CN1478146A - 钙结合蛋白质 - Google Patents

Abstract

描述了神经系统的一类新的钙结合蛋白质，具体而言地是calsyntenin－1到3。Calsyntenin蛋白质是治疗神经系统特别是中枢神经系统紊乱的有价值的制剂。它们对于治疗神经系统紊乱的药物的开发是非常有用的。

Description

钙结合蛋白质

相关申请的相互参考

本申请要求2000年9月14日提交的欧洲专利申请00810830.0的优先权，其公开内容在此整体引用作为参考。

技术领域

本发明涉及主要在神经系统中表达的一类新的钙结合蛋白质。

背景技术

神经系统相关的紊乱，具体而言地是中枢神经系统相关的紊乱正变得更加重要，这是由于人类的平均年龄提高，因潜在危险的增加的发生率而导致受伤的人的数目增加，以及压力相关的和其他精神紊乱的发生率增加。

在该领域中，对于获得关于神经系统和涉及神经系统的紊乱如精神紊乱的知识有极大的兴趣，其中的知识如疼痛发展、受伤神经的再生等，且特别是关于治愈这些紊乱或伤害，或至少改善遭受这样的紊乱或伤害的病人状态，并且对于药物和诊断制剂具有很大的需求。学习更多关于神经系统相关的紊乱的一个途径是对在神经系统的生物化学途径中涉及的蛋白质的鉴定和表征。钙在神经系统的信号途径中起重要的作用。尽管许多神经系统活性蛋白质的DNA序列已经公布，但仍然有许多这样的蛋白质还没有被检测到。此外，也是对大多数已知的序列而言，它们的活性仍然未知。

由于上述原因，对于鉴定和表征在神经系统中表达且在钙传导信号或贮存中起作用的蛋白质有极大的兴趣。

发明内容

在神经系统衍生的cDNA文库中，最近编码具有迄今为止活性尚未知的蛋白质的DNA序列已被公布。目前在本发明的范围内已发现该蛋白质在钙信号传导途径中起重要作用，且仅是一整组具有类似活性的化合物中的一员。已将在本发明范围内的该神经系统活性蛋白质命名为calsyntenin-1，且已经发现该蛋白质包含单向的跨膜区段，具有富含酸性氨基酸残基的小(约100个氨基酸)细胞质区段和大细胞外区段。

在本发明之前，对于calsyntenin基因表达的细胞模式、calsyntenin蛋白质的细胞和亚细胞定位、功能作用以及calsyntenin相关的紊乱一无所知。

因此本发明的一个目的是提供分离的多肽以用作药物，该多肽包含与选自下面的序列具有至少50％的一致性的氨基酸序列：

a)选自Seq.Id.No.2(calsyntenin-1)、Seq.Id.No.4(calsyntenin-2)和Seq.Id.No.6(calsyntenin-3)的全长氨基酸序列，

b)包含至少1个，优选地为2个，最优选地为3个选自下组的氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.2的约46到约165位残基的序列、约166到约257位残基的序列、约774到约861位残基的序列和约881到约981位残基的序列，

c)包含至少1个，优选地为2个，最优选地为3个选自下组的氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.4的约66到约158位残基的序列、约182到约259位残基的序列、约751到约834位残基的序列和约854到约955位残基的序列，

d)包含至少1个，优选地为2个，最优选地为3个选自下组的氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.6的约51到约142位残基的序列、约167到约244位残基的序列、约759到约845位残基的序列和约869到约956位残基的序列，

e)包含至少1个，优选地为2个，最优选地为3个选自下组的氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.2的约881到约981位残基的序列、Seq.Id.No.4的约854到约955位残基的序列和Seq.Id.No.6的约869到约956位残基的序列，

并且具有钙结合活性和/或具有结合Arp2/3复合物的能力。

上面描述的含有配体结合功能的多肽是特别感兴趣的，尤其是包含Seq.Id.No.2的46到165位氨基酸残基、约166到约257位残基的多肽；尤其是包含Seq.Id.No.4的约66到约158位氨基酸残基、约182到约259位残基的多肽；尤其是包含Seq.Id.No.6的约51到142位氨基酸残基、约167到约244位残基的多肽。

上述包含蛋白水解切割位点的多肽是优选的，尤其是包含Seq.Id.No.2的约774到约861位氨基酸残基的多肽，

尤其优选包含Seq.Id.No.4的约751到约834位氨基酸残基的多肽；

尤其优选包含Seq.Id.No.6的约759到约845位氨基酸残基的多肽。

上述包含calsyntenin-1和/或calsyntenin-2和/或calsyntenin-3的钙结合结构域的多肽是优选的，即包含Seq.Id.No.2的约881到约981位氨基酸残基的多肽和/或包含Seq.Id.No.4的约854到约955位氨基酸残基的多肽和/或包含Seq.Id.No.6的约869到约956位氨基酸残基的多肽。

优选的是那些与选自上述的氨基酸序列具有至少60％、更优选地大于70％的一致性的多肽序列。

本发明的另一个目的是用作药物的分离的多肽，所述多肽包含选自含有一段至少100个氨基酸的序列的氨基酸序列，该序列与选自Seq.Id.No.2、Seq.Id.No.4和Seq.Id.No.6的氨基酸序列具有至少50％的一致性百分比，优选地至少55％且更优选地至少60％，且所述序列具有钙结合活性和/或具有结合Arp2/3复合物的能力。

本发明的多肽优选地是只在神经系统细胞中表达的跨膜蛋白质，且更优选地是在神经元中表达的跨膜蛋白质。

本发明的多肽优选地是位于突触的突触后膜上的，更优选地位于棘突触的棘器和/或位于轴突触(shaft synapses)的亚突触内质网膜上。在细胞质区室内具有其主要钙结合结构域的蛋白质是特别感兴趣的。优选的是在肿瘤中表达的多肽，其他优选的多肽具有至少一个Arp2/3复合物结合位点。该Arp2/3结合位点是保守的酸性氨基酸序列基元，包含保守的色氨酸，包括但不局限于如MDWDDS和LEWDDS的序列基元(以单字母符号给出氨基酸序列)。

本发明的多肽或其含有最小长度为50个氨基酸的片段适合于用作药物开发的工具。

本发明另一个目的是编码本发明多肽的分离的核苷酸序列或其部分序列用作药物。

本发明的另一个目的是编码本发明的多肽或其片段的分离的核苷酸序列，该序列由于至少一个点突变、插入或缺失而失去了其功能。

本发明的进一步的目的是分别编码本发明的多肽或其片段的分离的核苷酸序列用作诊断工具，该序列由于至少一个点突变、插入或缺失而失去了其功能。这样的序列通常与包含蛋白酶识别位点的细胞外区段和/或钙结合细胞内区域的活性区段没有多于25个的差异。

编码本发明多肽的核苷酸序列的突变区域或突变区域侧翼的区域对如可用于诊断检验以探测从如人组织中分离的突变DNA的引物或核苷酸探针的设计是有用的。这样的检验对如预测细胞是否可能经历导致癌症发展的转化来说是适用的。此处所用的引物或核苷酸探针等术语包括包含10个或更多脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸序列。

应当理解本发明的DNA序列也包括剪接变体和在严格条件下与选自Seq.Id.No.1(calsyntenin-1)、Seq.Id.No.3(calsyntenin-2)和Seq.Id.No.5(calsyntenin-3)的序列杂交的DNA序列。在严格条件下杂交的序列通常是具有至少约80％的一致性，优选地为至少约90％的一致性和最优选地为至少98％的一致性的序列。该序列包含编码具有钙结合活性的氨基酸序列的序列以及编码不具有钙结合活性的氨基酸序列的序列，具体而言地是这样的因小缺陷而失去该活性的序列。小缺陷通常指在所述序列中的点突变、插入或缺失。本发明的序列也包含编码跨越位于编码蛋白质的细胞外区段中的蛋白水解切割位点的序列以及这样的编码不具有蛋白切割位点的氨基酸序列的序列，具体而言地是这样的因小缺陷而失去该切割位点的序列。本发明的序列也包含编码蛋白水解释放片段的氨基酸序列的序列，以及这样的编码在蛋白水解释放片段中具有突变的氨基酸序列的序列。此处所用的术语等位基因意思指包括差异为一个或多个核苷酸替换、添加或缺失、通常在活性提供区域有至多20个差异的序列。

本发明的另一个目的是使用本发明的多肽或核苷酸序列或其片段作为药物开发的工具和筛选药剂的工具。

本发明进一步涉及包含这样的如上所述的DNA序列和/或多肽或其片段的药物组合物。

本发明的药物组合物也可包含如上面所描述的蛋白质作为至少一种活性物质(成分)。

药物组合物此外可包含至少又一种活性化合物，如增加或减少上述蛋白质的钙结合活性、或增加或减少这样的蛋白质在体内其作用位置的量、或延长或缩短这样的蛋白质在体内其作用位置存在的时间的化合物。

本发明此外包含至少含有一种作为活性化合物的物质的药物组合物，所述物质可促进或抑制衍生自上述DNA的mRNA的转录，或促进或抑制这样的DNA的翻译。

本发明也涉及包含至少一种作为活性化合物的化合物的药物组合物，该化合物可减少或增加如上所述的蛋白质的钙结合活性，或增加或减少这样的蛋白质在体内其作用位置的量，或可延长或缩短这样的蛋白质在体内其作用位置存在的时间。

本发明的另一个目的是具有如Seq.Id.No.4所说明的序列的蛋白质；以及包含与所述序列具有至少60％的一致性的序列的同源物。

本发明的另一个目的是具有如Seq.Id.No.6所说明的序列的蛋白质，以及包含与所述序列具有至少98.5％的一致性的序列的同源物。

本发明的另一个目的是编码如Seq.Id.No.2、Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6所说明的蛋白质的核苷酸序列。核苷酸序列的编码序列包含所有编码Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6或其同系物的氨基酸序列的序列。上述的核苷酸序列的部分序列也包含在内。例如，calsyntenin编码序列优选地具有与编码Seq.Id.No.4或Seq.Id.No.6的氨基酸序列的核苷酸序列有至少70％的相似性的序列。

上述的DNA序列和/或蛋白质适合用于紊乱的筛选测定和/或治疗，所述紊乱优选地为神经系统紊乱，更优选地为中枢神经系统紊乱，最优选地为如由于缺少钙结合活性、或由于过度的钙结合活性或由于细胞内钙信号加工的紊乱所导致的脑部紊乱，以便预防、改善或治愈神经系统的紊乱，该紊乱归因于由至少一种蛋白酶诱导的对本发明蛋白质的切割缺乏或错误切割或过度切割而导致的，其中的蛋白酶具体而言地是选自组织型纤溶酶原激活物(缩写为tPA)，尿激酶型纤溶酶原激活物(缩写为uPA)，或plasmin，或神经蛋白酶(neurotrypsin)或neuroserpin的酶。所述由于细胞内钙信号加工混乱所导致的紊乱是优选地由以调节Arp2/3复合物活性的方式来调节细胞运动性过程的细胞外信号加工混乱所导致的。因而，也包含用本发明的蛋白质或核苷酸序列来治疗这样的疾病的方法。

最优选地，本发明涉及使中风时组织破坏最小化的DNA序列或蛋白质。

利用包含这样的DNA序列或蛋白质的制剂，可以获得中风时包括脑梗塞和局部缺血、脑内出血和蛛网膜下出血在内的组织破坏的最小化，例如通过在围绕坏死组织的所谓的半影区(penumbra zone)的细胞施加保护作用即可达到。

