

Abstract

本发明人深入研究了一种促进血管生成、但使血管通透性较低的方法，它是在用相对安全的质粒载体将VEGF165给予免缺血后肢之前，肌肉内注射促血管生成素－1。结果，本发明人开发了一种局部给药方法，它产生较高的血管诱导效应，且防止由于单独给予VEGF所引起的浮肿副作用。

Description

血管再生疗法

技术领域

本发明涉及通过在表达或施用血管生长基因之前表达或施用促血管生成素来促进血管生长的基因治疗。

背景技术

近年来进行了有关利用诱导血管生长的生长因子治疗缺血疾病的研究。例如，研究了施用成纤维细胞生长因子2(FGF2)(Baffour，R.等，J.Vasc.Surg.16(2)：181-91，1992)或内皮细胞生长因子(ECGF)(Pu，L.Q.等，J.Surg，Res.54(6)：575-83，1993)对心肌梗塞或急性肢体缺血的疗效。最近表明，血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)在心肌缺血和四肢缺血的动物模型中促进血管生成(Takeshita，S.等，Circulation 90(5 Pt 2)：II228-34，1994；and Takeshita，S.等，J.Clin，Invest.93(2)：662-70，1994)。

血管内皮生长因子(VEGF)作为血管内皮细胞特异性生长因子或血管通透因子(VPF)在1989年已有报道，现在已将其分类成VEGF A、B、C、D、E。VEGF A被进一步分成6亚类，其中可溶性VEGF 121和165由于具有特别强的血管生长能力现在已用于临床。有报告指出，VEGF 121和165的作用甚至涉及到胚胎期的血管生成，并且在低氧环境下其作用增强，另外，其广泛作用于NO合成和血管内皮细胞、血管内皮前体细胞的移动。另一方面，VEGF的过度表达可能破坏血管生长信号的平衡，形成血管瘤样的脆弱毛细血管(Carmeliet，P.，Nature Med.6，1102-1103(2000))。在体内将VEGF基因导入血管壁时，可能导致由血管瘤样内皮增生引起的新血管内膜显著肥厚，引起红细胞外渗(Yonemitsu，Y，等，Lab.Invest.75，313-323(1996))。用逆转录病毒在心肌使VEGF组成型过度表达时也能观察到同样的病理现象(Lee，R.J.，等，Circulation 102，898-901(2000))。

主动脉急性阻塞引发的急性重症肢体缺血主要起因于血栓性阻塞，是血管生长治疗对象的重要缺血疾病之一。急性重症肢体缺血的晚期疗效很不好，多数情况下导致截肢。并且，截肢患者的生命预后也不好，术后一年的生存率仅为50％。因此，正在研究从胚胎干细胞(VEGF受体Flk-1阳性细胞)再生血管的技术(Yamashita，J等，Nature 408(2)：92-96，2000)。血管由内皮细胞和壁细胞(周皮细胞和平滑肌细胞)组成，机体内血管生长和退化之间维持着动态平衡。目前尚不清楚什么样的分子机理导致萌发(sprouting)、分支(branching)、融合(fusion)和嵌入(intussusception)等复杂变化，使内皮细胞及时地实现迁移、脱离(detachment)和粘附(adhesion)等机能(Suda Toshio，Jikkenigaku(Experimental medicine)，May issue，19(7)：826-829(2001))。

另外，已经开展利用诱导血管生长的生长因子进行的人体基因治疗临床试验，并且正在研究将其用于临床上的重症肢体缺血的血管生长治疗。血管内皮生长因子/血管通透因子(VEGF/VPF)是内皮细胞特异性生长因子，被视为实现能上述目的的治疗基因。以阻塞性动脉硬化症和Burger氏病为代表的外周血管疾病表现出步行疼痛(间歇性跛行)、静息疼痛和下肢组织损伤(坏死)等临床症状。目前对外周血管阻塞引发静息疼痛或缺血性溃疡的患者没有有效的治疗。当很难进行血管扩张手术或外科血液循环重建手术时，不得不截掉下肢。因此，有人提出了通过血管生长因子形成侧支循环的新疗法——治疗性血管生长。

实际上，Isner等已经报告了利用VEGF基因进行的血管生长，证明通过质粒载体将基因导入人体有比较好的疗效(Baumgartner，I.，等，Circulation97，11 14-1123(1998)；Isner，J.M.，等，J.Vasc.Surg.28，964-973(1998))。Isner等开始了两种不同的基因治疗临床研究：1)通过导管将VEGF基因导入血管壁，2)通过注射器将VEGF基因施用到肌肉内。特别是报告了后者的肢体获救率为70～80％。另外，血管内基因导入和肌肉内基因导入在临床试验中都没有显示免疫反应引起的毒性，已经有100名以上的患者接受治疗，具有良好的结果。现在几乎没有有关VEGF肌肉内基因给药的有害副作用和毒性水平的报道。但是，最近的报道表明，转基因(Thurston，G.，等，Science286，2511-2514(1999))或腺病毒(Thurston，G.，等，Nature Med.6，460-463(2000))引起的VEGF过度表达在基因导入动物中引发异常的血管生成，质粒介导的肌肉内VEGF基因导入导致人缺血肢体的一过性浮肿(Baumgartner，I.，等，Circulation 97，1114-1123(1998)；Isner，J.M.，等，J.Vasc.Surg.28，964-973(1998)Baumgartner，I.，等，Ann Intern Med.；132，880-884，(2000))。

