CN1490332A - 重组人ia－2抗原的制备方法 - Google Patents

Abstract

重组人IA－2抗原的制备方法，包括从胎脑中克隆人IA－2胞内结构域(包括氨基酸606～979)的编码基因；以嵌套式PCR扩增该编码基因，实现PinpointXa－IA－2表达型重组质粒的构建；将含重组质粒的JM109菌经IPTG诱导培养，得到IA－2重组蛋白；IA－2重组蛋白经分离、亲和层析和透析纯化，获得生物素酰化IA－2融合蛋白，可以直接作为抗原，用于IA－2抗体的链亲和素固相酶免检测技术。

Description

重组人IA-2抗原的制备方法

所属技术领域

本发明涉及重组人IA-2抗原的制备方法，属于生物医学和基因工程技术领域。

背景技术

1型糖尿病是由于胰岛β细胞破坏引起胰岛素分泌严重不足而出现的一组代谢障碍综合征，是儿童和青少年人群中最常见的慢性终身性疾病之一，绝大多数患者在20岁之前发病，但是近年来成年人中的发病人数也在不断增加。1型糖尿病可引起肾功能衰竭、心脑血管病变、失明及肢体坏疽等严重的慢性并发症，不仅严重影响了病人的健康和生活质量，并且给家庭及社会带来沉重的经济负担。因此，广泛开展1型糖尿病的基础和临床研究具有重要的理论和现实意义。

从糖尿病的新分型标准中可以看出，起病年龄、血糖控制和胰岛素依赖与否已不再作为1型与2型糖尿病分型的主要依据。两者最主要的鉴别点在于1型糖尿病患者存在着自身免疫紊乱，而2型糖尿病无此现象。因此，针对多种胰岛细胞相关分子的自身抗体是目前糖尿病正确分型最直接可靠的临床指标。自1974年胰岛细胞抗体(ICAs)被发现以来，随着科研的深入，越来越多的胰岛自身抗体被人们所认识，其中研究较多的有IA-2、IA-2β、GAD65及胰岛素自身抗体等。对这些自身抗体的检测将有助于1型、2型糖尿病的鉴别诊断，尤其是对成人隐性自身免疫性糖尿病(LADA)诊断及治疗的指导有重要价值。

1型糖尿病一旦进展至临床阶段，由于此时胰岛β细胞总数已明显减少，且针对β细胞的自身免疫记忆反应已建立，患者目前尚不可能永久性治愈。因而要预防1型糖尿病的发生，就必须在高危人群(如一级亲属)或一般人群中筛查出1型糖尿病前期个体，并及时予以免疫干预，阻断β细胞的免疫损伤过程。目前，IA-2抗体(IA-2A)联合GAD65抗体(GADA)及胰岛素自身抗体(IAA)是预测1型糖尿病，筛查1型糖尿病前期个体最可靠的免疫学标志。在1型糖尿病一级亲属中，仅一种抗体阳性者五年发病危险度为5％，两种抗体阳性者为50％，三种抗体均阳性危险度为60％～80％。

IA-2是近年来用分子生物学技术获得的一种重组蛋白，它可与60％～80％的新诊1型糖尿病患者血清发生免疫沉淀反应，可刺激其外周血单核细胞发生强烈的增殖反应，被证实是重要的胰岛细胞自身抗原。其自身抗体(IA-2A)在新诊1型糖尿病患者中阳性率为60％～80％，与GADA阳性率(70％～80％)相近，故两者的敏感性相近。但GADA还常出现于Stiff-man综合征、不伴1型糖尿病的自身免疫性多分泌腺病综合征、Addison’s病、Graves病等自身免疫性疾病患者中，而IA-2A特异性强，在不伴1型糖尿病的自身免疫病患者中较少发现。

IA-2是受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(protein-tyrosine phosphatase，PTP)超家族中的一个新成员，是一个含有979个氨基酸残基的I型跨膜糖蛋白，主要在胰岛、脑组织、垂体等神经内分泌组织中表达，经免疫荧光研究将IA-2定位于内分泌细胞和神经元细胞的分泌性囊泡中。IA-2是先前发现的胰岛细胞40kDa胰蛋白酶消化片段抗原的前体，是1型糖尿病的主要自身抗原之一，其抗原决定簇局限于胞内结构域中。研究表明，用IA-2胞内段作为抗原进行IA-2自身抗体的检测，其敏感性及特异性较全长IA-2作为抗原并无明显改变。

综上所述，IA-2及其自身抗体对1型糖尿病的发病机理、诊断分型、预测筛查及早期防治等方面的研究均有重要意义。抗体检测方法的建立关键是获得具有免疫学活性的IA-2蛋白，因此，IA-2抗原的制备至关重要。

IA-2主要存在于胰岛、脑组织、垂体、肾上腺髓质等神经内分泌组织中。但从上述相关组织直接分离提取之，尚未见报道；而以多肽合成仪合成抗原肽费用昂贵。目前，均采用分子生物学技术制备重组型IA-2蛋白，包括下面两种方法：

1、真核表达：在以TnT-偶联的兔网织红细胞溶质系统及³⁵S标记的蛋氨酸等条件下，体外合成IA-2。这是公认的经典的制备IA-2蛋白的方法。但其缺点有：成本高，技术难，产量低(仅纳克级)，一般仅限于科研，难以进行应用开发。

2、原核表达：以原核表达系统表达外源目的蛋白具有稳定、高效的优点，在构建表达型重组质粒后仅需培养细菌便可获得目的蛋白，而大规模细菌培养成本低廉，操作亦不复杂，故可不断地大量获取重组目的蛋白。但原核表达也有缺点，如细菌不能对表达产物进行糖基化、酰基化修饰，无法进行前体蛋白的降解、亚基聚合及二硫键正确形成等蛋白质翻译后加工过程，这常可能造成原核表达的蛋白质不具备原有的生物学活性。

有报道从大肠杆菌中表达出具有免疫学活性的IA-2或IA-2胞内段蛋白。为了简化基因工程下游产品的分离和纯化过程，IA-2蛋白大多以融合蛋白的形式表达，如在羧基末端连接谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或在氨基末端连接生物素等。

Paton等从人胰岛cDNA中扩增出IA-2胞内段(包括氨基酸603～979)的编码基因，并亚克隆至PinPoint^TM质粒中，获得的重组质粒经转化大肠杆菌后，表达生物素酰化IA-2胞内段融合蛋白，但它采用溶菌酶(lysozyme)和脱氧核糖核酸酶(DNase)的方法来裂解细菌获取菌体蛋白，容易引起IA-2重组蛋白的降解和活性的丧失。(Payton MA，Hawkes CJ，Christie MR，et al.Relationship of the37,000-and 40,000-Mr tryptic fragments of islet antigens in insulin-dependentdiabetes to the protein tyrosine phosphatase-like molecule IA-2(ICA512).J ClinInvest，1995，96：1506-1511.)Lobner等以大肠杆菌表达的生物素酰化IA-2胞内段(包括氨基酸603～979)融合蛋白作为抗原，建立了血清中IA-2抗体的酶联免疫吸附检测方法。(Lobner K，Khoo-Morgenthaler UY，Seissler J，et al.Detection ofautoantibodies to the diabetes-associated antigen IA-2 by a sensitive enzyme-linkedimmunosorbent assay.Horm Metab Res，1999，31：686-691.)但其所用的含IA-2胞内段编码基因的重组PinPoint质粒是由上述学者赠送的，IA-2重组蛋白的具体表达过程不详。

Masuda等将IA-2胞内段(包括氨基酸604～979)的编码序列克隆至pGEX-2T质粒中，重组质粒经转化大肠杆菌NM522菌株后，以IPTG诱导GST融合IA-2蛋白的表达；最后用凝血酶(thrombin)消化去掉GST融合片断，获得天然的IA-2胞内段蛋白。但是加用凝血酶消化，可能会促进IA-2重组蛋白的降解，而使其免疫学活性降低。(Masuda M，Powell M，Chen S，et al.Autoantibodiesto IA-2 in insulin-dependent diabetes mellitus：measurements with a newimmunoprecipitation assay.Clinica Chimica Acta，2000，291：53-66.)

