CN105164271B - 测定流体中抗生素存在的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于测定样品例如奶中是否存在抗生素的方法和试验物。

Description

测定流体中抗生素存在的方法
发明领域
本发明涉及新的、经改进的用于测定样品例如奶中是否存在抗生素的微生物生长抑制试验物(test)。
发明背景
目前，抗生素被频繁用在兽医业中，不仅用于治疗细菌感染，还用于预防目的以提高食品的生产率。近年来，这种不负责任地滥用抗生素作为预防措施已成为有利于细菌抗性生长的决定性因素。
已知抗生素残留在奶和乳制品中最经常检测到的污染物中，并且其在经济水平上导致该行业部门中重要的问题。
为了避免抗生素残留对人类健康和整个生态系统的负面影响，多个立法者(例如EU)已建立了动物来源食品中抗菌剂的最大残留限量(MRL)。MRL是可允许在动物来源物或食品中的药理学活性物质的最大残留浓度。
已开发出微生物生长抑制试验物来测定样品中是否存在抗生素残留。例如EP 0005 891A和EP 0 285 792A中已描述了这类试验的实例。其中所描述的试验物是利用试验生物(test organism)和指示剂分子(例如，pH-和/或氧化还原-指示剂)的即用型试验物。试验物的一般原理是：当样品中存在的抗生素的浓度足以抑制试验生物的生长时，指示剂的颜色将保持不变；然而，当不存在抑制时，试验生物的生长伴随酸或还原代谢物的形成或者伴随会诱导指示剂信号的其它现象。
一般而言，微生物生长抑制试验物必须遵守基本立法规范并可靠地鉴定所检验样品中浓度等于MRL的抗菌剂残留的存在。然而，存在的微生物生长抑制试验物不能检测一些处于它们各自的MRL的抗菌剂残留，即它们对某些抗生素具有有限的灵敏度。特别地，目前商业化的微生物生长抑制试验物对氨基糖苷类抗生素具有有限的灵敏度。
EP 1 639 122A中已描述了：可通过使用指示剂溴百里酚蓝来提高微生物生长抑制试验物的灵敏度。然而，这种指示剂的使用显著改变了用于β-内酰胺抗生素的微生物生长抑制试验物的灵敏度。
鉴于此，仍然需要具有对例如氨基糖苷类抗生素的提高的灵敏度的微生物生长抑制试验物。
发明内容
本发明的目标是提供简单、廉价、易于使用、适用广泛的用于测定样品例如奶中是否存在抗生素的微生物生长抑制试验物。出乎意料地，已发现：当向试验物中加入氨基糖苷类抗生素例如链霉素时，可提高用于氨基糖苷类抗生素的微生物生长抑制试验物的灵敏度。
发明详述
在第一方面，本发明涉及用于检测样品中抗生素存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使样品与微生物生长抑制试验物接触，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和氨基糖苷类抗生素，(b)使试验生物生长，和(c)检测试验生物的生长量，其中生长不足反映出样品中抗生素的存在。
任选地，所述方法包含以下步骤：在使试验生物与样品接触之前，准备试验生物。因此，本发明还涉及用于检测样品中是否存在抗生素的方法，所述方法包括以下步骤：(a)准备试验生物，(b)使样品与微生物生长抑制试验物接触，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和氨基糖苷类抗生素，(c)使试验生物生长，和(d)检测试验生物的生长量，其中生长不足反映出样品中抗生素的存在。
在另一方面，本发明涉及氨基糖苷类抗生素用于提高灵敏度的用途，所述灵敏度为测定样品中抗生素存在的微生物生长抑制试验的灵敏度。在一个实施方式中，样品中的抗生素是氨基糖苷类抗生素。