至今为止完全不知道改善单独施用VEGF的血管生长疗法的缺点——血管通透性增加的具体实用的方法。

发明内容

为了防止基因治疗或药物治疗中单独施用VEGF导致的血管生长治疗的缺点——血管通透性增加，本发明提供一种方法，该方法通过在施用VEGF前施用促血管生成素，从而获得很高的血管生长诱导效果，并且没有浮肿副作用。

已知促血管生成素1(Ang-1)、促血管生成素2(Ang-2)及其受体Tie-2是与VEGF家族一样特异性作用于血管内皮的调节因子。促血管生成素是Tie-2酪氨酸激酶受体的配体，被视为与血管生长时的血管成熟有关，目前已知4个亚类，其中亚类1和亚类2与Tie-2受体结合。估计Ang-2是作为Ang-1的内源性拮抗剂起作用(Saito，T.N；Nature，Vol.376，70-74，(1995))。还已知Ang-2通过VEGF的作用被选择性地诱导(Oh，H.，等，J.Biol.Chem.，274，15732-15739(1999))。Ang-1与VEGF的区别在于Ang-1不能使血管内皮细胞增生，他参与血管周皮细胞的结合，并且不像VEGF那样导致血管通透性增加。已知血管生长中内皮-周皮细胞的相互作用是重要的调节机制。通过周皮细胞粘附到内皮细胞而使内皮细胞分化并抑制增殖。有人认为这种机制中包括活化TGF-β和形成包围细胞的物理屏障(D’Amore，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：4544-4548(1989))。

本发明人参照Kou-Gi Shyu等的促血管生成素效果研究报告，其中报道了给兔动物模型施用质粒pAng-1或pAng-2，发现pAng-1改善AG分数、血流、血管大小、毛细血管密度(Kou-Gi Shyu，等，Circulation.98，2081-2087(1998))，本发明人独立推断在VEGF开始发挥作用前预先诱导周皮细胞间的相互作用对新血管形成的有效性，从而开始实验并证实了其有效性。

另一方面，Thurston等表明，在使用伊凡斯蓝的血管通透性评价模型中，腺病毒介导的促血管生成素1基因导入可以抑制VEGF引发的通透性增加(Gavin Thurston，Nature Med，Vol.6，No.4，460-463，(2000))。但是，已知其它研究中，给兔动物模型同时施用质粒pAng-1和pVEGF的评价结果表明与单独施用pVEGF质粒几乎没有差异(Chase，J.K.，Arterio.Thromb.Vasc.Bio.20，2573-2578(2000))。

本发明着眼于两种基因的表达时期，并开发出一种局部给药方案，即在VEGF之前施用促血管生成素，这样能得到很好的血管生长诱导效果，且没有浮肿副作用。

即，本发明涉及通过在VEGF前施用促血管生成素获得很好的血管生长诱导效果且没有浮肿副作用的方法，更具体地，本发明涉及：

(1)局部给药治疗方法，其特征在于：在施用编码血管生长基因的载体或血管生长基因编码的蛋白质之前，施用编码促血管生成素的载体或促血管生成素；

(2)(1)中所述的方法，其中所述局部给药为肌内给药；

(3)(1)或(2)所述的方法，其中所述血管生长基因为VEGF121或VEGF165；

(4)(1)～(3)所述的方法，其中所述促血管生成素为促血管生成素1。

本发明中，术语“血管生长基因”是指与血管形成中的细胞发育、迁移、增殖、成熟直接或间接相关的基因。

本发明人采用安全性相对较高的质粒载体，并且给后肢缺血的兔模型预先肌内注射促血管生成素-1，然后肌内注射VEGF 165，由此悉心研究血管通透性低的血管生长方法，证实了其疗效。治疗的疾病包括例如：1)外周血管疾病、阻塞性动脉硬化症等；2)心脏疾病、心绞痛·心肌梗塞等；3)肾病、肾炎等；4)肺病、神经疾病等，除此之外，只要是血管生长诱导有效的疾病，没有特殊限制。治疗对象除了缺血组织外，还包括所有严格意义上不能称作缺血组织、但通过新生或重建机能良好的血管可以获得疗效的病症或疾病。例如肾炎、糖尿病性肾病变；顽固性溃疡；骨髓炎等慢性或急性顽固性感染；脑神经外科领域的脑底异常血管网病(moya-moya disease)和脑神经外科领域的其它血管性疾病等。作为给药部位的肌肉为骨骼肌、心肌和平滑肌等，与肌肉的种类无关，并且给药部位不限于肌肉，还包括给药至皮肤(表皮、真皮)、动脉、静脉(包括门静脉)、淋巴管、肾脏、浆膜、骨膜、结缔组织和骨髓等部位。通过局部给药而实质上获得疗效的方法包括载体或蛋白质的直接给药、通过载体和赋形剂给药。赋形剂是生理上可接受的物质，例如生物高分子等有机物、羟基磷石灰等无机物，具体可以列举胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物和这些物质的化学衍生物等。另外，赋形剂也可以是这些生理上可接受的材料的混合物。注入工具为普通的医疗用注射器或可以留在体外或体内的持续注入器等工业制品。所用载体只要是生理上可接受的载体，没有任何特殊限制，可以使用任何载体，包括腺病毒载体、腺病毒伴随载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、仙台病毒载体或非病毒载体。载体可以以经过载体处理的患者自身的细胞的形式使用。