发明内容

本发明提供了一种重组人IA-2抗原的制备方法，包括应用基因工程技术，从胎脑中克隆人IA-2胞内结构域(包括氨基酸606～979)的编码基因，构建高效的原核表达体系；通过优化原核表达过程中的各步骤，提高IA-2重组蛋白的产量和免疫学活性。本发明提供的重组人IA-2抗原的制备方法，采用原核表达体系，以嵌套式PCR扩增人IA-2胞内段的编码基因，重组质粒经两次转化感受态大肠杆菌JM109菌株，含重组质粒的JM109菌经IPTG诱导培养，得到IA-2重组蛋白。经亲和层析纯化获得生物素酰化IA-2融合蛋白，可以直接作为抗原，用于IA-2抗体的链亲和素固相酶免检测技术。

本发明涉及的重组人IA-2抗原的制备方法，可分成如下三个步骤：

步骤1：IA-2表达型重组质粒的构建；

步骤2：IA-2重组蛋白的诱导表达；

步骤3：IA-2重组蛋白的分离、亲和层析和透析纯化。

本发明方法内容的详细描述如下：

重组人IA-2抗原的制备方法，包括上述的步骤1-3。其中：

步骤1为IA-2表达型重组质粒的构建。是从胎脑中克隆人IA-2胞内结构域(包括氨基酸606～979)的编码基因；以嵌套式PCR扩增该编码基因，实现Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建。

首先，从人胎脑组织中抽提总RNA，并逆转录成cDNA。根据Genbank公布的人IA-2 mRNA序列，设计用于扩增人IA-2胞内段(包括氨基酸606～979)编码基因的两对嵌套式引物，并在第二对引物的正向引物序列5’端加上了限制性内切酶BamH I的酶切位点；进行二轮嵌套式PCR扩增；获得的PCR产物经割胶纯化与Pinpoint Xa-1 T载体相连接，经两次转化大肠杆菌JM109菌株，构建Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒。

(一)总RNA的抽提和质量鉴定

总RNA的抽提采用TRIzol试剂，取胎脑组织和Trizol液加入无RNA酶的离心管中，匀浆；加氯仿，振荡，离心，取上层水相，加入等体积异丙醇混匀，离心，弃上清，以75％乙醇洗涤RNA沉淀；干燥；以无RNA酶的去离子水溶解沉淀，得RNA原液；取RNA原液，加入三倍体积的无水乙醇，-70℃保存。

RNA的定量分析：以紫外分光光度计于260nm和280nm波长处测吸光度(A值)，求出A₂₆₀/A₂₈₀比值，计算其浓度。

RNA的纯度鉴定：按《分子克隆实验指南》配制甲醛变性琼脂糖凝胶，并将RNA溶液变性后上样，100V恒压电泳约0.5h后，于紫外灯下观察电泳结果，并摄影。

(二)cDNA的合成

以Oligo(dT)₁₅为引物，胎脑总RNA为模板进行cDNA第一链的合成。

(三)PCR扩增及电泳鉴定

根据Genbank公布的人IA-2 mRNA序列，用Primer 3软件设计用于扩增IA-2胞内段cDNA序列的嵌套式PCR的两对引物(由上海基康生物技术公司合成)。

嵌套式PCR的第一轮扩增：以胎脑总RNA的逆转录产物为模板，用第一对引物进行第一轮PCR：

第一对引物：上游序列(Pu)：5’-CATGCGCGGCAGCAAGACAAG-3’(SeqID No：1)

下游序列(Pd)：5’-GAGGAGTGGGTACACAGAGATGC-3’(Seq ID No：2)

拟扩增片断长度为1212bp。

将扩增产物与适量6×Loading Buffer混匀，加样于1.0％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并通过凝胶图像分析仪进行拍照。

嵌套式PCR的第二轮扩增：以第一轮PCR的部分反应物—产物混合物为模板，用第二对引物进行第二轮PCR：

第二对引物上游序列(Pu’)：5’-AT GGATCCAGCAAGACAAGGAGCGC-3’(划线部分为BamH I限制性酶切位点)(Seq ID No：3)

下游序列(Pd’)：5’-TCACTGGGGCAGGGCCTTGAG-3’(Seq ID No：4)

拟扩增片断长度为1132bp。第二对引物与第一对引物内侧的序列配对，并且在上游序列的5’端加上了BamH I限制性内切酶的酶切位点。

反应结束后，将扩增产物与适量6×Loading Buffer混匀，加样于1.0％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并通过凝胶图像分析仪进行拍照。

(四)第二次PCR扩增产物进行割胶纯化，纯化的DNA贮存于-20℃备用。

(五)Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建，包括Pinpoint Xa-IA-2 T-A克隆的构建(第一次转化)和Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建(第二次转化)：

1.Pinpoint Xa-IA-2 T-A克隆的构建(第一次转化)：将目的片段与PinPointXa-1 T载体连接，连接产物转化感受态JM109细菌；筛选出含正向T-A克隆的大肠杆菌。

2.Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建(第二次转化)：从上述筛选出的含正向T-A克隆的JM109菌株，抽提质粒DNA，割胶纯化；获得的含目的基因片断的线状质粒DNA进行自身连接；连接产物转化感受态JM109细菌。

将含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株扩大培养至对数生长中期，与灭菌甘油混匀，终浓度为30％，于-20℃至-70℃保存。

Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的筛选及鉴定，采用：

对重组质粒以BamH I和Bgl II进行单酶切消化或双酶切消化，根据酶切图谱初步鉴定；

以质粒DNA为模板进行PCR反应，产物进行琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶图像分析仪进行拍照；

对重组质粒进行测序分析，与GenBank中的IA-2 mRNA序列进行比较，分析重组质粒中的插入片段和IA-2 mRNA的同源性，并进一步分析重组子读码框架的正确性。

步骤2为IA-2重组蛋白的诱导表达。是将含重组质粒的JM109菌经IPTG诱导培养，得到IA-2重组蛋白。

取上述含表达型重组质粒的大肠杆菌JM109菌株在LB/氨苄青霉素培养平板上划线接种，培养过夜；挑取新鲜单个菌落接种于氨苄青霉素的LB液中，制得饱和菌液；再转接于氨苄青霉素和生物素的LB液中，振摇培养；加入IPTG，诱导培养，得到诱导培养重组质粒菌液。