其他可以使用本发明的有效物质或制剂的紊乱，不管是用药物还是用诊断剂，包括作为适当选择的：

在创伤性脑伤害中组织破坏的治疗，例如通过对围绕坏死组织的所谓半影区(penumbra zone)的细胞施加保护作用，

对由神经变性疾病或神经炎症疾病(例如多发性硬化)所导致的负作用的预防、改善或治疗，

减少或预防由癫痫发作所导致的脑组织的负作用，

挽救遭受危险的神经元，例如受到低氧和局部缺血、兴奋毒性(excitotoxicity)、神经炎性疾病和过程、癫痫发作，和癌性新生物危害的神经元，

轴突再生和/或突触完整性和功能的恢复，

视网膜紊乱例如视网膜退化和视网膜新血管发生(neoangiogenesis)的预防、改善或治愈，

神经系统细胞的细胞死亡，具体而言地是与神经组织的损伤(例如脑梗塞和缺血体卒中、或脑出血、或脑创伤)有关的细胞死亡，和/或与神经组织损伤由于缺乏氧或葡萄糖或由于中毒而引起的有关的细胞死亡，和/或与癫痫发作有关的细胞死亡，和/或与神经变性疾病和神经系统的遗传缺陷有关的细胞死亡，

受伤的、损坏的、发育不良的或畸形的脑组织和/或神经组织的再生，

在脑和/或神经受伤后或在脑区破坏或损坏后仍保持完整的脑或神经区域的重新组织，

病理疼痛综合症的预防、改善或治愈，

心理健康疾病领域内的紊乱或健康的身心状态的改善或治愈，例如神经过敏或“内心不安”，情感功能领域的紊乱(例如焦虑状况)的改善或治愈，

精神病紊乱的预防、改善或治愈，具体而言地是在精神分裂症和类精神分裂症领域的精神病紊乱，包括慢性精神分裂症、慢性分裂情感性紊乱、非特定性的紊乱，包括具有各种症状的急性和慢性精神分裂症，例如严重的非缓解型(non-remitting)“Kraepelinic”精神分裂症，或如类精神分裂症紊乱的DSM-III-R-原型，包括阵发式精神分裂紊乱，包括妄想性类精神分裂症紊乱，包括类精神分裂症人格障碍，例如具有轻微症状的类精神分裂症人格障碍，包括分裂型(schizotypic)人格障碍，包括精神分裂症和类精神分裂症的紊乱的潜伏型，包括非器质性精神病，和/或在内因性抑郁症领域或燥狂型或燥狂抑郁型紊乱领域的精神病紊乱，

对肿瘤的治疗，如原发性和转移性肿瘤的生长、扩展、渗入和转移的预防或减少，新血管生成或新血管发生(neoangiogenesis)的抑制，具体而言地是对脑瘤或视网膜瘤的治疗。所述肿瘤优选地在其生长、扩展、渗入、转移和促进血管或新血管发生中涉及Arp2/3复合物增强的活性。该Arp2/3复合物增强的活性优选地是由一种本发明的蛋白质的异常或过度或减少的调节功能来介导的。

该肿瘤优选地在其生长、扩展、渗入、转移和促进血管或新血管发生中涉及至少一种与本发明的多肽功能性地有关的蛋白酶。该酶优选地是下面一个家族的成员：

-丝氨酸蛋白酶家族，如组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶、凝血酶、神经胰蛋白酶(neurotrypsin)、neuropsin、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G，

-基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase)家族，如胶原酶、明胶酶、溶基质素、matrylisins，

-半胱氨酸蛋白酶家族，如组织蛋白酶B和组织蛋白酶D。

本发明也涉及健康人以及学习和记忆功能降低的人的学习和记忆功能的改善。

在另外一个方面，本发明涉及生产上述蛋白质的方法，其特征在于将适当的原核和真核细胞，具体而言地哺乳动物细胞用在载体中的上述DNA序列转染，以确保该DNA序列的表达，且特征在于该转染的细胞在允许该蛋白质表达的适当条件下培养。

在另一个目的中，本发明涉及生产多肽、肽或核酸序列的合成或化学方法，这些多肽、肽或核酸序列代表了至少部分本发明的序列且分别具有模拟或阻断calsyntenin的生物活性，特别是钙结合活性的能力。

上述的DNA序列和/或蛋白质可进一步被用作筛选抗calsyntenin蛋白质相关紊乱的药品的方法，也可用来筛选如转录增强子或减弱子(reducer)、翻译增强子或减弱子(reducer)等活性成分或分析增强子或减弱子(reducer)的活性。

本发明的另一个目的是在其细胞外区段切割本发明的蛋白质的蛋白酶。

本发明此外涉及包含切割本发明多肽的蛋白酶的细胞提取物。蛋白酶可为内源性来源的或可为转化或转染到该细胞中的异源表达构建体的产物。

本发明的另一个目的是鉴定调节该蛋白酶活性的化合物或试剂的方法。该方法包含用检验化合物与生产活性蛋白酶的细胞接触和测量蛋白酶活性的改变。在一个优选的实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞且蛋白酶是从异源基因构建体表达的。

此外，本发明也包含使用上述的序列作为生产抗原或作为抗原而生产抗体的方法。

这样的抗体可为如抑制或促进钙结合功能的抗体或抑制或促进对上述蛋白质的蛋白水解切割的抗体或可被用于免疫组织化学研究或诊断测定的抗体。

本发明也关注包含上述外源DNA序列的转基因动物。这样的动物适用于疾病研究和对上述活性物质的检验。

这样的动物具体而言地为非人的哺乳动物，如小鼠。

本发明的再进一步的方面涉及用上述的DNA序列以通过基因打靶技术用于对相应的内源基因进行失活或突变。

这样的基因打靶技术为如在小鼠中通过同源重组去除该基因或用其突变型置换。

在本发明的范围内，上述的DNA序列也可被用于诊断由于基因组序列的缺陷或改变而导致的紊乱的诊断制剂的制备，其中的基因组序列包含与上述编码序列之一相似但不相同的编码序列。

本发明的核酸序列在人或动物的基因治疗应用中也是非常有用的，例如作为基因治疗载体如生物和合成载体的部分或作为人工染色体的部分。

附图简述

参考下列详细描述后，对本发明将有更好的理解，并且除在上面阐明的之外的目的将是显然的。这样的描述参看附图，其中：

图1A表示接种在细胞培养系统的中央区室的E6鸡脊髓腹部一半的解离的神经元，

图1B表示培养6天后，延伸到边缘区室的E6鸡脊髓腹部一半的神经元的神经突，

图1C表示区室性细胞培养系统，其细胞培养表面被特氟隆(Teflon)分割器细分为3个区室，

图1D表示³⁵S甲硫氨酸标记的蛋白质双向SDS-PAGE凝胶的荧光自显影，该蛋白质是释放到中央和边缘区室两者的培养基中的蛋白质，

图1E表示³⁵S甲硫氨酸标记的蛋白质双向SDS-PAGE凝胶的荧光自显影，该蛋白质是释放到中央和边缘区室两者的培养基中的蛋白质，

图2表示来自由人(hs)、小鼠(mm)和鸡(gg)的calsyntenin-1 cDNA的单一可读框(ORF)推断的氨基酸序列的比对，

图3表示calsyntenin-1的胞质部分的钙结合活性证明，

图4A表示calsyntenin-1的mRNA在E18小鼠的矢状切片中表达模式，

图4B表示calsyntenin-1的mRNA在成年小鼠脑的冠状切片中的表达模式，

图4C表示calsyntenin-1的mRNA在成年人组织中的Northern印迹分析，

图4D表示人和鸡calsyntenin-1蛋白质的蛋白质印迹分析，

图4E表示calsyntenin-1蛋白质的示意图，

图5A通过免疫组织化学染色显示calsyntenin-1在成年大鼠海马切片上的突触定位，

图5B表示calsyntenin-1与突触标记synapthophysin的共定位，

图5C表示calsyntenin-1与突触标记GABA_A受体的α2亚基的共定位，

图5D表示calsyntenin-1与AMPA受体的GluR2亚基的共定位，

图6A表示calsyntenin-1在棘突触的突触后膜的超微结构定位，

图6B表示calsyntenin-1在棘突触的突触后膜的超微结构定位，

图6C表示calsyntenin-1在棘突触(spine synapses)的突触后膜的超微结构，

图6D表示calsyntenin-1在棘突触的突触后膜的超微结构，

图6E表示calsyntenin-1在棘突触的突触后膜的超微结构，

图6F表示calsyntenin-1在棘突触的突触后膜的超微结构，

图6G表示calsyntenin-1在棘突触的突触后膜的超微结构，

图7表示calsyntenin-1在突触小体而不是在突触后密集区中定位，

图8A表示棘突触的棘器上蛋白水解切割的calsyntenin-1跨膜片段的超微结构，

图8B表示棘突触的棘器上蛋白水解切割的calsyntenin-1跨膜片段的超微结构，

图8C表示棘突触的棘器上蛋白水解切割的calsyntenin-1跨膜片段的超微结构，

图8D表示棘突触的棘器上蛋白水解切割的calsyntenin-1跨膜片段的超微结构，

图8E表示棘突触的棘器上蛋白水解切割的calsyntenin-1跨膜片段的超微结构，

图9表示突触后Ca²⁺结合的calsyntenin-1的蛋白酶依赖性转位的图解，

图10A通过间接免疫荧光染色表示calsyntenin-1在培养的海马神经元生长锥的定位，

图10B通过间接免疫荧光染色用抗轴突标记蛋白质Tau1的抗体鉴定了图10A中的一个神经元突起为轴突，

图10C显示更高倍放大下间接免疫荧光显示的calsyntenin-1在培养的海马神经元生长锥的定位，

图11通过用抗calsyntenin-1的抗体(R63和R71)的蛋白质印迹表示了全长型calsyntenin-1和切割的calsyntenin N-末端分泌片段的生成，

图12A显示了RNA印迹测定的calsyntenin-3的mRNA在不同人器官中的表达，

图12B以细胞分辨率显示了calsyntenin-3的mRNA在成年小鼠脑水平切片中的表达，

图12C细胞分辨率显示了calsyntenin-3的mRNA在成年小鼠脑近矢状切片(parasagittal section)中的表达，

图13表示Arp2/3复合物与calsyntenin-1的细胞质部分的结合。使牛脑提取物通过含有结合的GST-Cst_C融合蛋白质的柱子。将在流出组分(flow-through fraction)、洗涤组分(washfraction)和洗脱组分(elute fraction)中收集的蛋白质用SDS-PAGE分离并用银染法染色(上面板)。在SDS-PAGE后也将该相同的蛋白质组分电转移到硝酸纤维素纸上，且通过用商业上可获得的针对Arp2/3复合物的Arp3亚基的抗体为第一抗体进行免疫检测来显现Arp2/3复合物的存在(下面板)。

实现本发明的方式

已知calsyntenin蛋白质主要在脑中表达；脑中的基因表达几乎专一地发生在神经元中。

作为新类型钙结合蛋白质的代表，对calsyntenin-1、2和3的分离和表征做了进一步的描述。

Calsyntenin-1的编码肽长1009个氨基酸且包含28个氨基酸的信号肽。成熟蛋白质由981个氨基酸组成。细胞外区段包含860个氨基酸，跨膜区段有21个氨基酸，而胞质区段有99个氨基酸。

Calsyntenin-1的特别有趣的功能是在形成钙结合胞质区的区段中发现的。

Calsyntenin-1具有高度富含酸性氨基酸残基的细胞质区段且具有结合钙离子的能力。Calsyntenin-1的细胞质区段以高能力低亲和力的钙结合结构发挥功能，也含有高亲和力的钙结合位点。

由于这个功能，calsyntenin-1在中枢和周围神经系统的兴奋性和抑制性突触的突触后区带保存钙。由这个特征，calsyntenin-1介导钙在突触后膜下的区带积聚并因此调节钙介导的突触功能。由于这些功能，calsyntenin-1在突触后膜下的区带维持提高的钙浓度，并因此延长突触后膜下区带的钙信号。Calsyntenin-1的有趣的方面是它通过内吞过程从突触后膜的去除，这是在细胞外区段内发生蛋白水解切割之后进行的。因此，calsyntenin-1是受至少一种突触蛋白酶的蛋白水解切割的动态调节的。

