CN1504188A

CN1504188A - 5-羟甲基糠醛在制备防治神经退行性疾病和认知损害的药品和保健品中的用途

Info

Publication number: CN1504188A
Application number: CNA021537321A
Authority: CN
Inventors: 林李; 李林; 张兰; 楚晋; 张如意
Original assignee: Xuanwu Hospital
Current assignee: Xuanwu Hospital
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: CN1240381C

Abstract

本发明涉及5－羟甲基－2－糠醛或其衍生物在制备预防/治疗神经退行性疾病或认知损害的药品和保健品中的用途。

Description

5-羟甲基糠醛在制备防治神经退行性疾病和认知损害的药品和保健品中的用途

发明领域

本发明涉及5-羟甲基糠醛及其衍生物在制备防治神经退行性疾病和认知损害的药品和保健品中的用途。

背景技术

神经退行性疾病(又称神经变性疾病)是指由于中枢神经系统过早出现衰变性损伤而导致脑功能障碍的一系列疾病，包括老年痴呆、帕金森病和亨廷顿病等。这些疾病以慢性进展性的记忆、语言、运动障碍为特征，给社会和家庭带来了沉重的负担，其患病率随着年龄增长逐年增高。我国已进入老龄化社会，对这些疾病的预防与治疗，减少其危害，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供5-羟甲基糠醛及其衍生物在制备防治神经退行性疾病和认知损害的药品和保健品中的用途。

5-羟甲基糠醛，全名：5-羟甲基-2-糠醛，英文名：5-hydroxymethyl-2-furaldehyde(5-HMF)或5-(hydroxy methyl)furfural。

结构式：

该化合物可以从山茱萸中提取、分离、纯化而得。也可以化学合成。还可以从市场上购得。

发明人经过细胞和动物试验发现，该化合物对于老年痴呆、帕金森病和亨廷顿病的病理、病理生理变化具有良好的改善作用。从而完成了本发明。

本发明的5-HMF可以采用口服的给药方法，能以各种药物制剂如片剂、胶囊和药学可接受组合物的形式使用。

本发明的5-HMF也可以制成注射制剂。

根据本发明的药物组合物，可以含有一定量的5-HMF作为活性成分，也可含有药学可接受的载体，这些药学可接受的载体可以是在现有技术中广泛用于药物中的各种载体，如赋形剂，例如水。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法如混合、制粒、压片来制备。本发明药物组合物还可以包括各种药学使用的任选组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。

5-HMF的口服用量一般为0.5-10mg/kg体重/日，注射用量一般0.1-5mg/kg体重/日。

附图说明

图1是5-HMF对叠氮钠致神经细胞产生Aβ的影响。

实施例

以下结合实施例来说明本发明。

实施例1

5-HMF 10mg，羧甲基纤维素650mg，乳糖320mg和硬脂酸镁20mg，将上述组分粉碎，混合，压片，制成片剂。

实施例2

5-HMF 100mg和生理盐水100mL，混合，制成针剂。

药效学试验

(一)5-羟甲基糠醛(5-HMF)对老年痴呆的防治作用

老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)是一种慢性脑神经退行性疾病，临床以记忆力衰退为首发症状，逐渐发展成为记忆完全丧失、语言障碍、运动功能障碍。近年来研究认为该病的病理机制主要与脑内β淀粉样蛋白(Aβ)过多沉积产生的炎症反应、微管相关蛋白tau过度磷酸化导致的神经原纤维缠结、线粒体缺陷、自由基增高、钙超载等密切相关。我们的以下系列研究发现5-HMF对这些病理损伤均有良好的改善作用。

1、5-HMF对AD患者融合细胞的影响

线粒体缺陷是普遍存在于老年性痴呆患者的脑和血小板等组织的特征性病理改变。我们采用AD患者血小板线粒体DNA与无线粒体DNA的ρ°细胞融合，建立了AD患者转线粒体DNA细胞系模型(AD患者融合细胞)。该模型可以模拟多种由线粒体损伤引起的老年痴呆病理因素，并进行药物干预研究。

(1)5-HMF对AD患者融合细胞活性氧水平的影响

1)实验目的

活性氧(ROS)大部分是在线粒体电子传递过程中产生的，是正常生理过程。在线粒体电子传递链(ETC)存在缺陷时，可产生超过正常水平的ROS，对细胞造成损伤。本研究观察5-HMF对AD融合细胞胞内活性氧水平的影响。

2)实验方法

5-HMF 100μg/ml与AD融合细胞预孵育24小时，用2’，7’-二氯荧光素(DCF-DA)荧光探针标记细胞内ROS，以激光共聚焦显微镜(LSCM)观察单个细胞内ROS的水平，实时监测ROS动态变化；用流氏细胞仪(FCM)对细胞整体水平ROS产生作一评价。统计方法以正常143B细胞内DCF-DA荧光值为1，以融合细胞DCF-DA荧光值同正常143B细胞内DCF-DA荧光值之比表示融合细胞内的ROS水平。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可使AD患者融合细胞内的活性氧(ROS)水平降低24％(表1)。

