CN1513552A - 肺组织胞浆菌（球状酵母菌）系列疫苗和诊断试剂及生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种由SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)，生产SARS系列特异性预防疫苗，其中包括混合疫苗、多糖疫苗(糖蛋白)，核酸疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗、细胞壁疫苗、毒素、类毒素疫苗、合成和半合成疫苗、基因重组疫苗、抗独特型抗体疫苗和生产特异性免疫球蛋白或单克隆抗体。以及特异性诊断试剂，包括酶联免疫诊断试剂、PCR诊断试剂、荧光抗体免疫诊断试剂、胶体金诊断试剂。供SARS流行疫区人群和各类易感人群特异性预防和诊断之用。

Description

肺组织胞浆菌(球状酵母菌)系列疫苗和诊断试剂及生产方法

本发明于2003年4月18日下午13时在中国广州历史时一个多月，由余国华成功鉴定并确认“非典”、SARS病原体是流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)变种，并开发本病原体医药科学研究和生产系列制品。

本发明提供一种采用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)为原料，制造出系列疫苗制品，生产SARS免疫特异性诊断试剂和筛选药物、测试基因序列，绘制基因图谱以及有关科学研究(附图)。图是肺组织胞浆菌(球状酵母菌)变种纯培养形态特征。

本发明提供一种采用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)为原料，制造混合疫苗和制造提纯精制系列特异性预防疫苗，包括多糖疫苗(糖蛋白)、核酸疫苗、亚单位疫苗，合成和半合成疫苗、胞壁疫苗、多肽疫苗、毒素、类毒素疫苗、基因重组疫苗、抗独特型抗体疫苗和生产特异性免疫球蛋白，以及用上述原料，制造出其他新生物制品，用于SARS特异性预防和特异性诊断。

1、技术领域：属生物技术领域

2、背景技术：由流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)引起的局限性或传播性深部真菌病，属流行病，生活在流行区的人多数会被感染，临床表现分原发性和进行性两种，原发性是急性、自限性的肺部感染，但少数发展为进行性急性、播散性深部真菌病，可以侵袭脑、肺、内脏和器官，严重者可危及生命。

流行性肺组织胞浆菌(球状酵母)是一种双相型真菌，寄生于人体组织内，本菌呈球形，称为球体，球体成熟时含有园形或不规则圆形内生孢子，(endospore)，数目可由数个至数十个，或充满球体。1周后球体成熟、破裂、释放出内生孢子，每个内生孢子又发教育成新的球体，球体成熟后又释放出生孢子，如此循环往复地生长繁殖，球体直径约有10-80μm，少数可达100μm；内生孢子直径1～2μm，少数可达10μm。菌体排出体外，在培养基上生长发芽，延长分支成为菌丝体，称为关节菌丝。

SARS流行性肺组织胞浆菌病(球状酵母病)，是最新发现的烈性传染病，本病对人群呼吸系统高度易感，主要临床表现为发烧、咳嗽、气促、呼吸困难、软弱、白细胞减少，X光诊断为非典型性肺炎。本病原体属于真菌属，是一种双相真菌，在血琼脂和沙保罗氏琼脂培养生长缓慢，约2-3周才长出肉眼可见的白色小菌落，在动物模型病理组织切片中，肺、脾、肝、脑等组织可见大量园形、椭园形、周围有一光亮带的厚壁酵母样孢子粒颗，在液体纯培养中可形成大小不等的孢子体，(见附图)。

3、发明内容

采用SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)为原料制造灭活疫苗和减毒疫苗，制造提纯精制系列特异性预防疫苗，包括多糖疫苗(糖蛋白)、核酸疫苗、亚单位疫苗、合成和半合疫苗、胞壁疫苗、多肽疫苗、毒素、类毒素疫苗、基因重组疫苗、抗独特型抗体疫苗和生产特异性免疫球蛋白，以及用上述原料，制造出其他新生物制品，用SARS特异性预防疫苗。并同时通过免疫技术生产酶联免疫试剂，PCR诊断试剂，免疫萤光抗体诊断、胶体金诊断试和基因芯片等诊断用品，制造抗体、多克隆抗体和单克隆抗体。

(1)技术关键

①本发明制造的系列疫苗，主要通过菌株分离、扩增、纯化、灭活、脱毒(死菌)制造而成，其灭活方法是使在水浴中或相当的加温环境中用100℃10-40分钟，或60-95℃，1-6小时灭活，或采用1％-3％甲醛灭活和同时脱毒，达到灭活目的，并保持疫苗抗原的免疫活性的最佳状态。

②本发明生产SARS系列预防疫苗，主要通过菌种培养、扩增、发酵、浓缩然后用物理、化学方法或生物技术，分离免疫活性组分，经层析、提取、纯化和精制。用细胞破碎器或用其他特殊的处理方法将细胞解体然后分离，提取、纯化、精制加工制造成系列特异性预防疫苗和系列特异性诊断试剂。