附图说明

图1表示质粒pCAcc的结构。

图2表示质粒pCAhVEGF的结构。

图3表示质粒pCAhAng-1的结构。

图4表示将基因导入兔后肢缺血模型的方案。

图5是缺血侧的兔阴囊照片，这些照片表明V组在基因给药后第15天出现阴囊浮肿和静脉扩张，但预先施用Ang-1预防了VEGF诱导的阴囊浮肿。

图6是6个给药组在第60天的选择性骼内血管造影照片：(A)，对照组；(B)，V组；(C)，A组；(D)，A+V组；(E)，V-A组；(F)，A-V组。

图7是缺血大腿肌肉中通过碱性磷酸酶染色显出大量毛细血管EC的代表性显微镜照片。(A)，对照组；(B)，V组；(C)，A组；(D)，A+V组；(E)，V-A组；(F)，A-V组：Bar＝50μm，EC＝内皮细胞。

图8是缺血大腿肌肉中通过平滑肌细胞α-肌动蛋白染色显出被平滑肌细胞覆盖的小动脉的代表性显微镜照片。(A)，对照组；(B)，V组；(C)，A组；(D)，A+V组；(E)，V-A组；(F)，A-V组：Bar＝50μm。

发明的最佳实施方式

下面通过实施例具体说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

另外，在本发明的实施例中基本按照下列文献进行实验。

1.Satoshi Takeshita，J.Clin.Invest.，1994，93：662-670

2.Yukio Tsurumi，Circulation.，1996，94：3281-3290建立兔后肢模型，通过对其施用pVEGF证明AG分数、BPR和毛细血管密度得到改善。还有上述血流改善的评价方法。

3.Iris Baumgartner，Ann.Intern.Med.，2000，132：880-884对90例接受pVEGF的病人下肢浮肿的实际评价方法。

4.Kou-Gi Shyu，Circulation.，1998，98：2081-2087给兔模型施用pAng-1或pAng2，评价pAng-1对AG分数、血流、血管直径和毛细血管密度的改善。

5.Gavin Thurston，Nature Med，2000，6(4)：460-463。

6.G.Thurston，Science，1999，286：2511-2514用使用了伊凡斯蓝的血管通透评价模型，评价腺病毒载体介导的Ang-1导入对受到抑制的VEGF诱导性血管通透性增加的改善。

7.Lioubov Poliakova，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.，1999，118：339-347.评价通过腺病毒导入了VEGF的兔模型中阴囊面积和小腿周径的经时变化。

本发明的实施例中，数据表示为平均值±SEM。统计对比采用ANOVA以及随后的Bonferroni/Dunn检验，p＜0.05时视为有统计学意义。

[实施例1]质粒

(1)编码VEGF的DNA通过RT-PCR获得，以从人神经胶质瘤U251细胞提取的RNA作为模板，所用引物为#1191：(CCGGAATTCACCATGAACTTTCTGCTGTCT/SEQ ID NO：1)和#1192：(CGCGGATCCTCACCGCCTCGGCTTGTCACA/SEQ ID NO：2)。所得的DNA片段用EcoRI/BamHI进行消化，克隆至pBluescriptSKII+的EcoRI/BamHI位点，得到质粒。确定该质粒的碱基序列后，切取EcoRI/BamHI片段，克隆至pCAcc(图1)的EcoRI/BglII位点，得到pCAhVEGF(图2)。对照载体pCAcc(Yoshida等，1997)来自以前报道的pCAGGS(Niwa等，1991)。

(2)编码促血管生成素1(GenBank：HSU83508(U83508))的DNA通过RT-PCR获得，以从人骨髓细胞(骨髓穿刺所得的具有持续贴壁能力的细胞、被称为骨髓基质细胞)中提取的RNA为模板，用#1435：(GAAGATCTATGACAGTTTTCCTTTCCTTTG/SEQ ID NO：3)和#1436：(GAAGATCTCAAAAATCTAAAGGTCGAATCA/SEQ ID NO：4)作为引物。所得的DNA片段用BglII进行消化，然后克隆到pBluescriptSKII+的BglII位点，得到质粒。确定该质粒的碱基序列后，切取BglII片段，克隆至pCAcc(图1)的BglII位点，得到pCAcchAng-1a(图3)。克隆后的DNA片段的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