在另一方面，本发明涉及封闭包装(closed packaging)，其包含至少一个微生物生长抑制试验物，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和氨基糖苷类抗生素。
在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含氨基糖苷类抗生素和微生物生长抑制试验物，所述试验物至少包含试验生物和指示剂。
以下实施方式适用于本发明的所有方面。
在本发明的一种实施方式中，在试验生物生长之前，即在试验开始之前，将氨基糖苷类抗生素加入到试验物中。也可以在试验开始后加入氨基糖苷类抗生素，但这是次优选的。在一个实施方式中，将氨基糖苷类抗生素加入到样品中。这可以在样品与试验物接触之前、期间或之后进行。在一个优选的实施方式中，将氨基糖苷类抗生素加入到试验物中，即它是试验介质的一部分。优选地，在试验物与样品接触之前，氨基糖苷类抗生素存在于试验物中，即试验介质中。换言之，在样品不存在时，微生物生长抑制试验物包含氨基糖苷类抗生素。再换言之，在将样品加入试验介质中之前，微生物生长抑制试验物的试验介质包含氨基糖苷类抗生素。
该试验物能够测定样品中抗生素的存在。待被测定的抗生素可以是来自选自下组的抗生素家族的抗生素，所述组由β-内酰胺抗生素家族、四环素抗生素家族、磺胺类抗生素家族、氨基糖苷类抗生素家族、大环内酯类抗生素家族、林可酰胺类抗生素家族和喹诺酮类抗生素家族组成。然而，该试验物还可被用于检测不同于上述抗生素的抗生素。
由于试验物中氨基糖苷类抗生素的存在，所以用于氨基糖苷类抗生素(例如链霉素和双氢链霉素)的试验物的灵敏度提高。出乎意料地，已发现：试验物中氨基糖苷类抗生素的存在不影响用于其它抗生素种类(例如，β-内酰胺(例如青霉素G)和四环素(例如氧四环素))的试验的灵敏度。因此，试验物中氨基糖苷类抗生素的存在特异性地提高了用于氨基糖苷类抗生素的试验物的灵敏度。
在一个实施方式中，氨基糖苷类抗生素选自由链霉素、双氢链霉素、阿米卡星(amikacin)、安普霉素(apramycin)、阿贝卡星(arbekacin)、阿司米星(astromicin)、卡那霉素B(bekanamycin)、地贝卡星(dibekacin)、新霉素B(framycetin)、庆大霉素、潮霉素B、异帕米星(isepamicin)、卡那霉素、新霉素、奈替米星(netilmicin)、巴龙霉素、罗多链霉素(rhodostreptomycin)、核糖霉素(ribostamycin)、紫苏霉素(sisomycin)、壮观霉素、妥布霉素和甲基姿苏霉素(verdamicin)组成的组。
在一个实施方式中，氨基糖苷类抗生素的浓度在10ppb-10000ppb之间、优选地在100ppb-10000ppb之间、更优选地在500ppb-5000ppb之间。仅为了澄清的目的，所述浓度范围涉及在样品不存在时试验物中氨基糖苷类抗生素的浓度。
在一个实施方式中，微生物生长抑制试验物包含指示剂。换言之，指示剂存在于试验介质中。术语“指示剂”指的是用于测量(例如，通过颜色或荧光的变化)与特定组分(例如，酸、碱、氧化剂或还原剂)存在有关的试验介质状态的物质。特别有用的指示剂是：从一种状态变为另一种状态之后，提供视觉上可检测的信号，例如颜色或荧光的变化。试验介质中指示剂的量一般在0.01-50g/l试验介质之间，优选地在0.1-10g/l试验介质之间，更优选地在0.5-5g/l试验介质之间，最优选地在1-3g/l试验介质之间。指示剂可以是pH-指示剂、氧化还原-指示剂或它们的组合。该术语也可以指两种或更多种指示剂。本领域技术人员将意识到：许多指示剂适用于本发明的目的。合适指示剂的实例可在手册H.J.Conn’sBiological Stains,R.D.Lillie ed.,Baltimore,1969中找到。