(2)技术方案

①本发明制造的疫苗，是采用一种前所未有的灭活和甲醛脱毒的方法制造出安全有效SARS的预防疫苗。

②用细菌破碎器破碎菌体，除去细胞碎片，硅胶吸附粗提糖蛋白、核酸、亚单位、细胞壁、毒素，然后用疏水层析法精提，经硫氰酸盐或其他沉淀剂处理后，获取目的产品，稀释和除菌，然后进行纯化，产品检定。通过聚丙烯酸胺凝胶电泳、免疫印染、高压液相等程序，使制品达到所需要求，进入疫苗半成品生产成注射液和喷喉气雾剂以及滴鼻的粘膜免疫滴剂。成品检定合格后分装、包装、商品化进入市场。为实现上述目标具体方法如下：

本发明的SARS预防疫苗，根据抗原活性对动物产生的抗原抗体免疫反应和免疫耐受性，通过菌株分离扩增、纯化、灭活、脱毒和毒性、效力试验、安全试验等程序，SARS预防疫苗的临床用量单位按含菌数计算，供皮下或肌肉注射的疫苗，用于滴鼻和喷喉气雾剂。并制造球SARS预防苗的系列剂型，如气雾剂、滴鼻雾剂(液体)和用于舌下含的片剂、供皮下或肌肉注射针剂，以及冻干粉针剂等。供预防SARS感染之用。采用减毒活疫苗的剂量是灭活疫苗减量的2～20倍。

(3)技术效果

SARS病，当今被认为是一种烈性传染病，本发明研制成功特异性预防疫苗，是彻底解决本病的传播延和易感者预防的最佳途径。世界公认，疫苗是最有效、最方便、最安全、最经济的预防传染病方法，SARS预防疫苗的研制成功，将于人类健康作贡献。

本发明流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)其制造方法是采用上述灭活方法，经反复多次离心洗涤，加入适量无菌溶剂，用超声波粉碎和反复冻溶后，经毒性试验、安全试验、过敏试验，用适当溶剂以1∶100-10000稀释，无菌试验合格，供特异性诊断SARS皮试应用(0.1ml/次皮内)。

对于急性流行病病原学的正确诊断，是消除流行病的传染源和对患者的及时治疗以及预防的关键，本发流行性肺组织胞浆菌素和球状孢子菌素研制成功，提供了一种特异性诊断用品，并同时用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)为原料生产酶联免疫试剂，PCR诊断试剂，免疫萤光试剂胶体金和基基芯片等特异性诊断试剂。

为实现上述目标，本发明采用技术方案如下：

《SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)

多糖疫、核酸疫苗制造方法》

1.定义、组织及用途

本品系用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)培养液，经提纯获得多糖抗原，并加入适宜稳定剂后冻干制成，供预防SARS感染之用。

2制造

2.1基本要求

2.1.1设施与生产质量管理

按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。同时还必须具备三级安全实验和生产工作(P3)条件，并须在二级以上生物安全匮中操作；动物模型须在P3和P3级以上实验室中进行。

2.1.2原料及辅料

应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。

2.1.3生产用水

生产用水源水应符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。

2.1.4生产用器

直接用于生产的金属或玻璃等器具，必须严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。

2.1.5生产及检定用动物

小鼠、豚鼠应符合清洁级标准。

2.2菌种

2.2.1菌种名称及来源

制造用疫区分离的SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)应经国家药品管理当局批准，并由国家药品检定机构或国家指定的单位保管和分发。

2.2.2种子批的建立

生产用菌种应采用种子批系统。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性。从原始种子批传代、扩增后冻干保存为主种子批。从主种子批制备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。

2.2.3种子批的检定

菌种接种在含10％羊血普通琼脂培养基上25℃，2周后生长出细小白色棉花样菌落，在GH改良液体培养24-48小时培养，涂片镜检应为纯的园形大小不等的孢子体。

2.2.3.1生化反应

接种葡萄糖、果糖及蔗糖，于35～37℃培养5-7日，发酵葡萄糖、麦芽糖，产酸不产气。

2.2.3.3血清凝集试验

将在25℃-37℃培养24-48小时培养悬液于0.5％  甲醛生理氯化钠溶液或60℃加热60分钟杀菌以后，使每1ml含菌1.0×10⁹-2.0×10⁹，与特异血清定量凝集反应，应置35-37℃过夜，次日再放置室温2小时观察结果，以肉眼可见清晰凝集现象之血清最高稀释度(+)为凝集效价，必须达到原血清效价之半。参考血清由国家药品检定机构分发或同意。

