CN1494592A - 在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中表达的核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种分离的核酸分子，其包含编码一种分子或其衍生物或同系物或与互补于编码一种分子或其衍生物或同系物的序列的核苷酸序列，其中所述的核酸分子在肥胖型动物的下丘脑组织或肌肉组织中表达的量大于瘦型动物或在摄食动物的下丘脑组织或肌肉组织中表达的量大于禁食动物。本发明公开了核酸序列。提出了将这类核酸的表达产物用作与肥胖、食欲缺乏、体重维持、肌肉发育不良、糖尿病和/或代谢能量水平相关的生理过程的调节剂和/或监控剂。

Description

在肥胖型动物下丘脑或 肌肉组织中表达的核酸
发明领域
本发明一般涉及在下丘脑或骨骼肌组织中表达、并使用差异显示或大阵列(macroarray)技术或能够在不同生理条件下检测核酸分子差异表达的其它技术鉴定的核酸分子。来自本发明核酸分子的表达产物与健康状态、肥胖、食欲缺乏、体重维持、肌肉发育不良、糖尿病和/或代谢能量水平和/或改变的生理条件中的一种或多种相关或作为它们的标志。鉴定本发明的核酸分子及其表达产物和/或其衍生物、同系物、类似物和模拟物以用作治疗剂和诊断试剂或用作作为与肥胖、食欲缺乏、体重维持、肌肉发育不良、糖尿病和/或代谢能量水平和/或其它生理情况相关的生理过程的调节剂和/或监控剂试剂的靶物。
发明背景
对本说明书中参考的任何现有技术不是且不应看作是承认或任何形式的暗示该现有技术形成澳大利亚或任意其他国家中的公知常识部分。
重组DNA技术不断完善极大促进在兽药和人和动物联合健康领域中的研究和开发。尤其在涉及某些疾病情况病因学的遗传碱基的研究中。从发病率和死亡率的观点来看，一种特别明显的情况是肥胖及其与2型糖尿病(早先的非胰岛素依赖性糖尿病或NIDDM)和心血管疾病的相关性。
将肥胖定义为体脂肪病理性过量，且是在一段持续时间期限内能量吸收与能量消耗之间发生失衡的结果。肥胖是在富国中发现的最常见的代谢性疾病。在这些国家中肥胖的患病率令人惊奇得高，在某些亚人群中从10％至高达50％(Bouchard，《肥胖遗传学》(Thegenetics of obesity.)  Boca Raton：CRC Press，1994)。特别相关的情况在于肥胖的患病率看起来在富人社会中持续上升，且目前当繁荣程度较低的国家变得比较富有和/或吸收了比较富有国家的文化实践时肥胖的患病率也正在快速增加(Zimmet，《糖尿病护理》(Diabetes Care)15(2)：232-247，1992)。
例如，在1995年的澳大利亚，19％的成年人口属于肥胖(BMI＞30)。1995年，妇女的体重平均超过1980年其相应者体重4.8kg，而男性体重平均超过1980年其相应者体重3.6kg以上(澳大利亚健康与福利研究所(Australian Institute of Health andWelfare)(AIHW)，《心脏病、中风和血管疾病-真实的澳大利亚》(Heart，Stroke and Vascular diseases，Australian facts.)AIHW Cat.No.CVD 7 Canberra：AIHW和《澳大利亚心脏病基金会》(Heart Foundation of Australia)，1999.)。近来在1999年与2000年之间进行的AusDiab研究表明年龄在25-64岁的65％的男性和45％的女性超重(de Looper和Bhatia，《澳大利亚健康趋势》(Australia’s Health Trends)2001；澳大利亚健康与福利研究所(Australian Institute of Health and Welfare)(AIHW)Cat.No.PHE 24.Canberra：AIHW，2001)。在美国肥胖的患病率在1991年至1998年间也基本上在增加，在此期间肥胖的美国人从12％上升到18％(Mokdad等，JAMA.282(16)：1519-22，1999)。
肥胖的高度和不断增加的患病率在总体上对个体和社会的健康具有严重影响。肥胖是复杂而异源性疾病，且已经将其鉴定为可预防的发病率和死亡率的关键危险指标，这是因为肥胖增加了包括2型糖尿病和心血管疾病在内的许多其他代谢性疾病的危险(Must等，JAMA.282(16)：1523-1529，1999；Kopelman，《自然》(Nature)404：635-643，2000)。除肥胖以外，糖尿病的患病率持续快速增加。据估计1995年在澳大利亚大约有700,000人患糖尿病，而在美国糖尿病的患病率从1990年的4.9％增加到1999年的6.9％(Mokdad，《糖尿病护理》(Diabetes Care)24(2)：412，2001)。在澳大利亚，据保守地估计，与糖尿病和其它疾病情况相关的肥胖的年度费用就1992-3年而言为8亿1千万澳元(国家健康和医疗研究委员会，对澳大利亚人体重的影响：预防超重和肥胖的策略。(NationalHealth and Medical Research Council，Acting on Australia’sweight：A strategy for the prevention of overweight andobesity.)Canberra：国家健康和医疗研究委员会(NationalHealth and Medical Research Council)，1996)。在美国，国家健康访问调查(National Health Interview Survey)(NHIS)估计1995年肥胖的经济费用约为990亿美元，由此占当时美国总健康费用的5.7％(Wolf和Colditz，《肥胖研究》(Obes Res.)6：97-106，1998)。
从对双胞胎的研究中显示了肥胖的病因学的遗传基础，该研究是选择研究和基于人群的分析，提示遗传影响决定一般人群中体重变化的25-80％(Bouchard[1994；文献同上]；Kopelman等，《国际肥胖杂志》(Int J Obesity)18：188-191，1994；Ravussin，《代谢》(Metabolism)44(增刊3)：12-14，1995)。认为基因决定个体体重的可能范围，然后环境影响个体在任何给出的时间点的处理该范围内的点(Bouchard[1994；文献同上])。然而，尽管对基因的大量研究认为它们涉及肥胖的发病机理，但是令人意外的是在该领域中几乎没有显著的发现。此外，在不同人群组中进行的宽范围的基因组扫描没有产生对肥胖具有主要作用的染色体区的确定证据。
许多器官/组织与肥胖和2型糖尿病的病理生理学相关，特别关注的是下丘脑。长期以来将下丘脑看作是调节能量摄取的关键脑区域(Stellar，《心理学综述》(Psychol Rev)61：5-22，1954)，且目前广泛接受的是下丘脑在能量稳态、整合并协调由下丘脑产生和/或对下丘脑起作用的大量因子中起关键作用。已经研究了许多这些因子在能量平衡和体重调节中的作用，包括神经肽Y、促肾上腺皮质素释放激素、黑色素浓缩激素、瘦蛋白(leptin)和胰岛素。已经提出干扰调节下丘脑中能量平衡的代谢途径的遗传改变可能导致发生肥胖和随后的糖尿病。因此，理解下丘脑在调节动物代谢中的功能中的重要步骤需要鉴定这些激素的靶物。这类靶物可能是完整的器官和表达受这些激素存在调节的基因。
按照本发明，本发明者寻求鉴定在瘦型与肥胖型动物或在摄食(fed)动物与非摄食(unfed)动物中差异表达的遗传序列。本发明者使用诸如差异显示和大阵列(macroarray)(即基于膜的微阵列)分析的技术鉴定了被认为与涉及健康状况或疾病情况的一种或多种生物功能相关的基因，所述的健康状况或疾病情况诸如但不限于肥胖、食欲缺乏、体重维持、糖尿病、肌肉发育和/或代谢能量水平和/或其它改变的生理情况。
发明概述
在本说明书中，除非上下文另有说明，将措词″包括″或诸如，″含有″或″包含″这样的变化形式理解为是指包括所述的组成部分或整体或组成部分或整体组，但不排除任意其它的组成部分或整体或组成部分或整体组。
核苷酸和氨基酸序列以序列标识符号(SEQ ID NO：)所示。SEQ IDNOs：在数值上相当于序列标识符<400>1、<400>2等。在权利要求后提供序列表。
将包括对来自下丘脑组织或肌肉组织的遗传物质进行差异显示分析和大阵列(macroarray)(即基于膜的微阵列)分析在内的技术用于鉴定与健康状况或与生理情况相关的候选遗传序列，所述的健康状况或疾病情况诸如有肥胖、食欲缺乏、体重维持、糖尿病、肌肉发育和/或代谢能量水平。使用包括以色列沙土鼠(Israeli Sand Rat)(Psammomys obesus)在内的动物模型。使用基于如下代谢表型命名的A、B和C组的三组动物：
A组：瘦型动物；
B组：肥胖型非糖尿病动物；和
C组：肥胖型糖尿病动物。
将动物维持在摄食或未摄食条件或高或低葡萄糖或胰岛素条件下，并通过差异显示和大阵列(macroarray)分析进行分析。在使用这些技术的一个优选实施方案中，鉴定了来自下丘脑的四种推定的差异表达的序列，本文中命名为AGT-106、AGT-113、AGT-201和AGT-202，分别具有序列标识符SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4。另一种给出的是在骨骼肌中差异表达的AGT-203(SEQ ID NO：5)。
差异表达是指在一组条件下与其它相比，遗传序列的表达水平升高。在一个特定的实施方案中，在摄食动物与瘦型动物中AGT-106的表达升高。在肥胖型动物中，甚至当其摄食时也发现AGT-106受到抑制。AGT-106参与对禁食时能量利用和体重的调节。AGT-113在糖尿病肥胖型动物中的表达高于瘦型健康动物中的表达，从而证明AGT-113参与体重调节和能量体内平衡，且可能还与下丘脑中胰岛素或胰岛素抗性作用有关。使用常量分析(macroanalysis)鉴定AGT-201，其表达在禁食动物中较少。AGT-201参与对禁食和能量稳态的中枢反应。AGT-201还可以在糖尿病中发挥作用。还通过常量分析鉴定了AGT-202，并证实与禁食动物相比它在摄食动物下丘脑中升高，且它可能参与能量调节和/或体重维持。最后使用大阵列(macroarray)分析在瘦型非糖尿病与肥胖型糖尿病动物的骨骼肌中差异表达了AGT-203。可能的情况是AGT-203在骨骼肌内葡萄糖或脂肪代谢中起作用，由此影响体重和胰岛素作用。表1中总结了AGT序列。
对这些可变表达的序列的鉴定可以合理设计和/或选择能够拮抗或激动表达产物的分子和/或开发筛选试验。这些筛选试验例如包括评价特定受试者的生理状态。
因此，本发明在一个方面中提供了包括编码蛋白质或其衍生物、同系物、类似物或模拟物或互补于编码蛋白质或其衍生物、同系物、类似物或模拟物的序列的核苷酸序列的核酸分子，其中所述的核酸分子在肥胖型动物的下丘脑或肌肉组织中表达的量大于瘦型动物。另一方面或此外，所述核酸分子在摄食动物的下丘脑或肌肉组织中表达的量大于禁食动物。
在一个优选的实施方案中，所述的核酸分子包含基本上如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的全部或部分具有至少约30％相似性的核苷酸序列和/或能够在42℃的低严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中的一种或多种或其互补形式杂交的核苷酸序列。
本发明的另一个方面提供了分离的分子或其衍生物、同系物、类似物或模拟物，它在肥胖型动物下丘脑组织中产生的量大于瘦型动物和/或在摄食动物下丘脑组织中产生的量大于禁食动物。
该分子一般是蛋白质，但也可以是mRNA、内含子或外显子。
该分子由基本上如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的全部或部分具有至少约30％相似性的核苷酸序列和/或能够在42℃的低严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5杂交的核苷酸序列编码。
在该方面中，可以认为所述的分子是本发明的核苷酸序列的表达产物。
本发明的优选遗传序列在本文中称作AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。由AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203编码的表达产物在本文中分别称作AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。优选的表达产物是蛋白质。
本发明的另一个方面涉及包括含表达产物，诸如由AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203定义的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物或模拟物或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的兴奋剂或拮抗剂以及一种或多种药物上可接受的载体和/或稀释剂的组合物。
此外，本发明涉及受试者的治疗方法，该方法包含在足以产生治疗作用的时间和条件下对受试者给予治疗有效量的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物、同系物、类似物或模拟物或编码它们的遗传序列或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203基因表达的兴奋剂或拮抗剂。
按照本发明的该方面和其它方面，本文关注的治疗包括但不限于对肥胖、食欲缺乏、体重维持、能量失衡和糖尿病的治疗。治疗可以通过给予药物组合物或经基因疗法给予遗传序列来进行。治疗所关注的是人体受试者和动物、诸如对家畜工业而言重要的动物。
本发明的另一个方面涉及用于监测或诊断疾病的诊断试剂，所述的疾病诸如但不限于肥胖、食欲缺乏、体重维持、能量失衡和/或糖尿病，所述的诊断试剂选自AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物、同系物、类似物或模拟物的抗体和用于PCR、杂交、RFLP及其它技术的遗传序列。
表2中总结了本说明书上下文中使用的序列标识符。
                           表1
                   差异表达的基因概述
  基因 SEQ ID NO：   组织              表型   检测方法
AGT-106     1 下丘脑 在摄食沙土鼠中的表达高于禁食沙土鼠(A组[瘦型健康大鼠])   差异显示
AGT-113     2 下丘脑 在C组(肥胖型糖尿病)中的表达高于A组   差异显示
AGT-201     3 下丘脑 在禁食A和B组(肥胖型血糖正常和血胰岛素过多)动物中的表达程度较低   大阵列(Macroarray)
AGT-202     4 下丘脑 在A和B组摄食动物中的表达高于A和B组禁食动物、高于C组动物   差异显示
AGT-203     5 骨骼肌 在瘦型非糖尿病(A组)动物中的表达高于C组(肥胖型糖尿病)   大阵列(Macroarray)
                     表2
               序列标识符概述
    序列ID NO.                描述
    1 AGT-106的核苷酸序列
    2 AGT-113的核苷酸序列
    3 AGT-201的核苷酸序列
    4 AGT-202的核苷酸序列
    5 早老蛋白(Presenilins)相互作用菱形样蛋白质(AGT-203)的核苷酸序列
    6 AGT-203正向引物
    7 AGT-203反向引物
    8 AGT-203探针
    9 AGT-201正向引物
    10 AGT-201反向引物
    11 AGT-201探针
    12 AGT-106正向引物
    13 AGT-106反向引物
    14 AGT-202正向引物
    15 AGT-202反向引物
    16 AGT-113正向引物
    17 AGT-113反向引物
    18 亲环蛋白正向引物
    19 亲环蛋白反向引物
    20 亲环蛋白探针
附图简述
附图1是在摄食和禁食组Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-106基因表达的图示。在下丘脑中，AGT-106表达在禁食A组动物中减少而在禁食B组和C组动物中保持不变。尽管A组动物中因禁食而导致的表达减少占55％，但是当使用Games-Howell post-hoc检验的ANOVA进行比较时，这一结果没有达到显著性。