另外，以pCAcchAng-1a的促血管生成素cDNA片段为模板，用#1641：(GGGAATTCACCATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGCTTTC/SEQ ID NO：6)和#1638：(AGCTCCTGGATTATATATGTTTGACG/SEQ ID NO：7)作引物进行PCR。所得的片段用EcoRI进行消化，然后用于替换pCAcchAng-1a的EcoRI片段，由此得到表达人促血管生成素cDNA的pCAcchAng-1，它具有Kozak共有序列。克隆后的DNA片段的碱基序列如SEQ ID NO：8所示。

[实施例2]动物模型

使用新西兰白兔(雄性，3.0～3.5kg)。用3ml盐酸氯胺酮(Sankyo Co.，Ltd.)和1ml甲苯噻嗪(Daiichi Pharmaceutical Co.，Ltd.)的混合物将兔麻醉后，切开左大腿腹股沟韧带到膝盖部分的皮肤，暴露出大腿动脉。结扎并切除所有的动脉分支，然后切出大腿动脉。将其放置10天，建立慢性后肢缺血模型，即兔后肢缺血模型(Takeshita，S.，J.Clin.Invest.，1994，93：662-670)。用3个小组进行比较研究。在模型建立当天(OPE day)后的第10天(Day 10)，或者在第10天(Day 10)和第15天(Day 15)，肌内给予质粒。给药方法如下：将每只质粒(500μg)溶于2.5ml PBS中，在缺血侧的大腿内侧切开小口，然后将上述溶液直接注入内侧阔肌(2处)、收肌(2处)和半膜肌(1处)。所述每种注射用27G的针缓慢进行，每处500μl，共5处。

将动物模型按照质粒给药方案(图4)分成以下6组：

1.对照兔(C组)，在第10天给予500μg安慰剂(pCAcc)(n＝8)；

2.单独给予VEGF(V组)，在第10天给予500μgVEGF(n＝10)；

3.单独给予Ang-1(A组)，在第10天给予500μgAng-1(n＝7)；

4.组A+V，在第10天给予500μgAng-1和500μgVEGF(n＝7)；

5.组A-V，在第10天给予500μgAng-1，然后在第15天给予500μgVEGF(n＝10)；

6.组V-A，在第10天给予500μgVEGF，然后在第15天给予500μgAng-1(n＝7)。

[实施例3]浮肿评价

通过测定阴囊面积和后肢周长评价VEGF的主要副作用之一——浮肿。在第10、15、20和40天用数码照相机拍摄患病一侧的阴囊，将第10天的面积设为100％，观察其变化。同样，在第10、15、20和40天测定患病一侧的后肢周长，观察其变化。

单独给予VEGF引起的浮肿的代表性现象如图5所示，其中发现阴囊面积增加，并且伴有静脉扩张。质粒DNA给药组都没在坏死等炎性变化后出现阴囊浮肿。在第10天肌内注射质粒DNA之前的平均阴囊面积为7.14±1.06cm²，相对于第10天的阴囊面积变化率如表1所示。ab

表1

阴囊面积(％)

第10天第15天第20天第40天

对照组 100 101.6±2.7 101.5±4.1 103.3±2.8

V组 100 140.1±11.1^b 111.2±5.8 107.7±1.8

A组 100 94.6±1.5 98.4±3.3 98.0±5.5

A+V组 100 115.5±6.1 107.1±4.0 97.6±5.1

V-A组 100 117.9±4.4^a 110.8±7.5 118.4±8.6

A-V组 100 98.4±2.0 94.5±3.7 94.4±5.1

^ap＜0.05(与对照组比较)

^bp＜0.01(与对照组比较)。

在第15天发现，与C组(101.6±2.7％)相比，V组(140.1±11.1％，^bp＜0.01)和V-A组(117.9±4.4％，^ap＜0.05)的浮肿有统计学意义上的显著增加。V组和V-A组中，浮肿面积在第20和第40天继续增加，但这些增加具有微小的显著性(marginal significance)。该实验中，A-V组在整个实验期间都没有发现阴囊面积的增加。上述结果表明V组和V-A组在注入基因后10天的短时间内发生全身浮肿。相反，预先给予促血管生成素-1看来可以预防VEGF诱发的全身浮肿。另外，还评价了后肢周长的变化，它可以指示后肢下部的局部浮肿。与C组相比，A-V组中没有发现局部浮肿的增加，V组、A+V组和A-V组中观察到了局部浮肿的增加。

[实施例4]新生血管密度的测定

在第10和40天，通过碱性磷酸酶染色进行患病一侧的骼内动脉血管造影，用血管造影分数(AG分数)评价血管生长。血管造影如下进行：麻醉后，将2.7Fr输注管从右边内侧颈动脉选择性地插入患病一侧的骼内动脉中。注入0.25mg硝酸甘油(nitrol)，然后用3ml造影剂(将3ml造影剂在5秒内注入)进行血管造影。将5mm²的网格(grid)以5mm的间隔置于大腿部位，被血管横跨的网格计为1，未被血管横跨的网格计为0。AG分数定义为有血管横跨的网格的总数/网格总数。