2.2.4菌种传代及保存

2.2.4.1菌种应冻干保存于2～8℃。主种子批自启开后传代最多不能超过5代。

2.2.4.2工作种子批生产前应检查菌种的全部特性，合格后方可用于生产。

2.3原液制备

2.3.1  生产用种子

将工作种子批菌种启开后，接种在GH改良液体培养基或其他适宜培养基上，放25～37℃培养一般不超过48小时，第2-4代菌种可用适宜的液体培养基，25-37℃。由此制备适宜数量的生产用工作种子，工作种子批开启后至接种培养不得超过5代。

2.3.2生产用培养基

生产多糖疫苗可选用适宜培养基。生产用的液体培养基不应含有能与加入的十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏原物质。

2.3.3菌种接种和培养

采用密封培养罐液体培养。于培养基中接种生产用工作种子后。在培养过程中和杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做美兰染色镜检，如发现污染杂菌，应去弃。

2.3.4收获和杀菌

培养物于对数生长期后或静止期前期收获。一般培养24-48小时为宜。将培养物加入甲醛溶液杀菌，或加热杀菌，以确保杀菌安全并不损伤菌体多糖为宜。

2.3.5提纯和精制

2.3.5.1去核酸(保留用于生产核酸)

将已杀菌的单一收获物(或合并收获物)离心去菌体，收集上清液，于其中加入十六烷基三甲溴化铵混匀，离心收集沉淀物。沉淀物中加入氯化钙溶液，使最终浓度为1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25％(ml/ml)。冷库静置3小时或过夜，离心去沉淀，收集澄清的上清液。

2.3.5.2沉淀多糖

于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度80％(ml/ml)，充分振摇。离心收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物(多糖粗制品)保存在-20℃以下待进一步提取。

2.3.5.3多糖精制

将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10-20mg/ml，然后按1∶2容量用冷酚(100g结晶酚溶40ml 1/10饱和醋酸钠溶液)提取2-3次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或适宜溶液透析。必要时可用其他方法去除内毒素。再加乙醇至最终浓度为75％-80％(ml/ml)。离心收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上。离心后倾去上清液，用注射用水溶解沉淀的多糖，所得溶液即为提取的多糖原液。原液经除菌过滤后，取样进行无菌试验、血清学试验及各项生化测定。提取过程应在15℃以下进行。提纯多糖应保存在-20℃或以下。

2.3.5.4再制

若提纯多糖的蛋白质、核酸及内毒素含量达不到要求时，可再制一次。

2.4原液检定

按3.1项进行。

2.5半成品检定

可将单批或多批检定合格的多糖原液合并，然后加入无菌无热原质乳糖和注射用水稀释，使每人用剂量疫苗含多糖30μg，乳糖2.5-3.0mg。

2.6半成品检定

按3.2项进行。

2.7分批

按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。

2.8分装及冻干

按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。采用适宜条件冻干，冻干过程制品温度不应高于30℃，真空或充氮封口。

2.9规格

本品规格为每安瓿150μg或300μg多糖。每人和剂量含多糖30μg。

2.10包装

按本版规程通则《生物制品包装规格》进行。

3检定

3.1原液检定

3.1.1固体总量测定

每批提纯多糖抗原的蛋白质含量应小于10mg/g，按Lowry法测定。

3.1.3.核酸含量

每批提纯多糖的核酸含量应小于10mg/g。按分光光度法，核酸在260nm波长处的吸收系数(E1％cm)为200。

3.1.4O-Z酰基含量测定

每批提纯多糖的O-Z酰基含量应不低于2mmol/g，按Herstrin法测定。

3.1.5磷含量

每批提纯多糖的磷含量应不低于80mg/g，用钼酸铵法测定。

3.1.6分子大小测定

每批提纯多糖的分子大小应用琼脂糖-4B或CL-4B凝胶层析法测定。KD值应不高于0.40。KD值在0.5以前的洗脱液多糖回收率应在65％以上。按附录方法进行。

3.1.7特异性试验

每批提纯多糖应用琼脂扩散试验(或国家药品检定机构认可的其他适宜免疫学方法)进行特异性试验。多糖抗原在球状酵母菌抗体存在下，应产生明显的沉淀线。

3.1.8细菌内毒素含量测定

每批提纯多糖可用常规鲎试验(半定量凝胶法)检测内毒素含量。一般控制每1μg多糖内毒素含量应不高于100EU(如超过，可按3.3.7项家兔法确证)。

3.1.9原液应保存于-20℃或以下，自收菌之日起有效期为5年。

3.2半成品检定

无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.3成品检定

3.3.1鉴别试验

按3.1.7项方法进行。

3.3.2外观

冻干成品应为白色疏松体，加入所附PBS后迅速溶解。溶液应澄明无异物。

3.3.3化学检定

按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。

3.3.3.1水分

不高于3.0％。

3.3.3.2多糖含量

每剂量多糖含量应不低30μg。磷含量应不低于2.25μg。

3.3.4分子大小测定

分装的疫苗至少5批抽一批测多糖分子大小，用琼脂糖-4B或CL-4B凝胶过滤法测定，KD值应不高于0.40。KD值小0.5的洗脱多糖加回收率应在65％以上。方法见附录。

