CN1481440A - 活性微生物的侦测方法 - Google Patents

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Abstract

侦测及计算活性微生物的方法。提供一种液态混合物，其包含一种或以上包封在液态溶胶－凝胶前体中的标记。在透明薄片涂上一层薄而均匀的液态溶胶－凝胶前体混合物，将样本通过过滤器，把微生物从液态样本分开，以作分析，然后把过滤器紧贴涂上溶胶－凝胶的薄片，将过滤器和涂上溶胶－凝胶的薄片放置在适合助长微生物吸收标记的温度，一起培养一段时间，以外界能源照射涂上溶胶－凝胶的薄片，以产生为微生物所吸收的标记所发放可侦测的讯号，取得从微生物发出可侦测讯号的图象，并以电子计算机系统分析图象，从而识别和计算微生物。

Description

活性微生物的侦测方法
技术领域
本发明涉及一种利用包封在多孔溶胶—凝胶的玻璃中的有机或无机物质来快速侦测及计算低浓度活性微生物的方法及其混合物。
背景技术
微生物侦测研究的主要目的在于发展便宜、快捷、可靠和灵敏的侦测器。现时已有可侦测微生物的标准实验室程序，大部份程序基于利用琼脂媒体，在一段时间内让指定微生物在其中生长。正常培养期为24至48小时，微生物繁殖后便可进行识别和量化。
现有测试的主要弊端在于得到结果所需的时间。水源染菌令水源和系统关闭，因此需使用其它更昂贵的水源供应，需要快速的微生物侦测以容许较短的关闭期。在医学界，任何需要使用抗生素药物的医疗情况都需要进行细菌识别和抗生素敏感测试，但测试结果需要72至96小时才能得到，缩短这段时间可达至更佳结果，并能令病人更早康复。在饮食业，原料和制成品都会进行常规染菌测试，测试所需的培养时间令实时处理过程无法进行，以致延迟货品的生产和供应，缩短测试所需时间可节省结构和人手。
过去几年发展出几种能在1.5至11.0小时内识别和计算细菌的方法。较为简单的方法需要大量细菌(在一毫升样本内多于104)，而可以侦测小量细菌的方法则昂贵、又不能应用于大型系统。
US 5,811,251公开了一种以电荷藕合组件(CCD)系统为基础的活性微生物计算系统，但这个系统只能提供细菌的总数，而不能分辨不同的细菌种类。US5,972,641和US 5,518,894公开一种用统计方法来确定细菌数量的快速大肠杆菌测试系统，该等方法用于低数量细菌时需要多达11小时才能得到结果。其它专利公开用荧光和激光光源来侦测微生物的方法(US 5,891,394、US 5,858,697、US5,763,203、US 5,751,839和US 5,663,057)，该等方法的缺点是需用昂贵的激光光源，而且直接在不平滑的过滤器上侦测微生物在分析时引起问题。另外，这些系统不可轻易携带，价钱亦较昂贵。
免疫测定法亦用于侦测某类微生物(Lee et al.，App.Environ.Microbiol.，Vol.56，pp.1541-1546)。这些方法利用以荧光或放射性染料标示的指定抗体来侦测微生物。不过，免疫测定法的限制在于其需要为每种欲侦测微生物生产抗体，以致需时甚久，而且价钱昂贵。
「溶胶—凝胶」指在室温以金属氧化物为基础所生产的无机玻璃，其工序涉及一些陶瓷性物料，令溶胶(液态)经过水解、凝聚及聚合过程转变为凝胶。一般溶胶—凝胶的起始物料为有机改性硅盐(ormosils)或金属氧化物。近年溶胶—凝胶已应用到有机硅烷中来创造「室温玻璃」。溶胶—凝胶性物料以数十埃至数十纳米的小孔所组成，并具有大的面积质量比例，例如：每克数百平方米。溶胶—凝胶物料即使在紫外线波长下都是透明的，并可简易地造成不同形状，如粉末、单块、薄片、纤维等。
利用溶胶—凝胶物料在矩阵媒体中包封有机分子的方法曾在现有文献中提及(Avnir et al.，Supramolecular architecture in two and three dimensions Bein T.(ed.)American Chemical Society Symposium Series XXX，1992)。应用上述技术，有机分子在室温下会被包封在溶胶—凝胶矩阵之中，并且不会损害较敏感的有机分子结构。加上，被包封的分子保留了接近全部的原本物理和化学特征，而溶胶—凝胶的大量小孔系统亦令外界的反应物可与之接触。