附图2在摄食和禁食的Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-106基因表达的图示。当将全部动物合并时，AGT-106的表达因禁食而显著减少(p＝0.035)。
附图3是AGT-106基因表达与禁食Psammomys obesus动物体重之间关系的图示。在下丘脑中，禁食24小时后AGT-106的表达与体重改变明显负相关(R＝0.483，p＝0.023，全部禁食动物)。
附图4是禁食瘦型Psammomys obesus动物中AGT-106基因表达与体重关系的图示。在瘦型的A组动物中，禁食24小时后下丘脑中的AGT-106表达与体重改变无关。
附图5是禁食肥胖型Psammomys obesus动物中AGT-106基因表达与体重之间关系的图示。在肥胖型B组和C组动物中，禁食24小时后下丘脑中的AGT-106的表达与体重改变明显负相关(R＝0.678，p＝0.005)。
附图6是摄食和禁食A、B和C组Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-113基因表达的图示。
附图7是下丘脑中AGT-113基因表达与(A)体重(摄食动物)、(B)体脂肪百分比(摄食动物)、(C)血浆胰岛素(摄食动物)和(D)体重(禁食动物)相关性的图示。
附图8是摄食和禁食Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-201的基因表达的图示。
附图9是摄食和禁食Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-201的表达的图示。
附图10是摄食和禁食Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-202的基因表达的图示。
附图11是摄食和禁食Psammomys obesus动物下丘脑中AGT-202基因的表达的图示。
附图12是表示(A)A、B和C组Psammonys obesus红腓肠肌(gastrocinemius)中AGT-203基因表达、(B)红腓肠肌中AGT-203基因表达与血浆胰岛素水平相关性、(C)红腓肠肌中AGT-203基因表达与体重相关性和(D)红腓肠肌中AGT-203基因表达体重百分比相关性的图示。
优选实施方案的详细描述
本发明部分基于对特别与调节能量平衡肥胖和糖尿病和/或肌肉发育相关的新型基因的鉴定。通过许多方法来鉴定这些基因，包括对瘦型与肥胖型动物之间和/或摄食动物与禁食动物之间下丘脑或骨骼肌mRNA的差异筛选或大阵列(macroarray)分析。
术语″差异″阵列在广义上使用，用于包括在相同或不同动物体内一种类型组织相对于另一种类型组织的核酸序列的表达。所涉及的″不同的″动物包括相同、但处于不同胃肠(gastronomical)状态、诸如摄食或非摄食状态下的动物。大阵列(macroarray)(即基于膜的微阵列)分析优选包括数组展示差异杂交特征的核酸和表达产物(例如mRNA或PCR产物)的阵列。
因此，本发明的另一个方面提供了包括编码一种表达产物或其衍生物、同系物、类似物或模拟物或与编码表达产物或其衍生物、同系物、类似物或模拟物的序列互补的核苷酸序列的核酸分子，其中所述的核酸分子在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中表达的量大于瘦型动物。
在一个相关的实施方案中，提供了包含编码表达产物或其衍生物、同系物、类似物或模拟物或与编码表达产物或其衍生物、同系物、类似物或模拟物的序列互补的核苷酸序列的核酸分子，其中所述的核酸分子在摄食动物下丘脑或肌肉组织中表达的量大于禁食动物。
所述的表达产物可以是蛋白质或mRNA或例如可以是剪接自RNA构建体的外显子或内含子。
使用一般意义上的术语″瘦型(lean)″和″肥胖型(obese)″、但应相对于用于确定肥胖的标准条件进行考虑。一般来说，对人受试者而言，肥胖的定义为BMI＞30(“危险因素流行率研究控制委员会”(Risk Factor Prevalence Study ManagementCommittee.)，“危险因素流行率研究：1989年3月监测”(RiskFactor Prevalence Study：Survey No.3 1989.  )Canberra：澳大利亚国家心脏病基金会和澳大利亚健康研究所(National HeartFoundation of Australia and Australian Institute ofHealth)，1990；Waters和Bennett，“心血管疾病危险因素：澳大利亚数据综述”(Risk Factors for cardiovascular disease：A summary of Australian data.)Canberra：澳大利亚健康与福利研究所(Australian Institute of Health and Welfare)，1995)。
可以易于将动物模型用于研究肥胖型和瘦型动物的作用。本发明特别使用膳食诱发的肥胖和NIDDM的Psammomys obesus(以色列沙土鼠)动物模型进行例证。在其天然沙漠栖息地中，活跃的生活习性和滨藜饮食确保了它们保持消瘦和正常血糖(Shafrir和Gutman，《基础临床生理学与药理学杂志》(J Basic Clin PhysiolPharm)4：83-99，1993)。然而，在随意饮食(在此条件下许多其它动物种类保持健康)的实验室环境中，观察到了许多的病理生理反应(Barnett等，Diabetologia 37：671-676，1994a；Barnett等，《国际肥胖杂志》(Int.J.Obesity)18：789-794，1994b，Barnett等，《糖尿病的营养与代谢》(Diabete Nutr Metab)8：42-47，1995)。到16周龄时，半数以上的动物变成肥胖，且大约有三分之一的动物发生NIDDM。仅多食性动物继续发展为高血糖，从而突显了过度能量摄取对Psammomys obesus中肥胖和NIDDM的病理生理学的重要性(Collier等，《纽约科学院年鉴》(Ann New YorkAcad Sci)827：50-63，1997a；Walder等，《肥胖研究》(Obesity Res)5：193-200，1997a)。发现的其它表型包括血胰岛素过多症、脂血异常(dyslipidemia)和葡萄糖耐量异常(Collier等，[1997a；文献同上]；Collier等，《糖尿病临床内分泌实验》(Exp Clin Endocrinol Diabetes)105：36-37，1997b)。Psammomys obesus表现出许多的体重和血糖和胰岛素水平，这一范围形成了与在人群中发现的模式极为相似的连续曲线，包括称作″Starling’胰腺曲线″的血糖与胰岛素水平的反向U形关系(Barnett等，[1994a；文献同上])。正是Psammomys obesus表型反应的不均一性使得它成为了研究肥胖和NIDDM的病因学和病理生理学的理想模型。
易于将Psammomys obesus动物分成3组，即瘦型、血糖正常和正常血胰岛素的A组动物；肥胖、血糖正常和血胰岛素过多的B组动物；以及肥胖、血糖过多和血胰岛素过多的C组动物。
本发明的另一个方面提供了包含编码表达产物或其衍生物、同系物、类似物或模拟物或与编码表达产物或其衍生物、同系物、类似物或模拟物的序列互补的核苷酸序列的核酸分子，其中所述的核苷酸序列是基本上如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID  NO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或与SEQID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的全部或部分具有至少约30％相似性的核苷酸序列和/或能够在42℃的低严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中的一种或多种或其互补形式杂交的核苷酸序列；且其中所述的核酸分子在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中表达的量大于瘦型动物和/或在摄食动物下丘脑或肌肉组织中表达的量大于禁食动物。
本文涉及的相似性一般是处于至少15个连续或基本上连续的核苷酸或至少5个连续或基本上连续的氨基酸残基的对比水平上。优选的相似性百分比具有至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％和至少约90％或90％以上。
本文所用的术语″相似性″包括比较的序列之间在核苷酸或氨基酸水平上确切同一性。如果在核苷酸水平上没有同一性，那么″相似性″包括产生不同的氨基酸、其在结构、功能、生化和/或构象水平上仍然彼此相关的序列之间的差异。如果在氨基酸水平上没有同一性，那么″相似性″包括在结构、功能、生化和/或构象水平上仍然彼此相关的氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，在同一性而非相似性水平上进行核苷酸和序列对比。
用于描述一种或多种多核苷酸或多肽之间序列相关性的术语包括″参比序列″、″比较窗″、″序列相似性″、″序列同一性″、″序列相似性百分比″、″序列同一性百分比″、″基本上相似″和″基本上具有同一性″。″参比序列″是长度至少为12个、但通常为15-18个且通常至少为25个或25个以上、诸如30个的包括核苷酸和氨基酸残基的单体单元。因为两个多核苷酸可能各自包括(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即仅是完整多核苷酸序列的部分)和(2)两个多核苷酸之间趋异的序列，所以两个(或多个)多核苷酸之间的序列对比一般通过比较″比较窗″内的两个多核苷酸序列以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。″比较窗″指的是一般为12个相邻残基的与参比序列相比的概念片段。就对两个序列进行最佳序列对比而言，与参比序列(不包括添加或缺失)相比比较窗可能包括约20％或20％以下的添加或缺失(即缺口)。可以通过计算机实现的算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA)或通过由所选择的任意不同方法产生的检验和最佳序列对比(即在比较窗内产生最高的同源性百分比)来进行用于排列比较窗的最佳序列对比。还可以按照例如Altschul等所公开的BLAST族程序来进行参比(《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)25：3389，1997)。可以在Ausubel等的19.3单元中找到对序列分析的详细讨论(《最新分子生物学方案》(″Current Protocols in MolecularBiology″)John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章)。
本文所用的术语″序列相似性″和″序列同一性″指的是基于比较窗内的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的序列相同或功能或结构相似的程度。因此，例如通过下列步骤来计算″序列同一性百分比″：比较比较窗内两个最佳序列排列的序列；测定相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)在两序列上出现的位置数以产生配对位置数；以比较窗内位置总数(即窗的大小)除配对位置数；将结果乘以100而得到序列同一性百分比。为了本发明的目的，″序列同一性″应理解为指的是通过DNASIS计算机程序(windows 2.5版；获自Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA)、使用软件附带的在参考手册中所用的标准默认值计算的″配对百分比″。类似的注解用于有关序列相似性。
本文涉及的低严格性包括且包含至少约0-至少约15％v/v的甲酰胺和至少约1M-至少约2M的盐用于杂交和至少约1M-至少约2M的盐用于洗涤条件。一般来说，低严格性在约25-30℃-约42℃。该温度可以改变且可以用较高的温度取代甲酰胺和/或得到另外的严格条件。如果必要，可以应用另外的严格条件，诸如：中等严格条件，它包括且包含至少约16％v/v-至少约30％v/v的甲酰胺和至少约0.5M-至少约0.9M的盐用于杂交和至少约0.5M-至少约0.9M的盐用于洗涤条件；或高度严格条件，它包括且包含至少约31％v/v-至少约50％v/v的甲酰胺和至少约0.01M-至少约0.15M的盐用于杂交和至少约0.01M-至少约0.15M的盐用于洗涤条件。一般来说，洗涤在Tm＝69.3+0.41(G+C)％下进行(Marmur和Doty，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)5：109，1962)。然而，在错配的碱基对数中每增加1％则双螺旋DNA的Tm就会下降1℃(Bonner和Laskey，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)46：83，1974)。甲酰胺在这些杂交条件中是可选的。因此，如下定义特别优选的严格水平：低严格条件是6×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS、在25-42℃下；中等严格条件是2×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS、在20℃-65℃范围的温度下；高度严格条件是0.1×SSC缓冲液、0.1％w/v SDS、在至少65℃的温度下。
本发明的核苷酸序列和氨基酸序列可能完全相当于相同的天然出现的基因(或相应的cDNA)或蛋白质的序列或可以携带一个或多个核苷酸或氨基酸取代、添加和/或缺失。SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列相当于本文分别称作AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的基因。相应的蛋白质分别为AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。如果合适，本文涉及的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203包括涉及的基因组基因或cDNA以及任意天然出现或诱导的衍生物。除核苷酸的取代、缺失和/或添加外，本发明进一步包括相当于AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的核苷酸序列的突变体、片段、部分和区段(portion)。
特别确定了AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的表达模式以证实它们参与调节一种或多种肥胖、糖尿病和/或能量代谢。除AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203在瘦型与肥胖型动物和摄食动物与禁食动物的下丘脑或肌肉组织中的差异表达外，这些基因还可以在包括但不限于肌肉和肝的其它组织中表达。本发明的核酸分子优选是诸如cDNA序列或基因组序列的脱氧核酸的序列。基因组序列还可以包括外显子和内含子。基因组序列还可以包括启动子区或其它调节区。然而，本发明涉及也可以参与遗传网络化的mRNA、内含子和外显子，无论它们是否被翻译成蛋白质。
认为同系物是来自另一动物种类的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202或AGT-203基因。本文中以来自Psammomys obesus下丘脑的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202或AGT-203基因进行例证。然而，本发明涉及如由来自人、灵长类、家畜动物(例如牛、绵羊、猪、马、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、豚鼠、仓鼠、家兔)、陪伴动物(例如猫、狗)和捕捉的野生动物(例如啮齿动物、狐狸、鹿、袋鼠)的核苷酸序列和/或功能所确定的同源基因。