3.3.5无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.3.6异常毒性试验

每批疫苗应按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行，豚鼠注射剂量为500μg多糖(1ml)，小鼠注射剂量为100μg多糖(0.5ml)。

3.3.7热原质试验

按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行，家兔注射剂量为0.025μg/kg体重。

3.4疫苗稀释液检定

稀释疫苗用的pH6.8-7.2PBS应经过下列检定。

3.4.1无菌试验

每批稀释液应按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.4.2异常毒性试验

按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。

3.4.3热原质试验

按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。

3.4.3热原质试验

按本版规程通则《生物制品热朱质试验规程》进行。

4保存、运输及有效期

于2-8℃避光保存和运输，自冻干之日起有效期为3年。

5使用说明

组成和性状

本品系用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)培养液，经提纯获得多糖抗原并加入适宜稳定剂后冻干制成的多糖疫苗。成品外观为白色疏松体，加入所附PBS后可迅速溶解，溶液澄明无异物。

规格

本品规格为注射用安瓿150μg或300μg多糖。每人用剂量含多糖30μg。气雾剂和滴鼻剂疫苗含多糖1.5-3mg/瓶。

质量标准

本品依据《中国生物制品规程》2000年版生产和检定，质量符合要求。

作用和用途

本疫苗接种后，可使机体产生免疫应答，用于预防SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)感染。

接种对象

SARS病疫区人群，易感人群，对本病医护人、实验室研究人员和与患者近距离接的各类人员的预防。

用法与剂量

(1)启开疫苗瓶后，按瓶签或盒签标含量，加入所附PBS溶解，摇匀立即使用。

(2)将上臂外侧三角肌附着处消毒后，皮下注射30μg(0.2ml或0.5ml)。

禁忌

有下列情况者，不得使用本疫苗。

(1)严重心血管、高血压、脑部疾患及有过敏史者。

(2)心脏病

(3)急性传染病及发热者。

副反应及处理

本疫苗反应轻微，偶有短暂低热，局部稍有压痛感，可自行缓解。

注意事项

(1)使用前应检查安瓿，如安瓿有裂纹、瓶塞松动或瓶内有异物者，不得使用。

(2)每一安瓿制品溶解后，应按规定人份(剂量)一次用完，不得分多次使用。

保存、运输及使用期限

于2-8℃避光保存和运输。在盒签(或瓶签)标明的失效期前使用。

生产批准文号

生产单位及地址

6附录

球状孢子菌多糖疫苗荚膜多糖抗原分子大小测定(琼脂糖4B层析法)

附录流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)多糖疫苗

                抗原分子大小测定

(琼脂糖4B层析法)

1试验材料

1.1试剂

1.1.1琼脂糖4B凝胶

1.1.20.2mol/L醋酸胺(pH7.0)

1.1.3蓝色葡聚糖2000(2mg/ml)

1.1.4铬酸钾或维生素B₁₂溶液(1mg/ml)

1.2仪器

1.2.1层析柱(1.5cm×90cm)

1.2.2组分收集器及试管

1.2.3凝胶及洗脱液贮瓶

1.2.4适宜监测装置及记录器

2试验步骤

2.1装柱及层析柱的标定

2.1.1琼脂糖4B凝胶的漂洗

取琼脂糖4B凝胶约200ml，加0.2mol/L醋酸胺400ml，充分搅拌并放置约1小时使其沉淀，倾去混悬有颗粒的上层悬液。如此反复数次后，加200ml0.2mol/L醋酸胺溶液，置真空罐内抽去凝胶中的空气。

2.1.2装柱

于1.5cm×90cm层析柱中，将琼脂糖4B凝胶装约87cm高，操作压70-75cm，用0.2mol/L醋酸胺流洗，流速为15-20ml/h，以2-3倍量柱床体积的流洗液流洗，使柱床平衡。

2.1.3柱的标定

2.1.3.1空流体积V

取2mg/ml蓝色葡聚糖2000(用0.2mol/L醋酸胺溶解)1ml，加于已平衡的柱上，用0.2mol/L醋酸胺流洗，用组分收集器收集流洗液，于260nm波长测定各管的A值。以A值为纵坐标，ml数为横坐标作图，第一个峰顶洗脱体积，即为Vo。

2.1.3.2柱床体积V1

取铬酸钾或维生素B12溶液(1mg/ml，用0.2mol/L醋酸胺溶解)1ml，加于已平衡的柱上，用0.2mol/L醋酸胺流洗，用收集器收集流洗液，于37onm波长测定各管A值。以A值为纵坐标，ml数为横坐标作图，计算峰顶流洗体积，即为V1。