US专利号6,022,748公开一种利用分析物选择性粘结至某平面而产生的颜色变化以直接侦测分析物的方法。所述侦测方法在固定化生物聚合物料中进行，该物料以溶胶—凝胶方法包封在金属氧化玻璃之中，这种方法的缺点在于只可侦测或计算大量细菌，因为只有大量细菌才能在溶胶—凝胶中引起可看见的颜色改变。再者，所述方法不能分辨活性微生物及非活性微生物，因为该方法只是基于微生物粘结在溶胶—凝胶表面的情况，与所述微生物为活性或非活性没有关系。
Armon et al.(J.of Biotechnology 51，279-285)公开了一种侦测大量大肠杆菌(E.coli)的方法，该方法把细菌散布在涂上指定混合物的溶胶—凝胶上，所述混合物会被细菌吸收，令细菌发出特定波长的光。不过，这种方法不能提供一种适合计算指定样本中细菌数量的方法，而且亦不能侦测低数量微生物。
现有技术未能提供一种既快速、又有足够灵敏度在低微生物浓度的情况下可靠计算微生物数量的方法。
本发明的目的在于提供一种快速及灵敏的侦测活性微生物的方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于计算低浓度样本中微生物数量的方法及其混合物。
本发明的其它目的及长处会在以下说明中显示。
发明内容
本发明的目的是在2小时内以包封在多孔溶胶—凝胶的玻璃中的有机或无机物质(以下简称为标记)来侦测及计算浓度低于103ml-1的活性微生物。
本发明涉及利用包封在多孔溶胶—凝胶的玻璃中的有机或无机物质(标记)来侦测及计算活性微生物的方法及其混合物。微生物使所述标记新陈代谢，从而发出可侦测到的辐射、电磁或荧光，因此，活性微生物可快速地在溶胶—凝胶玻璃上呈现。溶胶—凝胶玻璃的表面极度平滑和透明，能提供接近统一的焦点作高解像的显微扫描。
根据本发明的优选实施例，会进行以下步骤：
a)提供一种液态混合物，其包含一种或以上包封在液态溶胶—凝胶前体中的标记；
b)在透明薄片上，例如：玻璃片上，加上一层薄而均匀、为所述液态溶胶—凝胶前体混合物的涂层；
c)将被分析的液态样本倒进过滤器以分出微生物，然后把所述过滤器紧贴涂上溶胶—凝胶的薄片；
d)把上述过滤器和上述涂上溶胶—凝胶的薄片放置在适合助长微生物吸收标记的温度，如摄氏35至44度，一起培养一段时间，如0.5至6小时；
e)以外界能源照射上述涂上溶胶—凝胶的薄片，以产生从微生物使标记新陈代谢过程中发放可侦测的讯号；及
f)取得上述从微生物发出可侦测讯号的图象，并以电子计算机系统分析所述图象，从而识别和计算所述微生物。
本发明亦关于一种含有机或无机物质的液态溶胶—凝胶混合物(标记)的制备方法。所述标记会为要识别的微生物新陈代谢。
本发明可侦测的大肠杆菌为一大组别的细菌，包括大肠杆菌(E.coli)、肠肝菌属(Enterobacter spp.)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella spp.)和柠檬酸细菌属(Citrobacter spp.)。识别大肠杆菌，可利用呈荧光或显色物质，即3-羰基伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(3-carboxyumbelliferylβ-D-galactopyranoside/CUG)或4-氯甲基-6，8-二氟伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-chloromethyl-6，8-difluoroumbelliferylβ-D-galactopyranoside/CMDiFUG)，来侦测酵素，即β-半乳糖酵素(β-Galactosidase/E.C.3.2.1.23)的活动。
根据本发明，识别大肠杆菌(E.coli)，可利用下列呈荧光或显色物质：4-甲基伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-methylumbelliferylβ-D-galactopyranoside/MUG)、二β-D-半乳糖嘧喃糖荧光素(fluorescein diβ-D-galactopyranoside/FDG)、6，8-二氟-4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖-酸锂盐(6，8-difluoro-4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide，lithium salt/DiFMUGGIcU)、2-十二烷基resorufin(2-dodecylresorufin)、Elf-97、二β-葡萄糖-酸荧光素(fluorescein di-β-glucoronide/FDGIcU)、5-(五氟苯氨基)二β-D-葡萄糖-酸荧光素(5-(pentafluorobenzoylamino)fluorescein di-β-D-glucoronide/PFB-FDGIcU)和β-三氟甲基伞形酮β-D-葡萄糖-酸(β-trifluoromethylumbelliferylβ-D-glucoronide)，来侦测大肠杆菌指定酵素(E.coli-specific-enzyme)，即β-葡萄糖酸酵素(β-Glucuronidase/GUS/EC 3.2.1.31)的活动。