在第10天，C组、V组、A组、A+V组、A-V组和V-A组间的AG分数没有差异(分别为0.08±0.02、0.11±0.02、0.07±0.04、0.08±0.03、0.07±0.02和0.08±0.02)。但是，在第40天，V组、A组和A-V组的AG分数比对照组高(C组：0.29±0.05，V组：0.64±0.05^a，A组：0.52±0.03^a，A-V组：0.58±0.02^a；^ap＜0.01)(表2)。没有发现5个给药组之间的显著性差异。图6所示的代表性血管造影结果显示了该6组中大腿内侧新血管形成在数量和内径方面的差异。实际上，A-V组在靠近尾部臀动脉一侧的内径比对照组大(C组：0.77±0.02mm；A-V组：1.01±0.03mm^a；^ap＜0.01)(表2)。另外，A-V组的血管内腔大于(p＜0.01)V组(0.76±0.05mm)，这表明预先给予促血管生成素-1可能有助于形成更大的血管。在V组中，血管形成数量出现增多倾向，在A-V组中，在大腿中部形成的血管的内径有增大倾向。

表2

AG分数动脉直径(mm)

对照组 0.29±0.05 0.77±0.02

V组 0.64±0.05^a 0.76±0.05

A组 0.52±0.03^a 0.85±0.08

A+V组 0.49±0.06 0.90±0.05

V-A组 0.50±0.07 0.90±0.04

A-V组 0.58±0.02^a 1.01±0.03^a，b

AG分数＝血管造影分数

^ap＜0.01(与对照组比较)

^bp＜0.01(与V组比较)

[实施例5]血压比的测定

在第10和第40天测定血压比。通过多普勒寻找后颈动脉并测定血压。缺血一侧的血压/正常一侧的血压之比定为BPR(血压比)，以此作为体循环的指标。

在第10和第40天通过选择性血管造影、腓部血压(CBP)和静息血流(RBF)评价血液动力学状态的改善。具体地，根据以往的记载(Takeshita等，1994)，用与血压计相连的多普勒流量计(Datascope，Montvale，NJ)和臂带(cuff)，在第10和第40天测量各动物模型缺血侧和正常侧后肢的腓部血压(体血压)(CBP)。确定每一模型的CBP比，作为缺血肢/正常肢的收缩期CBP比。

肌内注射(第10天)质粒DNA之前各组间的CBP比没有差异，表明手术一侧的后肢发生了重症缺血。但是，第40天时，A-V组的CBP比(86.0±8.1％，^ap＜0.01)明显高于C组(51.7±6.9％)(表3)。

还进行了局部组织中血液灌流改善的评价。具体地，在收肌——内侧阔肌和半膜肌上安装经皮探针(P-430，LASERFLO BPM²，Vasamedics，St.Paul，Minnesota)，由此在第10和第40天测定缺血肢的静息血流(RBF)。缺血肢的RBF定义为上述区域中4个点的平均峰速度，RBF比是第40天的RBF与第10天的RBF之比。在第10天，没有发现6个小组之间手术侧肢体的RBF有差异。第40天的血流逆转(血流予偏能)变化如表3所示。从第40天的RBF/第10天的RBF之比的计算值看出A-V组(234.8±12.5％，^ap＜0.01)与C组(139.6±10.4％)相比有明显改善，但其它组中的血压灌流程度比A-V组低。

表3

CBP比(％) 局部RBF比(％)

对照组 51.7±6.9 139.6±10.4

V组 68.4±5.6 187.6±24.5

A组 67.6±5.7 207.8±20.5

A+V组 82.7±8.8 193.3±26.6

V-A组 72.4±13.8 169.0±24.2

A-V组 86.0±8.1^a 234.8±12.5^a

CBP比表示腓部血压比，局部RBF比表示局部静息血流比。^aP＜0.01(与对照组相比)。

[实施例6]组织血流的测定

在第10和第40天用组织血流计测定组织血流。在缺血侧的内侧阔肌2处、收肌2处进行测定，将第10天的值设为100％，评价合计值(BPM2)。结果发现，与对照组相比，预先给予Ang-1的组中，BPR、BPM2明显改善。

[实施例7]VEGF蛋白测定

在第0、10、15、20和40天用酶联免疫吸附测定(ELISA)人VEGF免疫测定试剂盒(Techne Corp.，Minneapolis，MN)测定VEGA的血清浓度。此次测定的灵敏度为9.0pg/mL。各组的VEGF蛋白水平仅为中等程度，第15天时各实验组最高为10～30pg/ml。

[实施例8]组织学评价

在第40天，从缺血肢采取两份块状收肌样品(block-samples)以进行组织分析。将一份样品包埋到OCT化合物中，然后在液氮中快速冷冻，以便进行碱性磷酸酶染色，从而测定毛细血管密度；另一份样品在福尔马林中浸渍固定48小时，然后包埋到石蜡中，以便进行平滑肌细胞α-肌动蛋白染色，从而测定小动脉密度。用恒冷切片机制作多个冷冻切片(10μm厚)，按照现有记载(Ziada等，1984)，通过吲哚氧基-四唑鎓方法进行碱性磷酸酶染色，以便检出毛细血管内皮细胞。毛细血管密度定义为每mm²的平均毛细血管数。为了进行免疫组织化学，以抗平滑肌α-肌动蛋白的抗体(1A4，Dako JapanCo.，Ltd.，Tokyo，Japan)作为第一抗体，用生物素化的抗小鼠血清以及与过氧化物酶偶联的链霉抗生物素蛋白通过HISTFINE SAB-PO试剂盒(NichireiCorp.，Tokyo，Japan)进行检测。为了鉴别小动脉并区别于毛细血管或小静脉，在3片不同的切片上选择15个不同的视野，阳性平滑肌细胞按照相同的方法计数。小动脉密度表示为每个视野的平均小动脉数。