试验物的形式可以是液态、固态或凝胶状基质。在本发明的一个实施方式中，微生物生长抑制试验物还包含胶凝剂。当在本文中使用时，术语“胶凝剂”指的是帮助将混合物变成凝胶或呈现凝胶形式的化合物。在本发明的多个方面，合适胶凝剂的实例包括但不限于，琼脂、明胶、藻酸及其盐、卡拉胶、角豆胶(槐树豆胶)、羟丙基瓜儿胶及其衍生物、加工的麒麟菜属海藻等等。琼脂是优选的胶凝剂。在一个实施方式中，试验生物和指示剂和任选地其它额外成分(例如氨基糖苷类抗生素)被引入到琼脂溶液中。允许琼脂溶液凝固形成试验介质，以使试验生物保持存活但由于例如低温而不能繁殖。一般而言，胶凝剂将构成试验介质的大部分。试验物中胶凝剂的量一般在1-200g/l试验介质之间，优选地在2-50g/l试验介质之间，更优选地在5-20g/l试验介质之间，最优选地在7-15g/l试验介质之间。
当试验介质的形式为固态基质时，它可包含载体材料，例如陶瓷、棉花、玻璃、金属颗粒、任何形状或形式的聚合物、硅酸盐、海绵状物、毛线等等。或者，试验物的形式可以是包含试验生物、指示剂和任选地营养物的块状物(tablet)、盘(disc)或滤纸。三种成分可存在于单一块状物中，但也可以在两个或更多个块状物中。当然，可以使用结合固态、液态和/或凝胶状形式的试验介质的试验物体系。
任选地，微生物生长抑制试验物还可包含营养物、稳定剂、盐、缓冲剂和/或增粘剂。当在本文中使用时，术语“营养物”指的是促进试验生物生长和/或试验生物生长所需的营养物质或成分。合适的营养物取决于试验物体系中使用的微生物。试验介质可包含两种或更多种不同的营养物。它们包括但不限于，可同化的碳源，例如碳水化合物例如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和右旋糖；可同化的氮源，例如氨基酸诸如蛋白胨或胰蛋白胨；维生素和生长因子的来源，例如牛肉或酵母提取物；矿物的来源，例如碱土金属盐诸如钡盐或钙盐。本领域技术人员已知可存在于根据本发明的试验物中的合适的额外成分，其包括但不限于，能够提高或降低抗生素试验物灵敏度的其它试剂(不同于氨基糖苷类抗生素)。
在本发明的一个实施方式中，试验生物选自由Bacillus物种、Escherichia物种和Streptococcus物种组成的组。当在本文中使用时，术语“试验生物”还包括孢子，例如任何这些物种的孢子。在本发明的一个优选实施方式中，试验生物是嗜热性的。实例是Bacillusstearothermophilus或Streptococcus thermophilus，其中Bacillusstearothermophilus是优选的。这些物种可被引入到试验物中作为能够产生菌落的单位，或菌落形成单位(CFU)。当在本文中使用时，术语“CFU”指的是能够产生生物菌落的试验生物、试验生物的孢子、试验生物的部分萌发孢子、营养细胞或它们的任何混合物的数目。所述CFU的浓度被表示为每ml试验介质的菌落形成单位(CFU/ml)，其通常在1×105-1×1012CFU/ml、优选地1×106-1×1010CFU/ml、更优选地2×106-1×109CFU/ml、最优选地5×106-1×108CFU/ml、或仍然更优选地5×106-2×107CFU/ml的范围内。
在本发明的一个实施方式中，样品可来源于体液、器官、肉或蛋。抗生素还可存在于食品中，其中这些动物产品作为成分被加入到食品中。食品的实例是奶、加工的奶制品(例如，奶油、酸奶)；奶牛、猪、家禽和鱼的肉；海鲜例如虾；肝脏；加工的肉制品例如香肠；即食型膳食和婴儿食品。抗生素还可存在于体液或动物组织中，该体液或动物组织适合由例如食品检验机构检验。实例是血液、肾脏组织或从肾脏和尿获得的前-尿(pre-urine)。尿和血液适合在屠宰动物之前检验。抗生素还可存在于污水、来自任何类型工业的水等中。在一个优选的实施方式中，样品是尿、血液、蛋、蜜(honey)、肾脏、肉、肝脏、鱼、虾、饲料和/或奶，其中奶是最优选的。奶可来源于奶牛，但也可来源于绵羊、山羊、牦牛、水牛、马、驯鹿和骆驼。在一个优选的实施方式中，样品是流体样品。在一个实施方式中，样品可以不是流体且需要从样品中提取包含抗生素的流体。