本发明的核酸且特别是AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203及其衍生物和同系物可以是分离或纯化形式和/或可以将它们与诸如表达载体等载体连接。表达可以在真核细胞系(例如哺乳动物、昆虫或酵母细胞)或微生物细胞(例如大肠杆菌)或两者中进行。
本发明的核酸分子衍生物包括寡核苷酸、PCR引物、反义分子、适用于共抑制的分子和融合核酸分子。涉及AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其mRNA的本发明还关注核酶和DNA酶。能够在42℃的低严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID  NO：5杂交的那些核苷酸序列适宜地包括AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的衍生物和同系物。
本发明涉及AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的表达产物。优选表达产物是蛋白质或其突变体、衍生物、同系物或类似物。
衍生物包括来自天然、合成或包括融合蛋白在内的重组来源的片段、部分、区段、突变体、变体和模拟物。部分或片段包括例如AGT-106、AGT-113、AGT-202或AGT-203的活性区。衍生物可以来源于氨基酸的插入、缺失或取代。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合以及单一或多氨基酸的序列内插入。插入氨基酸序列变体是这样一些变体，其中将一个或多个氨基酸残基导入蛋白质预定位点，尽管通过适当筛选所得产物也可能发生随机插入。缺失变体的特征在于从所述序列中除去一个或多个氨基酸。取代氨基酸变体是那些所述序列中的至少一个残基已经被除去且在该位置上插入了不同的残基的变体。取代氨基酸变体的实例是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代一般包括下列组内的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。氨基酸序列的添加包括与其它肽、多肽或蛋白质的融合。
应将AGT-106、AGT-113、AGT-202或AGT-203的化学和功能等价物理解为表现出这些分子中的任意一种或多种功能活性的分子，且它们可以来源于诸如通过化学合成的或通过筛选方法(诸如天然产物筛选)鉴定的任意来源。
衍生物包括具有与肽、多肽或其它蛋白质或非蛋白质分子融合的完整蛋白质的特定表位或部分的片段。
本发明的另一个方面提供了分离的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物或模拟物，它们在肥胖型动物下丘脑中产生的量大于瘦型动物。
在本发明的一个更优选的方面中，提供了分离的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物或模拟物，其中所述的蛋白质包含基本上由SEQID  NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID  NO：5中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列或与其全部或部分具有至少30％相似性的氨基酸序列；且其中所述的蛋白质在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中产生的量大于瘦型动物。
本发明的另一个方面涉及分离的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物或模拟物，其中所述的蛋白质由基本上如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或与SEQ ID  NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的全部或部分具有至少30％相似性的核苷酸序列和/或能够在42℃的低严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
本文涉及的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203包括涉及的分离的或纯化的天然出现的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203蛋白质分子及其任意的衍生物、同系物、类似物和模拟物。衍生物包括AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的部分、片段和区段以及对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的单一和多氨基酸取代、缺失和/或添加。由能够在42℃的低严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5杂交的核苷酸序列编码的分子适宜地包括AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的衍生物。
AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的其它衍生物包括化学类似物。本文关注的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的类似物包括但不限于侧链修饰、肽、多肽或蛋白质合成过程中非天然氨基酸和/或其衍生物的掺入和对蛋白质分子或其类似物产生构象(confirmational)约束的交联剂和其它方法的应用。
本发明关注的侧链修饰的实例包括诸如通过下列方法对氨基的修饰：通过与醛反应、随后用NaBH4还原进行还原烷基化；与甲基乙酰亚胺酸酯(methylacetimidate)的脒化(amidination)；与乙酐的酰化；氨基与氰酸酯的甲氨酰化；氨基与2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)的三硝基苄化；氨基与琥珀酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐的酰化；赖氨酸与吡哆醛-5-磷酸的吡哆醛化(pyridoxylation)、随后用NaBH4还原。
可以通过与诸如2，3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛这样的试剂形成杂环稠合产物来修饰精氨酸残基的胍基。
可以通过经形成O-酰基异脲的碳化二亚胺活化、随后例如衍生成相应的酰胺来修饰羧基。
可以通过下列方法来修饰巯基(sulphydryl)：诸如与碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化；过甲酸氧化成半胱磺酸；与其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯苯甲酸汞、4-氯苯磺酸汞、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞衍生物；在碱性pH下与氰酸酯的甲氨酰化。
例如，可以通过用N-溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或亚磺酰基卤使吲哚环烷基化来修饰色氨酸残基。另一方面，可以通过使用四硝基甲烷硝化成3-硝基酪氨酸衍生物来改变酪氨酸残基。
可以通过用碘乙酸衍生物烷基化或用二乙基焦碳酸酯乙酯基化来修饰组氨酸残基的咪唑环。
肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于应用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。将本文关注的非天然氨基酸列在表3中。
                               表3
非常用氨基酸                  代码       非常用氨基酸            代码
α-氨基丁酸                   Abu        L-N-甲基丙氨酸          Nmala
α-氨基-α-甲基丁酸           Mgabu      L-N-甲基精氨酸          Nmarg
氨基环丙烷羧酸                Cpro       L-N-甲基天冬酰胺        Nmasn
                                         L-N-甲基天冬氨酸        Nmasp
氨基异丁酸                    Aib        L-N-甲基半胱氨酸        Nmcys
氨基降冰片基羧酸              Norb       L-N-甲基谷氨酰胺        Nmgln
(aminonorbornylcarboxylate)              L-N-甲基谷氨酸          Nmglu
环己基丙氨酸                  Chexa      L-N甲基组氨酸           Nmhis
环戊基丙氨酸                  Cpen       L-N-甲基异亮氨酸        Nmile
D-丙氨酸                      Dal        L-N-甲基亮氨酸          Nmleu
D-精氨酸                      Darg       L-N-甲基赖氨酸          Nmlys
D-天冬氨酸                    Dasp       L-N-甲基甲硫氨酸        Nmmet
D-半胱氨酸                    Dcys       L-N-甲基正亮氨酸        Nmnle
D-谷氨酰胺                    Dgln       L-N-甲基正缬氨酸        Nmnva
D-谷氨酸                      Dglu       L-N-甲基鸟氨酸          Nmorn
D-组氨酸                      Dhis       L-N-甲基苯丙氨酸        Nmphe
D-异亮氨酸                    Dile       L-N-甲基脯氨酸          Nmpro
D-亮氨酸                      Dleu       L-N-甲基丝氨酸          Nmser
D-赖氨酸                      Dlys       L-N-甲基苏氨酸          Nmthr
D-甲硫氨酸                    Dmet       L-N-甲基色氨酸          Nmtrp
D-鸟氨酸                      Dorn       L-N-甲基酪氨酸          Nmtyr
D-苯丙氨酸                    Dphe       L-N-甲基缬氨酸          Nmval
D-脯氨酸                      Dpro       L-N-甲基乙基甘氨酸      Nmetg
D-丝氨酸                      Dser       L-N-甲基叔丁基甘氨酸    Nmtbug
D-苏氨酸                      Dthr       L-正亮氨酸              Nle
D-色氨酸                      Dtrp       L-正缬氨酸              Nva
D-酪氨酸                      Dtyr       α-甲基异丁酸           Maib
D-缬氨酸                      Dval       α-甲基-γ-氨基丁酸     Mgabu
D-α-甲基丙氨酸               Dmala      α-甲基环己基丙氨酸     Mchexa
D-α-甲基精氨酸               Dmarg      α-甲基环戊基丙氨酸     Mcpen
D-α-甲基天冬酰胺             Dmasn      α-甲基-α-萘基丙氨酸   Manap
D-α-甲基天冬氨酸             Dmasp      α-甲基青霉胺           Mpen
D-α-甲基半胱氨酸             Dmcys      N-(4-氨基丁基)甘氨酸    Nglu
D-α-甲基谷氨酰胺             Dmgln      N-(2-氨基乙基)甘氨酸    Naeg
D-α-甲基组氨酸               Dmhis      N-(3-氨基丙基)甘氨酸    Norn
D-α-甲基异亮氨酸             Dmile      N-氨基-α-甲基丁酸      Nmaabu
D-α-甲基亮氨酸               Dmleu      α-萘基丙氨酸           Anap
D-α-甲基赖氨酸           Dmlys    N-苄基甘氨酸                Nphe
D-α-甲基甲硫氨酸         Dmmet    N-(2-氨基甲酰基乙基)甘氨酸  Ngln
D-α-甲基鸟氨酸           Dmorn    N-(氨基甲酰基甲基)甘氨酸    Nasn
D-α-甲基苯丙氨酸         Dmphe    N-(2-羧乙基)甘氨酸          Nglu
D-α-甲基脯氨酸           Dmpro    N-(羧甲基)甘氨酸            Nasp
D-α-甲基丝氨酸           Dmser    N-环丁基甘氨酸              Ncbut
D-α-甲基苏氨酸           Dmthr    N-环庚基甘氨酸              Nchep
D-α-甲基色氨酸           Dmtrp    N-环己基甘氨酸              Nchex
D-α-甲基酪氨酸           Dmty     N-环癸基甘氨酸              Ncdec
D-α-甲基缬氨酸           Dmval    N-环十二烷基甘氨酸          Ncdod
D-N-甲基丙氨酸            Dnmala   N-环辛基甘氨酸              Ncoct
D-N-甲基精氨酸            Dnmarg   N-环丙基甘氨酸              Ncpro
D-N-甲基天冬酰胺          Dnmasn   N-环十一基甘氨酸            Ncund
D-N-甲基天冬氨酸          Dnmasp   N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸   Nbhm
D-N-甲基半胱氨酸          Dnmcys   N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸   Nbhe
D-N-甲基谷氨酰胺          Dnmgln   N-(3-胍基丙基)甘氨酸        Narg
D-N-甲基谷氨酸            Dnmglu   N-(1-羟基乙基)甘氨酸        Nthr
D-N-甲基组氨酸            Dnmhis   N-(羟基乙基)甘氨酸          Nser
D-N-甲基异亮氨酸          Dnmile   N-(咪唑基乙基)甘氨酸        Nhis
D-N-甲基亮氨酸            Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸      Nhtrp
D-N-甲基赖氨酸            Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸          Nmgabu
N-甲基环己基丙氨酸        Nmchexa  D-N-甲基甲硫氨酸            Dnmmet
D-N-甲基鸟氨酸            Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸          Nmcpen
