CN1502619A - 分离制备卵磷脂的方法及实施该方法的装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离制备高纯度卵磷脂的方法和实施该方法的装置。尤其是利用超临界流体制备色谱的方法从大豆及蛋黄磷脂提取物中分离出单组分卵磷脂，特别是磷脂酰胆碱的工艺。本发明是以磷脂提取物为原料，采用超临界流体制备色谱法，以超临界流体作为流动相将原料带入色谱柱中进行分离，根据各化合物保留时间及其出峰时间进行组分切割和收集。本发明建立了一种生产高纯度磷脂产品的体系，不需要繁琐的工艺过程，就可以收集得到基本上是单组分的高纯度PC和PE等重要的磷脂产物。

Description

分离制备卵磷脂的方法及实施该方法的装置

技术领域

本发明涉及一种分离制备高纯度卵磷脂的方法和实施该方法的装置。本发明尤其涉及利用超临界流体制备色谱的方法从大豆及蛋黄磷脂提取物中分离出单组分卵磷脂，特别是磷脂酰胆碱的工艺。

现有技术

商业上广义的卵磷脂实际上是指包含多种不同化学构造的磷脂质，一般包括磷脂酰胆碱(Phosphotidyl choline，俗称PC)，磷脂酰乙醇胺(Phosphotidyl ethanolamine，俗称PE)，磷脂酰肌醇(Phosphotidylinostol，PI)，磷脂酰丝氨酸(Phosphotidyl serine，PS)，磷脂酸(Phosphotidyl acid，PA)等。但是从专业和技术角度狭义的卵磷脂是指磷脂酰胆碱(PC)。

卵磷脂在分子构造上具有两条疏水性长脂肪酸链及亲水性磷酸根离子及碱基离子，是一种典型的离子型表面活性剂。由于其本身固有的乳化、软化、分散、润湿、抗氧化及生理活性等一系列特性，因此用途十分广泛，是食品、医药、化妆品、皮革制品、轻工、电子等行业中的重要原料。

在本发明以前，卵磷脂的提取和分离方法主要有有机溶剂法、超临界二氧化碳抽提法等。如专利申请CN1214340，名称为“高纯磷脂精细分离方法”，其中记载了采用大豆油油脚为原料，经己烷萃取、除杂、脱色、回收己烷和丙酮萃取来完成分离磷脂的方法；又如发明专利CN1257660，名称为“由蛋黄粉获得尤其是卵磷脂的方法”，公开了用超临界流体萃取蛋黄粉，通过多步骤方法处理提取物，提取出有用物质，尤其重要的是获得卵磷脂。这些方法都把重点放在提高磷脂总量上，都没有涉及如何得到单组分磷脂，也就是说，本发明以前的现有技术的一个共同的缺憾就是难以分离得到高纯度PC、PE的卵磷脂且过程复杂。

已知磷脂的性质随各组分含量的变化而不同，而卵磷脂PC的表面活性强于其他组分，所以在制备静脉注射剂、合成药物原料或生化试剂中，都需要高纯度的单组分磷脂，尤其是卵磷脂PC。用于制药目的，高纯度蛋黄或大豆磷脂酰胆碱(PC)的分离制备主要采用高效液相色谱。然而到目前为止，所报道的一些方法不是负载能力差，就是溶剂消耗大。由于磷脂产物的热稳定性差，磷脂产品与溶剂的分离困难，特别是有些方法中还要采用混合溶剂梯度冲洗，使溶剂难以回收利用。

因此，通过可行的工艺方法从磷脂中将PC分离出来，得到纯度尽可能高的PC产品，在制药、制备生化制剂等领域中具有很实际的意义。

总之，现有技术的不足之处在于所生产的卵磷脂为多种磷脂化合物的混合物，不仅工艺复杂且产品中重要组分(例如PC)纯度不够高。本发明所要解决的问题就是避免使用大量有机溶剂和复杂的工艺步骤，采用超临界流体制备色谱，建立一种生产高纯度磷脂产品，尤其是高纯度PC的体系。