表1. 5-HMF对AD融合细胞内活性氧(ROS)水平的影响

组别 N ROS(比例)

正常青年组 5 0.92±0.44*

AD模型组 5 1.50+0.29

AD+5-HMF 5 1.14±0.33

M±SD；*P＜0.05，与AD模型组比较。

(2)5-HMF对AD患者融合细胞线粒体膜电位的影响

1)实验目的

研究证实老年痴呆患者细胞系中线粒体膜电位(MMP)比正常老年对照降低约30％。本实验观察5-HMF对AD患者融合细胞MMP的影响。

2)实验方法

AD患者融合细胞常规培养至第二天，选择浓度为100μg/ml的5-HMF与融合细胞预孵育24小时，以LSCM、FCM测定MMP。以正常细胞143B细胞内Rh123荧光值为1，以融合细胞Rh123荧光值同正常143B细胞内Rh123荧光值之比表示融合细胞内的MMP水平进行组间比较。

3)实验结果

结果显示5-HMF可使AD患者融合细胞MMP水平提高80.4％，达到接近正常的水平(表2)。

表2. 5-HMF对AD患者融合细胞线粒体膜电位(MMP)的影响

组别 N MMP

青年对照 6 1.00±0.18**

AD模型 5 0.51±0.20

AD+5-HMF 5 0.92±0.65

M±SD；**P＜0.01，与AD模型组比较。

(3)5-HMF对AD患者融合细胞胞浆钙的影响

1)实验目的

在线粒体缺陷疾病中，常伴有胞浆钙调节失衡，已有研究表明AD患者细胞系中有存在钙失衡。本实验进一步探讨5-HMF是否对AD患者融合细胞线粒体的贮钙能力和胞浆钙的调节能力产生一定的影响。

2)实验方法

以5-HMF100μg/ml预孵育24小时，以Fluo-3/AM为胞浆钙离子荧光探针，用LSCM和FCM测定胞浆基础钙和线粒体氧化磷酸化解耦联剂(CCCP)刺激后的变化率，以融合细胞与143B细胞内Fluo-3荧光值相对值表示融合细胞的基础钙离子浓度以及受CCCP刺激后的Fluo-3荧光变化率。

3)实验结果

结果表明，5-HMF孵育可以减少AD患者融合细胞胞浆内Ca²⁺浓度(表3)；并且提高AD患者融合细胞胞浆钙在CCCP刺激后的变化率24.5％(表4)，表明5-HMF可提高细胞内钙库的贮钙能力和调节钙稳态的能力。

表3. 5-HMF对AD患者融合细胞基础胞浆钙离子浓度的影响

组别 N Ca²⁺(ratio)

青年对照 6 1.21±0.35

AD模型 5 1.63±0.95

AD+5-HMF 5 1.23±0.59

M±SD

表4. 5-HMF对AD患者融合细胞受CCCP刺激后的胞浆钙变化率的影响

组别 N Ca²⁺(ratio)

青年对照 6 0.98±0.58

AD模型 5 0.35±0.18*

AD+5-HMF 5 0.60±0.10

MSD；*P＜0.05，与AD模型组比较。

2、5-HMF对线粒体损伤致AD细胞模型的影响

线粒体呼吸链复合体IV功能的缺陷是散发型和迟发型AD发病的一个重要因素，在AD病人的脑细胞均有线粒体复合体IV活性的下降。我们采用了线粒体呼吸链复合体IV叠氮钠(NaN3)诱导与AD发病机理有关的变化，并观察了5-HMF的药效学作用。

(1)5-HMF抑制NaN3致老年痴呆细胞模型Aβ表达增高

1)实验目的

Aβ在脑内过度沉积是造成脑神经细胞炎性反应、坏死的重要原因。本实验探讨5-HMF是否对老年痴呆细胞模型胞内Aβ表达增高有抑制作用。

2)实验方法

不同浓度5-HMF(50μg/ml、100μg/ml)与SH-SY5Y神经细胞共孵育24小时后，弃去培养液。模型组及5-HMF保护组均加入50mmol/L NaN3，与细胞共孵育4小时，对照组加入等体积的培养液。应用免疫细胞化学的方法进行检测，用Aβ1-16抗体识别胞内Aβ。

3)实验结果

显微镜下观察(300×)：正常细胞Aβ主要分布于细胞胞浆中，染色较浅；模型组部分细胞变圆，胞浆中Aβ染色加深；5-HMF保护细胞形态恢复，胞浆内Aβ染色较模型组变浅，并有剂量依赖关系。

结果表明，NaN3可导致神经细胞Aβ表达增强；5-HMF具有抑制模型细胞Aβ表达的作用(附图)。

(2)5-HMF提高叠氮钠损伤AD患者融合细胞的存活率

1)实验目的

本实验观察5-HMF对NaN3致AD患者融合细胞损伤的保护作用。

2)实验方法

AD患者融合细胞常规培养至第二天，选择不同浓度(12.5--200μg/ml)的5-HMF与融合细胞预孵育24小时，弃上清液；用50mmol/L的NaN₃与细胞孵育2小时，测定细胞的存活率。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可提高NaN3致AD患者融合细胞损伤模型的存活率(表5)。

表5.5-HMF对叠氮钠(NaN3)致AD患者融合细胞损伤的影响

模型组 5-HMF(μg/ml)

正常组

(NaN3) 12.5 25 50 100 200

MTT值

0.58± 0.26± 0.33± 0.39± 0.43± 0.44± 0.41±

(O.D.