目前可以知道，在本发明的范围内，calsyntenin-1也具有体内活性，使得它成为蛋白酶相关紊乱、特别是神经系统紊乱、尤其是中枢神经系统紊乱的诊断和治疗的非常有用的工具。

已知calsyntenin-1在神经发育中的表达开始于观察到突触重建过程的时间范围的初始，在成体神经系统中，其表达主要位于发生突触可塑性的脑区域，且calsyntenin-1特别高的表达是在小鼠的大脑皮层、海马和扁桃体中发现的。

在成年小鼠脑的更深结构、脑干和脊髓中发现了calsyntenin-1的较弱的表达。

calsyntenin-1也在成体周围神经系统如感觉神经节神经元中表达。

calsyntenin-1在脑中的基因表达模式是极其有趣的，因为这些分子主要是在成体神经系统中被认为在学习和记忆功能中起重要作用的区域的神经元中表达的。

calsyntenin-1在大脑皮层中的基因表达模式也是极其有趣的，因为已发现大脑皮层中细胞分化的减少与精神分裂症有关联。

calsyntenin-1的另一个显著的特征在于它是由神经元分泌的。

这一事实——以及作为钙结合蛋白质发挥功能和在发育中和成体脑中的表达模式一起——暗示calsyntenin-1在脑中涉及习得行为、习得情感或记忆内容的加工和贮存的区域中参与钙介导信号的调节。

综合最近发现的在神经可塑性中作为细胞外蛋白酶、具体而言地是组织型纤溶酶原激活物发挥功能的证据(参见Frey等人，J.Neurosci.16，页码2057-2063，1996；Huang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，页码699-704，1996)，该表达模式使得人们推测calsyntenin的钙结合活性在学习和记忆活动中，例如涉及习得行为、习得情感或记忆内容的加工和贮存的活动中起一定作用。

Calsyntenin-1是蛋白酶的底物的事实是特别有趣的，因为例如已发现在兴奋性毒素(excitotoxin)-诱导的癫痫发作的情况下，蛋白酶组织型纤溶酶原激活物(tPA)在神经元细胞损伤或神经元细胞死亡的发病机理中起作用(参见Tsirka等人，Nature 377，页码340-344，1995)。

Calsyntenin-1在脊髓和感觉神经节中的表达模式是有趣的，因为在成体神经系统中，这些分子在被认为在疼痛加工以及病理性疼痛的发病机理中起作用的脑部区域神经元中表达。

Calsyntenin-1与目标在于发现从神经元的轴突分泌的蛋白质的研究有关(参见Stoeckli等人，Eur.J.Biochem.180，页码249-259，1989)。其制备已在几篇在此处包含作为参考的文章中描述(参见Osterwalder等人，EMBO J.15，页码2944，1996；Schrimpf等人，人neuroserpin(克隆和染色体定位于3q26(HumanNeuroserpin(PI12)：cDNA Cloning and ChromosomalLocalization to 3q26)，Genomics，Vol.39，页码1-8(1997))

该克隆程序也可用于其他物种的同源序列的分离，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、母牛、羊、灵长类、鸟、斑马鱼(Brachydaniorerio)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、优雅新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)等。这样的序列优选地用于兽医以避免不相容的反应。

例如通过上述方法获得的编码核苷酸序列可被用于具有上述编码的氨基酸序列的蛋白质的生产。

Calsyntenin基因的编码序列也可被用作分离等位基因和剪接变体或其部分的起始序列，可被用作分离与该序列相应的基因的探针。例如聚合酶链式反应和核酸杂交技术可用于该目的。

Calsyntenin基因的编码序列可被用作所谓的“定点诱变”的起始序列以生成编码上述蛋白质的核苷酸序列，具体而言地是那些Seq.Id.No.1、3和5表示的序列或其部分，但它们的核苷酸序列由于使用可选择的密码子而对于Seq.Id.No.1、3和5表示的序列是简并的。这样的诱变可能是期望的，这取决于用于目的蛋白质表达的宿主细胞。

本发明中公开的编码序列可被用作通过所谓的定点诱变方法生产展示改变的功能的序列变体的起始序列。这样的改变的功能可提供给蛋白质如更长的寿命即更慢的降解、增强的活性等。

编码序列可被用来生产用于基因治疗和细胞工程的载体。

编码序列可被用于超表达本发明的编码或被编码序列的转基因动物的产生。

编码序列可被用于与本发明的序列相应的基因的紊乱的诊断学。

由上述核酸序列编码的氨基酸序列可被用作活性成分，如用作生产抗体的抗原和用作药品开发的目标。

在进一步的方面中，本发明涉及使用本发明的多肽或核苷酸序列或其片段作为药物开发的工具和筛选药剂的工具，具体而言地是结合本发明的蛋白质的化合物的筛选测定。本发明的蛋白质用于结合这样的分子的优选的目标序列是本发明蛋白质的细胞外部分，具体而言地是显示蓝色琼脂糖结合能力的结构域/位点。结合这样的分子的另一个目标序列是细胞内Arp2/3复合物结合结构域，具体而言地是包含本发明的蛋白质的基元MDWDDS...和...LEWDDS(以单字母符号给出的氨基酸序列)的序列。

鉴定对本发明的蛋白质的活性和/或稳定性和/或表达有影响的化合物的适当的体外测定是如采用生物化学或生物物理学检测的体外测定，该测定能够探测特异性蛋白质/配体相互作用，包括如Moy等人，Anal.Chem.73(3)：571-81，2001所描述的MS/NMR、如Hajduk PJ.J.Med.Chem.42(13)：2315-7，1999所描述的基于高流通量核磁共振的筛选或如Kaur S.，J.Protein Chem.，16(5)：505-11，1997所描述的基于质谱分析法的策略，这些文献在此处整体引用作为参考。

本发明的该方面是基于Calsyntenin-1且极可能也有家族成员Calsyntenin-2和Calsyntenin-3能够结合Arp2/3复合物这一发现的。Calsyntenin-1的胞质区段与Arp2/3复合物的结合显示Calsyntenin蛋白质家族在细胞游动性的调节中的作用。在学习涉及细胞表面蛋白质和细胞骨架的相互作用的科学文献时，我们发现Calsyntenin家族所有蛋白质(即Calsyntenin-1、Calsyntenin-2和Calsyntenin-3)的细胞质部分都含有至少一个保守氨基酸序列的有趣的基元，其中含有保守的色氨酸。该基元与具有保守色氨酸的保守酸性氨基酸基元高度相似，所述色氨酸可是在目前已知的几乎所有Arp2/3复合物激活物的Arp2/3-结合结构域中发现。在Calsyntenin-1的细胞质区段中该基元存在两次，一次具有氨基酸序列...MDWDDS...，而另一次具有...LEWDDS...(以单字母符号给出的氨基酸序列)。Calsyntenin-2的细胞质区段含有一个...MDWDDS...和一个...LEWDDS...。Calsyntenin-3的细胞质区段含有一个这类的基元，即...LEWDDS...。Arp2/3复合物通过调节肌动蛋白丝生长和分支而在基于肌动蛋白的细胞游动性的调节中起重要的作用(综述参见：Borisy和Svitkina，Curr.Opin.Cell Biol.12：104-112，2000；Pantaloni等人，Biochem.，70：649-676，2001；Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；以及其中的参考文献)。含有具有保守的酸性氨基酸和色氨酸的相似基元的Arp2/3激活物包括人WASP(Wiscott Aldrich综合症蛋白质的缩写)、相关的人N-WASP、人Scar/WAVE1蛋白质和cortactin，它们分别展示序列...DDEWDD、...DDEWED和...EVDWLE、和...ADDWET...(WASP、N-WASP和Scar/WAVE1参见Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；cortactin参见Uruno等人，NatureCell Biol.3：259-266，2001)。保守的色氨酸和邻近的酸性氨基酸对肌动蛋白多聚化中Arp2/3结合和功能的重要性已经由cortactin的定点诱变证实了(Uruno等人，Nature Cell Biol.3：259-266，2001)。对cortactin的序列...ADDWET...中的色氨酸和色氨酸前的两个氨基酸残基进行的定点诱变导致Arp2/3结合和Arp2/3介导的肌动蛋白多聚化的丧失。所有这些Arp2/3激活物蛋白质均位于细胞质。它们使自跨膜受体与它们的细胞外调节物如生长因子、细胞因子等相互作用衍生的细胞内信号与Arp2/3复合物的活化联系起来了。从活化的跨膜受体到激活Arp2/3激活物的信号级联放大中至关紧要的中间步骤归因于Rho家族的小GTP-结合蛋白质(综述参见：Takai等人，Physiol.Rev.81：153-207，2001)。活化的Arp2/3复合物起始了新肌动蛋白丝的生成和先前存在的肌动蛋白丝的分支(综述参见：Borisy和Svitkina，Curr.Opin.CellBiol.12：104-112，2000；Pantaloni等人，Science 292：1502-1506；Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；以及其中的参考文献)。由于增强的细胞骨架动力学的结果，细胞生成和/或收回了质膜突出，如丝足和片状伪足(Borisy和Svitkina，Curr.Opin.Cell Biol.12：104-112，2000)。该增强的活性转化为生长锥即从神经元延伸的轴突的生长端部的增强活性以及增强的轴突生长和先导活性(pathfinding activities)(Hu和Reichardt，Neuron 22，419-422，1999；Suter和Forscher，.8：106-116，1998；Dickson，Curr.Opin.Neurobiol.11：103-110，2001)。在中枢神经系统神经元的树突棘中，增强的肌动蛋白丝的动力学导致游动性的增加，这依次再调节棘的形态和电特性。结果，对突触前信号的突触后反应可发生改变(Segal等人，TrendsNeurosci.23：53-57，2000；Halpain，Trends Neurosci.23：141-146，2000；Matus，Science 290：754-758，2000；Scott和Luo，Nature Neurosci.4：359-365，2001)。在非神经元细胞中，由Arp2/3激活诱导的肌动蛋白丝动力学的增强导致与增强的膜突出如片状伪足形成相伴随的增强的细胞游动性，以及增强的迁移性(Holt和Koffer，Trend Cell Biol.11：38-47，2001；Mullins，Curr.Opin.Cell Biol.12：91-96，2000；Prokopenko等人，J.Cell Biol.148：843-848，2000)。从细胞表面到细胞骨架的信号传导调节异常改变了肿瘤细胞的迁移活性，该活性是与其增强的侵入性生长和转移活性相联系的(Radisky等人，SeminarsCancer Biol.11：87-95，2001；Kassis等人，Seminars CancerBiol.11：105-119，2001；Condeelis等人，Seminars CancerBiol.11：119-128，2001；Price和Collard，Seminars CancerBiol.11：167-173，2001)。

本发明提供了评价化合物选择性地调节突触钙信号的活性的方法。此处介绍的筛选方法的基本原理是基于此处介绍的免疫电子显微镜研究的。在这些研究中，我们发现全长Calsyntenin-1几乎专一地位于突触后膜中或其下面，然而由蛋白水解切割而生成的跨膜片段则被转位到所谓的棘器膜上了。棘器膜上根本没有全长Calsyntenin-1指示只有蛋白水解切割的Calsyntenin-1是内在化的。显然，蛋白水解切割是Calsyntenin-1的跨膜片段内在化的先决条件。由于Calsyntenin-1蛋白水解切割及随后其跨膜片段的内在化，Calsyntenin-1在突触后膜中的量减少了。结果，Calsyntenin-1的细胞质区段对钙信号的调节影响也减少了。