N-甲基甘氨酸              Nala     D-N-甲基苯丙氨酸            Dnmphe
N-甲氨基异丁酸            Nmaib    D-N-甲基脯氨酸              Dnmpro
N-(1-甲基丙基)甘氨酸      Nile     D-N-甲基丝氨酸              Dnmser
N-(2-甲基丙基)甘氨酸      Nleu     D-N-甲基苏氨酸              Dnmthr
D-N-甲基色氨酸            Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸        Nval
D-N-甲基酪氨酸            Dnmtyr   N-甲基-萘基丙氨酸           Nmanap
D-N-甲基缬氨酸            Dnmval   N-甲基青霉胺                Nmpen
γ-氨基丁酸               Gabu     N-(对羟基苯基)甘氨酸        Nhtyr
L-叔丁基甘氨酸            Tbug     N-(硫代甲基)甘氨酸          Ncys
L-乙基甘氨酸              Etg      青霉胺                      Pen
L-高苯丙氨酸              Hphe     L-α-甲基丙氨酸             Mala
(L-homophenylalanine)
L-α-甲基精氨酸           Marg     L-α-甲基天冬酰胺           Masn
L-α-甲基天冬氨酸         Masp     L-α-甲基叔丁基甘氨酸       Mtbug
L-α-甲基半胱氨酸         Mcys     L-甲基乙基甘氨酸            Metg
L-α-甲基谷氨酰胺         Mgln     L-α-甲基谷氨酰胺           Mglu
L-α-甲基组氨酸                  Mhis        L-α-甲基高苯丙氨酸           Mhphe
L-α-甲基异亮氨酸                Mile        N-(2-甲基硫代乙基)甘氨酸      Nmet
L-α-甲基亮氨酸                  Mleu        L-α-甲基赖氨酸               Mlys
L-α-甲基甲硫氨酸                Mmet        L-α-甲基正亮氨酸             Mnle
L-α-甲基正缬氨酸                Mnva        L-α-甲基鸟氨酸               Morn
L-α-甲基苯丙氨酸                Mphe        L-α-甲基脯氨酸               Mpro
L-α-甲基丝氨酸                  Mser        L-α-甲基苏氨酸               Mthr
L-α-甲基色氨酸                  Mtrp        L-α-甲基酪氨                 Mtyr
L-α-甲基缬氨酸                  Mval        L-N-甲基高苯丙氨酸            Nmhphe
N-(N-2，2-二苯基乙基)氨甲酰基甲  Nnbhm       N-(N-(3，3-二苯基丙基)氨甲酰  Nnbhe
基)甘氨酸                                    基甲基)甘氨酸
1-羧基-1-(2，2-二苯基乙基氨基)   Nmbc
环丙烷
可以使用交联剂来稳定3D构象，例如使用同双功能交联剂，诸如带有(CH2)n间隔基、n＝1-n＝6的双功能亚氨酸酯；戊二醛；N-羟基琥珀酸酰亚胺酯；和异双功能试剂，它们通常含有反应性氨基部分、诸如N-羟基琥珀酸酰亚胺和另一种特异反应性基团部分、诸如马来酰亚氨基或二硫代部分(SH)或碳化二亚胺(COOH)。此外，例如可以通过引入Cα和Nα-甲基氨基酸、在氨基酸的Cα-Cβ原子之间引入双键并通过引入共价键、诸如在N与C末端、在两个侧链之间或在侧链与N或C末端之间形成酰胺键而形成环肽或类似物来对肽进行构象约束。
所有这类修饰可用于稳定体内给药方案或用于诊断目的的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203分子。
本发明的核酸分子优选是分离的形式或与诸如表达载体的载体连接。所谓″分离的″指的是已经进行了至少一次纯化步骤的核酸分子，且例如易于通过包含相对于由分子量、编码活性、核苷酸序列、碱基组成或其它适宜方法确定的其它成分而言至少约占10％、优选至少约占20％、更优选至少约占30％、更优选至少约占40-50％、甚至更优选至少约占60-70％、乃至更优选占80-90％或80-90％以上的本核酸分子的组合物来定义。在一个优选的实施方案中，还可以将本发明的核酸分子看作是生物纯的。
应将术语″蛋白质″理解为包括肽、多肽和蛋白质。该蛋白质可以是糖基化或非糖基化的和/或该蛋白质可以含有许多的与该蛋白质融合、连接、结合或缔合的其它分子，诸如氨基酸、脂类、碳水化合物或其它肽、多肽或蛋白质。下文涉及的″蛋白质″包括含有氨基酸序列的蛋白质和与诸如氨基酸、脂类、碳水化合物或其它肽、多肽类或蛋白质的其它分子结合的蛋白质。
在一个特别优选的实施方案中，相当于AGT-106的核苷酸序列是包含如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的cDNA序列或包括与SEQ IDNO：1具有相似性的核苷酸序列的其衍生物、同系物或类似物。
在另一个特别优选的实施方案中，相当于AGT-113的核苷酸序列是包含如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的cDNA序列或包括与SEQID NO：2具有相似性的核苷酸序列的其衍生物、同系物或类似物。
在另一个特别优选的实施方案中，相当于AGT-201的核苷酸序列是包含如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的cDNA序列或包括与SEQID NO：3具有相似性的核苷酸序列的其衍生物、同系物或类似物。
在另一个特别优选的实施方案中，相当于AGT-202的核苷酸序列是包含如SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的cDNA序列或包括与SEQID NO：4具有相似性的核苷酸序列的其衍生物、同系物或类似物。
在另一个特别优选的实施方案中，相当于AGT-203的核苷酸序列是包含如SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的cDNA序列或包括与SEQID NO：5具有相似性的核苷酸序列的其衍生物、同系物或类似物。
可以将所述的核酸分子与能够在原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞)中表达的表达载体连接。可以将该核酸分子与编码另一实体(entity)、诸如例如信号肽的核酸分子连接或融合或与其结合。它还可以包括与其3’或5’末端部分或3’和5’末端部分融合、连接或结合的其它核苷酸序列信息。该核酸分子还可以是载体诸如表达载体的部分。后一种实施方案有利于产生鞘氨醇激酶的重组形式，该形式包括在本发明中。
本发明涉及上文所定义的核酸分子的表达产物。该表达产物优选是蛋白质，但也可以扩展至mRNA、RNA、内含子和外显子。
优选所述的表达产物是分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID  NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5编码的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或是其衍生物、类似物、同系物、化学等价物或模拟物。
本发明的另一个方面涉及分离的蛋白质，它选自：
(i)相比于瘦型动物在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中差异表达的核酸分子编码的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(ii)相比于禁食动物在摄食动物肝组织中差异表达的核酸分子编码的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(iii)由基本上如SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(iv)由基本上如SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(v)由基本上如SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(vi)由基本上如SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(vii)由基本上如SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(viii)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(ix)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(x)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(xi)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：4中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(xii)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：5中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(xiii)如段落(i)-(xii)中任意一段中所定义的同二聚体形式的蛋白质；和
(vi)如段落(i)-(xii)中任意一段中所定义的异二聚体形式的蛋白质。
本发明的蛋白质优选是分离的形式。所谓″分离的″指的是已经进行了至少一次纯化步骤的蛋白质，且例如易于通过包括相对于由分子量、氨基酸序列或其它适宜方法确定的其它成分而言至少约占10％、优选至少约占20％、更优选至少约占30％、更优选至少约占40-50％、甚至更优选至少约占60-70％、乃至更优选占80-90％或80-90％以上的本发明的蛋白质的组合物来定义。在一个优选的实施方案中，还可以将本发明的蛋白质看作是生物纯的。
不受理论或本发明作用方式的限制，认为AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的表达涉及体重和循环的甘油三酯。特别认为调节这些基因表达可以通过对能量摄取的作用和对碳水化合物/脂肪代谢的作用来调节能量平衡。能量摄取作用可能由中枢神经系统来介导，而对碳水化合物和脂肪代谢可能是外周作用。还可以通过禁食和摄食来调节这些基因的表达，由此调节这些基因的表达和/或活性，或其表达产物可以为调节体重和能量代谢、包括碳水化合物和脂肪代谢提供机理。
AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的鉴定能够产生许多能够调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达或调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性的治疗分子。本发明关注的调节剂包括AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达的兴奋剂和拮抗剂。AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达的拮抗剂包括反义分子、核酶和共抑制分子。兴奋剂包括增加启动子活性或干扰负调节机制的分子。AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的拮抗剂包括抗体和抑制剂肽片段。首先需要对所有这类分子进行修饰以便这类分子能够透入细胞膜。另一方面，可以将病毒性病原体用于导入遗传因子以调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的表达。就AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203与其它基因，诸如编码瘦蛋白的ob基因共同起作用而言，所述的治疗分子可以靶向AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202 和AGT-203以及ob基因或其翻译产物。
本发明由此关注哺乳动物体内AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203中的一种或多种的表达的调节方法，所述的方法包括下列步骤：在足以上调或下调或其它方式调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203表达的时间和条件下使AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203基因与有效量的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达的调节剂接触。例如，可以将编码AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的核酸分子或其衍生物或同系物导入细胞以增强该细胞产生AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的能力，相反，可以导入诸如寡核苷酸等AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的反义序列以降低AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203分子的有效性。
本发明的另一个方面关注哺乳动物体内AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的活性的调节方法，所述的方法包括在足以增加或降低AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性的时间和条件下对所述哺乳动物给予调节有效量的分子。该分子可以是蛋白质分子或化学实体，且还可以是AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的衍生物或其配体。
AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达的调节水平在治疗许多疾病，诸如肥胖、食欲缺乏、能量失衡、糖尿病、代谢综合征、脂血异常(dyslipidemia)、高血压、胰岛素抗性和肌肉发育疾患中是重要的。还可以将它用于农业产业以便辅助产生较瘦型的动物，或如果需要，产生更肥胖的动物。因此，本发明关注的哺乳动物包括但不限于人、灵长类、家畜动物(例如牛、绵羊、猪、马、驴)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔)、陪伴动物(例如猫、狗)和捕捉的野生动物(例如狐狸、袋鼠、鹿)。特别优选的宿主是人、灵长类或家畜动物。
因此，本发明关注AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203氨基酸和核酸分子以及AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203兴奋剂和拮抗剂的治疗和预防应用。
本发明由此关注哺乳动物体内AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203表达的调节方法，所述的方法包括在足以上调、下调或其它方式调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203表达的时间和条件下使AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203基因与有效量的制剂接触。例如，可以使用反义序列，诸如寡核苷酸。