根据本发明另一项优选实施例，把一种抗生素物料与溶胶—凝胶混合物结合，以识别细菌对抗生素的抵抗力。细菌在某特定抗生素存在的环境下仍能发出荧光，表示所述细菌可抵抗抗生素。当某特定抗生素的存在令部份发出荧光的细菌数量减低，便表示细菌有部份抵抗力。下列抗生素会加入溶胶—凝胶混合物：氯霉素、红霉素、四环素、链霉素、多粘菌素、萘啶酸、新生霉素、三甲基苄二氨嘧啶、Rifanapicin和青霉素。
根据本发明，标记可为以下列形式：脂质体、薄膜、多层物、辫子状、片晶体、螺旋状、管状、及纤维状、溶剂化杆、溶剂化卷、以及其组合。根据本发明，把丙酮酸盐或硫酸钾结合溶胶—凝胶，有可能侦测受损或受压的微生物。现有技术指出丙酮酸盐或硫酸钾可用作恢复或改善氯化受损大肠菌(＂enumeration anddifferentiation of chlorine-stressed total coliform bacteria＂Robert A Duncanson-Ph.D.dissertation-University of Rhode Island 1993)。
根据本发明，在溶胶—凝胶溶液加入浓度介乎每百万10至100份的聚赖氨酸或相似物质，有可能增进细菌吸收力。
以下优选实施例更具体地说明本发明的上述及其它特征及其优点，但本发明不受这些实施例所限制。
附图说明
图一显示根据本发明优选实施例的识别和计算微生物系统；
图二为一幅在溶胶—凝胶表面的大肠杆菌(E.coli bacteria)放大四百倍的荧光照片；
图三为本发明优选实施例的过程流程表。
具体实施方式
根据一优选实施例，计算细菌的系统包括图一所示的下列部件：配合电子计算机的标准影象撷取器、处理及控制软件、以及马达和光源控制仪器—全部以(1)标示，配以影象播放速率为30fps及影幅大小为640×480的标准电荷藕合组件数组(CCDarray)照相机(2)，以及配以放大400倍及/或1000倍功能及自动对焦系统的外荧光或荧光显微镜(3)，光源(4)，光线分散器(5)，机动x-y桌(6)，以及放在桌上的过滤器(7)。
根据本发明的另一优选实施例，标准电荷藕合组件(CCD)系统被电荷藕合组件连线方法(CCD Line Approach)取替，其包括一个电荷藕合组件连线(CCD line)相机，其线大小为512像素，线速率为70kHz，相等于每秒135格512×512像素、特制讯号同步化硬件、特制数码或模拟讯号处理硬件。
为求清楚，并协助理解本发明，以下将采用下列简称：CFU：菌落形成单位MUG：4-甲基伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-methylumbelliferylβ-D-galactopyranoside)FDG：二β-D-半乳糖嘧喃糖荧光素(fluorescein di-β-D-galactopyranoside)CUG：3-羰基伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(3-carboxyumbelliferylβ-D-galactopyranoside)
                              例1
                    预备涂上溶胶—凝胶玻璃薄片
把标准显微镜用的薄片在肥皂水中温和地摇晃三十分钟，以作清洗。然后先以水喉水冲洗薄片，再以三重蒸馏水冲洗。把薄片放在培养器内以摄氏36度隔夜风干。把洁净过的薄片存放在软的纸中备用。
预备溶胶—凝胶薄片的标准起始溶液如下：把0.9毫升纯吡啶、0.2毫升CUG溶液(100mM)和0.1毫升水以一块小磁铁搅拌一分钟。如果基质未能完全溶解，便只使用混合物的上面部份。把0.8毫升上述溶液和0.4毫升甲基三甲氧基硅烷(methyltrimethoxysilane/MTMS，Fluka)混和。再以磁铁搅拌器把所述溶液搅拌2分钟。要开始化学反应，在所述溶液中加入30μl 0.1摩尔的盐酸，再以磁铁搅拌五分钟。