基于这些特征，Calsyntenin-1在其细胞外区段的蛋白水解切割与突触后膜下面Calsyntenin-1介导的钙结合能力的减少相关。因此，Calsyntenin-1的蛋白水解切割的程度与突触后钙信号的Calsyntenin-1介导调节相关。Calsyntenin-1的蛋白水解切割与突触后钙信号的Calsyntenin-1介导调节之间的这种联系可利用来建立相对简单的测定，以检验化合物作为突触钙信号的调节剂的潜在活性。该测定包含在适当的培养基或缓冲液中使表达Calsyntenin蛋白质和形成突触的神经元细胞培养物或突触小体或突触神经小体制剂与预先选择量的化合物接触。适当时间的温育之后，通过测量全长型Calsyntenin的减少和两种切割产物的增加来测定全长Calsyntenin蛋白质的蛋白水解切割反应进程。与对照相比较，通过测量该神经元细胞培养物或该突触小体或突触神经小体中全长Calsyntenin蛋白质的降解和/或Calsyntenin蛋白质切割产物的生成可评估化合物在调节Calsyntenin蛋白质的胞吞以及Calsyntenin结合结构域从棘器突触后膜下面区域的转位以及因此对突触后钙信号的调节中的效率。

更特定的，本发明提供了确定化合物影响Calsyntenin蛋白质在细胞外部分的切割的能力的方法。典型的实验包括：

a)制备突触形成性神经元细胞培养物(例如来自小鼠或大鼠脑的解离的海马培养物：Goslin等人，1998，神经细胞培养(Culturing nerve cells)，2^nd Ed.，MIT press Cambridge，MA)；或可选择地，利用已确立的操作从啮齿动物(小鼠或大鼠)或鸟类(鸡或鸽子)脑中制备突触小体或突触神经小体(突触小体见：Phelan和Gordon-Weeks，1997，神经化学，实用方法(Neurochemistry，A practical approach)，2^nd Ed.；突触神经小体见：Hollingsworth等人，1985，J.Neurosci.5，2240-2253)。

b)将化合物加入到突触形成性神经元细胞培养物的培养基或含有悬浮的突触小体或突触神经小体的缓冲液中。

c)用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞或突触小体或突触神经小体的蛋白质。

d)用蛋白质印迹分析显现全长Calsyntenin和其片段。

e)测量全长和切割的Calsyntenin的相对的量。

f)比较切割和未切割的Calsyntenin的相对量与在对照条件下获得的切割和未切割的Calsyntenin的相对量。

本发明提供了筛选药品对突触钙信号作用的简单体外系统，这对可选择地调节突触钙信号而不会由于调节非突触钙信号而产生副作用的药品开发将是有用的。测定可以在哺乳动物或鸟类神经元的活突触形成性培养物上或在分离的哺乳动物或鸟类突触(所谓的突触小体或突触神经小体)上进行，这些可以相对容易地分别培养或制备。用蛋白质印迹分析对Calsyntenin蛋白水解切割进行评估也是相对简单的程序。因而，该测定适用于大量化合物的高流通量筛选。

本发明也涉及鉴定称为“途径基因(pathway gene)”的基因的方法，该基因与Calsyntenin基因产物或由其延伸的生物化学途径有关联。如在此处所用的，“途径基因”指基因产物展示与Calsyntenin基因产物相互作用能力的基因。

适用于探测蛋白质-蛋白质相互作用的方法可被用于通过鉴定基因产物和Calsyntenin基因产物的相互作用而来鉴定途径基因产物。这样的已知基因产物可为细胞内的、跨膜的或细胞外的蛋白质。那些与这样的已知基因产物相互作用的基因产物代表途径基因产物，且其编码基因代表途径基因。

可采用的传统方法中有共免疫沉淀、通过梯度或层析柱的交联和共纯化。利用如这样的程序使得可鉴定途径基因产物。一旦鉴定到，途径基因产物即可与标准技术一起用于鉴定其相应的途径基因。例如，至少一部分途径基因产物的氨基酸序列可用本领域技术人员公知的技术来确定，如通过Edman降解技术(参见如Creighton，1983，蛋白质：结构和分子原理(Proteins：Structure and MolecularPrinciples)，W.H.Freeman & Co.，New York，pp.34-49)。获得的氨基酸序列可用于指导生成可用来筛选途径基因序列的寡核苷酸混合物。筛选可以用如标准的杂交或PCR技术来实现。生成寡核苷酸混合物和筛选的技术是众所周知的。(参见如Ausubel等人，eds.，1987-2000，分子生物学最新操作(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.New York，和PCR操作：方法和应用指导(PCR Protocols：A Guide to Methodsand Applications)，1990，Innis，M.等人，eds.AcademicPress，Inc.，New York)。

此外，可采用能同时鉴定编码与Calsyntenin基因产物相互作用的蛋白质的途径基因的方法。这些方法包括如用标记的Calsyntenin蛋白质探查表达文库，其中以与众所周知的lambda gtll文库抗体探查技术相似的方式使用所述蛋白质。

仅仅为了说明的目的而不是为了限制，详细描述了一种体内检测蛋白质相互作用的这样的方法，即双杂交系统。已经描述了这种系统的一种版本(Chien等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582)并由Clontech商业性的提供(Palo Alto，Calif.)。

简要地，利用这样的系统，构建编码双杂交蛋白质的质粒：一个由融合到已知蛋白质的转录激活物蛋白质的DNA-结合结构域组成，而另一个由融合到未知蛋白质的激活物蛋白质的激活结构域组成，其中所述未知蛋白质是由作为cDNA文库的部分而重组入该质粒中的cDNA编码的。将质粒转化入含有报告基因(如lacZ)的酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株中，其中报告基因的调节区含有激活物结合位点。单独每一个杂交蛋白质不能激活报告基因的转录：DNA-结合结构域杂交体是因为它不提供激活功能，而激活结构域杂交体是因为它不能定位到激活物结合位点。两种蛋白质的相互作用重构了功能性的激活物蛋白质并导致报告基因的表达，这可由对报告基因产物的测定来探测。

双杂交系统或相关的方法学可用于筛选激活结构域文库，以寻求与Calsyntenin基因产物(此处也称为已知的“诱饵”基因蛋白质)相互作用的蛋白质。可将总的基因组或cDNA序列融合到编码激活结构域的DNA上，将这样一个文库和编码融合到DNA结合结构域的诱饵基因蛋白质杂交体的质粒共转化入酵母报告基因菌株中，然后对所得的转化体筛选那些可表达报告基因的转化体。可纯化这些菌落并分离造成报告基因表达的文库质粒。然后可用DNA测序鉴定由文库质粒编码的蛋白质。

例如，但不是为了限制，可将诱饵基因克隆入载体，使它在翻译上融合编码GAL4蛋白质的DNA-结合结构域的DNA。

要在其中检测与诱饵基因相互作用的蛋白质的细胞系的cDNA文库可用本领域中的常规方法建成。根据如在此处描述的特别的系统，可将cDNA片段插入到载体以至于它在翻译水平上融合GAL4的激活结构域。该文库可与诱饵基因-GAL4融合质粒共转化入含有lacZ基因的酵母菌株中，其中的lacZ基因由含有GAL4激活序列的启动子驱动。cDNA编码的融合了GAL4激活结构域且可与诱饵基因相互作用的蛋白质将重构活性的GAL4蛋白质并因此驱动lacZ基因的表达。表达lacZ的菌落可通过X-gal存在时其蓝色探测。然后从这些菌株中纯化cDNA，并用来以本领域中的常规技术生产和分离与诱饵基因相互作用的蛋白质。

发现途径基因的另一个方法是真核表达克隆。表达克隆方法使得可以从包含在真核表达载体中的cDNA文库中分离编码可物理地与目的蛋白质相互作用的cDNA。在过去的几年中，该方法已成为鉴定许多不同的蛋白质和其他分子的结合伴侣的有力的方法(参见Simmons，1993，通过在哺乳动物细胞中的瞬时表达来克隆细胞表面分子(Cloning cell surface molecules by transientexpression in mammalian cells)，IRL Press at OxfordUniversity Press，New York；Ausubel等人，2000，Curr.Protocols in Molec.Biol.)。与双杂交系统技术相反，该方法是在细胞外区室探测蛋白质-蛋白质相互作用的优选技术。此处仅为了说明而不是为了限制详细描述了本方法的一个方案。

表达克隆方法包括：

构建和/或纯化将用于筛选的探针

从适当的mRNA来源构建cDNA表达文库

筛选该表达文库并确定表达与探针相互作用的配体的阳性库

亚克隆直到发现具有配体cDNA的单克隆。

在培养的哺乳动物细胞中筛选cDNA表达文库比在细菌培养物中筛选噬菌体或质粒文库更费力。这需要扩增细菌cDNA文库克隆中的质粒cDNA，分离及随后转染哺乳动物以进行表达。然而，哺乳动物细胞如COS细胞是用于该目的的理想宿主。这些细胞能够从cDNA模板正确地合成长的翻译产物并能在细胞外区室内正确地完成蛋白质的折叠及其翻译后修饰。设计探针以筛选cDNA表达文库的一种可能是将目的蛋白质与碱性磷酸酶融合(Flanagan和Leder，1990，Cell63，185-194)。碱性磷酸酶(AP)具有内在酶活性，可被用于高灵敏度地追踪融合蛋白质。AP的极其多种的底物使得可在溶液中定量测定或原位探测。由于有抗AP的抗体可供利用，因此AP-融合蛋白质的免疫检测也是可能的。

真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)对于AP-标记的融合蛋白质的生产是适用的。因为Calsyntenin与其配体的相互作用可能被扰动，所以如果结合位点位于AP标记融合的区域附近，则对于在筛选程序中包括的Calsyntenin的每一片段应生成两个构建体，一个构建体中AP标记融合到3’-末端而另一个构建体中AP标记融合到5’-末端。融合蛋白质可以在适当的真核细胞系如HEK293T或COS中瞬时表达。将充分表达的蛋白质用如蛋白质印迹分析来检验并用AP测定来量化。由于Calsyntenin蛋白质在遍及脑中的神经元包括海马中表达，可以检验探针对于解离的海马神经元培养物的结合。用来自其他脑区域的培养的神经元或组织切片对探针进行检验也是可能的。

为了获得表达和结合实验的对照，可将分泌的AP的序列插入到相同的表达载体中。使用内源分泌信号和Calsyntenin或AP的Kozak序列以及CMV启动子，可保证融合蛋白质的有效翻译及其分泌到培养基上。

将这样生成的载体用磷酸钙转染方法或其他转染方法如电穿孔或脂转染法转染入人胚胎肾细胞系HEK293T。在转染后3-4天收集条件培养基。通过测定条件培养基中的AP活性来估计表达蛋白质的量。使条件培养基样在含有AP的可溶性底物的缓冲液中稀释。AP转化底物的速度与该酶的活性成比例。由于AP将底物转变有色的产物，所以可能光谱计量性地测量。表达的蛋白质也可用抗AP的多克隆抗体通过蛋白质印迹分析进行检验。因而，融合蛋白质的表现分子量可作为其完整性的对照而测定。

真核表达克隆需要适当的RNA来源以生成cDNA文库。编码Calsyntenin蛋白质的mRNA主要在中枢神经系统的神经元中表达，包括海马的神经元。对小鼠脑切片的免疫组织化学染色也在蛋白质水平上证实了Calsyntenin-1在这些脑区域中的表达。因此，可合理地假定推定的配体是在Calsyntenin蛋白质所处的位置的相同区域表达的。为了检验该假说，制备了解离的海马细胞培养物并检验探针的结合。结合测定是根据下面的方法实现的。将解离的海马神经元简单地预先固定并在含有适当探针的缓冲条件培养基中温育90分钟。随后，洗涤细胞并进行短暂预先固定。然后使内源热敏感性AP通过在65℃温育细胞2小时而灭活。插入到融合蛋白质的AP是热稳定性的并在这一步骤后保持活性。最后将细胞与含有可被AP转变为有色沉淀的底物的染色缓冲液进行温育。因此，表达可结合探针的分子的细胞被染成了蓝色。

