CN1480476A - 铁磁性脲醛树脂微球介质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种铁磁性脲醛树脂微球介质及其制备方法，属于磁性树脂微球介质的技术。所述的微球介质的基材为粒径在0.5－20μm的脲醛树脂，在此基材中均匀分散有粒径为0.1－200nm的Fe₃O₄的纳米微粒。所述的制备方法采用超顺磁性的金属氧化物及尿素、甲醛，其制备过程包括磁流体的制备、磁流体的胶溶和分离、磁性微球的制备。本发明的优点在于所制得的微球具有超顺磁特性，Fe₃O₄的磁性纳米微粒被脲醛树脂完全包被，避免了对分离物系的毒化作用，磁微粒的颗粒大小分布均匀，在磁场中的沉降速率一致，表面易于进行修饰。其制备方法操作简单、过程易于控制、原材料成本低、产品稳定性好，易于工业化生产。

Description

铁磁性脲醛树脂微球介质及其制备方法

技术领域

本发明涉及到铁磁性脲醛树脂微球介质及其制备方法，属于磁性树脂微球介质的技术。

背景技术

生物磁分离技术具有仪器设备简单，制作成本低廉，使用方便和易于自动化的特点受到了人们的重视，越来越广泛地应用于细胞筛选、核酸提取、免疫分析、蛋白纯化等方面。在生物技术、生物医学诊断、环境与食品分析等领域中发挥着日益重要的作用。例如，表面结合抗体的磁微粒，即所谓“免疫磁珠”可用于血液中细胞的快速分离、骨髓中干细胞的分离富集；表面结合核酸片断Oligo-dT的磁微粒，可用于mRNA的富集与回收；而表面结合Streptavidin的磁微粒可以与聚合酶链反应(PCR)相结合，应用于DNA固相序列分析。磁性高分子微粒也可应用于一般受体的亲和分离。磁分离技术作为DNA分离纯化的有效手段，与DNA序列分析相结合，为大量样品的基因测试、基因变异分析提供了一个完整的自动化解决方案。

用于生物磁分离技术的磁性微粒，应具备如下特性：

1)呈现超顺磁特性，即当外加磁场除去后，磁微粒的残余磁性趋于零，从而可以均匀地重新分散在溶液中，方便洗涤；

2)分散在磁微粒中的磁性纳米微粒被有机高聚物完全包被，以避免对酶的毒化作用；

3)磁微粒的颗粒大小分布均匀，在磁场中的沉降速率一致。

磁性高分子微球的种类繁多，根据载体的性质可将他们分为疏水和亲水两大类。疏水性磁性微粒通常以聚苯乙烯为载体，在微粒内部或者表面嵌入Fe₃O₄胶粒，制成磁性微球。聚苯乙烯表面强疏水性可能造成生物分子的不可逆吸附，是这类磁微粒的主要弱点。亲水性磁性微粒通常由亲水的天然高分子聚合物如纤维素作为载体，包裹吸附Fe₃O₄粉末后再经研磨得到颗粒大小分布不均，形状不规则的磁性颗粒。这种亲水性磁性颗粒在磁场中沉降速度不同，造成分离困难；另一个问题是Fe₃O₄粉末裸露在外，可能引起对细胞的毒化作用；再一个问题是由于使用颗粒较大的Fe₃O₄磁性粉末，即使在外加磁场除去后，磁性高分子微粒的残余磁性使其仍然聚集在一起，不能重新分散在溶液中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种铁磁性脲醛树脂微球介质及其制备方法。所述的微球是在脲醛树脂的基材中均匀分散的纳米铁磁性材料构成。所述的方法采用分散聚合法制备，其过程简单易控，易于实现工业化生产。

本发明是通过下述技术方案加以实现的，采用包括超顺磁性的金属氧化物及尿素、甲醛制备的磁性脲醛树脂微球介质，其特征在于，该微球介质的基材为粒径在0.5-20μm的脲醛树脂，在该基材中均匀分散有粒径为0.1-200nm的Fe₃O₄的纳米微粒。

上述微球介质的制备方法，其过程包括磁流体的制备、磁流体的胶溶和分离、磁性微球的制备，其特征在于具体步骤如下：

1.按摩尔比1.0-3.0将FeCl₃.6H₂O和FeCl₂.4H₂O混合，加水搅拌使之充分溶解，然后用包括氢氧化铵的碱调节pH值为9-10，在85-95℃反应30min，得到黑色Fe₃O₄沉淀。

2.用去离子水洗涤Fe₃O₄沉淀，用包括高氯酸的酸调节pH为1-1.5，高速搅拌15-30min，过滤，得到粒径为0.5-200nm的均匀磁流体。

3.在上述磁流体中，按摩尔比1-1.5加入尿素和甲醛单体，用包括高氯酸的酸调节pH值为1.0-4.5，在5-50℃，搅拌速率20-100转/分，反应1-24h，制得具磁性的脲醛树脂微球介质，用磁分离装置收集磁性微球。