2.2多糖抗原KD的测定

取约1ml样品(含A群抗原3-5mg，如为固体可用0.2mol/L醋酸胺溶解)，加于已标定的琼脂糖4B凝胶柱上，用0.2mol/L醋酸胺洗脱，以收集器收集，测定每管的磷含量(参看磷含量测定，但以流洗液作为对照)，以每管磷含量(或A值)为纵坐标、体积为横坐标作图。也可用紫外分光光度计206nm下检测，测磷法为仲裁法。按下述公式(1)以多糖主峰峰顶洗脱体积(V0)计算分配系数(KD)；公式(2)计算KD0.5的多糖抗原回收率。

3结果计算

按下列公式计算KD值及KD值在0.5以前的多糖回收率。

$K_D=\frac{\mathrm{Ve}-\mathrm{Vo}}{\mathrm{Vi}-\mathrm{Vo}}$

《SARS亚单位、抗独特型疫苗制造方法》

1定义、组成与用途

本品系由SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)经扩增、分离、提取、纯化，加佐剂吸附后制成，用于预防SARS病感染。

2制造

2.1基本要求

2.1.1设施与生产质量管理

按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。同时还必须具备三级生物安全实验和生产工作(P3)条件，并二级以上生物安全柜中操作：动物模型须在P3和P3级以上实验室中进行。

 2.1.2原料及辅料

应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。

2.1.3生产用水

生产用水源水应符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水符合现行《中国药典》标准。

2.1.4生产用器具

直接用于生产的金属或玻璃等器具，必须严格清洗及灭菌处理。

2.1.5检定用动物

小鼠、豚鼠应符合清洁级标准。

2.2菌种

2.2.1菌种名称及来源

使用经国家药品管理当局批准的，来自SARS疫区新分离的流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)冻干保存菌种

2.2.2种子批的建立

疫苗生产用菌种以菌种种子批系统为基础进行三级管理，即原始种子批、主种子批和工作种子批。原始种子批应验明其记录、历史、来源和生物学特性。从原始种子批传出、扩增后冻存的为主种子批。从主种子制备工作种子批。主种子批和工作种子批在规定代次内的生物学特性应与原始种子批一致。工作种子批用于生产。