以毛细血管(直径小于10μm)水平的新血管形成评价毛细血管密度(毛细血管数/mm²)。A-V组中的密度较高(C组：169.9±8.5；A-V组：273.2±25.8^a；^ap＜0.01(与C组相比))(表4)。碱性磷酸酶染色切片的代表性显微镜照片如图7所示。通过血管中层膜α-肌动蛋白的免疫组织化学染色发现小动脉水平的新血管形成，其在血管生长的后期产生，是直径在10～50μm的血管。A+V组和A-V组中小动脉密度(小动脉数/视野)明显高于对照组(C组：4.8±0.5；A+V组：10.4±1.7^a；A-V组：12.4±1.4^a；^ap＜0.01)，但V组(6.1±0.8)和A组(6.3±1.3)中的增加具有微小的显著性(表4)。另外，A-V组中的增加大于V组(^bp＜0.01)和A组(^cp＜0.01)。α-肌动蛋白染色切片的代表性显微镜照片也如图8所示。从采用碱性磷酸酶染色和平滑肌细胞α-肌动蛋白染色的定量分析发现，通过细胞因子的联合应用、特别是预先施用促血管生成素-1，可以比单独给药方案形成更多的功能性血管。

表4

毛细血管密度动脉密度

(毛细血管数/mm²) (小动脉数/视野)

对照组 169.9±8.5 4.8±0.5

V组 228.0±3.2 6.1±0.8

A组 237.2±16.6 6.3±1.3

A+V组 242.7±22.8 10.4±1.7^a

V-A组 234.6±13.1 8.6±0.9

A-V组 273.2±25.8^a 12.4±1.4^a，b.c

^ap＜0.01(与对照组相比)

^bp＜0.01(与V组相比)

^cp＜0.01(与A组相比)。

在治疗性血管生长中，功能性血管的生成对于给缺血部位提供充足的血流是必需的。但是，数项研究表明，单独施用临床试验中广泛使用的VEGF对促进功能性血管生长的效果不确定。

对于这种考虑有两种理由。第一，主动脉中出现狭窄或阻塞，诱发外周血管缺血，导致转录因子——低氧诱导因子-1(HIF-1)的表达和活化。HIF-1的表达引起编码一氧化氮合成酶和VEGF的基因等多种血管生长基因的转录增加，血管生长级联反应向前进展(Royen等，2001)。尚不清楚通过单独给予VEGF基因产物能否实现功能性血管的形成。最近的某个研究声明VEGF可能刺激毛细血管的出芽，但该反应没有明显改善侧支血流(Hershey等，2001)。另外，在施用HIF-1α/VP16对兔后肢缺血的改善研究表明，施用HIF-1α/VP16比单独施用VEGF基因的改善效果好(Vincent等，2000)。第二，对数项用VEGF基因治疗缺血性疾病的临床试验进行的评价虽然报告了好的结果，但有一些研究没有表现出明显的改善(Rajagopalan等，2001)。实际上，在本发明的实施例中，单独施用VEGF虽然诱导毛细血管数量的增加，但没有改善血液动力学状态，也没有介导血管成熟。累积上述研究的结果是：如果生长因子联合治疗或主导转换基因(master switch genes)可以获得具有临床有益效果的血管生长或动脉生长，则有必要进一步深入了解这种治疗(Blau等，2001；Carmeliet.，2000；Simons等，2000)。

在本发明的实施例中，与单独施用Ang-1或VEGF或其它给药方案相比，预先给予Ang-1对血液动力学状态、血管生长后期的血管成熟和保护血管防止血浆渗漏的改善效果更好。上述数据表明，预先施用Ang-1所产生的刺激促进早期和晚期的血管生长，有助于血管成熟，这可能是改善血液动力学状态和血管保护的原因。