利用精细吸移管把40μl的上述溶液涂在薄片上。溶液以旋转涂复法均匀地涂在薄片上。然后把已涂溶液的玻璃薄片置在黑暗、干燥的室温环境中风干24小时。在初部风干程序后，以锡纸包好有涂上溶胶—凝胶的薄片，并储存于清凉的地方。
                               例二
使用0.1毫升浓度为0.016mg/ml的4′-6-二氨基-2-苯基-吲哚(4′-6-diamino-2-phenylindole)溶液重复例一。所得结果与例一相若。
                               例三
                    大肠杆菌(E.coli)识别及计算
在摄氏36度的营养发酵液中，在24小时内，大肠杆菌(E.coli)细菌生长。用灭菌蒸馏水准备约每毫升108细菌浓度的种菌溶液。以下列预计细菌浓度，准备一系列不同的溶液(每份溶液为350毫升)：每100毫升109细菌，每100毫升108细菌，每100毫升107细菌，每100毫升106细菌，每100毫升105细菌。
所有细菌溶液在水样下进行平行膜滤(MF)测试查证，在灭菌塑料瓶中以灭菌蒸馏水稀释溶液，以准确达到1∶108的稀释度。
为了在某一样本中计算细菌数目，水样先以微孔过滤器(0.47μm，13mm)过滤。然后把微孔过滤器倒转放在溶胶—凝胶表面。为了要令过滤器和溶胶—凝胶彼此完全接触，过滤器表面会加上小量灭菌水(10μl)和压力(达每平方厘米0.5公斤)。
然后，细菌和溶胶—凝胶会在摄氏36度的湿润容器(由一个大皮氏培养皿和湿润的Wattman垫组成，以防止过滤器干燥而与溶胶—凝胶分离)一起培养两小时。之后，拿走微孔过滤器，薄片则在摄氏44.5度摆放10至15分钟风干。
为计算细菌，溶胶—凝胶薄片会在显微镜系统(配以外荧光照明系统和50瓦水银灯的Zeiss Axiolab)下以LP420过滤器放大400倍。为淘汰可能造成错误阳性结果的自然荧光藻类，会使用指定光波长(例如：LP420过滤器)。
荧光点的照片会在涂上溶胶—凝胶薄片的5个不同的随机位置拍摄。图二为溶胶—凝胶表面上的大肠杆菌(E.coli)细菌放大400倍的图片。荧光点的数目会以图像处理软件(Image-Pro Plus，Media Cybernetics)计算。表一显示分析得出的数目。
表一：
测试号码 最初大肠杆菌数目(CFU/1ml) 图片号码  荧光点数目(单位)  估计细菌数目(CFU/1ml)  平均细菌数目(CFU/1ml)
1  106  12345  550500600575525  980,000890,0001,070,0001,020,0001,110,000 1,014,000
 2  105  12345  5756505862  83,00099,00089,000103,000110,000 96,800
 3  104  12345  56853  8,90010,70014,2008,9005,300 9,600
由于已知显微镜的视象范围，每块薄片的荧光点数目能准确估计原本溶液中的细菌最初数量。
                              例四
            以Image-Pro Plus计算荧光点数目的算法说明
此例说明侦测及计算溶胶—凝胶图像上的细菌的算法。本算法的目的在于侦测预期大小的明亮斑点：采用低通行的过滤以减少高频率噪音，利用图像分割得出黑色背景上白色细菌斑点的二元图像，此图像分割以简单的界限应用程序，并利用固定的预早设定界限进行。
分析包括以下步骤：
A)把二元图像标记，以造成一列小块物体，亦即是可能被标为细菌的候选物。
B)计算该列小块组件的几何特性(面积、对比等)。
C)淘汰大小及对比不在预期范围内的候选物。
D)计算几何过滤后余下的候选物。
图三表示上述算法的流程例子，其中包括以下阶段：
第一阶段：低通行的过滤以减少高频率噪声。
第二阶段：利用图像分割以得出黑色背景上白色细菌斑点的二元图像，此图像分割以简单的界限应用程序，并利用固定的预早设定界限进行。如有需要，可采用自动和/或动态的界限计算。
第三阶段：把二元图像标记，以造成一列小块物体，亦即是可能被标为细菌的候选物。
第四阶段：计算该列小块组件的几何特性(面积、对比等)。
第五阶段：淘汰大小及对比不在预期范围内的候选物。
第六阶段：计算几何过滤后余下的候选物。