发明内容

本发明提供了一种利用超临界流体制备色谱从磷脂提取物中分离制备高纯度卵磷脂的方法，通过控制组分切割，不需要繁琐的工艺过程，就可以收集到基本上是单组分的高纯度PC和PE等重要的磷脂产物。

基于上述方法，本发明还提供了用于实施方法的分离纯化装置，即，超临界流体制备色谱装置，建立一种生产高纯度磷脂产品的体系。

根据本发明的方法，其特征在于采用超临界流体制备色谱法，对磷脂提取物进行提取，即，以超临界流体作为流动相将原料带入色谱柱中进行分离，根据化合物保留时间及其出峰时间进行组分切割和收集，进而实现高纯度卵磷脂组分的分离，尤其是可以得到基本上是单组分的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等具有高价值的磷脂产品。

本发明的方法是以含PC的大豆磷脂或蛋黄磷脂或其他种类的植物磷脂提取物为原料，采用超临界流体制备色谱来分离纯化卵磷脂中的PC(同时可以得到PE及其它相关产物)。超临界流体中的溶剂可使用常规超临界流体萃取操作所采用的溶剂，例如二氧化碳、低级烃类等，从产物的安全性角度，优选使用二氧化碳或C₂-C₄的低级烷烃。本发明的流动相中包括一定体积比的溶剂与携带剂，固定相包括粒径为3-30μ的空白硅胶或键合硅胶。其中，携带剂在流动相中的体积含量为1-30％。

根据本发明的方法，携带剂可以为低级醇，也可以是低级醇+微量强极性组分。所述低级醇为4个碳以内(包括4个碳原子的)的一元醇和二元醇。当其中还包括微量强极性组分时，该组分可以选自水、氨水、三乙胺、三乙醇胺、磷酸、盐酸、三氟乙酸或它们的混合物。该微量强极性组分的质量含量是0.001m％-1.0m％。

根据本发明的优选方案，所采用的键合硅胶固定相可以是C₁₈键合相，C₃₀键合相、苯基、双醇基或氨基键合相固定相等，通常以匀浆装填法或压缩柱技术(轴向或径向)进行填充，在分离过程中采用动态压缩技术使色谱填料处于密实状态。

根据本发明的方法，其原理是利用超临界流体首先对原料中的磷脂组分进行提取，使之溶解后被送入色谱柱中，混合物中各组分由于受超临界流体的溶解作用和固定相吸附力的大小不同而得到分离，进而按照不同的先后顺序流出，根据各组分的保留时间及其出峰区间，通过微机控制实现组分切割和收集。

根据本发明的方法，先使溶剂和携带剂混合成为超临界流体，然后作为色谱分离的流动相，其将待分离原料带入色谱柱，温度为20-80℃，压力为10.0-45.0Mpa。在适当的温度(20-80℃)和压力(10.0-45.0MPa)下，按照保留时间和目标产物的出峰区间将所要分离的组分进行切割，组分的收集采用计算机采集信号并控制接收阀的阀位使不同的组分被收集在不同的收集器中，进样和产物收集周期性进行，得到的产物经真空干燥脱溶剂，低温保存。

根据本发明的技术方案，提供了一种超临界流体制备色谱作为卵磷脂的分离纯化设备，其包括溶剂罐和携带剂罐；用于超临界流体及携带剂输送的高压注射泵；自动控制进样器；可在线装填的轴向压缩色谱柱；在线检检测器和多通道切换阀组；用于分离产物与溶剂的分离器；用于分离溶剂与携带剂的分离装置；其中待分离样品的进样和分离产物的接收由计算机控制定时或自动切换。

从以上说明可以看出，本发明将超临界流体技术与制备色谱法结合有效起来，提出了一套可有效分离纯化卵磷脂的超临界制备色谱，同时选择适当的流动相和固定相，实现卵磷脂的纯化和分离。本发明最重要的是建立了一套卵磷脂的分离制备体系(本发明称之为超临界流体制备色谱)，以经任何可行方法制备得到的磷脂提取物为原料，对其进一步分离精制，可以得到高纯度的单组分磷脂产品，尤其可以得到高纯度单组分卵磷脂(PC和PE)，提取纯度可达98m％以(质量百分比)上。本发明由于采用超临界流体，使用例如二氧化碳和低级烃作为色谱流动相，流动相可以循环使用，与现有技术相比具有节省溶剂，样品回收和后处理简便，操作条件温和，工艺简单等优点。