优选地，在加入流体样品之前，试验生物最低限度地萌发和外生长(outgrowth)或者不萌发和外生长(outgrowth)。这是通过将试验物贮存和保持在包含不适宜的温度和/或不适宜的pH-值和/或缺乏试验生物萌发和外生长必需的营养物的条件下来实现的。当然，条件不应该对微生物生长抑制试验物中存在的所有CFU造成不可逆损伤。
在使样品与试验生物接触之后，在不存在抗生素的情况下，允许试验生物的生长发生对于试验生物生长足够长的时期。可通过如下确定时期：包括对照样品(即不含抗生素的样品)，并在用于测量对照样品的试验物已变色时终止所有检测样品的孵育。它还可以被决定以孵育所有样品持续固定的时期。通过加入营养物(任选地在接触所述样品之前)和/或升高温度，和/或提供试验生物能够生长的pH值，来诱导生长。或者，可以在使流体样品与试验生物接触之前建立这些条件。例如，当在有益于试验生物生长的温度下孵育试验生物时，可发生试验生物的生长。
通过观察指示剂的变化来检测试验生物的生长量。生长不足/缺乏生长反映了样品中存在抗生素，而生长反映了样品中不存在抗生素。如上所述，通过所使用指示剂的变化来测定抗生素的存在。通常，当抗生素存在于样品中时，指示剂不变化。当样品中不存在抗生素时，微生物生长将发生，从而导致指示剂变化。当例如这种变化是颜色变化时，可在视觉上观察所述颜色变化。然而，还可以使用如下装置来测定所述颜色变化，该装置产生数字图像数据或者该装置产生模拟图像数据并将所述模拟图像数据转化为数字图像数据，之后通过计算机处理器解释所述数字图像数据。WO 03/033728中描述了这种装置的一个实例，即，样品读取设备例如连接个人计算机的扫描仪。WO 2007/090683中描述了这种装置的另一个实例，即，连接个人计算机的组合的样品孵育和样品读取设备(例如与孵化器组合的扫描仪)。这两个文件通过引用被并入本文。
任选地，对某些试验物成分进行灭菌且通常将试验物的pH调节至所需值。任选地，可在加入到试验生物中之前，混合(例如，与其它样品，而且与盐、缓冲化合物、营养物、稳定剂、酶等等)、浓缩和/或稀释(例如，用稀释液，例如水、溶剂等等)样品。
在本发明的一个实施方式中，通过孵育试验生物持续预定的时期来使其生长，所述时期优选地在约0.5-6小时的时间跨度内，更优选地在0.75-5小时之间，最优选地在1.0-4小时之间且特别地在2-3.5小时之间。优选地，在预定的温度、优选地试验生物的最适生长温度下孵育试验生物。当例如，使用嗜热性试验生物时，所述温度优选地在40-70℃之间，更优选地在50-65℃之间，最优选地在60-64℃之间。任选地，可借助于恒温设备来进行所述反应。或者，试验生物生长所需的时间等于含有已知量抗生素的校准样品诱导指示剂变化所需的时间或者不含抗生素的对照样品诱导指示剂变化所需的时间。
在本发明的一个实施方式中，包装中存在至少一个微生物生长抑制试验物。试验物至少包含试验生物、指示剂和氨基糖苷类抗生素。在一个优选的实施方式中，包装是封闭的。当在本文中使用时，“封闭的”表示：存在于包装内的试验物尚未与样品接触。包装可以是盒子和任何其它合适的包装单元。它可以由适合制造包装单元的任何材料制成。优选地，包装包含多于一个微生物生长抑制试验物。微生物生长抑制试验物可存在于容器中。容器可具有任何形状和尺寸并可来自任何可获得的材料，条件是可以观察到指示剂变化。容器可以是管(例如安瓿)，但也可以是孔例如作为板(例如微孔板，即具有多个孔的平板)的一部分的孔。封闭的包装可例如包含5个板、10个板或20个板和/或25个板或100个板。