2.2.3种子批菌种检定

2.2.3.1培养物纯度试验

培养物接种于血琼脂平板和沙保罗琼脂平板，分别于20-25℃和30-35℃培养2-3周，应无细菌和其他真菌被检出。

2.2.3.2纯菌试验

菌种接种于10％血琼脂平板2周后可见长出细小白色样花样菌落。

2.2.4菌种传代

主种子批经一代扩增制成工作种子批，工作种子批经检定合格后用于生产。

2.2.5菌种保存

主菌种及工作菌种保存于液氮中，为方便生产，小部分工作菌种短期内(6个月内)可保存于-70℃冰箱中。

2.3发酵

2.3.1发酵工艺

将工作菌种在适宜温度和时间条件下进行三角瓶、种子罐和生产罐三级发酵，收获孢子体细胞冷冻保存。

2.3.2发酵产物检定

2.3.2.1培养物纯度

按2.2.3.1项进行。

2.3.2.2菌种纯度

流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)纯度100％。

2.4纯化

2.4.1纯化工艺

用细胞破碎器破碎孢子体细胞，除去细胞碎片，硅胶吸附法粗提亚单位疫苗，抗独特疫苗，疏水层析法精提抗独特疫苗亚单位疫苗，经硫氰酸盐处理后，稀释和除菌过滤。

2.4.2纯化产物检定

2.4.2.1无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

2.4.2.2蛋白质浓度

用lowry法测试，蛋白质浓度应在20.0-27.0μg/ml之间。

2.4.2.3纯度

(1)免疫印染法所测样品不得出现国家药品检定机构认可以外的孢子体杂蛋白。

(2)高压液相色谱法杂蛋白应不高于1.0％。

2.4.2.5细菌内毒素

按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》进行，应小于10EU/ml。

2.5疫苗原液配制及检定

2.5.1配制

加入甲醛，37℃保温适宜时间，氢氧化铝吸附后，加入硫柳汞作为防腐剂，即为疫苗原液。

2.5.2原液检定

按3.1项进行。

2.6半成品配制、分批及检定

2.6.1配制

灭活吸附后与铝稀释剂等量混合，即为半成品。

2.6.2分批

按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。

2..6.3半成品检定

按3.2项进行。

2.7分装

按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。

2.8规格

本品规格为每安瓿0.5ml及1.0ml。每次人用剂量0.5ml。

2.9包装

按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。

3检定

3.1原液检定

3.1.1吸附完全性试验

吸附率应不低于80％。

3.1.2硫氰酸盐含量

应小于1.0μg/ml。

3.1.3TritonX-100含量

应小于15.0μg/ml。

3.2半成品检定

3.2.1无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.2.2.化学检定

按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。

3.2.2.1游离甲醛含量

应小于20.0μg/ml。

3.2.2.2pH值

为5.5～7.2。

3.2.2.4铝含量

为0.35～10.62mg/ml。

3.2.2.5细菌内毒素

应小于10EU/ml。

3.2.2.6冰

用冰点仪测定，应为-0.52℃±0.12℃。

3.3成品检定

3.3.1鉴别试验

以免疫法测试，证明为流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)抗原。

3.3.2物理检查

应为乳白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。

3.3.3化学检定

按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。

3.3.3.1铝含量

同3.2.2.3.项。

3.3.3.2硫柳汞含量

同3.2.2.4项。

3.3.3.3pH值

为5.5～7.2。

3.3.4效力测定

将疫苗连续稀释，每个稀释度接种MIH 16-18克小鼠10只，每只腹腔注射1.0ml。4～6周后采血，用MIH小鼠测抗体。

3.3.5无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3.6无菌试验

按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。

3.3.7细菌内毒素

同2.3.2.5项。

4保存、运输及有效期

于2～8℃避光保存和运输，疫苗自效力检定合格之日起有效期为2年。

5使用说明

组成和性状

本品系由SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)经纯化、加佑剂吸附后制成。注射剂、气雾剂、滴鼻剂疫苗为白色混悬液体，可因沉淀而分层，易摇散，不应有摇不散的块状物。

规格

本品规格为每安瓿节0.5ml及1.0ml或5～10ml/瓶。每次人用剂量0.5ml含5μg，气雾和滴鼻5～10ml/瓶，50-100μg。

质量标准

本品依据《中国生物制品规程》2000年版标准生产和检定，符合质量要求。

作用和用途

本疫苗接种后，可刺激机体产生免疫力，用于预防流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)感染。

接种对象

(1)SARS病疫区人群，易感人群和患者近距离接触的种类人员的预防。

(2)从事医疗工作的医护人员及接触实验人员。

用法和剂量

(1)本疫苗注射时要充分摇匀。

(2)注射部位为上臂三角肌内。

禁忌

患有急性严重疾病患者及对酵母成分过敏者禁止使用。

副反应处理

本品很少有不良反应，个别人可能有中、低度发热或注射局部微痛，24小时内即自行消失。

注意事项

(1)用前摇匀。

(2)安瓿破裂、有摇不散块状物时不得使用。

保存、运输及使用期限

于2～8℃下避光保存和运输，在盒签或瓶签标明的失效期前使用。

生产批准文号

生产单位及地址

《SARS灭活疫苗和SARS菌素制造方法》

1.定义、组成及用途

本品系用流行性肺组织胞浆菌(球酵母菌)培养后(以下简称SARS菌)，经甲醛溶液灭活、脱毒处理、制成每瓶含菌2-5×10⁹/ml和适量保护剂，不含防腐剂制成。用于SARS病的预防。

2.制造

2.1基本要求

2.1.1设施与生产质量管理

按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。

2.1.2原料及辅料

符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，不低于化学纯。

2.1.3生产用水

生产用水符合国家饮用水标准，纯化水及注射用水符合现行《中国药典》标准。

2.1.4生产用器具

直接用于生产的金属或玻璃等器具，严格清洗及去热源处理或灭处理。

2.1.5生产及检定用动物

家兔、小鼠、豚鼠符合清洁级。

2.2菌种

2.2.1菌种名称及来源

制造用菌种由当地分离获得并冻干保存或国家指定的单位保管和分发。

2.2.2种子批的建立

生产用菌种采用种批系统。原始种子批应检明其记录、历史、来源和生物学特性，从原始种子批传代，扩增后冻干保存为主种子批。从主种子批备工作种子批。主种子批和工作种子批的各种特性与原始种子批一致。工作种子批用于生产。

2.2.3种子批菌种检定

2.2.3.1形态及培养特性

将待检菌种接种GH改良沙保罗琼脂或其他适宜培养基，为SARS菌，在血琼脂培养基上菌落初呈球状、脑形、粉红色至棕色。

2.2.3.2生化反应

所用菌种均用细胞生化鉴定系统，鉴定为SARS菌。

2.2.3.3血清凝集试验

用25℃或37℃培养24-48小时的培养物，以1％甲醛灭活，用无菌生理氯化钠溶液稀释，使其含菌2×10⁹ml，与SARS菌免疫诊断血清(做定量凝集试验)，充分混合后，置37℃过夜，以肉眼见到凝集之血清最高稀释度为凝集反应效价。凝集效价应不低于原血清效价之半。

2.2.3.4毒力试验

采用SARS菌分别用25℃或37℃培养24-48小时的GH改良沙保罗液体培养物，以无菌生理氯化钠溶液稀释成含菌1.2×10⁹ml、8×10⁸ml、4×10⁸ml、2×10⁸ml等浓度菌液，腹腔注射体重14-16g小鼠，同性或雌雄各半，每个浓度菌液使用至少5只小鼠，每只0.5ml，观察3-7天。