相反，可以导入编码AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的核酸分子或其衍生物以便上调一种或多种特异性功能活性。
本发明的另一个方面关注受试者体内AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203活性的调节方法，所述的方法包括在足以增加或降低AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203活性的时间和条件下对所述受试者给予调节有效量的制剂。
可以使用几种技术之-来完成通过对哺乳动物给予制剂调节所述活性，这些技术包括但不限于将蛋白质或非蛋白质分子导入所述哺乳动物，该分子：
(i)调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的表达；
(ii)起AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的拮抗剂的作用；
(iii)起AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的兴奋剂的作用。
所述的蛋白质分子可以来源于天然或重组来源，包括融合蛋白或例如如下的天然产物筛选。所述的非蛋白质分子例如可以是核酸分子或可以来源于诸如例如天然产物筛选的天然来源或可以以化学方式合成。本发明关注AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的化学类似物或能够起兴奋剂或拮抗剂作用的小分子。化学兴奋剂可以不一定来源于AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203，但可以共有某些构象相似性。另一方面，可以将化学兴奋剂进行特定设计以便模拟某些生理化学特性。拮抗剂可以是能够阻断、抑制或防止AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203实施其正常生理功能的任意化合物。拮抗剂包括防止哺乳动物细胞中AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203基因或mRNA的转录或翻译的单克隆抗体和反义核酸。还可以使用抗原、RNA、核酶、DNA酶、RNA适体(aptamers)或抗体来调节表达。
蛋白质或非蛋白质分子可以直接或间接起调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的表达或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的活性的作用。所述的分子如果与AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203结合，则其可以直接起作用，调节表达或活性。所述的分子如果与非AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的分子结合，则其间接起作用，而其它分子直接或间接调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的表达或活性。因此，本发明的方法包括通过诱导级联的调节步骤来调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203的表达或活性。
还可以将本发明对哺乳动物给予的分子与靶向物质诸如单克隆抗体连接，将这些分子特定转运至靶细胞。
本发明的另一个方面涉及与哺乳动物疾病情况相关的本发明的应用。例如，本发明特别用于但不限于在治疗或预防性治疗肥胖、食欲缺乏、糖尿病或能量失衡中的应用。
因此，本发明的另一个方面涉及患有特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡中的一种或多种症状的疾病的哺乳动物的治疗方法，所述的方法包括在足以调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203表达或足以调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203活性的时间和条件下对所述哺乳动物给予有效量的制剂。
本发明在另一个方面中涉及患有特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病或能量失衡中的一种或多种症状的疾病情况的哺乳动物的治疗方法，所述的方法包括对所述哺乳动物给予有效量的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203。
″有效量″指的是至少部分获得所需免疫应答或延缓发作或抑制发展或完全停止、所治疗个体特定疾病发作或发展、所治疗个体的分类组、所需预防的程度、疫苗的配制、医学情况的评价和其它相关因素必不可少的用量。预计该用量属于可以通过常规试验测定的相对宽的范围。
按照这些方法，可以将AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或能够调节所述分子表达或活性的制剂与一种或多种其它化合物或其它分子共同给药。所谓″共同给药″指的是在相同的制剂内或两种不同制剂内经相同或不同途径同时给药或通过相同或不同途径依次给药。所谓″依次″给药指的是在给予两种类型分子之间的秒、分钟、小时或天数的时间差。可以按照任意顺序给予这些分子。
本发明在另一个方面中涉及能够调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物或类似物的表达的制剂在制备用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡的疾病的药物中的应用。
本发明在另一个方面中涉及能够调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物的活性的制剂在制备用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡的疾病的药物中的应用。
本发明在另一个方面中涉及AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物或类似物或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物在制备用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病、肌肉发育异常和/或能量失衡的疾病的药物中的应用。
本发明在另一个方面中涉及用于调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物或类似物的表达的制剂。
本发明在另一个方面中涉及用于调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203活性或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物的制剂。
本发明在另一个方面涉及用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病、肌肉发育异常和/或能量失衡中的一种或多种症状的疾病的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物或类似物或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物。
在本发明的一个相关方面中，进行治疗的哺乳动物可以是需要治疗或预防性治疗的人或动物。
因此，本发明在一个实施方案中关注包含AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性调节剂和一种或多种药物上可接受的载体和/或稀释剂的组合物。在另一个实施方案中，该组合物包含AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物、同系物、类似物或模拟物和一种或多种药物上可接受的载体和/或稀释剂。该组合物还可以包括瘦蛋白或瘦蛋白活性或ob表达的调节物。
为简便起见，将这类组合物中的所有这类成分称作″活性成分″。
适合于可注射应用形式的活性成分组合物包括无菌水溶液(如果是水溶性的)和用于临时制备无菌可注射溶液的无菌粉末。在所有情况中，所述的形式必须是无菌的且必须达到易于可注射方式存在的液体的程度。它必须在制备和储存条件下保持稳定，且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。
所述的载体可以是溶剂或含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适宜的混合物和植物油的其它介质。
可以使用多种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thirmerosal)等。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收剂、例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
可以通过将所需用量的活性成分与如果需要可选的其它组分一起掺入适宜溶剂、随后例如通过过滤灭菌、照射或其它适宜方式灭菌来制备无菌可注射溶液。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法是从其预先无菌过滤的溶液产生活性组分及任意其它所需组分的粉末的真空干燥和冷冻干燥技术。
当将包括AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203本身在内的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203以及AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203适当保护时，可以将它们与惰性稀释剂或可同化食用的载体一起口服给药，可以将其包封在硬或软胶囊中，或可以将其压制成片剂，或可以将其直接混入膳食的食物。就口服治疗给药而言，可以将活性化合物与赋形剂混合并以可吞咽的片剂、含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的剂型使用。这类组合物和制剂应含有至少1％重量的活性化合物。当然，该组合物和制剂中的百分比是可变的，且易于在约5-约80％重量单位之间。活性化合物在这类治疗上可应用的组合物中的用量使得获得了合适的剂量。制备优选的本发明组合物或制剂，使得口服单位剂型含有约0.1μg-2000mg的活性化合物。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可以含有下列成分：粘合剂，诸如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钠；崩解剂，诸如玉米淀粉、土豆淀粉、藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；且可以加入增甜剂、诸如蔗糖、乳糖或糖精或调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃香料这样。当所述的单位剂型是胶囊剂时，它除含有上述类型的物质外还可以含有液体载体。还可以含有多种其它物质作为单位剂型的包衣材料，或改变该单位剂型的物理形式。例如，可以用虫胶、糖或两者包被片剂、丸剂或胶囊剂。糖浆剂或酏剂可以含有活性化合物、蔗糖作为增甜剂、羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料和调味剂，诸如樱桃或橙香料。当然，制备任意单位剂型中所用的任何物质应是药物纯的，且所用量基本上是无毒性的。此外，可以将活性化合物掺入持续释放型制剂和制品。
药物上可接受的载体和/或稀释剂包括任意和所有的溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延缓吸收剂等。这类介质和试剂在药物活性物质中的应用在本领域中是众所周知的。除任意常用介质或试剂与活性组分不相容外，关注的是它们在治疗组合物中的应用。还可以将补充的活性组分掺入组合物。
特别有利的是配制易于给药和剂量均一性的单位剂型形式的非肠道组合物。本文所用的单位剂型指的是适合作为单位剂量用于所治疗哺乳动物受试者的物理分散单位；各单位中含有预定量的经计算与所需药物载体一起产生所需治疗作用的活性物质。对本发明新型单位剂型的说明取决于且直接依赖于(a)活性物质的独特性质和所达到的特定治疗作用和(b)混合这类用于治疗活体受试者中疾病的活性物质的领域中固有的限制，所述的活体受试者患有本文具体公开的身体健康异常的疾病。
可以混合主要活性成分以便于和有效地与单位剂型中合适的药物上可接受的载体一起以有效量给药。单位剂型例如可以含有用量在0.5μg-约2000mg的活性成分。按比例表示，活性化合物一般以约0.5μg-约2000mg/m1载体存在。就含有补充的活性组分的组合物而言，通过参照所述组分的常用剂量和给药方式来确定剂量。
一般来说，AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的有效量为0.01ng/kg/体重-10,000mg/kg/体重以上。可选的用量为0.1ng/kg/体重-1000mg/kg/体重以上。根据所治疗疾病情况的不同，可以按照每分钟、每小时、每天、每周、每月或每年给予AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。给药途径可以变化，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、通过栓剂、通过输注、通过滴注、经口服或通过其它适宜方式。
药物组合物还可以包含遗传分子，诸如能够转染靶细胞的载体，其中所述载体携带能够调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性的核酸分子。该载体例如可以是病毒载体。
本发明的另一个方面涉及AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203及其衍生物和同系物的抗体。这类抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，且可以选自AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的天然出现的抗体，或对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物或类似物特异性产生的。就后者而言，首先需要将AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物或同系物与载体分子结合。本发明的抗体和/或重组AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物特别用作治疗剂或诊断试剂。
例如，可以用AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203及其衍生物筛选天然出现的针对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的抗体，它们可以在某些自身免疫病或发生细胞死亡的情况中出现。这可能发生在例如某些自身免疫病中。另一方面，可以用特异性抗体筛选AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。用于这类试验的技术在本领域中是众所周知的，例如包括夹心试验和ELISA。