0.01^** 0.02 0.03^* 0.02^** 0.02^** 0.02^** 0.03^**

550nm)

M±SD；^*P＜0.05；^**p＜0.01，与模型组比较。

(3)5-HMF提高NaN3损伤SH-SY5Y神经细胞的存活率及保护细胞膜完整性

1)实验目的

SH-SY5Y细胞为人神经母细胞瘤细胞系，其形态与生理活性与神经元相似。本实验采用NaN3致SH-SY5Y细胞损伤模型，观察5-HMF对该模型的药理作用。

2)实验方法

不同剂量的5-HMF与SH-SY5Y细胞预孵育24小时，弃去培养液，加入50mmol/L的NaN3损伤4小时后，测定MTT值及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率。结果表示为均数±标准差，每个剂量设三个平行孔，实验重复三次，结果趋势相同。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可增高NaN3致神经细胞损伤模型的存活率，降低细胞内LDH漏出率，保护细胞膜的完整性(表6)。

表6. 5-HMF对NaN3致SH-SY5Y神经细胞存活率下降及细胞膜破坏的影响

MTT LDH漏出率

组别 N

(550nm) (％)

正常 3 0.251± 9.155±

0.034** 3.700**

NaN3模型 3 0.050±0.011 28.05±6.746

模型+5-HMF 6.25μ 3 0.072±0.024 23.24±1.992

g/ml

5-HMF 12.5μg/ml 3 0.082± 19.01±3.659

0.085*

5-HMF 25μg/ml 3 0.084± 16.20±3.659*

0.032*

5-HMF 50μg/ml 3 0.062± 11.27±2.542*

0.017*

5-HMF 100μg/ml 3 0.080± 13.62±3.614*

0.019*

5-HMF 200μg/ml 3 0.088±0.005 13.03±4.482*

M±SD；*P＜0.05；^**p＜0.01，与NaN3模型组相比。

(4)5-HMF对抗NaN3致SH-SY5Y神经细胞线粒体跨膜电位下降

1)实验目的

研究表明，线粒体呼吸链复合体IV抑制剂NaN3可以使神经细胞线粒体跨膜电位下降。本研究观察5-HMF对NaN3致SH-SY5Y神经细胞线粒体跨膜电位下降的影响。

2)实验方法

5-HMF(50μg/ml、100μg/ml)与SH-SY5Y神经细胞孵育24小时，加入50mmol/L NaN3损伤4小时，正常对照组加入等体积的无血清培养液，观察药物对线粒体跨膜电位下降的保护作用。采用Rhodamine 123标记线粒体跨膜电位，PI标记死亡细胞，利用生物显微镜及激光共聚焦显微镜采集图象观察膜电位的荧光分布及改变，并用图像分析计算荧光面积及荧光强度。

3)实验结果

形态观察示正常SH—SY5Y细胞，细胞铺展良好，轴突长；Rhodamine123荧光主要分布在胞浆中，轴突内也有少量分布，荧光强，未见死亡细胞。NaN3损伤组细胞，细胞形态部分变圆，轴突回缩；分布在胞浆的Rhodamine123的荧光明显减弱，而轴突内的荧光则消失，并可见部分细胞死亡。5-HMF保护组细胞，细胞形态维持良好，部分细胞轴突较长；分布在胞浆的Rhondamine123的荧光增强，轴突内的荧光出现，并有剂量依赖关系，未见死亡细胞。

图像分析示5-HMF可拮抗叠氮钠所致线粒体膜电位荧光面积的减少及荧光强度的降低，并有剂量依赖关系(表7)。

表7. 5-HMF对NaN3致SH-SY5Y神经细胞线粒体膜电位下降的影响

组别灰阶面积

正常 61.65±11.91* 630.70±288.72**

NaN3模型 42.52±20.85 279.94±97.88

模型+5-HMF 50μ 54.21±15.10* 394.77±125.28*

g/ml

5-HMF 100μg/ml 60.40±19.69* 583.92±250.15*

M±SD；*P＜0.05；**P＜0.01，与NaN3模型组相比。

(5)对NaN3致SH-SY5Y神经细胞骨架损伤的保护作用

1)实验目的

老年痴呆患者脑神经细胞中Tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结是细胞骨架损伤的典型表现。细胞骨架主要由微管、微丝组成。本实验在NaN3致老年痴呆细胞模型上观察5-HMF是否对其骨架损伤具有保护作用。