2.2.3.5毒性试验

分别采用25℃或37℃培养24-48小时的GH改良沙保罗液体培养物混悬于生理氯化纳液内，70℃加温2小时(或其他方法)杀菌，不加防腐剂。杀菌试验合格后，按一定比例混合，稀释成每1ml含菌4.0×10⁹、2.0×10⁹及1.0×10⁹共3个浓度，每个浓度菌悬液0.5ml腹腔注射体重16-18g小鼠5只，观察3天，注射1.0×10⁹至2.0×10⁹个死菌体的小鼠应全部生存。

2.2.3.6抗原性试验

选体重2kg左右之家兔至少3只，以上述免疫力试验用菌液注射家兔，注射8次，末次注射后7-10天，采血做定量凝集试验，测定效价。2/3家兔血清凝集价应不低于1∶2560。

2.2.3.7免疫力试验

用终浓度不超过1.1％±0.1％的甲醛溶液杀菌，以不加防腐剂的菌液稀释，使其含菌2.0×10⁹ml。选体重14-16g小鼠至少30只，每次皮下注射菌液0.5ml，间隔5天注射1次，共注射3次，末次免疫后7-10天，用毒菌攻击，观察3天，对照组小鼠死亡数应不低于80％，免疫组小鼠保护率应不低于70％。

2.2.4菌种传代及保存

2.2.4.1菌种冻干保存于2-8℃，主种子批自启开后传代不得超过5批。

2.2.4.2生产前检查菌种特性，合格后用于生产。

2.3原液制备

2.3.1生产用种子

将工作种子批菌种启开后，接种于GH改良沙保罗培养基或其他适宜培养基，置℃培养传代，一般不超过48小时，由此制备适宜数量的生产用工作种子。

2.3.2生产用培养基

用pH7.2-7.4的GH改良沙保罗培养基或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基中不含对人体有害或其他过敏原物质。

2.3.3菌种接种和培养

采用密封三角烧瓶种法，接种后置37℃摇床培养24-48小时，在过程中灭菌前权样做纯菌试验，涂片染色镜检、如发现杂菌，应废弃。

2.3.4收集和杀菌

培养结束后，立即加热100℃，10-30分种80℃一小时灭菌，然后加入终浓度为1.0％-1.2％的甲醛溶液，置37℃，7天，取样种于GH改良沙保罗培养基做无菌试验，4℃离心洗涤去甲醛后，加无菌PBS洗二次PBS补至原量，置2-8℃保存。

2.4原液检定

按3.1项进行。

2.5半成品配制

单批或多批检定合格的原液合并，用PBS稀释，加入适量保护剂，与原液混合，使每1ml含SARS病原菌5×10⁹。

2.6半成品检定

按3.2项进行。

2.7分批

按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。

2.8分装或冻干。

按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。

2.9规格

本品规格为每小瓶1-55×10⁹ml，内含适量保护剂。

2.10包装

按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。

3检定

3.1原液检定

3.1.1无杂菌。

3.1.2无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.1.3浓度测定

按“中国细菌浊度标准“进行浓度测定，相当每1毫升含菌应为5×10⁹稀释时按此浓度计算，误差不超过10

3.1.4原液保存

原液静置保存于2-8℃。

原液采集保存期，自原液合并之日起不超过4个月。保存期自采集灭菌之日起不超过6个月。

3.2半成品检定

3.2.1无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.2.2制剂浓度

每1ml含组织胞浆5×10⁹。

3.3成品检定

3.3.1鉴别试验

与本菌的特异性免疫血清进行玻片凝集试验，应呈明显凝集反应。

3.3.2外观

为白色混悬液或白色冻干粉针剂、溶解后应为乳白色混悬液，不应含有摇不散的凝块或异物

3.3.3化学检定

按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。

3.3.3.1PH值

为6-7。

3.3.3.2游离甲醛含量：不应高于0.1g/L。

3.3.3.3乳糖

按现行《中国药典》进行。含乳糖。

3.3.4无菌试验

按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。

3.3.5异常毒性试验

按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》进行。

3.3.6浓度测定

用“中国细菌浊度标准”进行浓度测定，每小瓶含SARS病原功菌5×10⁹ml。

3.3.7质量标准

适应症

接种后能提高机体特异性免疫，用于预防SARS菌病感染。

《流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)

诊断试剂的制造方法》

在完成SARS疫苗的(3、1、4)制造程序基础上，取上述合并后的组织浆菌(球状酵母菌)原液离心洗涤三次，用超声波充分粉碎，并同时在-100℃以下反复冻溶三次，取出，4℃ 12000次/分离心一小时，弃沉淀，取上清，用注射用水1∶100～10000稀释，供疑似SARS病患者皮肤试验之用，《SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)