针对本发明AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以选自针对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的天然出现的抗体，或对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物特异性产生的。就后者而言，首先需要将AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203蛋白质或其衍生物或同系物与载体分子结合。另一方面，可以使用抗体片段，诸如Fab片段。此外，本发明涉及重组和合成的抗体，并涉及杂种抗体。在本文中认为″合成抗体″包括抗体的片段和杂种。本发明该方面的抗体特别用于免疫疗法，且也可以用作诊断工具或用作纯化AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的方法。
例如，可以用特异性抗体筛选AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203蛋白质。后者例如作为在细胞提取物或其它生物液体中筛选AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的水平或纯化通过重组方式由培养物上清液制备的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的方法是重要的。用于本文关注的试验的技术在本领域中是公知的，且包括例如夹心试验和ELISA。
在本发明范围内包括上述第一抗体的任何第二抗体(单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段)。第一和第二抗体，均可以在检测试验中使用，或可以将第一抗体与商购抗免疫球蛋白抗体联用。本文关注的抗体包括特异性针对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的任意区的任意抗体。
通过免疫接种所述酶或蛋白质而获得多克隆抗体和单克隆抗体，且每一类型均可用于免疫试验。获得两种类型血清的方法在本领域中是众所周知的。多克隆血清不太优选，不过，相对易于通过给合适的实验室动物注射有效量的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其抗原性部分、从动物体内采集血清并通过公知免疫吸附剂技术分离特异性血清来制备。尽管本方法产生的抗体可实际应用于任意类型的免疫试验，但是因产物潜在的不均一性，一般不太优它们。
单克隆抗体在免疫试验中的应用因大量产生它们的能力和产物的均一性而是特别优选的。可以通过本领域技术人员众所周知的技术来制备用于单克隆抗体产生的杂交瘤细胞系，其通过融合无限增殖细胞系和免疫原性制品致敏的淋巴细胞而生产。(例如，参见Douillard和Hoffman，“有关杂交瘤的基本事实”(Basic Facts aboutHybridomas)-《免疫学概要》(Compendium of Immunology)Vol.II，Schwartz编辑，1981；Kohler和Milstein，《自然》(Nature)256：495-499，1975；Kohler和Milstein，《欧洲免疫学杂志》(European Journal of Immunology)6：511-519，1976)。
本发明的另一个方面关注受试者的生物样品中AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物或同系物的检测方法，所述的方法包括在足以形成复合物的时间和条件下使所述生物样品与特异针对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其抗原性衍生物或同系物的抗体接触，然后检测所述复合物。
该复合物的存在表明存在AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。该试验可以是定量的或半定量的以便测定发展肥胖或其它疾病的倾向或用于监测治疗方案。
可以通过许多方式，诸如蛋白质印迹和ELISA法来监测AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203存在。许多免疫测定技术是可获得的，正如可以通过参照美国专利US 4,016,043、US4,424,279和US 4,018,653。当然，这些技术包括非竞争性类型的单点和两点或″夹心″试验以及传统竞争性结合试验。这些试验还包括使标记抗体与靶物直接结合。
夹心试验是其中最有用和常用的试验。存在许多对夹层试验的改变技术，它们均包括在本发明中。简单地说，在典型的正向试验中，将标记的抗体固定在固体底物上，并使欲被测试样品与结合的分子接触。在适宜的温育期后，即足以使抗体-AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203复合物形成的时间期限，加入用能够产生可检测信号的报道分子标记的对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203特异的第二抗体并温育，使时间足以形成另一种抗体-AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203-标记抗体的复合物。洗涤掉任何未反应的物质，并通过观察由所述报道分子产生的信号来确定AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的存在。通过简单观察可见信号可以对结果定性，或可以通过与含有已知量半抗原的对照样品进行比较可以对结果进行定量。对正向试验的改变包括同时测定，其中向结合抗体中同时加入样品和标记抗体。这些技术对本领域技术人员而言是众所周知的，包括显而易见的任何微小的改变。按照本发明，所述的样品是可能含有AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203的样品，包括细胞提取物、组织活检物或可能的血清、唾液、粘膜分泌物、淋巴、组织液和呼吸道液体。因此，所述的样品一般是包括生物液体、而且也可以扩展至发酵液体和诸如来自细胞培养物的上清液的生物样品。
固体表面一般是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是管、珠、微量培养板圆盘或适合于进行免疫测定的任意其它表面的形式。结合过程在本领域中是众所周知的，一般由交联共价结合或物理吸附组成，在用于测试样品的制备过程中洗涤所述的聚合物-抗体复合物。然后将测试样品的等分部分加入到固相复合物中并温育足够的时间(例如2-40分钟或如果更适宜的话过夜)，且该步骤在合适的条件下进行(例如室温-约37℃)，以便结合抗体中存在的任何亚单位。在温育期后，洗涤抗体亚单位固相并干燥，且与对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203部分特异的第二抗体一起温育。将第二抗体与用于指示第二抗体与AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203结合的报道分子连接。
可选的方法包括将靶分子固定在生物样品中，然后使固定的靶物暴露于可以用或不用报道分子标记的特异性抗体。根据靶物的量和报道分子信号强度的不同，可以通过用抗体直接标记来检测结合的靶物。另一方面，使对第一抗体具有特异性的第二标记抗体暴露于靶物-第一抗体复合物以形成靶物-第一抗体-第二抗体三级复合物。通过由所述报道分子发出的信号来检测该复合物。
本说明书中所用的″报道分子″指的是根据其化学性质产生可检测到抗原结合的抗体的可分析鉴定信号的分子。检测可以是定性的或定量的。这种类型测定法中最常用的报道分子是酶、荧光团或含有分子(例如放射性同位素)的放射性核素和化学发光分子。
就酶免疫测定法而言，一般通过戊二醛或高碘酸使酶与第二抗体缀合。然而，正如易于认识到的，存在本领域技术人员易于得到的各种不同的缀合技术。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。一般对特定酶所用的底物进行选择以便在被相应的酶水解时产生可检测到的颜色改变。合适的酶的实例包括进行磷酸酶和过氧化物酶。还能够使用荧光底物，它们产生荧光产物而非上述的显色底物。在所有情况中，向第一抗体半抗原复合物中加入酶标记的抗体，使它们结合，然后洗涤掉过量的试剂。随后向抗体-抗原-抗体复合物中加入含有适宜底物的溶液。该底物与连接于第二抗体的酶反应，从而产生定性的可见信号，通常通过分光光度法对该信号进行进一步定量而给出对存在于样品中的半抗原的量的指示。″报道分子″还可以扩展至应用细胞聚集或聚集的抑制，诸如乳胶珠上红细胞等。
另一方面，可以将荧光化合物(诸如荧光蛋白和罗丹明)与抗体进行化学偶联而不改变其结合能力。当通过用特定波长的光照射而活化时，荧光染料标记的抗体吸收光能，诱导分子的激发状态，随后发射可用光学显微镜检测到的可见的特征颜色的光。当在EIA中时，使荧光标记的抗体与第一抗体-半抗原复合物结合。在洗涤掉未结合的试剂后，使剩余的三级复合物暴露于适宜波长的光，所观察到的荧光表明存在目的半抗原。免疫荧光和EIA技术在本领域中均是充分确立的，且特别优选用于本方法。然而，也可以使用其它报道分子，诸如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。
本发明还关注遗传试验诸如包括PCR分析，以用于检测AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物。
本发明的试验还可以扩展至测定结合ob或瘦蛋白的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203。
通过下列非限制性实施例来进一步描述本发明。
                     实施例1
              Psammomys    obesus群
将Psammomys obesus群维持在Deakin University，WaurnPonds，Geelong，Victoria，Australia，以随意饮食的方式给繁殖对动物饲喂苜蓿和标准实验室食物的膳食。使4周龄的动物断奶并维持能量的12％来源于脂肪、63％来源于碳水化合物且25％来源于蛋白质的标准实验室食物的膳食(Barastoc，Pakenham，Australia)。使动物居住在12-12小时光照-黑暗循环的湿度和温度可控的室(22±1℃)内。
A组动物是瘦型的、血糖正常且血胰岛素正常的动物；B组动物是肥胖型的、血糖正常的且血胰岛素过多的动物；而C组动物是肥胖型的、高血糖的和血胰岛素过多的动物。
                      实施例2
                      实验动物
称重18周龄动物并在摄食状态下从尾静脉采血。处死动物并立即取出组织、称重、冷冻在液氮中并储存在-80℃下。根据表示为总体重百分比的肠系膜的、肩胛上的、肾周的、附睾的和肌内的(来自腓肠肌头间)脂垫的合并重量估计体脂肪百分比。将动物基于其血糖和胰岛素浓度分成A组、B组或C组。血糖过多和血胰岛素过多症的截断值分别为8mmol/L和l50μU/ml。称重禁食动物并在摄食状态下放血，然后禁食24小时，此后称重并在处死前再次放血。
                      实施例3
                      分析方法
立即使用酶葡萄糖分析仪(Model 27，Yellow SpringsInstruments，OH)测定全血血糖。使用双抗体固相放射性免疫测定法(Phadeseph，Kabi Pharmacia Diagnostics，Sweden)测定血浆胰岛素浓度。
                      实施例4
                  RNA提取和反转录
对于每一组织类型，使用TriZol(Life Technologies，Rockville，MD)、按照制造商的建议从组织中提取RNA。通过在260nm处的分光光度法对RNA定量(Beckman Instruments，Fullerton，CA)，并用2μg进行1％w/v乙二醛琼脂糖凝胶(Ambion，Austin，TX)电泳以检测完整性。然后使用AMV逆转录酶与oligo(dT)引物(Promega，Madi son，WI)对所述的RNA进行反转录。
                      实施例5
                     统计学分析
将全部数据表示为平均值±S.E.M。用一元方差分析(one-wayahalysis of variance)与post hoc最小显著性差异或Games-Howell检验比较各组之间的平均值，且如果合适使用t-检验。建立2-tailed Pearson相关性以分析基因表达与表型之间的关系。在分析前将血糖和血浆胰岛素浓度进行对数变换以便接近正态分布。将P＜0.05时的差异看作具有显著性差异。
                      实施例6
                    差异显示PCR
使用TriZol(Life Technologies，Rockville，MD)从组织中提取RNA，并用DNA酶处理(Life Technologies)、苯酚∶氯仿(4∶1)抽提和乙醇沉淀。通过在260nm处的分光光度法对RNA定量(Beckman Instruments，Fullerton，CA)，用2μg进行1％w/v乙二醛琼脂糖凝胶电泳(Ambion，Austin，TX)以检测完整性。然后使用Superscript II逆转录酶(Life Technologies)与锚定的oligo(dT)引物对所述的RNA进行反转录。使用RNAimage mRNA差异显示系统(GenHunter Corporation，Nashville，Tennessee)对来自摄食和禁食状态下的肥胖型和瘦型Psammomys obesus的下丘脑cDNA样品进行差异显示PCR。在6％w/v聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物，并通过使干燥的凝胶暴露在x-光片上使差异表达的PCR片段显现出来。从凝胶上切下候选带，并使用合适的引物组合通过PCR重新扩增。使用ABI PRISM Big-Dye终止循环测序备用反应试剂盒(ABI PRISMBig-Dye terminator cycle sequencing ready reaction kits)进行测序反应，并在ABI 373A DNA测序仪上进行分析。在国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information)使用BLAST网络服务进行基因数据库检索。
                     实施例7
               大阵列(Macroarray)
使用TriZol(Life Technologies，Rockville，MD)从组织中提取RNA，并用DNA酶处理(Life Technologies)、苯酚∶氯仿(4∶1)抽提和乙醇沉淀。通过在260nm处的分光光度法对RNA定量(Beckman Instruments，Fullerton，CA)，并用2μg进行1％w/v乙二醛琼脂糖凝胶电泳(Ambion，Austin，TX)以检测完整性。将混合的用于各研究组的RNA样品用33P d-ATP标记，并与人GF 201膜微阵列滤膜(Research Genetics)杂交。将总计5184个基因、包括已知基因和表达的序列标志点印在膜上。使用磷成象仪(phosphorimager)对与各基因结合的水平进行定量，并使用Pathways软件(ResearchGenetics)进行比较。
                      实施例8
                      AGT-106
使用差异显示PCR技术鉴定AGT-106是在以色列沙土鼠(ISR)的下丘脑中差异表达的，且AGT-106在摄食沙土鼠中的表达高于在禁食沙土鼠中的表达。
所用的引物是：
AGT-106：
正向引物：5’-CAATCACCGCTTTTAAGATAGTTTGT-3’[SEQ ID NO：12]
反向引物：5’-AGCATTAAAAAGGGCTCGCA-3’[SEQ ID NO：13]
Psammomys obesus  AGT-106 cDNA的部分核苷酸序列如下：
NTTTGNTGNCCNGCTGTGTGTGTTAGAAGAAAACAGAAAAGGAAAGAAAAACAATCACCGC
TTTTAAGATAGTTTGTATCAGCTTAGATTTCATCATGACTGTTTTACATACTGGAATTTAT
AAATTGTAAGTTATCATTTTCCAATGCGAGCCCTTTTTAATGCTTTTTAAAACTTGTGAAT
AAAATTGATACTCCTT [SEQ ID NO：1].