根据本发明，上述的二价铁盐和三价铁盐的摩尔比优选1.8-2.2，以获得具有所需大小和磁性能的超顺磁材料。

根据本发明，包括超顺磁微粒在内的磁性材料，最好通过胶溶或者研磨细分成亚微米尺度，使得任何单个磁微粒不再保留其磁性偶极矩。通常根据光散射方法来测定胶溶的凝聚物的大小在0.1-200nm的范围内变化，胶溶的凝聚物特别适用于本发明，胶溶通过对磁微粒的初始凝聚物用酸或者碱加以处理，直到获得所需大小为止。根据所用的酸碱不同，超顺磁微粒可以携带净的正电或负电。由于微粒是两性胶粒，用酸处理可得到带正电荷的超顺磁微粒，而经碱处理可以得到带负电的磁微粒。

磁微粒的磁饱和特性与制备过程有关。例如：根据本发明，用于制备亲水性磁性微粒的有机高分子载体是通过混合醛类化合物与氨基化合物而制成的。这些化合物必须可溶于极性溶剂，即他们必须是水溶性的，可以与磁流体混溶而不致引起絮凝。高分子链的形成过程中必须可以吸附磁性胶粒，以便形成球状凝聚体，并在聚合反应完成时生成磁性聚合物微球。

有机成分和无机胶粒凝聚成颗粒大小均一，胶粒分布均匀的微球，不仅仅是高分子材料对胶粒的机械捕获。为了获得微球粒径和磁性胶粒在微球内分布的高度均一性，胶粒表面的氧化物和高分子链的某种相互作用显然是必须的，这两种均一性显然与反应中所用的尿素和甲醛的摩尔比有关。根据本发明，对于尿素甲醛聚合反应介质合适的摩尔比为1-1.5，反应pH为1.0-4.5。有机成分与磁性材料的比例应该是这样的，聚合反应及沉淀的微粒应含有10-90％(以重量计)的无机成分。这一组成也可以用微球中不同成分的体积百分比来表达，微球中无机成分的百分比通常在10-50％范围，尽管理论上70％也是可能的。反应初始生成非常微小的高分子聚合物颗粒，他们随着聚合反应的进行而生长。在聚合反应单体过量的情况下，一组颗粒生长到10μm，然后另一组亚微米颗粒开始出现，得到两种不同的颗粒分布的混合物。可以加入表面活性剂或者与水混溶的溶剂来改变所生成微粒的大小。

聚合反应通常是在反应温度5-50℃内进行，反应温度低于5℃反应太慢而导致收率偏低，而当反应温度高于50℃，反应进行太快，倾向于生成凝胶而非微球。

合成得到的亲水性磁性聚合物微球经洗涤除去反应物后可以重新分散在水溶液中，也可以对其表面涂敷一层亲水高分子膜，这一亲水膜可以由与磁微球载体相同的材料组成，也可以由不同的亲水高分子组成。根据要求可以在磁性高分子微球表面键合上不同的官能团，也可以在表面涂布一层有特定官能团的交联高分子薄膜。本发明的优点和效果在于：

所制得的微球具有超顺磁特性，Fe₃O₄的磁性纳米微粒被脲醛树脂完全包被，避免了对分离物系的毒化作用，磁微粒的颗粒大小分布均匀，在磁场中的沉降速率一致，表面易于进行修饰。其制备方法操作简单，过程易于控制，原材料成本低，产品稳定性好，易于实现工业化生产。

具体实施方式

实施例1：

磁流体的制备

分别溶解112.8g FeCl₃.6H₂O，41.2g FeCl₂.4H₂O于100ml水中，将其倒于800ml水中，将混合盐溶液置于冰浴中，冷却到6℃，搅拌下加入200ml 28％氢氧化铵，同时保持温度在6℃，反应生成黑色氢氧化铁匀浆，加热至90℃，并保持30min，氢氧化铁转化为四氧化三铁沉淀。反应方程式如下：

反应物冷却至室温，氢氧化铁匀浆转移至烧杯中，放置在磁分离装置上，弃去清液，重新分散在800ml去离子水中，在经过洗涤的匀浆中加入112ml 60％(以重量计)的高氯酸，搅拌10min，在磁分离装置上收集上层磁流体；将剩余的匀浆重新分散在500ml的去离子水中，加入81ml 60％(重量计)高氯酸再次胶溶，搅拌10min，置于磁分离装置上，收集上层磁流体，合并两次胶溶分离所得到的磁流体。磁性微球的制备

在含有平均胶粒直径为50nm Fe₃O₄(4.2g)的磁流体中，搅拌下加入15g尿素，直到完全溶解。加入浓高氯酸调节混合物的pH至2，再加入25ml 37％甲醛水溶液，剧烈搅拌下30s后，降低搅拌速度至20rpm，使混合物在室温下反应2h，将产物剧烈搅拌、磁分离、洗涤除去反应物后备用。