需要说明的是，根据通常的理解，目前在本领域中所称的“超临界流体”包括了在亚临界态和超临界态的流体，也就是说，在临界温度附近的流体都被称为超临界流体。本发明中也沿用这样的定义，在本发明的权利要求书和说明书中所提到的“超临界流体”都应理解为包括在临界温度附近的亚临界态和超临界态流体。

以下通过图示说明和具体实施例详细说明本发明的有益效果。

附图说明

图1是本发明提供的超临界流体制备色谱流程图。

参看图1，本发明超临界流体制备色谱分离纯化卵磷脂的原理和过程如下。溶剂和携带剂分别由溶剂罐001和携带剂罐003经高压泵101、102成为超临界流体，经输出混合作为色谱流动相，进入烘箱201中被加热到预定的温度。待分离原料由泵103抽出送入高压进样器301，并被流动相带入色谱柱401中，该高压进样器由计算机控制脉冲进样，混合物中各组分由于受超临界流体的溶解作用力和固定相吸附力的大小不同得到分离，按不同的先后顺序流出，通过检测器501得到产物流出的信号，由计算机901控制多通道阀组601-602切换到指定的收集器701-706中，在进入收集器前降低超临界流体流动相的压力，将产物分离出来。溶剂经冷却器801循环回溶剂罐，携带剂在溶剂罐中分离后回到携带剂罐003，002是超临界流体储罐。

在操作前利用PC、PE等化合物组分的标准品，将相关信息输入计算机，这样，原料的进样和产物的收集都由计算机901控制完成。

实施例

下面的具体实施例用于帮助阅读者理解本发明的实现和所带来的有益效果，并不能构成对本发明实施范围的限定。

各实施例的具体操作参见图1所示流程图及上面结合图1的描述。

原料中PC和PE的含量测定可以采用柱薄层色谱分析法(TLC-FID)。TLC-FID薄层色谱分析法以胆固醇乙酰酯(Cholesterol acetate choA)为内标物，标准液和样品液均以Folch溶剂(氯仿∶甲醇＝2∶1)配制，蛋黄卵磷脂的分析用两种展开剂，展开剂A：氯仿∶甲醇∶水＝10∶5∶0.5，展开至5cm；展开剂B：正己烷∶乙醚∶甲酸＝54∶6∶0.08，展开至10cm，然后用FID扫描检测并计算PC，PE等各谱峰面积及含量。大豆卵磷脂的两种展开剂分别为，展开剂A：氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶丙酮∶水＝35∶25∶4∶14∶2，展开剂B：正己烷/乙醚＝4∶1，同样方法展开后用FID扫描检测并计算PC，PE等各谱峰面积及含量。

实施例1

利用Φ25*250mm硅胶(5μ)制备柱上对大豆磷脂提取物进行分离，测定该提取物中PC质量含量为34％，色谱填料以40MPa压力轴向动态压缩。操作压力25MPa，温度为40℃，流动相流速为8ml/min，携带剂体积含量为20％。流动相中溶剂使用二氧化碳，携带剂为乙醇+三乙胺+三乙醇胺，携带剂中三乙胺+三乙醇胺的浓度为0.1m％，且三乙胺∶三乙醇胺＝75m％∶25m％。每次循环为12分钟，每天40次循环，进样量1.4g，收集PE、PC组分，经脱除其中的微量溶剂，测得PE纯度为95m％，PC纯度为97m％，原料中PE和PC的总回收率为90m％。