Blast分析显示了AGT-106 cDNA序列与鼠TROY mRNA之间的序列同源性。TROY是新近鉴定的肿瘤坏死因子受体超家族中的成员(Kojima等，《生物学与化学杂志》(J.Biol.Chem.)275(27)：20742-20747，2000)。ISR TROY与小鼠TROY mRNA的核苷酸序列同源性为85％。
在Psammomys obesus中下丘脑AGT-106的表达因禁食而减少(附图1、2)。在A组摄食和A组禁食动物中观察到的主要作用为AGT-106表达因禁食而减少约50％。这种AGT-106表达因禁食而导致的显著减少在B组和C组动物中不明显；而两肥胖组的摄食动物与禁食的A组动物相似。这些结果证实在肥胖型动物中AGT-106的下丘脑表达甚至在摄食状态下也保持抑制，从而提示这种基因在这些动物体内调节异常。
有意义的是还证实了在禁食24小时后体重改变(δ体重)与下丘脑中AGT-106的基因表达之间的显著关联(附图3)。尽管当将所有动物合并时也观察到这种关联，但是当将动物分成瘦型和肥胖型时，所述的联系在瘦型动物中不存在(附图4)，而在肥胖型组中得到加强(附图5)。在下丘脑AGT-106表达与循环葡萄糖或胰岛素浓度之间没有关联。
这一结果由此证实肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)成员Troy(AGT-106)在调节啮齿动物对禁食反应的能量利用和体重中的新作用。由于AGT-106是下丘脑中的受体，用于调节体重和能量平衡的大脑内的关键点，这种调节可能包括通过NF-кB途径或其它未确定的途径的体内稳态所涉及的基因的下游转录调节。另一方面，这种调节可能包括体内能量平衡状态时循环信使/分子反馈信息对下丘脑的作用。
                      实施例9
                      AGT-113
使用差异显示发现了AGT-113，看起来它在C组(肥胖型、糖尿病)动物下丘脑中的表达水平高于A组(瘦型、健康)动物。
实时PCR证实了这一结果(附图6)，且表明A组动物在摄食和禁食状态下在其下丘脑中该基因的表达水平均远低于B组(肥胖型、葡萄糖耐量异常)动物和C组动物(A组摄食与C组摄食相比，p＝0.031；A组禁食与B组禁食相比，p＝0.028；A组禁食与C组禁食相比，p＝0.023)。
在摄食状态下，下丘脑AGT-113基因表达与体重(p＜0.001，附图7A)、体脂肪百分比(p＝0.002，附图7B)和血浆胰岛素水平(p＝0.026，附图7C)相关。在禁食状态下，下丘脑AGT-113基因表达仅与体重相关(p＝0.002，附图7D)。
使用Taqman PCR技术、在ABI Prism 7700序列检测器(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)上对各eDNA样品中的基因表达进行定量。将亲环蛋白(Cyclophilin)用作内源性对照以使加入到反应中的cDNA的量标准化。PCR条件为50℃下2分钟、95℃下10分钟、随后是95℃下15秒和60℃下1分钟的40个循环。对全部样品均按一式两份进行检测。就AGT-201(实施例10)、AGT-203(实施例11)和亲环蛋白而言，将带有与5’末端连接的报道染料FAM和与3’末端连接的猝灭剂染料TAMRA的荧光探针与Taqman UniversalPCR Master Mix(PE Applied Biosystems)一起使用。就AGT-202、AGT-106(Troy)和AGT-113而言，不使用探针，而使用SYBR GreenMaster Mix(PE Applied Biosystems)。在各组中检验了″管家基因″亲环蛋白的表达水平且证实在肥胖型糖尿病或禁食状态下没有发生改变。
所用引物如下：
AGT-113：
正向引物：5-CATGATGCCAGCCACCTG-3’[SEQ ID NO：16]
反向引物：5’-TCCCAAAGTAAATTAAACACATCAGAA-3’[SEQ ID NO：17]
亲环蛋白：
正向引物：5’-CCC ACC GTG TTC TTC GAC AT-3’[SEQ ID NO：18]
反向引物：5’-CCA GTG CTC AGA GCA CGA AA-3’[SEQ ID NO：19]
探针：5’-CGC GTC TCC TTC GAG CTG TTT GC-3’[SEQ ID NO：20]
Psammomys obesus AGT-113部分核苷酸序列如下：
TTTCATAGCTGGCATGATGCCAGCCACCTGGCAAACTGTGTCTCTTACCTGACTCCTTTCA
AAATCAAGATATTTTGAGAATAGTCTATATTCTGATGTGTTTAATTTACTTTGGGAAGAAA
CTCCTTGCTTAAGTCTAAAATGGAAAACATTTTTTAATTAATAAAAAAAAAAA[SEQ ID
NO：2].
该序列与人克隆RP11-368J13(GenBank保藏号AC008070)具有一定的同源性(65个核苷酸中有84％同源性)。
基因表达模式强烈暗示AGT-113在体重调节和能量稳态中通过其在下丘脑中的作用而起作用。AGT-113还可能参与下丘脑中的胰岛素作用或胰岛素抗性。
                        实施例10
                        AGT-201
通过对下丘脑的基于膜的微阵列(大阵列(macroarray))分析确定AGT-201在Psammomys obesus中是差异表达的。
所用引物如下：
AGT-201
正向引物：5’-GCATGCCTGGTTGCCTG-3’[SEQ ID NO：9]
反向引物：5’-TTTCAAGATGGCCTGGCG-3’[SEQ ID NO：10]
探针：5’-CCCTGGCAGGTGAGTTCATCAAGGC-3’[SEQ ID NO：11]
Psammomys obesus AGT-201的部分核苷酸序列如下：
CTTTAAGATT  GGGANTNCGA  TGATCTCTTG  GTGGCAGAGG  TGGGAATCTC
AGACTATGGT  NCCAAGCTGA  ACATGGAGCT  NAGTNAAAAG  TNCAAGCTGG
TCAAAGAGGN  CTACCCAGTG  TTNTACCTCT  TCCGAGACGG  GGACTTTGAG
AACCCAGTCC  CATACAGTGG  GGCAGTTAAG  GTTGGAGCCA  TCCAGCGCTG
GCTAAAGGGG  CAGGGGGTCT  ACCTAGGCAT  GCCTGGTTGC  CTGCCTGCNT
ACGATGCCCT  GGCAGGTGAG  TTCATCAAGG  CCTCCAGTGT  AGAGGCCCGC
CAGGCCATCT  TGAAAAAGGG  GCAGGAAGGC  CTCTCTGGTG  TGAAGGAGAC
TGNGAATAAG[SEQ ID NO：3]
长度：360个核苷酸
对Psammomys obesus AGT-201序列的分析证实了与人AGT-201的高度序列同源性(88％，X94910)和与大鼠同系物Erp29的高度同源性(89％，Y10264)。
已知AGT-201位于第12条染色体上，且已经将其绘制成了间隔D12S78-D12S79(12q21-22)图。2种动物的QTLs位于AGT-201的相邻处、Qsbw和Weightl(Chagnon等，《肥胖研究》(Obes Res.)8(1)：89-117，2000)。
这三组动物中，下丘脑的AGT-201表达在A组和B组动物中因禁食显著减少(附图8)，不过，在C组动物中没有因禁食而导致表达减少。这些结果提示糖尿病型的C组动物中下丘脑AGT-201表达的调节异常。
在禁食动物中下丘脑的AGT-201表达显著低于摄食动物(附图9)。
下丘脑中的AGT-201基因表达与摄食或禁食状态下的体重、血糖或胰岛素浓度无关。
这些结果提示AGT-201在对禁食和能量稳态的中枢反应中的作用可能通过改变蛋白质表达、存在于内质网中的分泌性蛋白的保留、提取或折叠来进行。此外，这些结果提示AGT-201在这种调节中的作用在糖尿病状态下可能改变，由此该基因鉴定作为研发糖尿病疗法的可能的靶物。
                      实施例11
                      AGT-202
通过大阵列(macroarray)分析确定AGT-202在Psammomysobesus下丘脑中差异表达。
所用引物如下：
AGT-202：
正向引物：5’-CTGCAAAACGCCCATTCG-3’[SEQ ID NO：14]
反向引物：5’-TCATAGTCTCGCTCGCAGTAGG-3’[SEQ ID NO：15]
获得Psammomys obesus AGT-202序列的部分以便设计用于基因表达研究的引物。
CCGGAGAGATCATGCACGCCCTCAAGATGACCTGGCACGTGCACTGNTTCACTTGTGCTGC
CTGCAAAACGCCCATTCGCAACCGAGCGTTCTATATGGAGGAAGGGGCACCCTACTGCNAG
CGAGACTATGAGAAGATGTTTGGCACAAAGTGCCGAGGCTGNGACTTCAAGATTGATGCTG
GAGACCGCTTCCTGGAAGCGCTG[SEQ ID NO：4].
对Psammomys obesus AGT-202序列(154个核苷酸)的分析证实了与人AGT-202的高度序列同源性(88％，L35246)和与大鼠同系物AGT-202的高度同源性(86％，AF096685)。
AGT-202位于人第5条染色体上。发现QTL’s与肥胖或糖尿病无关。
看起来AGT-202的基因表达是广泛分布的。cDNA来源包括主动脉、血液、大脑、乳腺、结肠、生殖细胞、肾、喉、肺、肌肉、卵巢、胰腺、集合物(pooled)、前列腺、胃、睾丸、扁桃体、子宫、完整胚胎、大脑、子宫颈、结肠、眼、颈、肾、肺、卵巢、胰腺、前列腺、肿瘤、皮肤、胸腺、集合物、子宫，全血。使用抗-AGT-202抗体在骨骼肌中进行的免疫定位研究证实AGT-202存在于成人肌节中的Z线和某些横纤丝上。
总之，在摄食动物下丘脑中AGT-202表达显著高于禁食动物(p＝0.013)(附图10)。此外，看起来在A组和B组摄食动物下丘脑中的AGT-202基因表达高于在C组动物，不过，它们没有显著性差异(附图11)。
AGT-202基因表达与体重、体脂肪百分比或血糖或胰岛素水平之间没有相关性。
                     实施例12
早老蛋白(Presenilins)相互作用菱形样蛋白酶(AGT-203)
通过基于膜的微阵列(大阵列(macroarray))发现具有保藏号AA131464的表达序列标志(EST)形式的人类基因在瘦型非糖尿病与肥胖型糖尿病动物中是差异表达的。近来将具有与EST AA131464相配的完整编码序列的人mRNA添加到GenBank中(2000年11月1日，保藏号AF197937)。该mRNA编码379个氨基酸的蛋白质，已经将它们命名为早老蛋白相互作用菱形样蛋白酶(AGT-203)。
所用的引物如下：
AGT-203：
正向引物：5’-CCCACCTCTGGAAGAAACTGTCT-3’[SEQ ID NO：6]
反向引物：5’-CCTGTGAACCCAACAGTGAAGA-3’[SEQ ID NO：7]
探针：5’-TTATCCTTCCCCCTACCCTATAAGAACTTTGGTG-3’[SEQ IDNO：8]
获得Psammomys obesus AGT-203序列的部分以便设计用于基因表达研究的引物并提供如下：
TGGAAGGTTGAACCTCGAAGATCAGACACAGGGTCAAGTGGTGAAGCTTACAAGAGAAGTGC
CTTGATCCCACCTCTGGAAGAAACTGTCTTTTATCCTTCCCCCTACCCTATAAGAACTTTGG
TGAAGCCCTTTTTCTTCACTGTTGGGTTCACAGGCTGTGCATTTGGATCAGCTGCCATTTGG
CAATATGAATCACTGAAATCCAGGGTCCAGAGTANNTGNNCGGAATGGCAGGAATGCCTGGA
CTCAATGAAATCCAGGGTCC[SEQ ID NO：5].