用于生成表达载体的cDNA可用标准技术从成年小鼠、大鼠或人的脑中所得的mRNA来生成(参见Ausubel等人，2000)。用于将文库转染到COS细胞中的真核表达载体包括如pCDM8(Aruffo和Seed，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，8573-8577)或更近的pcDNA31(Invitrogen)。对于文库的生成，已成功地使用了各种操作(参见如Simmons，1993)。在生成后，cDNA表达文库可立即被分为约200库，复杂度为每库1000-5000个菌落形成单位(Colony-forming units，cfu)。将每一个库涂平板培养，例如一式三份。在每一个平板上生长500-1000cfu。36小时后，当菌落达到直径为2-3mm时，将细菌用培养基从培养板中洗涤下来。可将部分细菌悬液与甘油混合并冷冻贮存以作为随后亚库构建的备份。其余的悬液可被用于质粒DNA的分离。例如用单个cDNA文库中库的质粒DNA转染COS细胞，48小时后，当cDNA片段表达时，对他们检测探针结合。转染的效率和染色反应的质量一直是由神经菌毛蛋白-1(neuropilin-1)的cDNA对细胞的转染和用他们与AP融合的已知结合伴侣semaphorin-III对这些对照细胞染色来作为对照的。作为负对照，模拟转染的细胞用Calsyntenin-AP和semaphorin-AP两者染色。所有cDNA文库的库都可以一式三份进行筛选。

所有的阳性库都可以进行亚分库的程序。从每一个阳性库的备份里培养了50个平板，使得在每个平板上有约100cfu存在。当菌落可见时即制取复制物。将复制物和原始平板两者都进一步温育直到菌落达到约2-3mm的直径。然后将细菌从复制平板上洗涤并分离质粒DNA。将原始平板贮存在4℃以备下一轮的亚分库使用。然后用分离的DNA转染COS细胞，并在2天后用相同的探针检验。

一旦鉴定和分离了途径基因，即可进一步地如在此处所讨论的进行表征。

如在此处所述的，鉴定为途径基因产物的蛋白质可被用于调节Calsyntenin的基因表达。作为选择地，鉴定为途径基因产物的蛋白质可被用于调节Calsyntenin的蛋白水解切割以及Calsyntenin的跨膜片段与其钙结合细胞质结构域的内在化。作为选择地，鉴定为途径基因产物的蛋白质可被用于调节Calsyntenin的钙结合结构域对突触钙信号的影响。途径基因自身可作为调节的目标以继而调节Calsyntenin蛋白质的功能。

在筛选中鉴定的化合物将证明作为突触钙信号的调节物选择性地调节Calsyntenin蛋白质的活性的能力。这些化合物包括但不局限于调节切割Calsyntenin蛋白质的细胞外部分的蛋白酶的蛋白水解活性的小有机分子、与Calsyntenin蛋白质的细胞外部分结合并因而调节Calsyntenin蛋白质对蛋白水解切割和/或内在化的易感性的分子、与Calsyntenin蛋白质的跨膜或细胞质结构域结合并调节其与钙的亲和力或其钙结合能力的分子，以及与Calsyntenin蛋白质的任意部分结合并调节其与大分子配体如那些在此处所描述为途径蛋白质或途径基因的相互作用的分子。这些化合物也包括但不局限于编码Calsyntenin蛋白质和其同系物、类似物和缺失物的核酸，以及反义物、核酶、三股螺旋、双链RNA、抗体和多肽分子和小的无机或有机分子。

任何鉴定的化合物都可引入动物宿主包括病人，引入形式可以其自身或存在于药物组合物中，在其中它与适当的载体或赋形剂相混合，引入量足以在治疗上有效地治疗或改善多种紊乱，包括那些特征在于Calsyntenin活性的不足、异常或过度的紊乱。治疗有效量进一步指足以导致与这样的紊乱有关联的症状改善的化合物的量。有关本申请化合物制剂和引入的技术可发现于《Remington药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.，最新版。

许多紊乱可由Calsyntenin活性的不足、异常或过度所引起。另外，几个有时认为可能不需要的生理状态也可能与Calsyntenin的活性有关联。作为例子但不是为了限制，这样的可用本发明化合物治疗的紊乱和生理状态包括但不局限于精神病紊乱如精神分裂症或抑郁症、神经紊乱如Alzheimer病、中风和急性头部损伤、急性或慢性头疼、高血压和心肌梗死。

其他选择可包括直接递送用克隆的基因经遗传方法生产和纯化的酶。其他同工型可存在并可利用Calsyntenin序列进行克隆。本发明的化合物可针对组织特异性进行设计或引入。如果化合物包含核酸分子，包括那些含有表达载体的，则可将它连接对目的组织特异的调节序列上，如脑、肾、心等，所用的为本领域公知的方法，包括那些阐明于Hart，1994，Ann.Oncol.，5 Suppl 4：59-65；Dahler等人，Gene，145：305-310；DiMaio等人，1994，Surgery，116：205-213；Weichselbaum等人，Cancer Res.，54：4226-4269；Harris等人，1994，Cancer，74(Suppl.3)：1021-1025；Rettinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA，91：1460-1464；和Xu等人，Exp.Hematol.，22：223-230；Brigham等人，1994，Prog.Clin.Biol.Res.，388：361-365中的方法。本发明的化合物可通过直接注射到特定位点而定位到该位点。设计用于中枢神经系统的化合物应该能够穿过血脑屏障或适合于通过局部化地注射而引入。另外，保持在血管系统中的本发明的化合物在治疗血管炎症时可以是有用的，该炎症可能因动脉硬化、囊形血管成形术(balloonangioplasty)、导管插入术、心肌梗死、血管阻塞和血管外科手术而引起。保持在血流中的这样的化合物可通过本领域中众所周知的技术而制备，包括那些在McIntire，1994，Annals Biomed.Engineering，22：2-13中更充分地描述的。

适用于本发明的药物组合物包括其中以有效量含有活性成分以达到预期目的的组合物。更明确地，治疗有效量意思指可有效防止所治疗个体中症状的发展或减轻现有症状的量。有效量的确定在本领域的技术人员的能力范围内的，根据在此处提供的详细公开内容尤其清楚。

对于任何在本发明的方法中使用的化合物，治疗有效量最初可从细胞培养测定来估计。例如，可在动物模型中设计剂量以实现如在细胞培养物中确定的包括IC50(即其中50％的细胞显示预期作用的剂量)的循环浓度范围。这样的信息可被用于在人中更准确地确定有用的剂量。

治疗有效量指导致病人症状的改善或生存延长的化合物的量。这样的化合物的毒性和治疗功效可由细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，如确定LD50(对菌落的50％为致死的量)和ED50(对菌落的50％在治疗上有效的量)。毒性效果和治疗效果之间的剂量比率为治疗指数，且可表达为LD50和ED50之间的比率。展示高治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可用于设计用于人中的剂量范围。这样的化合物的剂量优选地在包括ED50、很少或无毒性的循环浓度范围内。该剂量可依赖于所采用的剂量形式和引入的途径而在这个范围内有变动。精确的制剂、引入途径和剂量可由个别内科医师考虑病人的情况来选择。(参见如：Fingl等人，1975，in《治疗的药物学基础(ThePharmacological Basis of Therapeutics)》，Ch.1 p1)。可单独调整剂量和间隔以提供足以维持预期作用的活性部分的原生质水平。

在局部引入或选择性摄入的情况下，药品的有效局部浓度与原生质浓度可能不相关。

当然，引入的组合物的量将依赖于被治疗的被试者、被试者的体重、痛苦的严重程度、引入的方式和开处方的内科医师的判断。

本发明的药物组合物可以其自身已知的方式来制造，如以常规的混合、溶解、制粒化、糖锭剂制造、研磨、乳化、胶囊化、俘获(entrapping)或冻干的方法。

因而可根据本发明使用的药物组合物可用一种或多种生理上可接受的载体以常规方式而配制，其中的载体包含可促进将活性化合物加工入在药物学上可使用的制剂中的赋形剂和辅助剂(auxililiaries)。适当的制剂依赖于所选择的引入途径。对于注射，本发明的试剂可配制为水溶液，优选地配制在生理学相容的缓冲液，如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液中。对于跨粘膜引入，在制剂中要用到适合于透过屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域所公知的。

对于口服引入，化合物可容易地通过使活性化合物与本领域中众所周知的药物学上可接受的载体混合而设计。这样的载体使得本发明的化合物能被配制成片剂、药丸、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等以使要治疗的病人口服摄取。用于口服的药物制剂可从固体赋形剂获得，任选地研磨所得的混合物，然后处理颗粒混合物，如果需要在加入适当的辅助剂之后即获得片剂或糖衣核心。具体而言地，适当的赋形剂为如糖类的填料，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素制剂如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄菁胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或褐藻酸或其盐如褐藻酸钠。

对糖锭剂核心提供适当的外衣。为此目的，可用到浓缩的琼脂溶液，它可任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普(carbopol)凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆(lacquer)溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料原料或色素添加到片剂或糖锭剂外衣中以鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。

可口服使用的药物制剂包括由明胶制得的推入胶囊，以及由明胶和增塑剂制得的柔软密封胶囊，如甘油或山梨糖醇。推入胶囊可在与填料如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选地稳定剂的混合物中含有活性成分。在柔软的胶囊中，活性化合物可被溶解或悬浮于适当的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。所有用于口服的制剂都应用适合于这种引入的剂量。对于经颊引入，组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。对于通过吸入的引入，根据本发明而所用的化合物以来自受压包或雾化器的气溶胶喷雾呈递的形式而方便地送递，其中用到了适当的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体。在受压的气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供测定量的阀门来确定。用于吹入器或吸入器的如明胶的胶囊和药筒可被设计为含有化合物和适当的粉末基料如乳糖或淀粉的粉末混合物。

化合物可设计为通过注射的肠胃外引入，如通过大丸剂注射或连续的灌注。用于注射的制剂可与添加的防腐剂以单位剂量的形式存在，如在安瓿或多剂量容器中。组合物可采用这样的形式如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可含有调配剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

用于肠胃外引入的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的悬浮液可制备成适当的油性注射悬浮液。适当的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射悬浮液可含有能增加悬浮液粘性的物质，如羧基甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可含有适当的稳定剂或增加化合物溶解性的试剂以使得可制备高浓度的溶液。或者，活性成分可采用粉末的形式以在使用前用适当的载体如无菌的无致热原的水重溶。化合物也可制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，如含有常规的栓剂基料如可可油或其他甘油酯。除了前面描述的制剂之外，化合物也可配制成贮存制剂。这样长期作用的制剂可通过植入(例如皮下或肌内地)或肌内注射而引入。因而，化合物可用如适当的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂来配制，或作为溶解度有限的衍生物如溶解度有限的盐。

本发明的疏水化合物的药物载体是一种包含苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混合有机聚合物和水相的共溶剂系统。自然地，该共溶剂系统的比例可有相当大的改变而不破坏其溶解性和毒性特征。此外，该共溶剂成员的类型可有变动。

或者，可采用其他疏水药物化合物的送递系统。脂质体和乳剂是疏水药物公知的送递工具或载体的例子。也可采用某些有机溶剂如二甲基亚砜，尽管通常有更高的毒性。此外，可以用缓释系统来送递化合物，如含有治疗试剂的固体疏水聚合物的半透性基质。业已建立多种缓释系统且是本领域技术人员所众所周知的。依赖于其化学本性，缓释胶囊可在几个星期至超过100天内释放化合物。依赖于治疗试剂的化学本性和生物学稳定性，可以采用额外的蛋白质稳定策略。

药物组合物也可包含适当的固相或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实施例包括但不局限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。

本发明的许多化合物可以与药学相容性抗衡离子形成的盐的形式提供。药学相容性盐可与许多酸形成，包括但不局限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。相比于相应的游离碱形式，盐类在水性或其他质子溶剂中更可溶。

引入的适当途径可包括如口服的、直肠的、跨粘膜的、经皮肤的或经肠的引入；肠胃外送递，包括肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。

或者，可将化合物以局部而非全身的方式引入，例如通过直接将通常为贮存液或缓释制剂的化合物注射到受影响的区域。此外，可将药品在定向的药品送递系统中引入，例如在用受影响的细胞特异性的抗体包被的脂质体中施用。该脂质体将被导向这些细胞并被其选择性地摄入。