包装还可包含取样设备。取样设备是可借助其将流体加入到微生物生长抑制试验物中的设备。实例包括但不限于，注射器、移液器或自动化移液系统。这种注射器或移液器可被设计成以下形式：可利用仅一种操作方式从待被分析的流体样品中取出预定的体积。任选地，可使用能够利用一个单独的手柄操作多于一个注射器或移液器的本领域已知的系统。任选地，包装还包含：在样品已加入容器中之后和/或在孵育容器期间用于密封容器的工具。此外，包装可包含带有使用说明的插入物和/或用于设置孵育所需时间的工具。
本发明还涉及试剂盒，其包含(a)氨基糖苷类抗生素，和(b)微生物生长抑制试验物。如上所述，试验物可存在于容器中。氨基糖苷类抗生素也可存在于容器中。可在使用试验物前不久，将氨基糖苷类抗生素加入到试验物中。
任选地，样品与试验介质的比率超过2:3(0.68:1)(体积/体积)。优选地，所述比率为最低20:27(0.74:1)(体积/体积)，更优选地所述比率为最低25:27(0.93:1)(体积/体积)；最优选地所述比率为最低2:1(体积/体积)。已发现：不存在关于样品量上限的技术原因。在实际中，这种体积不应该超过容纳试验介质的容器的最大容量。例如，在含有0.2ml试验介质的2ml容器中，应该加入不多于1.8ml流体样品。在实际中，用于进行本发明的方法的容器的体积很少超过50ml，因此待加入的流体样品的量不应超过50ml，优选地10ml，更优选地5ml，仍然更优选地2ml，最优选地1ml。因此，一般而言，流体样品的体积与试验介质的体积的比率的上限为250:1(体积/体积)，优选地50:1(体积/体积)，更优选地25:1(体积/体积)，仍然更优选地10:1(体积/体积)，最优选地5:1(体积/体积)。在一个优选的实施方式中，稀释物/样品的体积不多于试验介质的体积。
任选地，包装还可包含恒温设备，可借助其使样品保持在预设温度下，例如试验生物显示出充分生长的温度。优选地，所述恒温设备被设计成它能够容纳容器的形式。任选地，恒温装置与用于设定孵育所需时间的工具相连，以使在预设时期流逝后加热和/或冷却停止。
任选地，包装还包含装载有计算机程序的数据载体，该计算机程序适合指导计算机分析获自样品读取设备的数字数据。所述数据载体可以是适合储存数字信息的任何载体，例如CD-ROM、磁盘、DVD、记忆棒、磁带等等。有利地，所述装载有计算机程序的数据载体提供通向适合在本发明的方法中使用的最新的可用计算机程序的方便容易的入口。
实施例
实施例1
试验介质中的氨基糖苷类抗生素对微生物生长抑制试验物中的氨基糖苷类抗生素的检测极限的影响
为了确定氨基糖苷类抗生素对用于氨基糖苷类抗生素的微生物生长抑制试验的灵敏度的影响，进行下述系列实验。
作为参照，使用不加入任何氨基糖苷类抗生素的市售试验物体系(DSMSP-NT，含8×12个试验孔的板)。此外，通过以100ppb或1000ppb的最终浓度向试验介质中加入氨基糖苷类抗生素链霉素来修改参照试验物，从而制备两种不同的试验物体系。
在参照试验物和具有含不同浓度链霉素的经修改介质的试验物中测量四种不同抗生素的检测极限。被测量的抗生素是链霉素和双氢链霉素(DH-链霉素)(二者均属于氨基糖苷类抗生素家族)、青霉素G(属于β-内酰胺抗生素家族)和氧四环素(属于四环素抗生素家族)。测量5种不同浓度的每种抗生素(参见表1)。向试验介质(170μl)中加入添加百微升不含抗生素的奶或掺入相应浓度抗生素的百微升奶，并在水浴中在64℃下孵育。
在不含抗生素的样品的颜色由紫色变为黄色的时间点，对试验物进行视觉测定。此时，将板在冰浴中冷却持续5分钟。在扫描仪上扫描冷却的板。每个孔的颜色被表示成Z-值；紫色产生正Z-值，而黄色具有负Z-值。利用不含抗生素的样品的试验物结果的Z-值通常为-5<Z<-10。WO 03/033728中描述了扫描技术和用Z-值表示颜色的详细说明。