2)实验方法

不同浓度的5-HMF(50μg/ml、100μg/ml)与SH-SY5Y细胞共孵育24小时，加入50mmol/L的NaN3与SH-SY5Y细胞作用4小时，正常对照组加入等体积的无血清培养液。利用DM1α抗体识别α-tubulin，用红色荧光物质标记的TRITC标记的二抗与DM1α结合以识别微管，利用绿色荧光物质FITC标记的Phalloidin标记肌动蛋白微丝，利用激光共聚焦显微镜采集图像，观察微管和微丝在SH-SY5Y细胞的分布，及5-HMF对NaN3致微管、微丝损伤的保护作用。以放大倍数为200×的图像用图像分析仪进行图像分析。

3)实验结果

形态观察(1000×)：正常组SH-SY5Y细胞，细胞形态良好，微管分布广泛，在胞质、轴突及树突中均有分布，呈网状，致密规则，纤维束粗大，而微丝主要分布于胞质，轴突中也有少量分布，而树突中则未见微丝荧光的分布，荧光强。NaN3损伤组细胞，部分细胞胞体变圆，轴突变短，微管坍塌紊乱，微丝收缩，结构较正常细胞疏松，荧光分布减少，荧光变弱。5-HMF保护组细胞，细胞形态恢复正常，轴突出现，微管较致密规则，纤维束较粗，微丝致密，分布增多，荧光较强，且荧光强度、荧光分布面积均有剂量依赖关系。

图像分析结果表明，5-HMF对NaN3致微管和微丝的荧光面积的减少及荧光强度的降低均有保护作用，并有剂量依赖关系(表8，9)。

表8. 5-HMF对NaN3致SH-SY5Y神经细胞微管损伤的保护作用

组别灰阶面积

正常 89.05±28.72** 775.47±425.34**

NaN3模型 66.97±37.65 389.03±93.62

模型+5-HMF 50μ 78.59±27.64* 451.80±139.21*

g/ml

5-HMF 100μ/ml 83.58±27.38* 539.02±245.02**

M±SD；*P＜0.05；**P＜0.01，与NaN3模型组相比。

表9. 5-HMF对NaN3致SH-SY5Y神经细胞微丝损伤的保护作用

组别灰阶面积

正常 76.47±26.67** 544.58±287.56**

NaN3模型 50.81±19.08 341.78±133.54

模型+5-HMF 50μ 60.09±18.37* 392.22±182.38*

g/ml

5-HMF 100μg/ml 72.73±31.72* 411.24±132.49*

M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与NaN3对照组相比。

3、5-HMF对磷酸酶抑制剂致老年痴呆细胞模型的影响

研究表明，AD脑中神经原纤维缠结的主要原因是微管相关蛋白Tau蛋白过度磷酸化导致细胞骨架发生病理性变化。AD病人脑中蛋白磷酸酶活性降低是Tau蛋白过度磷酸化的重要原因。岗田酸(Okadaic acid，OA)为蛋白磷酸酶-1(PP-1)、PP-2A的抑制剂，可诱导SH-SY5Y细胞系出现Tau蛋白过度磷酸化，并伴有突触的消失、轴突回缩，细胞死亡，可用于研究AD的神经纤维退行性变及调节Tau蛋白磷酸化水平的因素。SK-N-SH细胞为人神经母细胞瘤细胞系，形态与生理活性与神经元相似。我们应用OA和SK-N-SH细胞建立了老年痴呆细胞模型，并应用此模型进行了药物研究。

(1)5-HMF对抗OA致SK-N-SH神经细胞存活率下降

1)实验目的

本实验采用OA致SK-N-SH细胞损伤模型，观察5-HMF对该模型的药理作用。

2)实验方法

以不同剂量的5-HMF与SK-N-SH细胞孵育24小时，弃去培养液，加入150nmol/L的OA损伤24小时，测定细胞MTT值。结果表示为均数±标准差，每个剂量三个平行孔，实验重复三次，结果趋势相同，用相差显微镜观察细胞形态。

3)实验结果：

结果表明，5-HMF可提高OA致神经细胞损伤模型的存活率(表10)。

表10. 5-HMF对OA致SK-N-SH神经细胞存活率下降的影响

MTT

组别 N

(550nm)

正常 4 0.129±0.008**

OA模型 4 0.103±0.007

模型+5-HMF 12.5μg/ml 4 0.127±0.009*

5-HMF 25μg/ml 4 0.130±0.006*

5-HMF 50μg/ml 4 0.128±0.011*

5-HMF 100μg/ml 4 0.142±0.004*

5-HMF 200μg/ml 4 0.141±0.014*

Mean±SD；*P＜0.05；^**p＜0.01，与OA模型组相比。

相差显微镜观察细胞形态：正常细胞贴壁良好，轴突粗壮较长，有树突分支，突触丰富，胞体和突起相差效果良好。OA损伤组细胞贴壁不良，胞浆轴突回缩，树突和突触消失，胞体变圆发亮。5-HMF保护组大部分细胞轴突较粗壮，树突恢复，相差效果较好，并有良好的剂量依赖关系。