原核表达产物可采用变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。

步骤3为IA-2重组蛋白的分离、亲和层析和透析纯化。是将上述诱导培养重组质粒菌液经裂菌分离、亲和层析、透析纯化获得生物素酰化IA-2融合蛋白。

首先将上述诱导培养重组质粒菌液离心，收集细菌沉淀，在冰浴条件下，以超声波裂菌；离心，吸取上清菌体蛋白，贮于-20℃。

亲和层析在Softlink^TM Soft Release亲和素树脂进行，得到的生物素酰化IA-2融合蛋白置于透析膜中，放入细菌裂解缓冲液中，透析；透析后的蛋白溶液冻干，于-20℃保存。

纯化后的IA-2重组蛋白可用Bradford法测定其浓度；以SDS-PAGE(12％的分离胶和3.9％的浓缩胶)和考马斯亮蓝染色对纯化的蛋白进行分子量及纯度鉴定。

对重组IA-2蛋白免疫原性的dot-blot鉴定表明，按本发明提供的方法制得的IA-2重组蛋白具有免疫学活性。

本发明提供的这种重组人IA-2抗原的制备方法，也采用原核表达体系，表达IA-2胞内段蛋白，获得重组融合目的蛋白。但本发明的方法还具有以下优点：

1、以嵌套式PCR扩增人IA-2胞内段的编码基因，既减少了PCR过程中非特异性产物的生成，同时又提高了特异性扩增的灵敏度。

2、重组质粒经两次转化感受态大肠杆菌JM109菌株，保证了重组质粒阅读框架的正确性及重组质粒菌的稳定性。

3、含重组质粒的JM109菌经IPTG诱导培养后，收获细菌，在冰浴条件下以超声波裂菌，从而最大限度地保证了IA-2重组蛋白的完整性和免疫学活性。

4、获得的IA-2胞内段目的蛋白含374个氨基酸(包括IA-2的第606～979位氨基酸)。国外研究获得的IA-2胞内段蛋白包括第603～979、第604～979或第605～979位氨基酸。由于IA-2蛋白的抗原表位主要位于胞内段(第601～979位氨基酸)的羧基末端，因此其胞内段氨基端几个氨基酸的缺失不会显著影响获得的IA-2重组蛋白的免疫学活性。

5、经亲和层析纯化获得生物素酰化IA-2融合蛋白后，不再用酶将融合片段去掉，避免使IA-2融合蛋白的降解增加。可以直接以生物素酰化IA-2融合蛋白作为抗原，建立血清中IA-2抗体的链亲和素固相酶免检测技术。

采用本发明提供的这种重组人IA-2抗原的制备方法，使含重组质粒的大肠杆菌通过IPTG诱导的原核表达及亲和层析纯化，获得了高纯度、分子量约为59kDa的生物素酰化IA-2融合蛋白，每升菌液中蛋白的表达量达到毫克级。且表达产物与GAD65抗体(GADA)阳性的1型糖尿病患者混合血清及健康对照血清间发生的免疫印迹反应有显著性差异(P＜0.05)，表明原核表达的生物素酰化人IA-2胞内段融合蛋白具有免疫原性。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是以Trizol试剂抽提胎脑组织总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果的图谱。

图2是嵌套式PCR扩增人IA-2胞内段的编码基因。

图3-图9是Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建与鉴定。其中：

图3是Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的克隆策略示意图。

图4是T-A克隆的BamH I单酶切鉴定。

图5是部分T-A克隆的单酶切和双酶切鉴定。

图6是Pinpoint Xa-IA-2重组质粒的酶切及PCR鉴定。

图7是Pinpoint Xa-IA-2重组质粒测序图谱之一；

图8是Pinpoint Xa-IA-2重组质粒测序图谱之二；

图9是Pinpoint Xa-IA-2重组质粒测序图谱之三。

图10是IA-2原核表达产物及其纯化蛋白的变性SDS-PAGE分析。

图11是Western blot检测生物素酰化IA-2融合蛋白的亲和素显色反应图谱。

图12是IA-2重组蛋白免疫活性的dot-blot鉴定。

图13是IA-2重组蛋白免疫活性的dot-blot灰度扫描分析。

图1中，以Trizol试剂抽提得到的胎脑组织总RNA，其A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.8～2.0范围内，提示RNA的纯度较高。计算得RNA的浓度约为10μg/mL。总RNA经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析，可见28S rRNA和18S rRNA两条清晰的荧光条带，两者的比例约为2∶1，条带间荧光强度弱，表明RNA质量较好，可以用于RT-PCR。

图2是嵌套式PCR扩增人IA-2胞内段的编码基因图谱。图中泳道1：第一轮扩增产物；泳道2：第二轮扩增产物；泳道M：DL2000 DNA Marker。

以胎脑总RNA逆转录所得到的cDNA为模板进行第一轮扩增，产物大小约1.2kb；以第一轮PCR的部分反应物—产物混合物为模板进行第二轮扩增，得到了约1.1kb的片段，后者与预计目的序列(1132bp)长度一致。

图3-图9是Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建与鉴定。其中：

图3是Pinpoint Xa-IA-2重组质粒构建示意图。

经割胶纯化的第二次PCR产物与Pinpoint Xa-1 T质粒相连接(T-A克隆)，并转化感受态JM109细菌，经含氨苄青霉素的LB固体培养基筛选培养后，挑选10个细小的独立菌落，分别接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养并抽提质粒，先进行BamH I单酶切(图4)。

图中，泳道M：Lambda DNA/Hind III+EcoR I Marker；泳道1～10：1～10号质粒的BamH I单酶切结果。其中1、3、4、5、7和8号为目的片段插入方向颠倒的T-A克隆；2、6和10可能为目的片段插入方向正确的T-A克隆；泳道P：线状空白质粒DNA。

其中有六个质粒可切出目的基因片断，可能为目的片段插入方向颠倒的克隆。2号、6号和10号质粒只产生一个条带(比线状空白质粒滞后)，可能为目的片段插入方向正确的T-A克隆(外源DNA的BamH I位点与质粒的BamH I位点相邻)，接着对上述三个质粒进行BamH I和Bgl II双酶切(图5)，均产生两个条带：空白质粒平齐带和第二次PCR产物平齐带，从而得到进一步证实。选取其中的2号质粒DNA用BamH I消化后，进行自身连接，并再次转化及筛选后，得到表达型重组质粒。

图5中，泳道P′：第二次PCR产物；泳道2′、6′、10′：2号、6号和10号质粒用BamH I和Bgl II双酶切；泳道2、6、10：2号、6号和10号质粒用BamH I单酶切；泳道P：线状空白质粒DNA。

Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的鉴定：

空白质粒不论是经BamH I单酶切还是经BamH I和Bgl II双酶切后均得到长约3.3kb的单一片段(线状空白质粒DNA)；而重组质粒经BamH I单酶切后得到长约4.4kb的单一片段(线状重组质粒DNA)，经BamH I和Bgl II双酶切后得到长约3.3kb(线状空白质粒DNA)和1.1kb(外源目的DNA)两个片段。此外，以重组质粒DNA为模板，用嵌套式PCR的第二对引物进行扩增，产物与RT-PCR第二次扩增产物大小一致(图6)。提示目的DNA片段以正确的方向插入至质粒载体的多克隆位点。