如果需要，组合物可在含有一种或多种含活性成分的单位剂型的包装或分配器中呈递。该包装可包含如金属或塑料箔，如发泡药包装。该包装或分配器与用药说明书一起提供。也可以制得包含配制在相容性药物载体中的本发明的化合物的组合物，将其置于适当的容器中，然后标记所治疗的状况。在标签上指明的适当的状况可包括如特征在于calsyntenin-1活性不足、异常或过度的疾病的治疗。

刚才略述的上述核酸序列和氨基酸序列的用处已表示在本发明的范围内，是非常适用于涉及蛋白酶的紊乱的，具体而言地是涉及tPA的疾病，且对中风的治疗尤其适合。例如在中风的治疗中，calsyntenin或calsyntenin衍生的蛋白质在短期治疗和长期治疗中都是适当的药物。

在急性的状态下，即在中风后的前几个钟头内，目前优选的应用模式是直接应用大量的calsyntenin蛋白质，优选地为鞘内应用，即直接注射入脑脊液中。

对于中风的长期治疗，即损害的恢复，优选的方法是细胞治疗。

对于基因治疗和/或细胞治疗，要将编码calsyntenin蛋白质的核酸序列(认为calsyntenin蛋白质的表达包括具有蛋白酶抑制剂的等位基因和突变体，至少具有tPA抑制剂活性)引入到适当的载体中以使得calsyntenin基因在所针对的神经细胞或特定的治疗细胞中表达。这样的适合于基因治疗和使得calsyntenin表达的载体包含在神经细胞特异性启动子控制之下的calsyntenin-1编码基因。

对于基因治疗，适当的载体为可直接地或在转运细胞中进行应用的神经营养性病毒(neurotrophic virus)。

也可将Calsyntenin表达细胞被囊化以使得可通过外科治疗而将它们带到想要作用的中心，且不相容反应的危险大大降低。一旦这样的细胞不再需要或一旦它们失去了活性因而需要替换即可将它们除去。

上述治疗中风的所有方法都可相似地应用于由蛋白酶、具体而言地是tPA诱发的其他的紊乱。这样的紊乱也包含如那些由于tPA对细胞迁移的作用而诱发的肿瘤，以及通常在其生长、扩展、渗入、转移和促进血管或新血管发生中涉及至少一种蛋白酶的肿瘤。这样的蛋白酶优选地为至少一种下面的蛋白质家族的成员：

-丝氨酸蛋白酶家族，如组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶、凝血酶、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、神经胰蛋白酶(neurotrypsin)、neuropsin

-基质金属蛋白酶家族，如胶原酶、明胶酶、溶基质素、matrylisins，

-半胱氨酸蛋白酶家族，如组织蛋白酶B和组织蛋白酶D。

除上面进一步描述的治疗之外，本发明也提供了非常有用的诊断工具。通过已经在上面提及的PCR和杂交方法，可以确定Calsyntenin编码蛋白质的遗传缺陷。这样的确定有助于其症状已可观察的紊乱的诊断，并且有助于确定发展为这样的紊乱的危险增加的人或人群，如家庭。

当然也可能通过合成或化学方法生产蛋白质、肽或核酸序列，它们代表了至少上述序列的部分并具有分别模拟或阻断Calsyntenin的生物学活性、具体而言地是钙结合活性的能力。

此外，缺陷基因或由这样的基因编码的缺陷蛋白质的表征和分离提供了筛选可能药物的有效工具，该药品可改善遭受由这样的缺陷引起的紊乱的病人的健康。

转基因动物具体而言地对于搜寻更多的紊乱乃至药品是有非常大的价值的。

本发明的这些方面和更多方面现进一步描述于下面的实施例中。然而，必须理解它们并非意味着限制本发明的范围。它们仅仅是为了说明的目的。

实施例1：

对从胚胎鸡脊髓神经元的神经突释放的蛋白质的筛选鉴定了115kD的蛋白质为Calsyntenin-1的蛋白水解片段。

在搜寻神经突释放的蛋白质中，我们在区室化细胞培养系统中培养了解离的脊髓神经元，该系统可提供对神经元体和神经突的单独接触(图1C)。该区室化细胞培养系统是以如Campenot(1979)，Methods Enzymol，58，302-7所述的方法建立的。将来自E6鸡胚胎脊髓腹侧一半的解离细胞培养在前述的区室化培养系统的中央区室中(Sonderegger等人，1984，J.Cell Biol.，98(1)：364-8)。铺板培养6天后，当旁边的区室中神经突浓密地增加时(图1B)，将新合成的蛋白质通过向中央区室添加含[³⁵S]甲硫氨酸的新鲜培养基而进行代谢标记(Stoeckli等人，1989，Eur.J.Biochem.，180(2)：249-58)。40小时后，将中央和旁边区室两者的条件培养基都收获并进行双向凝胶电泳(O’Farrell，J Biol Chem.1975 May25；250(10)：4007-21.)，随后对新合成的蛋白质进行荧光检测(Bonner和Laskey，Eur J Biochem.1974 Jul 1；46(1)83-8.)(图1D和E)。如在图1D中所表示的，中央区室的上清液含有相对大数目的蛋白质，而在旁边的区室中只发现了4个强的蛋白质斑点(图1E)。因为从中央向旁边区室扩散的蛋白质没有达到其在中央区室浓度的10％以上，我们推断这4个蛋白质必衍生自旁边区室的神经突中(对于用相同系统的定量研究，参见Stoeckli等人，1989，Eur.J.Biochem.，180(2)：249-58))。它们中的一个(图1E，箭头1)以前鉴定为neuroserpin，即一种轴突分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Osterwalder等人，EMBO J.1996；15(12)：2944-53.)。基于分子量和pI，三种其他的蛋白质尚未知。分离表观分子量为115 kD、pI为5.9-6.3的蛋白质(图1E的箭头2)，并如在随后的实施例中表征。纯化、氨基酸测序和cDNA克隆(参见实施例2和3)揭示，从胚胎鸡脊髓神经元的神经突释放的115 kD蛋白质是一种跨膜蛋白质的蛋白水解片段。由于它的突触定位(参见实施例10和11)和它以其细胞质结构域结合钙的能力(实施例6)，我们将其称为Calsyntenin-1。为了简短清楚，我们将在所有实施例中采用术语Calsyntenin-1。

实施例2：

从跨膜锚定的Calsyntenin-1蛋白质释放的115 kD片段的纯化和微量测序。

对于从区室化培养系统中脊髓神经元的神经突释放的Calsyntenin-1的115 kD片段的纯化(参见实施例1)，我们使用了来自E6鸡脊髓的腹侧一半的解离培养物的条件培养基。将来自E6鸡脊髓的腹侧一半的6×10⁶个细胞培养在60mm的胶原蛋白包被的培养皿(猪胶原蛋白，25010 COL1，Corning，NY)中，生长7天，其中更换一次培养基。为了收获释放的蛋白质，将细胞用不含补加物的预热的MEM洗涤2次，并在含有营养混合物N3(Bottenstein和Sato，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1979，76(1)：514-7)而缺少BSA和运铁蛋白的无血清培养基上生长2-3天。将条件培养基收获、通过0.22μm的滤器过滤，然后贮存于-20℃。

对于Calsyntenin-1的纯化，将条件培养基用缓冲液A(20mMTrIS-Cl，pH8.0)进行透析，除去气体，再次通过0.22μm的滤器过滤，然后加入到1ml的流速为1ml/min的Mono Q阴离子交换柱(Pharmacia)上。在用10体积的缓冲液A洗涤柱子后，将蛋白质于20ml的0％到50％缓冲液B(1M NaCl在20mM Tris-Cl中，pH8.0)的梯度进行洗脱。收集3ml组分并用双向SDS-PAGE进行分析(O’Farrell，J Biol Chem.1975 May 25；250(10)：4007-21.)，随后进行银染色(Heukeshoven和Dernick，Electrophorsis.1988；9(1)：28-32.)。Calsyntenin-1在300到450mM NaCl之间洗脱。

对于通过双向SDS-PAGE的制备分离，合并级分并或者根据Wessel和Fluegge(Anal.Biochem.(1984)，138：141-3)进行浓缩或者通过多孔的膜进行离心浓缩(Ultrafree-20，Milipore，Bedford，MA)。双向SDS-PAGE是根据O’Farrell(1975)实现的，其中将3-4个来自阴离子交换柱的浓缩级分加入到一块凝胶中。用于等电聚焦步骤的安福灵(Ampholine)溶液由1.6％的pharmalyte5/8、0.4％的pharmalyte 3/10和0.8％的pharmalyte 4/6(均来自Pharmacia)组成。在等电聚焦期间凝胶的pH范围为pH4.9-6.8。第二向是在7.5％的SDS-PAGE凝胶上进行的(Lmmli，1970)。

用考马斯蓝染色后，将Calsyntenin-1的凝胶对应物蛋白质斑点切下并用漏斗-孔浓缩系统(funnel-well concentration system)通过SDS-PAGE进行处理(Lombard-Platet和Jalinot，NucleicAcids Res.1993，21(17)：3935-42)。由Lombard-Platet和Jalinot(1993)发明的漏斗-孔凝胶电泳系统是从几个凝胶片中浓缩蛋白质的方法。使2个形成漏斗的间隔物接到Bio-Rad的微型凝胶系统(Bio-Rad，Richmond，CA)上。用20％的丙烯酰胺进行密封。由10％的丙烯酰胺组成的电泳胶长度为1cm，由4％的丙烯酰胺组成的积层胶长为4-5cm。

在向漏斗-孔上样之前，使含有Calsyntenin-1的凝胶片在20％乙醇/5％乙酸中褪去考马斯蓝，并于室温在样品缓冲液(4％甘油、2.5％SDS、2.5％β-巯基乙醇在25mM Tris-Cl中，pH6.8)中平衡3小时。将多达8片的含有Calsyntenin-1的凝胶片小心地转移到漏斗-孔中，用电泳缓冲液覆盖并于50V在凝胶中浓缩2小时。在浓缩过程中，电流从10mA变为4mA。浓缩的进展可通过对凝胶内前部蛋白质的目测检查监视(归因于施利仑作用(schliereneffect))。当蛋白质在电泳胶的中部浓缩时，使电泳停止以进行胶内消化或转移到PVDF膜上进行直接氨基酸测序。在一般的实验中，获得了含有约20μg Calsyntenin-1的蛋白质条带。在切下并用40％的正丙醇(LichroSolv grade，Merck)褪色后，用0.2M NH₄HC0₃、50％的乙腈抽提Calsyntenin-1并在真空离心蒸发浓缩器(SpeedVac)中干燥。为了对N-末端测序，将浓缩的Calsyntenin-1从凝胶电转移到PVDF膜上(Immobilon P^SQ，Millipore)。PVDF膜上含有Calsyntenin-1的区域可通过放射自显影来定位并切下。其序列通过在蛋白质测序仪(Model 477 A，Applied Biosystems，Inc.)上以Edman降解法确定。