看起来AGT-203基因具有广泛分布的组织表达模式。已经在肾上腺、血液、骨、大脑、乳腺、结肠、包皮、生殖细胞、心脏、肾、肺、淋巴、骨髓、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、胎盘、前列腺、皮肤、脾、胃、睾丸、扁桃体、子宫和完整胚胎中发现了相当于AGT-203mRNA的ESTs。
通过将mRNA序列与人高流通量基因组测序克隆进行序列对比、然后应用GT-AG规则(其中全部内含子以GT开始，以AG结束)来推定人AGT-203基因的外显子/内含子结构。人AGT-203基因带有10个外显子。前4个外显子位于克隆RP11-315J22(保藏号AC068644)上，其来自第3条染色体。后6个外显子位于克隆RP11-637N15(保藏号AC020694)上，其来自第17条染色体。可以认为这些克隆之一定位不正确。目前进行研究以便确定哪条染色体是正确的染色体。
通过Taqman PCR进行的基因表达研究(附图12)证实当与瘦型A组动物比较时，肥胖型血胰岛素过多的B和C组动物骨骼肌中AGT-203基因表达减少(B组p＝0.014，C组p＝0.011)。骨骼肌中AGT-203基因表达与log胰岛素(p＝0.001)、体重(p＝0.011)和体脂肪百分比(p＝0.006)之间的相关性进一步支持了这种关联。与血糖水平没有显著的相关性。
发现AGT-203基因表达在肥胖型血胰岛素过多的Psammomysobesus的骨骼肌中减少。观察到了与体重和血浆胰岛素水平的负相关。认为AGT-203与早老蛋白发生相互作用且参与蛋白质裂解。
早老蛋白参与诸如APP和Notch这样的跨膜蛋白的蛋白水解加工。尽管APP大部分在中枢神经系统中高度表达，但是它被普遍表达，且其在骨骼肌中的作用是未知的。已知糖尿病是阿尔茨海默病的危险因素，且AGT-203可能在两种疾病中起作用。NOTCH是膜受体，且在该膜内的蛋白水解加工后具有移动至核并激活基因表达的能力。AGT-203可以通过NOTCH起作用来影响参与代谢的基因的表达。另一方面，AGT-203在肥胖或糖尿病中的作用可能通过另一种尚未鉴定的跨膜蛋白的加工来进行。
早老蛋白的其它可能的作用包括调节编程性细胞死亡和/或钙稳态。因此，存在许多不同的途径，通过这些途径，减少的AGT-203表达可能在骨骼肌中葡萄糖或脂肪的代谢中起作用，由此影响体重和胰岛素作用。
本领域技术人员应当理解的是易于对本文所述的本发明做非具体描述的改变和修改。应理解本发明包括所有这类改变和修改。本发明还分别或共同包括本说明书或本说明书中涉及或所示的全部步骤、特征、组合物和化合物以及所述步骤或特征中的一个或多个的任意和全部的组合。
                             序列表
<110>Autogen Research Pty Ltd
     International Diabetes Institute
     Deakin University
<120>在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中表达的核酸
<130>2497924/EJH
<140>国际上-尚未得到
<141>2002-02-05
<150>AU PR 2950
<151>2001-02-07
<160>20
<170>PatentIn 3.0版
<210>1
<211>199
<212>DNA
<213>Psammomys obesus
<220>
<221>misc_特征
<222>(6)..(6)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(9)..(9)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(12)..(12)
<223>n＝任意核苷酸
<400>1
ntttgntgnc cngctgtgtg tgttagaaga aaacagaaaa ggaaagaaaa acaatcaccg     60
cttttaagat agtttgtatc agcttagatt tcatcatgac tgttttacat actggaattt    120
ataaattgta agttatcatt ttccaatgcg agcccttttt aatgcttttt aaaacttgtg    180
aataaaattg atactcctt                                                 199
<210>2
<211>175
<212>DNA
<213>Psammomys obesus
<400>2
tttcatagct ggcatgatgc cagccacctg gcaaactgtg tctcttacct gactcctttc     60
aaaatcaaga tattttgaga atagtctata ttctgatgtg tttaatttac tttgggaaga    120
aactccttgc ttaagtctaa aatggaaaac attttttaat taataaaaaa aaaaa         175
<210>3
<211>360
<212>DNA
<213>Psammomys obesus
<220>
<221>misc_特征
<222>(15)..(15)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(17)..(17)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(61)..(61)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(81)..(81)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(85)..(85)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(92)..(92)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(110)..(110)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(123)..(123)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(249)..(249)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(353)..(353)
<223>n＝任意核苷酸
<400>3
ctttaagatt gggantncga tgatctcttg gtggcagagg tgggaatctc agactatggt     60
nccaagctga acatggagct nagtnaaaag tncaagctgg tcaaagaggn ctacccagtg    120
ttntacctct tccgagacgg ggactttgag aacccagtcc catacagtgg ggcagttaag    180
gttggagcca tccagcgctg gctaaagggg cagggggtct acctaggcat gcctggttgc    240
ctgcctgcnt acgatgccct ggcaggtgag ttcatcaagg cctccagtgt agaggcccgc    300
caggccatct tgaaaaaggg gcaggaaggc ctctctggtg tgaaggagac tgngaataag    360
<210>4
<211>206
<212>DNA
<213>Psammomys obesus
<220>
<221>misc_特征
<222>(47)..(47)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(120)..(120)
<223> n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(164)..(164)
<223>n＝任意核苷酸
<400>4
ccggagagat catgcacgcc ctcaagatga cctggcacgt gcactgnttc acttgtgctg     60
cctgcaaaac gcccattcgc aaccgagcgt tctatatgga ggaaggggca ccctactgcn    120
agcgagacta tgagaagatg tttggcacaa agtgccgagg ctgngacttc aagattgatg    180
ctggagaccg cttcctggaa gcgctg                                         206
<210>5
<211>268
<212>DNA
<213>psammomys obesus
<220>
<221>misc_特征
<222>(221)..(222)
<223>n＝任意核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<222>(225)..(226)
<223>n＝任意核苷酸
<400>5
tggaaggttg aacctcgaag atcagacaca gggtcaagtg gtgaagctta caagagaagt     60
gccttgatcc cacctctgga agaaactgtc ttttatcctt ccccctaccc tataagaact    120
ttggtgaagc cctttttctt cactgttggg ttcacaggct gtgcatttgg atcagctgcc    180
atttggcaat atgaatcact gaaatccagg gtccagagta nntgnncgga atggcaggaa    240
tgcctggact caatgaaatc cagggtcc                                       268
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>6
cccacctctg gaagaaactg tct                                            23
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>7
cctgtgaacc caacagtgaa  ga                                            22
<210>8
<211>34
<212>DNA
<213>引物
<400>8
ttatccttcc ccctacccta taagaacttt ggtg                                34
<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>引物
<400>9
gcatgcctgg ttgcctg                                                    17
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>10
tttcaagatg gcctggcg                                                   18
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>引物
<400>11
ccctggcagg tgagttcatc aaggc                                           25
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>引物
<400>12
caatcaccgc ttttaagata gtttgt                                          26
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>13
agcattaaaa agggctcgca                                                 20
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>14
ctgcaaaacg cccattcg                                                   18
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>引物
<400>15
tcatagtctc gctcgcagta gg                                              22
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>引物
<400>16
catgatgcca gccacctg                                                   18
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>引物
<400>17
tcccaaagta aattaaacac atcagaa                                         27
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>18
ccaccgtgt tcttcgacat                                                  20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>引物
<400>19
ccagtgctca gagcacgaaa                                                 20
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>20
cgcgtctcct tcgagctgtt tgc                                             23

Claims (33)

1.分离的核酸分子，其包含编码一种分子或其衍生物或同系物或互补于编码一种分子或其衍生物或同系物的序列的核苷酸序列，其中所述的核酸分子在肥胖型动物的下丘脑组织或肌肉组织之一或两者中表达的量大于瘦型动物或在摄食动物的下丘脑组织或肌肉组织之一或两者中表达的量大于禁食动物。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：1中所示核苷酸序列或与其具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补形式杂交的核苷酸序列。
3.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：2中所示核苷酸序列或与其具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：2或其互补形式杂交的核苷酸序列。
4.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：3中所示核苷酸序列或与其具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：3或其互补形式杂交的核苷酸序列。
5.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：4中所示核苷酸序列或与其具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：4或其互补形式杂交的核苷酸序列。
6.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：5中所示核苷酸序列或与其具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：5或其互补形式杂交的核苷酸序列。
7.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：1中所示的核苷酸序列。
8.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：2中所示的核苷酸序列。
9.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：3中所示的核苷酸序列。
10.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：4中所示的核苷酸序列。
11.权利要求1的分离的核酸分子，其中该核酸分子包含SEQ IDNO：5中所示的核苷酸序列。
12.包含核苷酸或氨基酸的序列的分离的分子，其中所述的氨基酸由在肥胖型动物的下丘脑组织或肌肉组织之一或两者中表达的量大于瘦型动物或在摄食动物的下丘脑组织或肌肉组织之一或两者中表达的量大于禁食动的核酸分子编码。
13.权利要求12的分离的分子，其由SEQ ID NO：1中所示核酸分子或与SEQ ID NO：1具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：1或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
14.权利要求12的分离的分子，其由SEQ ID NO：2中所示的核酸分子或与SEQ ID NO：2具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：2或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
15.权利要求12的分离的分子，其由SEQ ID NO：3中所示的核酸分子或与SEQ ID NO：3具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：3或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
16.权利要求12的分离的分子，其由SEQ ID NO：4中所示的核酸分子或与SEQ ID NO：4具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：4或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
17.权利要求12的分离的分子，其由SEQ ID NO：5中所示的核酸分子或与SEQ ID NO：5具有至少约30％相似性的核苷酸序列或能够在低严格条件下与SEQ ID NO：5或其互补形式杂交的核苷酸序列编码。
18.权利要求13或14或15或16或17的分离的分子，其中所述的分子是蛋白质。
19.权利要求18的分离的蛋白质，其由SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列编码。
20.权利要求18的分离的蛋白质，其由SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列编码。
21.权利要求18的分离的蛋白质，其由SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列编码。
22.权利要求18的分离的蛋白质，其由SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列编码。
23.权利要求18的分离的蛋白质，其由SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列编码。
24.分离的蛋白质，其选自下列蛋白质：
(i)由与瘦型动物相比在肥胖型动物下丘脑或肌肉组织中差异表达的核酸分子编码的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(ii)由与禁食动物相比在摄食动物肝组织中差异表达的核酸分子编码的蛋白质或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(iii)由基本上如SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(iv)由基本上如SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(v)由基本上如SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列的序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(vi)由基本上如SEQ ID NO：4中所示核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(vii)由基本上如SEQ ID NO：5中所示核苷酸序列或其衍生物、同系物或类似物或编码与该序列具有至少约30％相似性的氨基酸序列编码的蛋白质或所述蛋白质的衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物；
(viii)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(ix)由能够在低严格条件下与SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(x)能够在低严格条件下与SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(xi)能够在低严格条件下与SEQ ID NO：4中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(xii)能够在低严格条件下与SEQ ID NO：5中所示核苷酸序列杂交的核酸分子或其衍生物、同系物或类似物编码的蛋白质；
(xiii)如段落(i)-(xii)中任意一段中所定义的同二聚体形式的蛋白质；和
(xiv)如段落(i)-(xii)中任意一段中所定义的异二聚体形式的蛋白质。
25.哺乳动物体内AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203中的一种或多种的表达的调节方法，所述的方法包括下列步骤：在足以上调或下调或其它方式调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达的时间和条件下使AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203与有效量的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203表达的调节剂接触。
26.哺乳动物体内AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性的调节方法，所述的方法包括在足以增加或降低AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性的时间和条件下对所述的哺乳动物给予调节有效量的一种分子。
27.患有特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡的一种或多种症状的疾患的哺乳动物的治疗方法，所述的方法包含在足以调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203表达的时间和条件下或足以调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203活性的时间和条件下对所述的哺乳动物给予有效量的一种制剂。
28.患有特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病或能量失衡的一种或多种症状的疾患的哺乳动物的治疗方法，所述的方法包含对所述的哺乳动物给予有效量的AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203。
29.能够调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物或类似物表达的制剂在制备用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡的疾患的药物中的应用。
30.能够调节AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物活性的制剂在制备用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡的疾患的药物中的应用。
31.AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物或类似物或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和/或AGT-203或其衍生物、同系物、类似物、化学等价物或模拟物在制备用于治疗特征在于肥胖、食欲缺乏、糖尿病和/或能量失衡的疾患的药物中的应用。
32.包含AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203表达或AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203活性的调节剂和一种或多种药物上可接受的载体和/或稀释剂的组合物。
33.检测来自受试者的生物样品中AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其衍生物或同系物的方法，所述的方法包含下列步骤：在足以形成复合物的时间和条件下使所述生物样品与对AGT-106、AGT-113、AGT-201、AGT-202和AGT-203或其抗原性衍生物或同系物具有特异性的抗体接触，然后检测所述复合物。
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