图6中，泳道M₁：λ-EcoT14 I DNA Marker；泳道1：PinPoint Xa-1空白质粒DNA；泳道2：经BamH I单酶切消化的空白质粒DNA；泳道3：经BamH I和Bgl II双酶切消化的空白质粒DNA；泳道4：Pinpoint Xa-IA-2重组质粒DNA；泳道5：经BamH I单酶切消化的重组质粒DNA；泳道6：经BamH I和Bgl II双酶切消化的重组质粒DNA；泳道7：以Pinpoint Xa-IA-2重组质粒DNA为模板获得的PCR产物；泳道8：嵌套式PCR的第二轮扩增产物；泳道M₂：DL 2,000DNA Marker。

对重组质粒中插入片段及接合处附近的DNA进行序列测定。连续进行3个测序反应(图7～9)，共测到1645个核苷酸，其中包含的IA-2核苷酸数为1125个(第22～1146位核苷酸)。将此克隆到的IA-2序列与GenBank中人IA-2mRNA序列(序列号为L18983)进行同源性比较(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。结果表明：二者核苷酸序列完全一致(相当于IA-2 mRNA的第3013～1889位核苷酸)。且外源目的DNA与载体质粒接合处读码框架正确，无移码突变。

测到的核苷酸全长序列见序列表(Seq ID No：5)。图中的序列为重组质粒双链DNA的模板链，即反义链。

图10是IA-2原核表达产物及其纯化蛋白的变性SDS-PAGE分析：图10中，泳道M：蛋白分子量markers；泳道1：JM109宿主菌菌体蛋白泳道；泳道2：空白质粒菌菌体蛋白泳道；泳道3：未经IPTG诱导的重组质粒菌菌体蛋白泳道；泳道4：经IPTG诱导的重组质粒菌菌体蛋白泳道；泳道5：经亲和层析纯化的IA-2融合蛋白泳道。

将经IPTG诱导表达的重组质粒菌、空白质粒菌及宿主菌处理后，连同亲和层析洗脱产物一起上样，进行变性SDS-PAGE。发现重组质粒菌菌体蛋白泳道在66kDa附近较空白质粒菌及宿主菌泳道多出一蛋白条带。在洗脱产物泳道的这一水平位置上，也有一清晰的条带(图10)，此即为诱导表达的IA-2胞内段重组蛋白。用Quantity one软件分析表明融合蛋白的表观分子量为59kDa。在亲和层析洗脱产物泳道仅见这一59kDa的蛋白条带，未见其他条带，提示所获蛋白纯度较高。另外，通过Bradford法测定蛋白质浓度估计融合蛋白的表达效率约为0.5～0.6mg/L菌液。

图11是Western blot检测生物素酰化IA-2融合蛋白的亲和素显色反应图谱。图11中，泳道1：Pinpoint Xa-I-2重组质粒菌菌体蛋白泳道；泳道2：PinPoint Xa-1空白质粒菌菌体蛋白泳道；泳道3：JM109宿主菌菌体蛋白泳道。

含重组质粒菌、空白质粒菌和不含质粒的JM109细菌菌体蛋白经SDS-PAGE及电转移操作，使得蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，以TTBS封闭后与酶标亲和素发生结合，显色反应结果如图11所示。由于JM109宿主菌自身可合成一种生物素酰化的蛋白，因此不含质粒的JM109细菌菌体蛋白泳道上呈现表观分子量为22.5kDa的单一条带。含空白质粒的JM109细菌除了表达上述22.5kDa的蛋白外，还合成PinPoint^TM特有的生物素酰化标签肽(13kDa)。重组质粒菌泳道除了22.5kDa的蛋白条带，在59kDa的位置上也可见一条带，此即为生物素酰化IA-2融合蛋白。

图12是IA-2重组蛋白免疫活性的dot-blot鉴定。图12中，泳道1∶1∶100稀释的阴性对照血清；泳道2∶1∶100稀释的GADA阳性1型糖尿病混合血清；泳道3∶1∶200稀释的阴性对照血清；泳道4∶1∶200稀释的GADA阳性1型糖尿病混合血清。

图13是IA-2重组蛋白免疫活性的dot-blot灰度扫描分析。

以不同稀释度的GADA阳性混合血清及阴性对照血清作为一抗，与不同剂量的IA-2重组蛋白进行免疫印迹反应，显示IA-2蛋白与两组血清发生的显色反应有明显不同(图12)，两组灰度值的差异有统计学意义(P＜0.05，图13)。不同剂量的IA-2蛋白与GADA阳性血清的免疫反应呈剂量依赖性关系，表明所获IA-2重组蛋白具有免疫学活性。

具体实施方式

实施例1、

重组人IA-2抗原的制备方法，包括：

步骤1、从胎脑中克隆人IA-2胞内结构域(包括氨基酸606～979)的编码基因，以嵌套式PCR扩增该编码基因，实现Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建：

(一)总RNA的抽提和质量鉴定

取0.2g胎脑组织和2ml Trizol液加入无RNA酶的15ml离心管中，用电动匀浆器打成组织匀浆；将匀浆后的液体平分至两只无RNA酶的1.5ml Eppendorf管中，加入0.2ml氯仿后，用力振荡1分钟，室温静置5分钟；4℃ 10,000g离心15分钟；小心吸取上层水相，加与上层水相等体积的异丙醇至吸取的水相中，轻轻混匀后，室温静置5分钟；4℃ 10,000g离心5分钟，弃上清，以75％乙醇洗涤RNA沉淀；4℃ 10,000g离心5分钟，弃上清；将离心管置于真空干燥机中干燥约5分钟；以无RNA酶的去离子水溶解沉淀，得RNA原液；取一定量RNA原液，加入三倍体积的无水乙醇，-70℃保存。

RNA的纯度鉴定及定量分析：

将RNA原液稀释100倍后，以紫外分光光度计于260nm和280nm波长处测吸光度(A值)，求出A₂₆₀/A₂₈₀比值，并根据下列公式计算其浓度：

RNA原液浓度(μg/mL)＝A₂₆₀×40×稀释倍数

RNA电泳：

按《分子克隆实验指南》配制甲醛变性琼脂糖凝胶，并将RNA溶液变性后上样，100V恒压电泳约0.5小时后，于紫外灯下观察电泳结果，并摄影。

(二)cDNA的合成

以Oligo(dT)₁₅为引物，胎脑总RNA为模板进行cDNA第一链的合成。逆转录反应操作如下：

将ligo(dT)₁₅ 1.0μl、上步骤抽提得到的RNA 2.0μl、DEPC处理双蒸水9.0μl加入微量离心管中，混匀；短暂离心后，70℃水浴10分钟，冰上放置3分钟后，加入5×逆转录buffer 4.0μl、DTT 2.0μl、dNTP 1.0μl、混匀；42℃水浴2分钟后加入superscript II约为1.0μl，使总体积为20μl。按如下条件进行反应：

42℃，1小时；70℃，15分钟；4℃，5分钟；短暂离心后，-20℃贮存所获cDNA。

(三)PCR扩增及电泳鉴定

1.PCR引物设计和合成

根据Genbank公布的人IA-2mRNA序列，用Primer 3软件设计用于扩增IA-2胞内段cDNA序列的嵌套式PCR的两对引物，由上海基康生物技术公司合成。