(2)5-HMF对OA致SK-N-SH神经细胞骨架损伤的保护作用

1)实验目的

老年痴呆患者脑神经细胞中Tau蛋白过度磷酸化导致的神经原纤维缠结是细胞骨架损伤的典型表现。细胞骨架主要由微管、微丝组成。本实验在OA致老年痴呆细胞模型上观察5-HMF是否对其骨架损伤具有保护作用。

2)实验方法

不同浓度的5-HMF(50μg/ml、100μg/ml)与SH-SY5Y细胞共孵育24小时，加入100nmol/L的OA与SH SY5Y细胞作用4小时，正常对照组加入等体积的无血清培养液。利用DM1α抗体识别α-tubuLIn，用红色荧光物质标记的TRITC标记的二抗来与DM1α结合以识别微管，利用绿色荧光物质FITC标记的Phalloidin标记肌动蛋白微丝，利用激光共聚焦显微镜采集图像，观察微管和微丝在SH-SY5Y细胞的分布，及5-HMF对NaN3致微管、微丝损伤的保护作用。以放大倍数为200×的图像用图像分析仪进行图像分析。

3)实验结果

用显微镜(100×)观察示：正常细胞铺展良好，胞质微管致密规则，微管纤维束粗大，荧光强；OA损伤组细胞形态变圆，胞质微管塌陷疏松，微管纤维束变细，含量明显降低，荧光变弱；保护组部分细胞胞质微管较致密规则，轴突微管纤维束较粗，荧光较强，并有良好的剂量依赖关系。

用图像分析系统(1000×)观察结果显示：正常细胞铺展良好，胞质微丝致密，荧光强；OA损伤组细胞胞质微丝疏松紊乱，荧光变弱；保护组部分细胞胞质微丝较致密，荧光较强，并呈剂量依赖关系。

结果表明，5-HMF可拮抗OA所致的微管微丝荧光强度的降低和荧光面积的减少(表11，12)。

表11. 5-HMF对OA致SK-N-SH神经细胞微管损伤的保护作用

组别灰阶面积

正常 110.19±23.65** 624.11±112.34*

OA模型 73.73±39.85 475.86±94.36

OA+5-HMF 50g/ml 85.51±18.83* 537.31±142.36*

5-HMF 100μg/ml 103.72±25.14* 592.43±177.42*

M±SD；*P＜.05，**P＜0.01，与OA模型组相比。

表12. 5-HMF对OA致SK-N-SH神经细胞微丝损伤的保护作用

组别灰阶面积

正常 160.03±46.39** 592.75±199.26*

OA模型 57.20±29.48 409.03±274.96

OA+5-HMF 50μg/ml 69.04± 14.54* 559.09±243.49*

5-HMF 100μg/ml 82.76±21.50* 583.28±271.14*

M±SD；*P＜0.05，**P＜0.01，与OA模型组相比。

4、5-HMF对过氧化氢致AD患者融合细胞损伤的保护作用

1)实验目的

自由基增高可促进Aβ沉积和炎性细胞因子增多，损伤生物膜、DNA和蛋白质等，是AD的重要发病机理之一。本试验观察5-HMF对活性氧过氧化氢(H₂O₂)所致细胞损伤是否具有拮抗作用。

2)实验方法

将AD患者融合细胞模型常规培养至第二天，选择浓度为12.5--200μg/ml的5-HMF与融合细胞预孵育24小时，弃培养液；用500μmol/L的H₂O₂损伤2小时，以MTT法测定细胞的存活率。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可显著提高H₂O₂致AD患者融合细胞损伤的细胞存活率，具有抗氧化作用(表13)。

表13.5-HMF对H₂O₂致AD患者融合细胞存活率下降的影响(MTT法)

模型组模型+5-HMF(μg/ml)

正常组

(H2O2) 12.5 25 50 100 200

MTT值 0.58 ± 0.27 ± 0.35 ± 0.37 ± 0.39 ± 0.38 ± 0.31±

(O.D. 0.01^** 0.01 0.02^* 0.01^** 0.02^* 0.02^** 0.03^**

550nm)

M±SD；^*P＜0.05；^**p＜0.01，与模型组比较。

(二)5-HMF对帕金森病的防治作用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又称震颤麻痹，是中、老年较常发生的脑部进行性神经变性疾病。其病理机制是由于中脑黑质的多巴胺能神经元退化、变性，使通过黑质纹状体束、作用于纹状体的递质多巴胺减少，造成纹状体内多巴胺和乙酰胆碱平衡失调而发病，其中神经退化、变性涉及氧化应激损伤、线粒体功能障碍、细胞内钙失调等机制。以下研究围绕这些机制对5-HMF的药理作用进行了研究。

1、5-HMF对帕金森病患者融合细胞模型的影响

研究发现帕金森病脑中线粒体呼吸链复合体I活性降低，线粒体功能缺陷。我们采用PD患者血小板线粒体DNA与无线粒体DNA的ρ°细胞融合，建立了PD患者转线粒体DNA细胞系模型(PD患者融合细胞)。并在此模型上进行了药理学研究。