特异性诊断试剂制造方法》

主要采用羊抗免或兔抗羊抗体：具体方法是用上述未稀释的原菌液，加入适量羊毛脂或花生油作佐剂，然后注射到羊或兔，抽取免疫后的血清，制成羊抗免或免抗羊的抗血清，或直接从血清提取IgG抗体，制成诊断试剂盒，或制成抗抗体，酶联免疫试剂、胶体金诊断试剂，PCR诊断试剂，或用萤光素标记抗体制成萤光免疫试剂盒。亦可通过细胞融合制成单克隆抗体。

1.酶联免疫诊断试剂

免疫酶技术是19世纪发展的一项新技术，酶联免疫吸附技术简称ELISA是将SARS病原体的可溶性抗原或抗体吸附在固相载体上，利用酶标记抗体或抗原定量测定相应的抗原或抗体。由于酶的高效催化作用，再结合抗原抗体反应的高度特异性，使ELISA测定具有灵敏、特异性的优点，其操作简便，出结果快，用流行性肺组织胞浆菌(球酵母菌)做抗原，制造出一种免疫诊断试剂(具体祥细制造方法另附或随时提供)。

2、荧光抗体诊断试剂

20世纪初荧光显微技术已萌芽，30年代由于荧光素的发展以及采用超高压水银石英灯作光源，使荧光染色技术有了显著进步，用异氰酸荧光黄(FITC)等标记流行性肺组织浆菌(球酵母菌)免疫抗体蛋白能保护抗体的活性，两者结合物制作诊断特异性试剂，主要是用荧光素标记抗体，免疫荧光技术又称为荧光抗体技术，它是利用免疫学的特异性和敏感性同显微镜的精确性相结合，达到特异性、敏感、快速和简便地检出样品中的抗原物质，荧光抗体诊断试剂(详细具体制造方法另附或随时提供)。

3、胶体金免疫诊断试剂

免疫金和免疫银一般是采用间接步骤进行，即用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)特异性抗体与抗原反应，再用胶体金标记“二抗”与“一抗”反应显示抗原的位置，这就是免疫金法，其结果可直接用于光镜观察。胶体金免疫试剂是应用胶体金为标记物，胶体金即金的水溶胶，它具有一般的溶胶特性，用胶体金标记流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)抗原或特异性抗体，制成特异性免疫试剂，用于诊断病原体有高度特异性和灵敏性，(胶体金免疫试剂的具体详细方法另附或随时提供)。

4、PCR诊断试剂

原理是用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)免疫动物(羊、兔等)分离特异性抗体或用单克隆抗体，通过将样品的抗原物质解离成DNA遗传物，并通过使其抗增后达到供检测的量，然后经仪器直接检测获得病原体抗原的正确诊断。(具体制造方法另附)。

5、制造抗体、多克隆抗体和单克隆抗体

采用流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)作抗原制备高特异性、高效价的免疫血清，制备方法：一是以纯化的抗原免疫羊、兔、马等动物，从动物血清中获得多克隆抗体，二是应用杂交瘤技术制造单克隆抗体。作诊断试剂或医药用途。(具体详细制造方法另附或随时提供)。

(附图)图1是SARS肺组织胞浆菌(球状酵母菌)纯培养形态图，图2是SARS肺组织胞浆菌(球状酵母菌)动物模型小鼠脑膜组织切片形态图。

Claims (6)

1、本发明涉及一种SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)系列特异性预防疫苗，和系列特异性诊断试剂及其生产方法，其特征是：由SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)制成SARS特异性预防疫苗，或用生物技术生产SARS系列精制特异性疫苗和制造系列特异性诊断试剂及其各种不同剂型的制品，或作医药科学研究用途。

2、根据权利要求1所述的SARS系列特异性预防疫苗，其特征是：包括混合疫苗、多糖疫苗(糖蛋白)疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、细胞壁(壁酸)疫苗、多肽疫苗、毒素、类毒素疫苗、合成疫苗和半合成疫苗、基因重组疫苗，抗独特型抗体疫苗和特异性免疫球蛋白，或单克隆抗体，以及其它新生物制品。

3、根据权利要求1所述的SARS系列特异性诊断试剂，其特征是：包括酶联免疫诊断试剂、PCR诊断试剂，、免疫萤光抗体、胶体金诊断试剂，基因芯片诊断试剂，、和SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)素皮试诊断试剂。

4、根据权利要求1  所述制品剂型，流行性肺组织浆菌(球状酵母菌)的剂型，其特征是：包括制品的注射液，生产出注射针剂、喷喉气雾剂和滴鼻制剂。

5、根据权利要求1所述SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)系列制品制造方法，其特征是：由SARS流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)经过扩增、发酵、缩浓，然后用物理和化学方法或生物技术将流行性肺组织胞浆菌(球状酵母菌)细胞破碎(溶解)然后分离、层析提取、纯化、精制加工制造成系列特异性疫苗和系列特异性诊断试剂。

6、根据权利要求1所述的科学研究用途，其特征是：包括基因测试、特效药物筛选和医药研究用途。