第一对引物：上游序列(Pu)：5’-CATGCGCGGCAGCAAGACAAG-3’(SeqID No：1)

下游序列(Pd)：5’-GAGGAGTGGGTACACAGAGATGC-3’(Seq ID No：2)，拟扩增片断长度为1212bp。

第二对引物上游序列(Pu’)：5’-AT GGATCCAGCAAGACAAGGAGCGC-3’(划线部分为BamH I限制性酶切位点)(Seq ID No：3)

下游序列(Pd’)：5’-TCACTGGGGCAGGGCCTTGAG-3’(Seq ID No：4)，拟扩增片断长度为1132bp。

第二对引物与第一对引物内侧的序列配对，并且在上游序列的5’端加上了BamH I限制性内切酶的酶切位点，以利于确定外源目的DNA片断的插入方向。

2.嵌套式PCR的第一轮扩增

以胎脑总RNA的逆转录产物为模板，用第一对引物进行第一轮PCR。

反应体系：

           PCR-Grade H₂O                         17μl

           10×HF 2 PCR Buffer                    2.5μl

           cDNA template                          1.0μl

           10×HF 2 dNTP Mix                      2.5μl

           Pu(10μmol/L)                          0.75μl

           Pd(10μmol/L)                          0.75μl

           50×Advantage-HF 2 Polymerase Mix      0.5μl

           total volume                           25.0μl

反应条件：

                          94℃      3分钟

                         

                          72℃      3分钟

反应结束后，将扩增产物与适量6×Loading Buffer混匀，加样于1.0％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并通过凝胶图像分析仪进行拍照。

3.嵌套式PCR的第二轮扩增

以第一轮PCR的部分反应物—产物混合物为模板，用第二对引物进行第二轮PCR。

反应体系：

          PCR-Grade H₂O                          16.5μl

          10×HF 2 PCR Buffer                     2.5μl

          第一轮PCR的反应物-产物混合物(1∶10⁴)   1.0μl

          10×HF 2 dNTP Mix                       2.5μl

          Pu’(2μmol/L)                          1.0μl

          Pd’(2μmol/L)                          1.0μl

          50×Advantage-HF 2 Polymerase Mix       0.5μl

          Total volume                            25.0μl

反应条件：

                            95℃      3分钟

                           

                            72℃      3分钟

反应结束后，将扩增产物与适量6×Loading Buffer混匀，加样于1.0％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并通过凝胶图像分析仪进行拍照。

(四)第二次PCR扩增产物的割胶纯化

1.第二次PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，在长波紫外灯下，用无菌手术刀片迅速切下含目的DNA条带的琼脂糖凝胶块，置1.5mlEppendorf管中。

2.按每100g琼脂糖加入300μl S1液的比例加入S1液，置55℃水浴10分钟，每2分钟颠倒混匀一次。使琼脂糖完全溶化。

3.将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，10,000g离心1分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

4.向吸附柱中加入450μl W1溶液，静置1分钟，室温高速离心30秒，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。

5.向吸附柱中加入450μl W1液，高速离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管。

6.高速离心1分钟后，将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30μl T1液，静置1分钟后，高速离心1分钟，将回收的DNA贮存于-20℃备用。

取1μl纯化产物在1.0％琼脂糖凝胶下电泳，以明确纯化的效果并根据marker进行定量。

(五)Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建

1.Pinpoint Xa-IA-2 T-A克隆的构建(第一次转化)

(1)目的片段与载体的连接

目的片段与PinPoint Xa-1 T载体的最佳摩尔比值为4.5∶1，此时的连接效率最高。计算所需目的片段的量。按下列体系进行连接反应：

T4 DNA Ligase 10×Buffer             1μl

PinPoint Xa-1 T-Vector               1μl(约50ng)

第二次PCR的纯化产物                  2μl(约80ng)

T4 DNA Ligase(1～3 Weiss units/μl)  1μl

deionized water                      5μl

total                                10μl

反应条件：混匀后于15℃孵育16小时。

(2)质粒的转化

A.感受态细菌的制备

a：用铂丝蘸取-70℃冻存的E.coli JM109细菌，在LB平板上划线接种。然后将平板置于37℃保温16小时。

b：用无菌牙签挑取单菌落(约3mm)置于5ml LB培养基中，37℃，300rpm振摇16小时。

c：取1mL上述培养液接种到一含有100ml LB培养基的烧瓶中，37℃振摇培养3小时，测A600，待其值达到0.3～0.4时将烧瓶取出，立即置冰浴10分钟。

d：在无菌条件下将细菌转移到一消毒过的预冷的50ml离心管，4℃，4000rpm离心10分钟，弃去培养液，将离心管倒立于滤纸上1分钟使培养液流尽。

e：向离心管中加入10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，重悬沉淀的菌体，置冰浴30分钟。4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清液，将离心管倒立于滤纸上1分钟。

f.加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，轻轻重悬菌体。

g：将上述菌体置于4℃冰箱中，12～24小时内可用于质粒转化；或加入30％体积的甘油，分装于-80℃保存菌种。

B.质粒的转化

在一冰预冷的1.5ml Eppendorf管中，分别加入100μl感受态JM109细菌和4μl连接产物；冰浴10分钟；42℃水浴45～50秒；冰浴2分钟；加入900μl4℃的SOC液体培养基，混匀；37℃，150rpm振摇60分钟；将菌液涂布于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养平板上；平板于室温放置至液体被完全吸收；37℃倒放20小时

同时，以不含外源DNA序列的Pinpoint Xa-1 T质粒于相同条件下转化感受态JM109细菌。

(3)筛选含正向T-A克隆的大肠杆菌：

A.质粒的抽提：挑取上述LB平板上的单个菌落，接种于5ml含100mg/L氨苄青霉素的LB液中，37℃，200rpm振摇培养约12小时。

采用柱离心式质粒抽提试剂盒抽取质粒，操作如下：

取1.5ml细菌培养液于13,000rpm离心2分钟，弃上清；将沉淀悬浮于150μlB1缓冲液中，剧烈振摇；加入150μl B2缓冲液，温和颠倒5次；加入210μl B3缓冲液，立即温和颠倒5次；13,000rpm离心10分钟后，将上清转移到吸附柱内；静置1分钟，13,000rpm离心30秒后，弃液体；加入450μl P1缓冲液，13,000rpm离心30秒，弃液体；加入450μl W1洗涤液，13,000rpm离心30秒，弃液体；离心1分钟，弃液体；以30μl双蒸水洗脱，洗脱液保存于-20℃备用。

B.用限制性内切酶BamH I和Bgl II对上述质粒DNA进行单酶切或双酶切消化，以筛选出连接方向正确的T-A克隆。

a：以BamHI进行单酶切反应

反应体系：

                双蒸水                11μl

                10×Buffer E          2μl

                质粒DNA               6μl

                BamH I酶              1μl

                total                 20μl

反应条件：混匀、短暂离心后，37℃水浴2小时。

b：对目的DNA片断插入方向可能正确的T-A克隆用BamH I和Bgl II进行双酶切反应，以进一步鉴定之。

反应体系：

                    双蒸水              10μl

                    10×Buffer K        2μl

                    质粒DNA             6μl

                    BamH I酶            1μl

                    Bgl II酶            1μl

                    total               20μl

反应条件：混匀、短暂离心后，37℃水浴2小时。

根据质粒酶切的电泳结果初步筛选目的基因片段插入方向正确的T-A克隆。

2.Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建(第二次转化)