对于内部肽的测序，在由漏斗-孔系统获得的凝胶片内进行胰蛋白酶消化(Jeno等人，Anal Biochem.1995；224(1)：75-82.)。将Calsyntenin-1用上述的双向SDS-PAGE进行处理，用考马斯蓝染色，切下，然后在漏斗-孔系统中浓缩。将约20μgCalsyntenin-1的蛋白质条带切成小片。凝胶片用40％的正丙醇(LichroSolv grade，Merck)褪色，用0.2M NH₄HCO₃、50％的乙腈抽提并在真空离心蒸发浓缩器(Speed Vac)中完全干燥30分钟。胰蛋白酶消化在含有1μg胰蛋白酶(Promega，Madison，WI；0.5μg/μl在1mM HCl中)的消化缓冲液(5％的乙腈在100mM Tris-Cl中，pH8.0)中进行并在37℃温育18小时。用消化缓冲液以及80％的乙腈、0.1％的三氟乙酸抽提肽。使合并的抽提物蒸发以得到反相HPLC柱的注射量(30-50μl)。用连接到质谱仪(API-III，PESciex，Thornhill，Ontario)的反相HPLC柱(Vydac C8，5μm大小颗粒，1mm(i.d.)×250mm；Vydac，Hesperia，CA)分离肽。溶剂A为0.1％的三氟乙酸，溶剂B为含有0.09％三氟乙酸的80％乙腈。所用的洗脱程序为：5％溶剂B5分钟；5％到60％溶剂B以流速50μl/min进行60分钟。在215nm监控流出液。将90％的洗脱体积收集并将10％联机注射到质谱仪(API-III，PE Sciex，Thornhill，Ontario)上。分析层析谱并选择单一肽级分进行测序。序列分析是根据生产商的操作在Model G 1005蛋白质测序仪(Hewlett-Packard，Camas，WA)上完成的。

用此方法，确定了从脊髓神经元培养物中释放的Calsyntenin-1的115 kD片段的N-末端和7个内部肽的氨基酸序列。发现了下面的序列：

N-末端序列(氨基酸的单字母符号)：

ARVNKHKPWIETTY(Seq.Id.No.7)

内部肽：

肽编号  氨基酸序列

1.      HKPWIETTYHGIVTENDNTVLLDP(Seq.Id.No.8)

2.      VEAVDA(Seq.Id.No.9)

3.      IEYEPGTGSLALFPSMR(Seq.Id.No.10)

4.      IPDGVVT(Seq.Id.No.11)

5.      TYKPAEFHW(Seq.Id.No.12)

6.    EGLDLQIADGV(Seq.Id.No.13)

7.    GIEMSSSNLGMIITGVDTMASYEEVLHL(Seq.Id.No.14)

一个内部肽(肽编号为1)的序列与N-末端序列交迭，因而生成了N-末端序列长达29氨基酸的延伸，序列如下：

ARVNKHKPWIETTYHGIVTENDNTVLLDP

实施例3：

鸡Calsyntenin-1 cDNA的克隆和测序

将N-末端和内部肽的氨基酸序列用于设计简并引物，利用来自E14鸡脑的总RNA作为模板进行RT-PCR。总RNA是从E14鸡脑和P10小鼠小脑中制备的(Chomczynski和Sacchi，Anal Biochem.1987；162(1)：156-9)。oligo(dT)-和随机引发的cDNA是用M-MLV逆转录酶(Promega)生产的。对于PCR，合成了与氨基末端和4个内部肽相应的兼并引物。(有义引物：5’-GTIAAMAAGCAYAAGCCITGGAT-3’(Seq.Id.No.15)和5’-CATGGIATHGTIACIGAGAATGATAA-3’(Seq.Id.No.16)；反义引物：5’-CCIGTICCIGGCTCATACTCDAT-3’(Seq.Id.No.17)、5’-GTATCIACICCITADATDATCATICC-3’(Seq.Id.No.18)、5’-ACICCATCIGCDATCTGIAAATC-3’(Seq.Id.No.19)和5’-GCATCAAACTCIGCCTCCTTATAAAA-3’(Seq.Id.No.20)。PCR是用Taq DNA聚合酶(Promega)进行的。将PCR片段测序并用于筛选cDNA文库。oligo(dT)引发的E14鸡脑cDNA文库(Zuellig等人，1992；Eur.J.Biochem 204(2)：453-63)、oligo(dT)引发的P20小鼠脑cDNA文库(Stratagene)、oligo(dT)-和随机引发的E15小鼠脑cDNA文库(Clontech)和oligo(dT)引发的和随机引发的人胎脑cDNA文库(Clontech)的大约2.5×10⁶个斑点分别通过在高度严格的条件下与相应的放射性标记的PCR片段进行杂交而筛选(Sambrook等人，1989；《分子克隆，实验室手册(MolecularCloning.A Laboratory Manual)》)。进一步鉴定阳性克隆的特征。

最长的PCR产物具有2.2kb的长度。它含有一个编码所有前面确定的氨基酸序列的单一的可读框(ORF)(图2)。用该片段作为探针筛选oligo(dT)引发的E14鸡脑cDNA文库(Zuellig等人，1992；Eur.J.Biochem 204(2)：453-63)得到了含有额外的ORF3’序列和3’非翻译区的克隆。复合的cDNA含有2850nt长的ORF(起始于纯化的蛋白质的氨基末端)。其亲水性图提供了靠近C-末端的19个氨基酸的单一跨膜区段的证据(图2)。因此，我们推断，成熟的蛋白质由831个氨基酸的细胞外N-末端部分、19个氨基酸的跨膜区段和100个氨基酸的细胞质部分组成。基于作为I型跨膜蛋白质的假定结构特征，从E6脊髓培养物上清液中分离的115kD的蛋白质代表全长跨膜蛋白质的蛋白水解切割片段。在全长Calsyntenin-1序列中切割位点的精确定位仍需确定。基于胰蛋白酶水解肽的定位(图2中以灰色的盒表示)，从培养物上清液中分离的释放片段必须具有至少750个氨基酸的长度(从成熟蛋白质的N-末端开始计数)。

Calsyntenin-1的细胞质区段100个氨基酸中的38个是酸性的(参见表1)。在最为酸性的中部，20个残基中有18个是酸性的，且侧翼的序列也富含酸性氨基酸。相似的酸性区段是集钙蛋白、钙网蛋白和蛋白质二硫化物异构酶的特征(Fliegel等人，J.Biol.Chem.1989；264(36)：21522-28)。由于其以低亲和力结合大量Ca²⁺的能力，这些蛋白质对在骨骼肌细胞的肌质网和非肌肉细胞的内质网中贮存Ca²⁺是必需的(Baksh和Mich。Alak，J.Biol.Chem.1994；266(32)：21458-65；Ohnishi和Reithmeier，(B)iochemistry.1987；26(23)：7458-65.)。

实施例4：

人和小鼠Calsyntenin-1 cDNA的克隆和测序：Calsyntenin-1在脊椎动物中的物种同系物展示了高度的结构保守性

人Calsyntenin-1的cDNA的主要部分是通过用THC(试验性的人共有序列)Blast程序查找THC数据库而发现的。鉴定到了与鸡Calsyntenin-1的cDNA具有同源性的7个THC(THC176438、THC178825、THC195843、THC200424、THC192325、THC211114和THC211115)，并被用于组成缺少5’末端区段和2个内部区段的部分序列。缺口可通过RT-PCR来封闭。推定的翻译起始密码子和5’UTR序列的区段是通过筛选人脑cDNA文库而发现的。因而，我们得到了具有一个2943bp长的ORF的人cDNA序列，它与KIAA0911具有100％的一致性，其中KIAA0911为由筛选脑特异性蛋白质产生的、未被进一步鉴定的cDNA(Nagase等人，DNA Res.1998；5(6)，355-364)。

小鼠Calsyntenin-1的cDNA是通过RT-PCR和随后对脑cDNA文库的筛选而得来的。基于交迭克隆的序列，确定了编码含979个氨基酸的肽的2937nt长的单一ORF(图2)。

人和小鼠Calsyntenin-1起始于氨基酸29的序列与鸡Calsyntenin-1的N-末端肽的序列是相应的(图2)。人和小鼠直向同源物的推定的氨基酸序列分别与鸡Calsyntenin-1具有86.4％和84.7％的一致性(表I)。人和小鼠的Calsyntenin-1的氨基酸序列一致性为92％。

这些结果揭示，Calsyntenin-1在3种脊椎动物即人、小鼠和鸡中的物种同系物展示高度的结构保守性。基于这种高度的结构保守性，可以预期，在不同脊椎动物物种如人、小鼠、大鼠和鸡中Calsyntenin-1的物种直向同源物具有高度的功能保守性。

实施例5：

Calsyntenin-1相关基因的数据库搜索：在数据库中发现的相关序列揭示类Calsyntenin基因在黑腹果蝇和优雅新小杆线虫中存在

与脊椎动物Calsyntenin-1具有结构关系的基因也发现于黑腹果蝇和优雅新小杆线虫的数据库中。在果蝇基因组注释数据库(GadFly)中，发现了单一的类Calsyntenin-1基因(acc.Nr.GC11059)。基于6个交迭的EST(GM09293、HL03914、LD07408、LD11689、GM10465、LD06216)，我们已经确定了相应cDNA的序列(acc.Nr.AJ289018)。推断的蛋白质展示与脊椎动物Calsyntenin-1有约35％的氨基酸序列一致性。在优雅新小杆线虫中发现了又一个Calsyntenin-1相关基因，即登记号为AAC38816的BO034.3(参见表I)。

这些结果显示，类Calsyntenin-1基因也存在于无脊椎动物中。因而，Calsyntenin-1代表了一个在进化中非常保守的进化古老基因。

实施例6：

Calsyntenin-1的细胞质区段的钙结合研究：Calsyntenin-1的细胞质区段可结合钙离子

酸性氨基酸成簇出现是存在于Ca²⁺贮藏小泡中的高能力、低亲和力Ca²⁺结合蛋白质的典型性状，如集钙蛋白(Yano和Zarain-Herzberg，Mol Cell Biochem.1994；135(1)：61-70)和钙网蛋白(Krause和Michalak，Cell.1997；88(4)：439-43)。为检验Calsyntenin-1的Ca²⁺结合能力，我们生成了其细胞质区段和细菌蛋白质intein的融合蛋白质。用Impact-CN系统(New EnglandBiolabs Inc.)在细菌中表达了小鼠Calsyntenin-1的细胞质区段和N-末端intein标记的融合蛋白质。

在符合读框地将其插pTYB11载体(New England BiolabsInc.)的多克隆区域(MCS)之前，用PCR扩增Calsyntenin-1的细胞质区段的cDNA。该PCR是用具校对功能的聚合酶Pwo(Roche)，用完整的小鼠Calsyntenin-1的cDNA作为模板和引物LV38Fmax3(5’-GGGGAACAGAAGAGCTGCACATCAGCGAACG-3’)(Seq.Id.No.21)与LV39Bmax3(5’-CCCCCTCGAGTTAGTAGCTGAGTGTGGAG-3’)(Seq.Id.No.22)来完成的。将PCR片段用限制性位点SapI和XhoI克隆入pTYB11的MCS。连接之后，将质粒用于转化感受态大肠杆菌(E.coli)菌株BL21DE。用含有正确质粒的单菌落进行蛋白质表达。用新鲜的菌落接种1升含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。将培养物于37℃温育在通气的摇床中直到OD₂₆₀达到0.6。然后将培养物转移到22℃的摇床中。蛋白质的表达是通过加入0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导的。6小时后，将细胞于4℃经5000×g10分钟旋转沉淀。将细胞沉淀重悬在20ml的细胞裂解缓冲液中(20mM Tris；500mM NaCl；pH8.0)且用超声处理来破碎细胞。将细胞的粗抽提物在12000×g离心30分钟以得到澄清的细胞抽提物。为了纯化Calsyntenin-1/intein融合蛋白质，将澄清的细胞抽提物上样入几丁质柱上并在严格的洗涤条件下(1M NaCl)以高的流速(2ml/min)进行洗涤。融合蛋白质用3×SDS-PAGE样品缓冲液(187.5mM Tris-HCl pH6.8；6％SDS；30％甘油和0.03％溴酚蓝)进行洗脱，并将其在99℃温育3分钟。