将5g磁性脲醛树脂微球作为种子加入到装有100ml 0.2M HCl(pH2)中，加入三分之一单体溶液(3g尿素+5g 37％甲醛溶液)，搅拌分散，室温下反应30min，滴加剩余单体，1.5h内滴加完，在室温下反应2h，产物磁分离，洗涤后得到表面包覆脲醛树脂的亲水性磁性聚合物微球。磁性微球在核酸纯化中的应用

取新鲜培养过夜的菌悬液离心沉淀细胞，加入30μl溶液1(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl pH8，10mM EDTA pH8,100ug/ml RNase)及60μl溶液2(0.2MNaOH，1％SDS)混合，室温下放置5min。加入45μl溶液3(3M KOAC)混合冰浴放置10min。离心10min，取100μl上清液备用。

将上述制得的磁性微球分散在磷酸缓冲液(PBS)中，微球浓度为20mg/ml，取10μl用0.5M EDTA，pH 7.2洗涤三次后悬浮于10μl 0.5M EDTA中，加入到上述制得的干净溶菌液中，加入100μl混合缓冲液(20％PEG8000，2.5M NaCl)，混匀后室温下放置5min，在磁场下除去上清液，余下的磁性微球70％乙醇洗涤两次，空气中放置10-30min挥发除去乙醇，加入50μl去离子水，振荡重悬磁性微球，室温放置1min使DNA得到洗脱，在磁分离装置上移取纯化的DNA。

实施例2：磁流体的制备

分别溶解5.6g FeCl₃.6H₂O，1.98g FeCl₂.4H₂O于50ml水中，搅拌下加入10ml 28％氢氧化铵，反应生成黑色氢氧化铁匀浆。加热至60℃保持30min，反应物冷却至室温，将氢氧化铁匀浆转移至烧杯中，通过磁分离装置，弃去清液，用50ml去离子水将匀浆重新分散并洗涤三次，在匀浆中加入浓硝酸，调节pH为1-3，快速搅拌30min，得到磁流体。磁性微球的制备

取上述磁流体30ml，搅拌下加入0.3g SDS粉末，3g尿素，直到完全溶解。加入浓高氯酸调节混合物的pH至2-2.5，再加入4ml 37％甲醛水溶液，剧烈搅拌20s后，停止搅拌，使混合物在室温下反应2h，产物经搅拌、磁分离、洗涤得到磁性微球。

实施例3：

取10g聚乙二醇溶于75ml水中，分别加入8.41g FeCl₃.6H₂O，3.05gFeCl₂.4H₂O于50ml水中，搅拌下加入15ml 28％氢氧化铵，反应生成黑色氢氧化铁匀浆。加热至60℃保持30min，反应物冷却至室温，将氢氧化铁匀浆转移至烧杯中，经磁分离装置，弃去清液，用50ml去离子水将匀浆重新分散并洗涤三次，在匀浆中加入浓硝酸，调节pH为1-3，快速搅拌30min，得到磁流体。磁性微球的制备

取上述磁流体40ml，搅拌下加入2.5g尿素，直到完全溶解。加入浓高氯酸调节混合物的pH至1-2，再加入7ml 37％甲醛水溶液，剧烈搅拌20s后，降低搅拌速度至20rpm，使混合物在室温下反应2h，产物经搅拌、磁分离、洗涤得到磁性微球。

Claims (3)

1.一种铁磁性脲醛树脂微球介质，该微球介质是采用包括超顺磁性的金属氧化物及尿素、甲醛制备而成，其特征在于：该微球介质的基材为粒径在0.5-20μm的脲醛树脂，在该基材中均匀分散有粒径为0.1-200nm的Fe₃O₄的纳米微粒。

2.一种制备按权利要求1所述的铁磁性脲醛树脂微球介质的方法，其过程包括磁流体的制备、磁流体的胶溶和分离、磁性微球的制备，其特征在于具体步骤如下：

1).按摩尔比1.0-3.0将FeCl₃.6H₂O和FeCl₂.4H₂O混合加水搅拌使之充分溶解，然后用包括氢氧化铵的碱调节pH值为9-10，在85-95℃反应30min，得到黑色Fe₃O₄沉淀；

2).用去离子水洗涤Fe₃O₄沉淀，用包括高氯酸的酸调节pH为1-1.5，高速搅拌15-30min，过滤，得到粒径为0.5-200nm的均匀磁流体；

3).在上述磁流体中，按摩尔比1-1.5加入尿素和甲醛单体，用包括高氯酸的酸调节pH值为1.0-4.5，在5-50℃，搅拌速率20-100转/分，反应1-24h，制得磁性脲醛树脂微球介质，用磁分离装置收集磁性微球。

3.按权利要求2所述的铁磁性脲醛树脂微球介质的方法，其特征在于二价铁和三价铁盐的摩尔比优选1.8-2.2。