(1)上述筛选出的含有Pinpoint Xa-IA-2正向T-A克隆的JM109菌株，经扩大培养后，抽提质粒DNA，以BamH I酶切后，行琼脂糖凝胶电泳，并对含目的基因片断的线状质粒DNA进行割胶纯化。方法同上。

(2)将上述纯化后的含目的基因片断的线状质粒DNA进行自身连接反应体系：

  T4 DNA Ligase10×Buffer               1μl

  经BamH I酶切的T-A克隆质粒DNA          5μl(约100ng)

  T4 DNA Ligase(1～3 Weiss units/μl)   1μl

  deionized water                       3μl

  total                                 10μl

反应条件：混匀后于15℃孵育16小时。

(3)取4μl连接产物转化100μl感受态JM109细菌，操作同前。

(4)Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的筛选及鉴定

a：对重组质粒以BamH I和Bgl II进行单酶切消化或双酶切消化，根据酶切图谱初步鉴定。

b：以质粒DNA为模板进行PCR反应

反应体系：

                PCR-Grade H₂O             15.85μl

                10×PCR Buffer             2.5μl

                MgCl₂(25mmol/L)           2.0μl

                dNTP Mix(各2.5mmol/L)      2.0μl

                Pu’(2μmol/L)             1.0μl

                Pd’(2μmol/L)             1.0μl

                质粒DNA                    0.5μl

                TaKaRa Taq(5U/μl)         0.15μl

                total volume               25.0μl

反应条件：

                   95℃       3分钟

                  

                   72℃       10分钟

反应结束后，取PCR产物5μl进行琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶图像分析仪进行拍照。

c：重组质粒的测序分析

用ABI PRISM^TM 377 DNA自动测序图谱分析仪，以SP₆通用引物及设计的两条测序引物：5’-CCAGGTTCACCTCATATACG-3’(Seq ID No：6)和5’-AGGACGGGGTGC TGCTGT-3’(Seq ID No：7)，对重组质粒中的插入片段及接合处附近进行核苷酸序列分析。具体测序操作由上海基康生物技术公司完成。

采用BLAST软件将所测序列与GenBank中的IA-2mRNA序列进行比较，分析重组质粒中的插入片段和IA-2mRNA的同源性，并进一步分析重组子读码框架的正确性。

对重组质粒中插入片段及接合处附近的DNA进行序列测定。连续进行3个测序反应(图7～9)，共测到1645个核苷酸，其中包含的IA-2核苷酸数为1125个(第22～1146位核苷酸)。将此克隆到的IA-2序列与GenBank中人IA-2mRNA序列(序列号为L18983)进行同源性比较(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。结果表明：二者核苷酸序列完全一致(相当于IA-2mRNA的第3013～1889位核苷酸)。且外源目的DNA与载体质粒接合处读码框架正确，无移码突变。

测到的核苷酸全长序列见序列表(Seq ID No：5)。

(5)菌株的保存

将经过测序证实的含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株扩大培养至对数生长中期(A₆₀₀为0.4～0.5)，加入终浓度为30％体积的灭菌甘油，混匀后分装入0.5ml离心管，于-20℃至-70℃保存。

步骤2、IA-2重组蛋白的诱导表达，是将含重组质粒的JM109菌通过异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养，得到IA-2重组蛋白：

(一)IA-2重组蛋白的诱导表达

以接种环取-20℃保存的含表达型重组质粒的大肠杆菌JM109菌株在LB/氨苄青霉素培养平板上划线接种，于37℃培养过夜；挑取新鲜单个菌落接种于5ml含100mg/L氨苄青霉素的LB液中，37℃，200rpm振摇12小时，制得饱和菌液；将饱和菌液按1∶100的比例转接于5ml含100mg/L氨苄青霉素和2μmol/L生物素的LB液中，37℃振摇培养1小时；加入100mmol/L的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为100μmol/L，37℃，200rpm继续培养5小时。

同时按照相同条件培养不含外源DNA序列的Pinpoint Xa-1 T质粒(空白质粒)转化的JM109菌株；并按不加氨苄青霉素的其他相同条件，挑取不含质粒的JM109单个菌落进行对照培养。

(二)原核表达产物的变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定

取上述培养菌液各250μl于0.5ml的Eppendorf管中，10,000g离心5分钟后收集菌体沉淀。以50μl 1×SDS加样缓冲液重悬沉淀，95℃加热5分钟后进行变性SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)。采用变性SDS不连续凝胶电泳(Laemmli凝胶电泳法)。凝胶的配制：底层使用12％分离胶(4ml，含30％丙烯酰胺/0.8％亚甲双丙烯酰胺1.6ml、pH8.8的1.5mol/L Tris·Cl 1.0ml、10％SDS 40μl、10％过硫酸铵14μl、TEMED 3μl、ddH₂O 1.4ml)，灌注适当高度后，项层覆盖一层水饱和异丁醇，待胶聚合后以ddH₂O洗数次，吸干，再灌注3.9％积层胶(2ml，含30％丙烯酰胺/0.8％亚甲双丙烯酰胺0.266ml、pH 6.8的1.5mol/L Tris·Cl 0.5ml、10％SDS20μl、10％过硫酸铵10μl、TEMED 2μl、ddH₂O 1.22ml)，聚合后拔出梳子，以电泳缓冲液冲洗上样孔。上样后，先以80V电泳，待样品进入分离胶后，再以恒压100V电泳2小时。电泳结束后取出凝胶，经固定、考马斯亮蓝染色和脱色后，用Molecular Imager FX进行扫描，根据蛋白质标准品测定表达蛋白条带的表观分子量。

将胶用玻璃纸包裹后，置于干胶仪中，在80℃及抽真空的条件下处理2小时使胶彻底干燥后，于室温保存。

(三)生物素酰化IA-2融合蛋白的Western印迹分析

将重组质粒菌、空白质粒菌及JM109菌体蛋白等样品进行SDS-PAGE后，用蛋白电转移系统将凝胶中蛋白质转移至硝酸纤维素膜(NC)上，电转移缓冲液为25mmol/L Tris碱，192mmol/L glycine和20％methanol，100V电转移60分钟。再行以下操作：

将NC膜浸于TTBS封闭液(100mmol/L Tris·Cl，pH7.5；150mmol/L NaCl；0.05％Tween 20)中，室温轻摇1小时；将NC膜放入用TTBS以1∶5000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的链亲和素液体中，室温轻摇30分钟；用TTBS洗膜，5分钟×3次；以去离子水快速冲洗NC膜后，将膜浸于AP底物溶液中显色；条带显示清楚后以去离子水冲洗，终止反应；将NC膜干燥保存并摄影。