(1)5-HMF对PD患者融合细胞内活性氧水平的影响

1)实验目的

活性氧(ROS)大部分是在线粒体电子传递过程中产生的，是正常生理过程。在线粒体电子传递链(ETC)存在缺陷时，可产生超过正常水平的ROS。本研究观察5-HMF对PD融合细胞胞内活性氧水平的影响。

2)实验方法

5-HMF 100μg/ml与PD患者融合细胞预孵育24小时，以激光共聚焦显微镜(LSCM)、流氏细胞仪(FCM)测定ROS。用2’，7’-二氯荧光素(DCF-DA)荧光探针标记细胞内ROS，以LSCM)观察单个细胞内ROS的水平，实时监测ROS动态变化；用FCM对细胞整体水平ROS产生作一评价。统计方法以正常细胞143B细胞内DCF-DA荧光值为1，以融合细胞DCF-DA荧光值同正常143B细胞内DCF-DA荧光值之比表示融合细胞内的ROS水平。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可使PD患者融合细胞内的ROS水平降低56％(表14)。

表14. 5-HMF对PD患者融合细胞内活性氧水平的影响

组别 N ROS (比例)

正常青年 5 0.92±0.44*

PD模型 6 1.78±0.67

PD+5-HMF 6 1.22±0.40

M±SD；*P＜0.05，与PD模型组比较。

(2)5-HMF对PD患者融合细胞线粒体膜电位的影响

1)实验目的

研究证实PD患者细胞存在线粒体膜电位(MMP)降低。本实验观察5-HMF对PD融合细胞MMP的影响。

2)实验方法

PD患者融合细胞常规培养至第二天，选择浓度为100μg/ml的5-HMF与融合细胞预孵育24小时，以LSCM、FCM测定MMP。以正常细胞143B细胞内Rh123荧光值为1，以融合细胞Rh123荧光值同正常143B细胞内Rh123荧光值之比表示融合细胞内的MMP水平进行组间比较。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可使PD融合细胞MMP水平提高56％，达到接近正常的水平(表15)。

表15. 5-HMF对PD融合细胞线粒体膜电位(MMP)的影响

组别 N MMP

正常青年 6 1.00±0.18**

PD模型 6 0.50±0.21

PD+5-HMF 6 0.78±0.18*

M±SD；^*P＜0.05；^**p＜0.01，与PD模型组比较。

(3)5-HMF对PD患者融合细胞胞浆钙的影响

1)实验目的

在线粒体缺陷疾病中，常伴有胞浆钙调节失衡，已有研究表明PD患者细胞系中有存在钙失衡。本实验进一步探讨5-HMF是否对PD患者融合细胞线粒体的贮钙能力和胞浆钙的调节能力产生一定的影响。

2)实验方法

以5-HMF100μg/ml与PD患者融合细胞预孵育24小时，以Fluo-3/AM为胞浆钙离子荧光探针，用LSCM和FCM测定胞浆基础钙和线粒体氧化磷酸化解耦联剂(CCCP)刺激后的变化率，以融合细胞与143B细胞内Fluo-3荧光值相对值表示融合细胞的基础钙离子浓度以及受CCCP刺激后的Fluo-3荧光变化率。

3)实验结果

结果表明，5-HMF孵育可以减少PD患者融合细胞胞浆内Ca²⁺浓度(表16)，并且可提高PD患者融合细胞胞浆钙在CCCP刺激后的变化率24.5％(表17)，表明5-HMF可提高细胞内钙库的贮钙能力和胞浆钙的稳态的能力。

表16. 5-HMF对PD患者融合细胞基础胞浆基础钙离子浓度的影响

组别 N Ca²⁺(ratio)

正常青年 6 1.21±0.35

PD模型 6 1.54±0.79

PD+5-HMF 6 0.94±0.79

M±SD

表17. 5-HMF对PD患者融合细胞受CCCP刺激后的胞浆钙变化率的影响

组别 N Ca²⁺(ratio)

正常青年 6 0.98±0.58

PD模型 6 0.38±0.26

PD+5-HMF 6 0.66±0.12

M±SD

2、5-HMF对H₂0₂致PD患者融合细胞损伤的保护作用

1)实验目的

自由基增高在PD的发病过程中起了重要作用。本实验观察不同剂量5-HMF对H₂O₂损伤PD患者融合细胞的保护作用。

2)实验方法

将该模型融合细胞常规培养至第二天，选择浓度为12.5、25、50、100、200μg/ml的5-HMF与融合细胞预孵育24小时，H₂O₂500μmol/L损伤2小时，以MTT法测定细胞的存活率。

3)实验结果

结果表明，除12.5μg/ml剂量组外，其他各剂量5-HMF均可明显拮抗H₂O₂`损伤PD患者融合细胞，提高细胞存活率(表18)。

表18. 5-HMF对H2O2损伤PD患者融合细胞存活率的影响

模型组模型+5-HMF(μg/ml)

正常组

(H2O2) 12.5 25 50 100 200

MTT值

0.63± 0.52± 0.58± 0.63± 0.62± 0.64± 0.64±

(O.D.