为说明本发明，上述皆为指定的实施例，但实际上本发明可为有经验的技术人員所应用，而得出不离开本发明精神及不超越本发明权利范围的多种改进、变动和改编。

Claims (14)

1.一种侦测及计算活性微生物的方法，包括：
a)提供一种液态混合物，其包含一种或以上包封在液态溶胶—凝胶前体中的标记；
b)在透明薄片上，例如：玻璃片上，加上一层薄而均匀、为所述液态溶胶—凝胶前体混合物的涂层；
c)将被分析的液态样本倒进过滤器以分出微生物，然后把所述过滤器紧贴涂上溶胶—凝胶的薄片；
d)把上述过滤器和上述涂上溶胶—凝胶的薄片放置在适合助长微生物吸收标记的温度，一起培养一段时间；
e)以外界能源照射上述涂上溶胶—凝胶的薄片，以产生为微生物所吸收的标记所发放可侦测的讯号；及
f)取得上述从微生物发出可侦测讯号的图象，并以电子计算机系统分析所述图象，从而识别和计算所述微生物。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述微生物为细菌。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述能源为可见的光、荧光、紫外光、红外线、电磁场、声纳、超声波、无线电波、或辐射短波。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述微生物与水、奶、食物、唾液、尿液、喉咙分泌物测试、创伤、痰、胃物及排泄物分隔。
5.根据权利要求1的混合物，其特征在于：所述标记由3-羰基伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(3-carboxyumbelliferylβ-D-galactopyranoside)、4-氯甲基-6，8-二氟伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-chloromethyl-6，8-difluoroumbelliferylβ-D-galactopyranoside)、4-甲基伞形酮β-D-半乳糖嘧喃糖(4-methylumbelliferylβ-D-galactopyranoside)、二β-D-半乳糖嘧喃糖荧光素(fluorescein diβ-D-galactopyranoside)、6，8-二氟-4-甲基伞形酮β-D-葡萄糖-酸锂盐(6，8-difluoro-4-methylumbelliferylβ-D-glucuronide lithium salt)、2-dodecylresorufin、Elf-97、二β-葡萄糖酸荧光素(fluorescein di-β-glucuronide)、5-(五氟苯氨基)二β-D-葡萄糖-酸荧光素(5-(pentafluorobenzoylamino)fluorescein di-β-D-glucuronide)和β-三氟甲基伞形酮β-D-葡萄糖-酸(β-trifluoromethylumbelliferylβ-D-glucuronide)中选择。
6.根据权利要求1的混合物，其特征在于：所述标记由所依附或连结的抗生素物质组成。
7.根据权利要求6的混合物，其特征在于：所述抗生素在氯霉素、红霉素、四环素、链霉素、多粘菌素、萘啶酸、新生霉素、三甲基苄二氨嘧啶、Rifanapicin和青霉素中选择。
8.根据权利要求1的混合物，其特征在于：所述标记可为以下列形式：脂质体、薄膜、多层物、辫子状、片晶体、螺旋状、管状、及纤维状、溶剂化杆、溶剂化卷、以及其组合。
9.根据权利要求1的混合物，其特征在于：其包含吡啶或硫酸钾。
10.根据权利要求1的方法，其特征在于：其计算的微生物数目少于103ml-1。
11.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述薄片和过滤器会一起在介乎摄氏35至44度的温度下培养0.5至6小时。
12.用以识别和计算微生物的系统，包括一个标准影像撷取器、一个电荷藕合组件数组(CCD array)照相机、一个显微镜、一个机动x-y桌、一个自动对焦系统和一个荧光光源。
13.根据权利要求12的系统，其特征在于：所述影像撷取器播放速率为每秒30帧，而影像的大小为640×480像素。
14.利用包含一种或多种标记的多孔溶胶—凝胶玻璃以识别和计算活性微生物，即本说明书所说明的。
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