步骤3、IA-2重组蛋白的分离、亲和层析和透析纯化，获得生物素酰化IA-2融合蛋白。

(一)重组质粒菌的收获和裂解

以上述条件诱导培养6L重组质粒菌液，4℃ 8,000g离心10分钟，收集细菌沉淀，称湿重后，将细菌裂解。具体操作如下：

每克细菌湿重加入10ml细菌裂解buffer(50mmol/L Tris·Cl，pH8.0；100mmol/L NaCl；1mmol/L EDTA)于4℃重悬细菌沉淀；将菌液分装入10ml小烧杯中，于4℃冰浴中以Soniprep 150型超声细胞破裂仪充分裂解细菌；4℃10,000×g离心15分钟，吸取上清，贮于-20℃。

(二)亲和层析

按Softlink^TM Soft Release亲和素树脂说明对树脂进行预处理后，以上述细菌裂解buffer作为平衡buffer对树脂进行平衡；将细菌裂解上清液与树脂混合，于4℃缓慢搅动过夜，吸弃上清；以10倍树脂体积的平衡buffer洗柱，吸弃上清，重复3次；加入2倍树脂体积的含5mmol/L生物素的平衡buffer，4℃间歇晃动过夜，以竞争性洗脱生物素酰化融合蛋白；吸取上清，贮于-20℃，并重复洗脱2次；将树脂再生后，于4℃保存。

(三)纯化蛋白的透析

(1)透析膜的准备

a：将透析膜在过量的10mmol/L NaHCO₃溶液中湿润并煮沸5分钟。

b：将透析膜在10mmol/LNa₂EDTA溶液中煮沸5分钟，并重复1次。

c：将透析膜用蒸馏水冲洗数次，放于20％～50％的乙醇溶液中于4℃贮存。

(2)透析

a：将保存于乙醇中的透析膜用蒸馏水冲洗3次。

b：将膜一端用棉线扎牢，用水试过不漏后，加入待透析蛋白约10ml，再用棉线扎紧膜的另一端，立即放入盛有400ml细菌裂解缓冲液的烧杯中，4℃缓慢搅动。同样制成另一透析袋，容量约10ml。

c：每4小时更换烧杯中的缓冲液1次，共换液5次。

d：回收透析后的蛋白样品。取1ml留作鉴定用，其余在冷冻干燥机中制成干粉，于-20℃保存。

(四)纯化蛋白的浓度测定及纯度鉴定

取透析后的未浓缩的蛋白溶液，用Bradford法测定蛋白的浓度。

(1)在两组1.5ml Ependorf管中各加入0.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)5，10，15和20μl，并以0.15mmol/L NaCl补足至100μl，同时以两管100μl的0.15mmol/L NaCl作空白对照。

(2)每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。

(3)用紫外分光光度计以1cm光径的微量比色杯测A₅₉₅，取A₅₉₅吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线。

(4)另取两管各加入待测蛋白样品20μl，同上方法测量A₅₉₅，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。

纯度鉴定：

以SDS-PAGE(12％的分离胶和3.9％的浓缩胶)和考马斯亮蓝染色对纯化的蛋白进行分子量及纯度鉴定。方法同前。

(五)重组IA-2蛋白免疫原性的dot-blot鉴定

1.将硝酸纤维素膜用TBS(100mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl)湿润后，装好dot-blot装置，每孔加100μl TBS后抽真空。

2.将纯化后的不同量的IA-2蛋白及对照蛋白BSA加至相应的孔中，室温自然沉降约2小时。

3.每孔加100μl TBS后抽真空。

4.每孔加100μl含1％BSA的TTBS(TBS加0.1％Tween 20)液封闭，重力自然沉降1小时。

5.每孔加100μl TBS后抽真空，重复两次。

6.各孔加入以1％BSA-TTBS稀释的阳性血清或对照血清50μl，室温自然沉降1小时。

7.每孔加100μl TTBS后抽真空，重复三次。

8.每孔加1∶2500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG50μl，室温自然沉降1小时后抽真空。

9.每孔加100μl TTBS冲洗二次后，再用100μl TBS冲洗二次，分别抽真空。

10.拆开dot-blot装置，将膜取下，用DAB溶液显色。流水冲洗终止反应。

将所得的硝酸纤维素膜以Quantity one软件进行灰度扫描分析，计算阳性血清与阴性对照血清各点的灰度值并以配对t检验比较。

以不同稀释度的GADA阳性混合血清及阴性对照血清作为一抗，与不同剂量的IA-2重组蛋白进行免疫印迹反应，显示IA-2蛋白与两组血清发生的显色反应有明显不同(图12)，两组灰度值的差异有统计学意义(P＜0.05，图13)。不同剂量的IA-2蛋白与GADA阳性血清的免疫反应呈剂量依赖性关系，表明所获IA-2重组蛋白具有免疫学活性。

序列表

<110>上海市内分泌代谢病研究所

<120>重组人IA-2抗原的制备方法

<160>7

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套式PCR第一轮扩增第一对引物上游序列(Pu)。

<400>1

catgcgcggc agcaagacaa g 21

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套式PCR第一轮扩增第一对引物下游序列(Pd)。

<400>2

gaggagtggg tacacagaga tgc 23

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套式PCR第二轮扩增第二对引物上游序列(Pu’)。

<400>3

atggatccag caagacaagg agcgc 25

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌套式PCR第二轮扩增第二对引物下游序列(Pd’)。

<400>4

tcactggggc agggccttga g 21

<210>5

<211>1645

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)...(1533)

<223>该部分的互补序列为重组融合蛋白的编码序列。

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)...(1146)