0.01^** 0.02 0.01 0.01^** 0.01^* 0.02^** 0.03^**

550nm)

M±SD；^*P＜0.05；^**p＜0.01，与模型组比较。

3、5-HMF对NaN3致PD患者细胞损伤的保护作用

1)实验目的

拟观察5-HMF对线粒体呼吸链抑制剂NaN3损伤PD患者融合细胞的保护作用。

2)实验方法

PD患者融合细胞常规培养至第二天，选择浓度为12.5、25、50、100、200μg/ml的5-HMF与融合细胞预孵育24小时，NaN₃50mmol/L损伤2小时，测定细胞的存活率。

3)实验结果

结果表明，5-HMF可拮抗NaN3所致PD患者融合细胞存活率下降，具有细胞保护作用(表19)。

表19. 5-HMF对NaN3致PD患者融合细胞损伤的保护作用

模型组模型+5-HMF(μg/ml)

正常组

NaN3 12.5 25 50 100 200

MTT值

0.63± 0.43± 0.48± 0.50± 0.52± 0.53± 0.54±

(O.D.

0.01^** 0.02 0.02^* 0.01^** 0.01^** 0.02^** 0.03^**

550nm)

M±SD；^*P＜0.05，^**p＜0.01，与模型组比较。

4、5-HMF对MPTP致帕金森病小鼠模型的影响

1)实验目的

帕金森病的病理机制是由于中脑黑质的多巴胺能神经元退化、变性，使通过黑质纹状体束、作用于纹状体的递质多巴胺减少，造成纹状体内多巴胺和乙酰胆碱平衡失调而发病。MPTP可以通过特异性阻断线粒体复合体I，产生一种选择性神经毒素损害黑质中多巴胺神经元，产生与临床帕金森病人十分相似的病理、生理改变。本实验旨在观察5-HMF对MPTP致小鼠黑质多巴胺能神经元损伤的行为学改善作用。

2)实验方法

雄性C57B1小鼠，在给予5-HMF连续灌胃7天后，腹腔注射MPTP 30mg/kg造模，再连续灌服5-HMF14天，期间进行如下爬杆训练与时间测定，并设立正常组和模型组进行比较。

实验用具为自制不锈钢杆长0.5米，直径1cm(其上用胶布缠绕)顶端为一直径2.5cm的木制圆球。动物给予MPTP前，先进行爬杆训练，引导动物15秒内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕即对其进行爬杆时间测定，给予MPTP后1-2小时内，对动物进行第二次爬杆时间的测定。具体测定方法如下：持小鼠尾部，将其头向下置于杆顶部(以小鼠双后肢置于球上为准)，让其自然爬下，记录小鼠自站于杆顶至双前肢接触杆底平台所需时间，给予MPTP后卜2小时重复如上测定。(测定时限120秒，小鼠不能持杆，完全自然下滑者，记录其爬杆时间为120秒)。计算各组小鼠处理前后爬杆时间差值(处理后爬杆时间短于未处理时，其数据记录为0)。连续测定造模期间各组小鼠处理前后爬杆时间差值。爬杆时间反映动物的协调性好则爬杆时间短，协调性差则爬杆时间长。

3)实验结果：

5-HMF给药组小鼠爬杆时间与模型组相比显著缩短，表明该药能显著提高帕金森模型小鼠的运动协调能力(表20)。

表20. 5-HMF对MPTP致帕金森病模型小鼠爬杆时间的影响

组别 N 爬杆时间(秒)

正常对照 6 10.47±2.31*

MPTP模型 6 92.28±23.97

模型+5-HMF(10mg/kg) 5 67.93±27.05

模型+5-HMF(100mg/kg) 6 39.00±21.63*

M±SD；*P＜0.05，与MPTP模型组比较

(三)5-HMF对亨廷顿病的防治作用

1)实验目的

亨廷顿病(Huntington Disease，HD)又称Huntington舞蹈病，是一种常见的基底节和大脑皮层神经变性疾病，临床特征为慢性进行性的舞蹈样动作和痴呆。本实验拟利用线粒体复合体II/III抑制剂3-硝基丙酸(3-NPA)建立的亨廷顿病大鼠模型，观察5-HMF对该模型大鼠行为学的改善作用。

2)实验方法

SD大鼠隔日腹腔注射10mg/kg的3-NPA，共造模20天，造模前1周开始每日皮下注射30mg/kg的5-HMF，共给药6周。

Morris水迷宫试验：检测空间学习记忆能力。主要由圆形水池和自动录像系统两部分组成。每只动物每天训练2次，训练4天。120秒未找到站台者，将其引至站台，放置30秒，引导其学习与记忆。第2-4天重复以上操作。数据采集与处理均由图像自动检测和分析系统完成。得出游出时间(即入池到找到站台的时间)和游泳距离。