为了测定每种抗生素的检测极限，构建剂量-响应函数(Z-值对抗生素浓度)。检测极限被定义为S形剂量-响应函数具有等于截止值的Z-值时的抗生素浓度。对于SP-NT，使用为0的截止Z-值。表2中总结了计算出的检测极限。
结果清楚显示：向试验介质中加入氨基糖苷类抗生素产生了对氨基糖苷类抗生素的敏感度强烈提高的试验物体系，而对β-内酰胺抗生素和四环素抗生素的敏感度保持不受影响。
表1：掺加的奶样品的抗生素浓度
表2：含不同浓度链霉素的SP-NT中不同抗生素的检测极限

Claims (14)

1.检测样品中氨基糖苷类抗生素存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使所述样品与微生物生长抑制试验物接触，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和链霉素，
(b)使所述试验生物生长，和
(c)检测所述试验生物的生长量，其中生长不足反映出样品中氨基糖苷类抗生素的存在，
其中在所述试验物与所述样品接触之前，链霉素存在于试验物中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基糖苷类抗生素选自由链霉素、双氢链霉素、阿米卡星、安普霉索、阿贝卡星、阿司米星、卡那霉素B、地贝卡星、新霉素B、庆大霉素、潮霉素B、异帕米星、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、罗多链霉素(rhodostreptomycin)、核糖霉索、紫苏霉素、壮观霉素、妥布霉索和甲基姿苏霉素组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述指示剂是pH指示剂和/或氧化还原指示剂。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述试验生物选自由Bacillus物种、Escherichia物种和Streptococcus物种组成的组。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是流体样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述样品是奶。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述试验生物是嗜热性的。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述试验物还包含胶凝剂。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中链霉素的浓度为10ppb-10000ppb。
10.链霉素用于提高灵敏度的用途，所述灵敏度为测定样品中氨基糖苷类抗生素存在的微生物生长抑制试验物的灵敏度。
11.封闭包装，其包含至少一个微生物生长抑制试验物，所述试验物至少包含试验生物、指示剂和链霉素。
12.根据权利要求11所述的封闭包装，其中所述试验物存在于管或板的孔中。
13.根据权利要求11或12所述的封闭包装，其中所述试验物中所述链霉素的浓度为10ppb-10000ppb。
14.试剂盒，其包含：
a)链霉素，和
b)微生物生长抑制试验物，所述试验物至少包含试验生物和指示剂。
CN201480024491.1A 2013-05-02 2014-04-30 测定流体中抗生素存在的方法 Active CN105164271B (zh)

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