<223>扩增的IA-2序列。

<400>5

ggccgcccgg gagatctgat ttcactgggg cagggccttg aggatggcat tcacttcctc 60

cgccacggct gtcagggcaa attcaaactg gtccttagag cggacaaggc caggccgctg 120

gtcacggaca tgctccaggg tggcagcgat gtcaatctcc ttcactcctt ttgccatgcg 180

gttcaggacc atgtcgatga ggatgtaggt gccggtcctc cccgcaccat cactgcagtg 240

cacgatgatg gggcaggagc ggccccggta gcacttgttc accttcctgc ggaagtccag 300

caggggccgc gtggaggccg gtgtgccctc tgccggccag ctgaggaagt ggaactgcgt 360

gagcgtgcgc gtctcctggg tctgcacgtt cttcaggtag aagctccgca ccagaaagtc 420

ctcgcaccag atgtgctccg acaccaggtt cacctcatat acgtggtaga gggaggcacc 480

ctcatctggc cagtagcggt cacactgctt gacaccatcc tccaccagcg gggtcagcat 540

gacgatgacg gtgcagccgc tctcccacac catctgccag aagtctgcga tggtatggga 600

cagcgggccc tgcgtggcta tgtaggctgg catccgaggg tcatgctcaa taatggggct 660

ggcgttgatg taatcgctcc gagaagggct gctctccacc ttcagtttta tgcgggcatg 720

gtcatagggc aggaagtcag gatgccggtt ctttttgatg ttgccctccc cctgcgcggt 780

ggcacaggtg tttggctctg cttggtaggc acagagggcc tgccactcct tggcaaggcg 840

gtcccggttc cgcaggtgat cctccatgta tgccagaatc atgtgtcccg tggagatgtc 900

catgttggct tgggccggct cctcgcacca ggacggggtg ctgctgtggg agctggggct 960

ggcctgggct gcgtcgctga actgggagga cacactgctc acccgtgaag gctccggtgg 1020

accctctgcc cggttgaaca aggacttcgt ggccatgtgc tggcggcaca ggtcctggta 1080

ctcaaaggta gtgtcaccat gggccccctc aggccccagg gctgccaggc gctccttgtc 1140

ttgctggatc ccagctgaag cttcgcgacc ttcgatgagc tcgagatccc cgatcttgat 1200

gagaccctga ccgccctgca ccgcgtcacg ctccttgacc aggaccttct cgaccttgcc 1260

gtcggtggga gcgttgatct cggtctccat cttcatggcc tcgagaacga gcacggtctg 1320

accagccttg accgtgtcac cctccttcac gaggatcttg gagacggtgc cggccagcgg 1380

agcgggaatc tcgccctctc cggccttacc ggcgcctgcg ccacctgctg ccggtgccgg 1440

cgcgccgccg gtgccgccgc cgaaagggat ggtgcccatc gggttttcgt gtgacttgtc 1500

gacgtcaacg tcaacgtcat acgcagtgcc gttgactgtt accttcagtt tcatgtgagt 1560

tactcccgga tcaacgaatg gaatggttct gcagccaagc tgggaattct gtttcctgtg 1620

tgaaattggt atccgctcac aattc 1645

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的测序引物。

<400>6

ccaggttcac ctcatatacg 20

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>设计的测序引物。

<400>7

aggacggggt gctgctgt 18

Claims (7)

1、重组人IA-2抗原的制备方法，包括步骤1：IA-2表达型重组质粒的构建；步骤2：IA-2重组蛋白的诱导表达；步骤3：IA-2重组蛋白的分离、亲和层析和透析纯化；其特征在于：

所述的步骤1是从胎脑中克隆人IA-2胞内结构域(包括氨基酸606～979)的编码基因；以嵌套式PCR扩增该编码基因，实现Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建；

所述的步骤2是将含重组质粒的JM109菌经IPTG诱导培养，得到IA-2重组蛋白；

所述的步骤3是将IA-2重组蛋白经分离、亲和层析和透析纯化，获得生物素酰化IA-2融合蛋白。

2、根据权利要求1所述的重组人IA-2抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤1中，总RNA的抽提采用取胎脑组织和Trizol液加入无RNA酶的离心管中，匀浆；加氯仿，振荡，离心，取上层水相，加入等体积异丙醇混匀，离心，弃上清，以75％乙醇洗涤RNA沉淀；干燥；以无RNA酶的去离子水溶解沉淀，得RNA原液；取RNA原液，加入三倍体积的无水乙醇，-70℃保存；

cDNA的合成以Oligo(dT)₁₅为引物，胎脑总RNA为模板进行cDNA第一链的合成；

嵌套式PCR的第一轮扩增，以胎脑总RNA的逆转录产物为模板，用第一对引物进行第一轮PCR：

第一对引物上游序列(Pu)具有Seq ID No：1的核苷酸序列，其下游序列(Pd)具有Seq ID No：2的核苷酸序列；

拟扩增片断长度为1212bp；

嵌套式PCR的第二轮扩增，以第一轮PCR的部分反应物—产物混合物为模板，用第二对引物进行第二轮PCR：

第二对引物上游序列(Pu’)具有Seq ID No：3的核苷酸序列，其下游序列(Pd’)具有Seq ID No：4的核苷酸序列；

拟扩增片断长度为1132bp；

第二对引物与第一对引物内侧的序列配对，并且在上游序列的5’端加上了BamHI限制性内切酶的酶切位点；

第二次PCR扩增产物进行割胶纯化，纯化的DNA贮存于-20℃；

Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建，包括Pinpoint Xa-IA-2 T-A克隆的构建(第一次转化)和Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建(第二次转化)：

Pinpoint Xa-IA-2 T-A克隆的构建(第一次转化)：将目的片段与PinPoint Xa-1T载体连接，连接产物转化感受态JM109细菌；筛选出含正向T-A克隆的大肠杆菌；

Pinpoint Xa-IA-2表达型重组质粒的构建(第二次转化)：从上述筛选出的含正向T-A克隆的JM109菌株，抽提质粒DNA，割胶纯化；获得的含目的基因片断的线状质粒DNA进行自身连接；连接产物转化感受态JM109细菌；

将含重组质粒的大肠杆菌JM109菌株扩大培养至对数生长中期，与灭菌甘油混匀，终浓度为30％，于-20℃至-70℃保存。

3、根据权利要求1、2所述的重组人IA-2抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤2是将上述含表达型重组质粒的大肠杆菌JM109菌株在LB/氨苄青霉素培养平板上划线接种，培养过夜；挑取新鲜单个菌落接种于氨苄青霉素的LB液中，制得饱和菌液；再转接于氨苄青霉素和生物素的LB液中，振摇培养；加入IPTG，诱导培养，得到诱导培养重组质粒菌液。

4、根据权利要求3所述的重组人IA-2抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤2是以接种环取-20℃保存的含表达型重组质粒的大肠杆菌JM109菌株在LB/氨苄青霉素培养平板上划线接种，于37℃培养过夜；挑取新鲜单个菌落接种于5ml含100mg/L氨苄青霉素的LB液中，37℃，200rpm振摇12小时，制得饱和菌液；将饱和菌液按1∶100的比例转接于5ml含100mg/L氨苄青霉素和2μmol/L生物素的LB液中，37℃振摇培养1小时；加入100mmol/L的异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为100μmol/L，37℃，200rpm继续培养5小时；得到诱导培养重组质粒菌液。

5、根据权利要求1、2所述的重组人IA-2抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤3是将上述诱导培养重组质粒菌液离心，收集细菌沉淀，在冰浴条件下，以超声波裂菌；离心，吸取上清菌体蛋白，贮于-20℃；

亲和层析在Softlink^TM Soft Release亲和素树脂进行，得到的生物素酰化IA-2融合蛋白置于透析膜中，放入细菌裂解缓冲液中，透析；透析纯化获得的生物素酰化IA-2融合蛋白溶液冻干，于-20℃保存。

6、根据权利要求3所述的重组人IA-2抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤3是将上述诱导培养重组质粒菌液离心，收集细菌沉淀，在冰浴条件下，以超声波裂菌；离心，吸取上清菌体蛋白，贮于-20℃；

亲和层析在Softlink^TM Soft Release亲和素树脂进行，得到的生物素酰化IA-2融合蛋白置于透析膜中，放入细菌裂解缓冲液中，透析；透析纯化获得的生物素酰化IA-2融合蛋白溶液冻干，于-20℃保存。

7、根据权利要求4所述的重组人IA-2抗原的制备方法，其特征在于所述的步骤3是将上述诱导培养重组质粒菌液离心，收集细菌沉淀，在冰浴条件下，以超声波裂菌；离心，吸取上清菌体蛋白，贮于-20℃；

亲和层析在Softlink^TM Soft Release亲和素树脂进行，得到的生物素酰化IA-2融合蛋白置于透析膜中，放入细菌裂解缓冲液中，透析；透析纯化获得的生物素酰化IA-2融合蛋白溶液冻干，于-20℃保存。

Images