在该模型中，预先施用Ang-1促进早期和晚期的血管生长可能有两种的机理。第一，通过外源性Ang-1基因产生的血流中的内皮前体细胞(CEP)可能增强VEGF诱发性血管生长。CEP是出生后血管生长的原因(Asahara等，1999)，最近的一项研究表明，与施用VEGF相比，施用Ang-1基因延长CEP的移动(Hattori等，2001)。在小鼠中腺病毒引起VEGF165过度表达导致CEP向外周血液移动，在第2天达到峰值，第14天以前回到对照水平。相反，Ang-1的过度表达导致CEP水平上升，其峰值出现在第7～14天，在第28天以前回到对照水平。因此，在预先施用Ang-1的方案中，VEGF基因和Ang-1基因联合治疗的效果更好，因为施用这两种基因引起的CEP移动的各个峰值同时出现。另外，Yamashita等证明EC和壁细胞(周皮细胞和血管平滑肌细胞)可能来自共同的前体细胞(Yamashita等，2000)。他们得出了下述结论：VEGF是EC分化所必需的，但是壁细胞的分化可以与外源性生长因子无关(Yamashita等，2000)。因此，通过在没有外源VEGF的状态下预先给予Ang-1基因直至第15天，可以促进由CEP和循环壁前体细胞(CMP)构成的循环前体细胞(CP)的移动。在预先施用Ang-1的方案中，VEGF给药(增加CEP)的时间晚于其它联合应用，导致更多的成熟血管生成，因此CP群中的CMP比例高于其它给药方案。第二，预先给予Ang-1基因，然后给予VEGF基因，可以刺激Ang2(一种重要的血管生长诱发因子)的明显基因转换，从而增强新血管的形成。Ang2的表达对成人的血管生长是必需的，该因子在血管生长部位起早期作用(Malsonpierre等，1997)。另外，Mandriota等表明Ang2 mRNA水平随VEGF的施用而升高，随Ang-1的施用而降低(Mandriota等，1998)。综合以上的结果表明，预先给予Ang-1基因的给药方案比其它的联合应用方案能更明确地引起向内源性Ang2的血管生长性转换，且Ang2的表达可以更长时间地促进血管生长。在同时给药的方案中，由于VEGF和Ang-1对Ang2基因表达起相反的作用，Ang2的表达比预先给药方案中的更低。另外，后给药方案中，Ang-1的给药是在第15天，因此Ang2的表达时间比预先给药中的时间更短。

本发明人用阴囊面积评价VEGR诱发性浮肿。因为兔的阴囊与躯干分离，其组织支持弱，结缔组织间隙大，容易引起血管外渗液的蓄积，因此阴囊面积的变化率对浮肿评价而言灵敏度高。本发明实施例中，只有预先给药方案中预防了浮肿。Ang-1可以促进内皮细胞牢固附着在其周围的基质和细胞上，预防因各种刺激而导致的血管通透性(Thurston等，1999)。Ang-1诱导附着的分子机理有待进一步阐明，但最近的研究表明，Ang-1可以直接支持由整联蛋白介导的细胞粘附(Carlson等，2001)。Thurston等报道用腺病毒载体将Ang-1基因导入大鼠后，48小时以内产生对血管渗漏的抵抗性，这一点也通过相同的动物模型在7天后注入VEGF蛋白得到证实(Thurston等，2000)。实际上，本发明人的结果表明，预先给药方案阻止了VEGF诱导的血管通透性。相反，其它的给药方案中，由于没有时间产生Ang-1诱导的通透抵抗性并预防VEGF导致的血管通透性，因此出现浮肿。

综上所述，VEGF和Ang-1的3种联合应用方案中，只有Ang-1基因的预先给药方案显示对缺血部位的有效改善。本发明的实施例中，通过预先给予Ang-1基因，使缺血肢的血压明显升高，缺血部位中的血流得到改善，形成成熟血管，并预防了浮肿。因此，预先给予Ang-1基因刺激可对VEGF基因疗法中的治疗性血管生长有益。

工业适用性

本发明提供下述方法：该方法通过在VEGF之前施用促血管生成素，获得很好的血管生长诱导效果，并且没有浮肿副作用。因此，本发明提供了一种基因治疗，它能够防止单独施用VEGF所导致的血管通透性增加。

序列表

<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)

<120>血管再生疗法

<130>D3-A0104P

<140>

<141>

<150>JP 2001-174919

<151>2001-06-08

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>1

ccggaattca ccatgaactt tctgctgtct 30

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>2

cgcggatcct caccgcctcg gct tgtcaca 30

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>3

gaagatctat gacagttttc ctttcctttg 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>4

gaagatctca aaaatctaaa ggtcgaatca 30

<210>5

<211>1508

<212>DNA

<213>(Homo sapiens)