避暗反应：检测被动回避学习记忆能力。第1天进行训练，将大鼠头向外放入避暗箱明室，动物一般会进入暗室受到1-2次电击，如动物不进入，则驱入暗室，使之产生记忆，共5分钟。第2天进行测试，记录四肢全部进入暗室的次数及进入暗室的时间为潜伏期，如未进入，按300秒纪录。

旷场分析：检测运动功能。将大鼠放入箱底划为25方格的旷场分析箱内，观察5分钟内动物的跨格次数、站立次数和理毛次数。运动次数减少，表明运动功能越差。

3)实验结果

与3-NPA模型组相比，5-HMF给药组水迷宫游出时间与游泳距离在各日程均有一定程度缩短，在均数差异更大(表21、22)；避暗实验潜伏期延长、错误次数减少(表23)，表明该药对亨廷顿病大鼠模型的记忆能力有一定提高。旷场分析实验表明，5-HMF可使亨廷顿病大鼠运动次数增加，使之运动功能得到改善(表24)。

表21. 5-HMF对亨廷顿病大鼠模型Morris水迷宫游出时间(秒)的影响

组别 N 第一日第二日第三日第四日平均

正常对照 10 93.1± 61.5± 51.5± 19.3± 52.6±

24.9 36.5 51.8 16.7 16.1

3-NPA模型 8 89.9± 86.9± 84.5± 29.1± 89.5±

40.2 41.2 38.4 33.0 43.1

模型 + 11 80.5± 62.6± 61.1± 26.4± 56.5±

5-HMF 48.7 47.8 39.4 25.9 33.7

M±SD

表22. 5-HMF对亨廷顿病大鼠Morris水迷宫游出距离(厘米)的影响

组别 N 第一日第二日第三日第四日平均

正常对照 10 1928.0±7 1700.5± 1007.5± 460.8± 1140.8±

24.1 711.5 906.3 500.5 464.0

3-NPA 模 8 2220.1±9 1846.3± 2005.9± 797.3± 1636.9±

型 52.3 848.0 1036.3 875.9 737.9

模型 + 11 1534.7±9 1148.42± 1245.8± 527.5± 1100.5±

5-HMF 21.6 797.8 726.5 484.8 617.9

M±SD

表23. 5-HMF对亨廷顿病大鼠避暗实验的影响

组别 N 潜伏期(秒) 错误次数

正常对照组 10 173.2±15.5 0.22±0.44*

3-NPA模型 8 105.0±82.3 1.62±1.40

模型 + 11 173.3±22.3 0.09±0.30*

5-HMF

M±SD；*P＜0.01，与模型组比较

表24.5-HMF对亨廷顿病大鼠旷场分析实验的影响

组别 N 站立次数跨格次数理毛次数

正常对照组 10 7.11±8.43* 27.67±33.40 1.89±1.90

3-NPA模型 8 1.38±2.77 11.25±9.94 0.87±1.12

模型+5-HMF 11 1.45±2.34 17.09±24.76 1.72±2.49

M±SD；*P＜0.05，与模型组比较

结论

通过以上的系列研究，我们发现5-HMF可以从抗氧化、提高神经细胞在病理损伤的存活率、稳定细胞膜、调节钙离子平衡、对抗微管相关蛋白过度磷酸化和Aβ沉积等多方面对老年痴呆病有良好改善作用；能够有效提高帕金森病细胞模型的抗损伤能力和动物模型的行为能力；并且能够改善亨廷顿病大鼠模型的记忆能力和运动功能。因此，5-HMF类化合物可以用作防治脑神经退行性疾病和认知损害的药物及保健品。

Claims

1、5-羟甲基-2-糠醛或其衍生物在制备预防/治疗神经退行性疾病或认知损害的药品中的用途。

2、根据权利要求1的用途，其中神经退行性疾病为老年痴呆。

3、根据权利要求1的用途，其中神经退行性疾病为帕金森病。

4、根据权利要求1的用途，其中神经退行性疾病为亨廷顿病。

5、5-羟甲基-2-糠醛或其衍生物在制备预防/治疗神经退行性疾病或认知损害的保健品中的用途。

6、根据权利要求2的用途，其中神经退行性疾病为老年痴呆。

7、根据权利要求2的用途，其中神经退行性疾病为帕金森病。

8、根据权利要求2的用途，其中神经退行性疾病为亨廷顿病。

9、一种预防神经退行性疾病和认知损害的药物组合物，特征在于含有治疗有效量的5-羟甲基-2-糠醛或其衍生物。

10、根据权利要求9的药物组合物，其中神经退行性疾病为老年痴呆。

11、根据权利要求9的药物组合物，其中神经退行性疾病为帕金森病。

12、根据权利要求9的药物组合物，其中神经退行性疾病为亨廷顿病。

13、一种治疗神经退行性疾病和认知损害的药物组合物，特征在于含有治疗有效量的5-羟甲基-2-糠醛或其衍生物。

14、根据权利要求13的药物组合物，其中神经退行性疾病为老年痴呆。

15、根据权利要求13的药物组合物，其中神经退行性疾病为帕金森病。

16、根据权利要求13的药物组合物，其中神经退行性疾病为亨廷顿病。