实施例2

在Φ25*500mm C₁₈硅胶键合相(10μ)制备柱上对大豆磷脂提取物进行分离，该大豆磷脂提取物中的PC质量含量为53％，色谱填料以35MPa压力轴向动态压缩。操作压力15MPa，温度为80℃，流动相流速15ml/min，携带剂加入量为10％。流动相中的溶剂是丙烷，携带剂为乙醇+三氟乙酸+磷酸，携带剂中三氟乙酸+磷酸浓度为0.05m％，且三氟乙酸∶磷酸浓度＝40m％∶60m％。每次循环为6分钟，每天80次循环，原料处理量为3.0g，收集PC组分，经色谱检验PC纯度为98m％，回收率为92m％。

实施例3

在Φ100*500mm苯基硅胶键合相(10μ)制备柱上对蛋黄卵磷脂提取物进行分离，该提取物中PC质量含量80m％，色谱填料以45MPa压力轴向动态压缩。操作压力30MPa，温度为35℃，携带剂加入量为5m％。流动相中的溶剂是二氧化碳，携带剂为乙醇+水+磷酸，携带剂中水+磷酸的浓度为0.01m％，且水∶磷酸＝70m％∶30m％。流动相流速150ml/min，每次循环为10分钟，每天进行50次进样，处理样品约为50.0g。收集PC组分，经色谱检验纯度大于98.5m％，回收率为95m％。

实施例4

在Φ100*500mm C₃₀硅胶键合相(20μ)制备柱上对PC含量70m％的大豆磷脂提取物进行分离，色谱填料以40MPa压力轴向动态压缩。流动相中的溶剂是二氧化碳，压力30MPa，温度为55℃，携带剂加入量为8m％，携带剂为乙醇+水+盐酸，携带剂中水+盐酸的浓度为1.0m％，且水∶盐酸＝90m％∶10m％。流动相流速150ml/min。每次循环为12分钟，每天进行40次进样，处理样品为80g。收集PE、PC组分，经检验PE组分纯度为95m％，PC纯度为97m％，PE和PC的总回收率为93m％。

Claims (11)

1、卵磷脂的分离制备方法，其特征在于以磷脂提取物为原料，采用超临界流体制备色谱法，以超临界流体作为流动相将原料带入色谱柱中进行分离，根据各化合物保留时间及其出峰时间进行组分切割和收集。

2、权利要求1所述的方法，其中，所述超临界流体制备色谱的流动相中包括溶剂和携带剂，所述溶剂选自二氧化碳或C₂-C₄烷烃，所述携带剂中含有C₁-C₄的一元醇或含有C₂-C₄的二元醇，携带剂在流动相中的体积含量为1-30％；固定相包括粒径为3-30μ的空白硅胶或键合硅胶。

3、权利要求2所述的方法，其中，所述携带剂中还含有强极性组分，其质量含量为0.001-1.0m％。

4、权利要求3所述的方法，其中，所述强极性组分为水、氨水、三乙胺、三乙醇胺、磷酸、盐酸、三氟乙酸或它们的混合物。

5、权利要求2所述的方法，其中，所述键合固定相为C₁₈键合相，C₃₀键合相，苯基、双醇基或氨基键合相固定相。

6、权利要求1或2所述的方法，其中，所述磷脂提取物中的磷脂酰胆碱的质量含量在10％以上。

7、权利要求1或2所述的方法，其中，待分离原料经加压后被流动相带入色谱柱，超临界流体流动相的温度为20-80℃，压力为10.0-45.0Mpa。

8、权利要求1所述的方法，其中，组分的切割和收集通过多通道切换阀完成。

9、前述任一项所述的方法，其中，采用超临界色谱周期进样，连续收集组分。

10、前述任一项所述的方法，经组分切割和制备的产物包括基本上是单组分的磷脂酰胆碱。

11、用于分离纯化卵磷脂的超临界流体制备色谱装置，其设置有：

—溶剂罐和携带剂罐；

—用于形成超临界流体及携带剂输送的高压注射泵和自动控制进样器；

—可在线装填的轴向动态压缩色谱柱；

—在线检测器和多通道切换阀组；

—用于分离产物与流动相的分离器；

其中待分离样品的进样和分离产物的接收由计算机控制定时或自动切换。

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