<400>5

agatctatga cagttttcct ttcctttgct ttcctcgctg ccattctgac tcacataggg 60

tgcagcaatc agcgccgaag tccagaaaac agtgggagaa gatataaccg gattcaacat 120

gggcaatgtg cctacacttt cattcttcca gaacacgatg gcaactgtcg tgagagtacg 180

acagaccagt acaacacaaa cgctctgcag agagatgctc cacacgtgga accggatttc 240

tcttcccaga aacttcaaca tctggaacat gtgatggaaa attatactca gtggctgcaa 300

aaacttgaga attacattgt ggaaaacatg aagtcggaga tggcccagat acagcagaat 360

gcagttcaga accacacggc taccatgctg gagataggaa ccagcctcct ctctcagact 420

gcagagcaga ccagaaagct gacagatgtt gagacccagg tactaaatca aacttctcga 480

cttgagatac agctgctgga gaattcatta tccacctaca agctagagaa gcaacttctt 540

caacagacaa atgaaatctt gaagatccat gaaaaaaaca gtttattaga acataaaatc 600

ttagaaatgg aaggaaaaca caaggaagag ttggacacct taaaggaaga gaaagagaac 660

cttcaaggct tggttactcg tcaaacatat ataatccagg agctggaaaa gcaattaaac 720

agagctacca ccaacaacag tgtccttcag aagcagcaac tggagctgat ggacacagtc 780

cacaaccttg tcaatctttg cactaaagaa ggtgttttac taaagggagg aaaaagagag 840

gaagagaaac catttagaga ctgtgcagat gtatatcaag ctggttttaa taaaagtgga 900

atctacacta tttatattaa taatatgccg gaacccaaaa aggtgttttg caatatggat 960

gtcaatgggg gaggttggac tgtaatacaa catcgtgaag atggaagtct agatttccaa 1020

agaggctgga aggaatataa aatgggtttt ggaaatccct ccggtgaata ttggctgggg 1080

aatgagttta tttttgccat taccagtcag aggcagtaca tgctaagaat tgagttaatg 1140

gactgggaag ggaaccgagc ctattcacag tatgacagat tccacatagg aaatgaaaag 1200

caaaactata ggttgtattt aaaaggtcac actgggacag caggaaaaca gagcagcctg 1260

atcttacacg gtgctgattt cagcactaaa gatgctgata atgacaactg tatgtgcaaa 1320

tgtgccctca tgttaacagg aggatggtgg tttgatgctt gtggcccctc caatctaaat 1380

ggaatgttct atactgcggg acaaaaccat ggaaaactga atgggataaa gtggcactac 1440

ttcaaagggc ccagttactc cttacgttcc acaactatga tgattcgacc tttagatttt 1500

tgagatct 1508

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>6

gggaattcac catgacagtt ttcctttcct ttgctttc 38

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：人工合成的引物序列

<400>7

agctcctgga ttatatatgt ttgacg 26

<210>8

<211>1511

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>8

gaattcacca tgacagtttt cctttccttt gctttcctcg ctgccattct gactcacata 60

gggtgcagca atcagcgccg aagtccagaa aacagtggga gaagatataa ccggattcaa 120

catgggcaat gtgcctacac tttcattctt ccagaacacg atggcaactg tcgtgagagt 180

acgacagacc agtacaacac aaacgctctg cagagagatg ctccacacgt ggaaccggat 240

ttctcttccc agaaacttca acatctggaa catgtgatgg aaaattatac tcagtggctg 300

caaaaacttg agaattacat tgtggaaaac atgaagtcgg agatggccca gatacagcag 360

aatgcagttc agaaccacac ggctaccatg ctggagatag gaaccagcct cctctctcag 420

actgcagagc agaccagaaa gctgacagat gttgagaccc aggtactaaa tcaaacttct 480

cgacttgaga tacagctgct ggagaattca ttatccacct acaagctaga gaagcaactt 540

cttcaacaga caaatgaaat cttgaagatc catgaaaaaa acagtttatt agaacataaa 600

atcttagaaa tggaaggaaa acacaaggaa gagttggaca ccttaaagga agagaaagag 660

aaccttcaag gcttggttac tcgtcaaaca tatataatcc aggagctgga aaagcaatta 720

aacagagcta ccaccaacaa cagtgtcctt cagaagcagc aactggagct gatggacaca 780

gtccacaacc ttgtcaatct ttgcactaaa gaaggtgttt tactaaaggg aggaaaaaga 840

gaggaagaga aaccatttag agactgtgca gatgtatatc aagctggttt taataaaagt 900

ggaatctaca ctatttatat taataatatg ccggaaccca aaaaggtgtt ttgcaatatg 960

gatgtcaatg ggggaggttg gactgtaata caacatcgtg aagatggaag tctagatttc 1020

caaagaggct ggaaggaata taaaatgggt tttggaaatc cctccggtga atattggctg 1080

gggaatgagt ttatttttgc cattaccagt cagaggcagt acatgctaag aattgagtta 1140

atggactggg aagggaaccg agcctattca cagtatgaca gattccacat aggaaatgaa 1200

aagcaaaact ataggttgta tttaaaaggt cacactggga cagcaggaaa acagagcagc 1260

ctgatcttac acggtgctga tttcagcact aaagatgctg ataatgacaa ctgtatgtgc 1320

aaatgtgccc tcatgttaac aggaggatgg tggtttgatg cttgtggccc ctccaatcta 1380

aatggaatgt tctatactgc gggacaaaac catggaaaac tgaatgggat aaagtggcac 1440

tacttcaaag ggcccagtta ctccttacgt tccacaacta tgatgattcg acctttagat 1500

ttttgagatc t 1511

Claims

1、局部给药治疗方法，其特征在于：在施用编码血管生长基因的载体或血管生长基因编码的蛋白质之前，施用编码促血管生成素的载体或促血管生成素。

2、权利要求1所述的方法，其中所述局部给药为肌内给药。

3、权利要求1或2所述的方法，其中所述血管生长基因为VEGF121或VEGF165；

4、权利要求1～3任意一项所述的方法，其中所述促血管生成素为促血管生成素1。