作为对照使用了融合intein标记的麦芽糖结合蛋白质(pMYB5对照质粒；New England Biolabs Inc.)。

Ca²⁺结合测定是以如前述的方法进行的(Maruyama等人，JBiochem 1984；95(2)：511-9.)。对于SDS-PAGE，在上样入10％的聚丙烯酰胺凝胶上之前，将5μg的纯化融合蛋白质于100℃加热5分钟。向硝酸纤维素膜(Schleicher & Schuell，Dassel，德国)上的电转移是于4℃恒压100V进行1小时，用含有20％的甲醇、0.025M Tris-Cl和0.129M的甘氨酸(pH8.5)的溶液作为电极缓冲液。转移之后，将膜浸泡在含有60mM KCl、5mM MgCl₂和10mM的咪唑-HCl，pH6.8的溶液中，且在1小时内使缓冲液更换数次。然后，将膜分别温育在含有0.5μM、或1μM、或5μM的⁴⁵Ca²⁺的相同缓冲液中(28mCi/mg的钙，Amersham，Buckinghamshire，UK)10分钟。该膜用蒸馏水漂洗2分钟。将多余的水用Whatman No.1滤纸吸收，使膜在室温干燥。对于放射自显影，印迹用PhosphorImager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)进行分析。

如在图3中所示的，当使硝酸纤维素膜在0.5μM、1μM和5μM的Ca²⁺浓度进行温育时发现了与Calsyntenin-1/intein融合蛋白质交迭的剂量依赖性⁴⁵Ca²⁺信号。而在由细菌麦芽糖结合蛋白质和intein组成的融合蛋白质(图3中的MBP/intein)中没有观察到Ca²⁺的结合。

对于Calsyntenin-1/intein融合蛋白质，当加入CaCl₂时我们观察到了大范围的沉淀。50mM或更多Ca²⁺的加入导致可溶性Calsyntenin-1/intein进行沉淀(未显示)，但MBP/intein并不如此。Ca²⁺诱导的Calsyntenin-1/intein的沉淀通过加入等摩尔浓度的EDTA而阻止。因为在Ca²⁺浓度低于50mM时未观察到沉淀，我们推断Calsyntenin-1的细胞质结构域的交叉桥接涉及Ca²⁺与通过⁴⁵Ca²⁺结合而在硝酸纤维素膜上检测到的高亲和力位点明显不同的位点的低亲和力结合。至于低亲和力的Ca²⁺结合容量，Calsyntenin-1的细胞质结构域展示了与集钙蛋白惊人的相似性，后者是横纹肌细胞的肌质网中的主要钙结合蛋白质。集钙蛋白展示了集中为14个酸性残基的连续片段的相似的酸性残基簇。已将具有毗邻酸性残基的肽的Ca²⁺结合容量与一般的阳离子结合容量而不是特定的Ca²⁺位点相联系起来。对具有这样的酸性片段的蛋白质的比较提示，Ca²⁺结合容量是与酸性残基的容量成比例的(Lucero等人，J Biol Chem.1994；269(37)：23112-9)。X-射线结晶学提示低亲和力的Ca²⁺结合是通过在集钙蛋白二聚体的酸性C-末端区段之间Ca²⁺的嵌入而实现的(Wang等人，Nat Struct Biol.1998；5(6)：476-83)。相似地，Calsyntenin-1可通过在其细胞质部分之间的嵌入而结合Ca²⁺，其中所述部分由跨膜锚定而维持有序的平行方向。

总之，这些结果显示，Calsyntenin-1的细胞质结构域展示高亲和力的和低亲和力的Ca²⁺结合。

实施例7：

Calsyntenin-1 mRNA组织分布的Northern印迹分析：脑是具有最高Calsyntenin-1 mRNA表达水平的组织。

为了得到Calsyntenin-1在不同人体组织中表达模式的信息，使人多组织Northern印迹(Clontech)与2.8kb长的人Calsyntenin-1 cDNA片段进行杂交，该片段是用Prime-it II随机引物标记试剂盒(Statagene)以[α-³²P]dCTP(Amersham)进行标记的。杂交在42℃进行过夜，杂交信号用PhosphorImager(Molecular Dynamics)进行分析。对来自成体人组织的富含聚腺苷酸化的RNA的Northern印迹分析揭示了约5 kb长的Calsyntenin-1mRNA单一种类(图4)。在脑中观察到了最高的Calsyntenin-1mRNA的表达。在心、胎盘、骨骼肌和肾中探测到了弱的信号。在肺和肝中没有发现转录物。

因此，这些结果明确地证明Calsyntenin-1 mRNA最高的表达水平存在于脑中。

实施例8：

Calsyntenin-1 mRNA组织分布的原位杂交分析：Calsyntenin-1主要在神经元中表送

为了以细胞分辨率确定Calsyntenin-1在脑中的表达，以如前所述的方法进行了原位杂交(Schaeren-Wiemers和Gerfin-Moser，Histochemistry 1993；100(6)：431-40)。对来自E18小鼠的冷冻切片的原位杂交揭示了在中枢和周围神经系统的灰质中Calsyntenin-1 mRNA有强的细胞表达(图4A)。在E18小鼠的矢状切片中，以下区域被标记上(图4A)，即新大脑皮(nc)、海马结构(hi)、尾状核(caudate putamen)(cpu)、丘脑(th)、下丘脑(hyth)、小脑(ce)、脑桥(po)、三叉神经节(tg)、背根神经节(drg)、嗅上皮(oe)、下颌下腺(sg)和肠(in)。除在下颌下腺之外，在非神经组织中没有检测到Calsyntenin-1的mRNA。用有义探针处理的对照切片没有显示染色()。在成体小鼠中，Calsyntenin-1 mRNA在灰质的所有区域中都很丰富(图4B)。在白质如胼胝体(cc)中没有发现Calsyntenin-1的表达。在高放大倍率下检查，显示了在CNS和PNS的所有区域的神经元表达模式。大多数、甚至全部神经元表达Calsyntenin-1 mRNA，然而在表达水平上发现了相当大的差异。对成体人组织中Calsyntenin-1 mRNA的Northern印迹分析如图4C所示。用放射性标记的人Calsyntenin-1cDNA片段对每泳道2μg的纯化p0ly A⁺RNA进行了分析，这些RNA来自心(He)、脑(Br)、胎盘(Pl)、肺(Lu)、肝(Li)、骨骼肌(Sm)和肾(Ki)。分子大小标度为kb。图4D中表示鸡Calsyntenin-1蛋白质的蛋白质印迹分析。对来自成体鸡脑(Br)、心(He)、肝(Li)、睾丸(Te)、鸡脑脊液(CSF)和人脑脊液(hCSF)的150μg组织抽提物进行了SDS-PAGE并用抗Calsyntenin-1的多克隆抗体R63(左边泳道)和R71(右边泳道)进行免疫印迹。分子大小标度为kD。图4E表示显示对Calsyntenin-1蛋白质的蛋白水解切割位点(箭头)和用于产生R63(阴影的)和R71(阴影线的)抗体的重组肽区段在成熟Calsyntenin-1全长序列上的定位的示意图。注意抗体R63识别全长型Calsyntenin-1和N-末端切割产物两者。相反，抗体R71识别由Calsyntenin-1的蛋白水解切割生成的跨膜部分。跨膜结构域(TM)以黑色标记。比例尺：(A)、2.5mm；(B)、1.0mm。

实施例9：

Calsyntenin-1蛋白质及其切割产物的特征：Calsyntenin-1蛋白质以全长跨膜蛋白质、膜结合的C-末端切割产物和可溶性N-末端产物出现

为了分析全长Calsyntenin-1及其切割产物的组织分布，在兔中生成了两个抗体，分别称为R63和R71。R63抗血清的免疫原由在鸡Calsyntenin-1的N-末端起始的267个氨基酸的肽组成。R71抗血清的免疫原由鸡Calsyntenin-1的跨膜区段外边相紧邻的87个氨基酸的肽组成。两个片段均在细菌中带有His-标记而表达，且用NiNTA柱(Qiagen)进行纯化。

R63抗原的生产：

将位于鸡Calsyntenin-1的N-末端的267个氨基酸长的肽的cDNA片段用PCR进行扩增，然后符合阅读框地插入到pTFT74载体中。PCR是用可校对的聚合酶pfu(Stratagene)，用鸡Calsyntenin-1的cDNA作为模板，以及引物LV31Fchax3(5’-GGGCCATGGCTCGTGTTAACAAGCATAAGCCCTGGATTG-3’)(Seq.Id.No.23)和LV32Bchax3(5’-CCCAAGCTTAGTGGTGGTGGTGATGGTGTGGTTCATCACATGTGTCC-3’)(Seq.Id.No.24)来进行的。将PCR片段用限制性位点Nco I和HindIII克隆入pTFT74载体中。连接之后，将质粒转化感受态大肠杆菌(E.coli)菌株BL21DE。使含有正确质粒的单菌落用于蛋白质表达。用新鲜的菌落接种到1升含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。将培养物于37℃温育在通气的摇床中直到OD₂₆₀达到0.6。然后将培养物转移到22℃的摇床中。蛋白质的表达是通过加入0.5mM的IPTG来诱导的。6小时后，将细胞于4℃时经5000×g10分钟旋转沉淀。将细胞沉淀重悬在20ml的细胞裂解缓冲液中(50mM Tris；pH8.0)且用超声处理来破碎细胞。将细胞的粗抽提物在12000×g离心30分钟以得到澄清的细胞抽提物。根据生产商的手册用NiNTA柱(Qiagen)纯化融合蛋白质。以这种途径生成的R63抗体如下所示(氨基酸的单字母符号；分别地，大写字母显示在Calsyntenin-1中发现的氨基酸；小写字母显示起始的甲硫氨酸和组氨酸-标记)。

R63抗原的蛋白质序列(Seq.Id.No.25)

        ARVNKHKPW IETTYHGIVT ENDNTVLLDP PLIALDKDAPLRFAESFEVT VTKEGEICGF KIHGQNVPFE AVVVDKSTGE GIIRSKEKLDCELQKDYTFT IQAYDCGKGP DGANAKKSHK ATVHIQVNDV NEYSPVFKEKSYKATVIEGK RYDNILKVEA VDADCSPQFS QICNYEIVTP DVPFAIDKDG

YIKNTEKLSY GKEHQYKLTV TAYDCGKKRA AEDVLVKISI KPTCKPGWQG

WSKRIEYEPG TGSLALFPSM RLETCDEP

R71抗原的生产：

将用作抗原以生产R71抗体的87个氨基酸长的肽的cDNA片段，然后符合经PCR扩增阅读框地插入到pTFT74载体中。PCR是用可校对的聚合酶pfu(Stratagene)，用鸡Calsyntenin-1的cDNA作为模板和引物MS1Fchax3(5’-GGGCCATGATACGCTACAGAAACTGGCAC-3’)(Seq.Id.No.26)和MS2Bchax3(5’-CCCAAGCTTAGTGGTGGTGGTGATGGTGAGTGGCTGTACTTGGAACAAC-3’)(Seq.Id.No.27)来进行的。将PCR片段用限制性位点NcoI和HindIII克隆入pTFT74载体中。连接之后，将质粒转化感受态大肠杆菌(E.coli)菌株BL21DE。使含有正确质粒的单菌落用于蛋白质表达。用新鲜的菌落接种到1升含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。将培养物于37℃温育在通气的摇床中直到OD₂₆₀达到0.6。然后将培养物转移到22℃的摇床中。蛋白质的表达是通过加入0.5mM的IPTG来诱导的。6小时后，将细胞于4℃时经5000×g10分钟旋转沉淀。将细胞沉淀重悬在20ml的细胞裂解缓冲液中(50mM Tris；pH8.0)且用超声处理来破碎细胞。将细胞的粗抽提物在12000×g离心30分钟以得到澄清的细胞抽提物。根据生产商的手册用NiNTA柱(Qiagen)纯化融合蛋白质。以这种途径生成的R71抗体如下所示(氨基酸的单字母符号；分别地，大写字母显示在Calsyntenin-1中存在的氨基酸；小写字母显示起始的甲硫氨酸和组氨酸-标记)。

R71抗原的蛋白质序列(Seq.Id.No.28)

        mIRYRNWHTV SLFDRKFKLV CSELNGRYVS NEFKVEVNVIHTANPIEHAN HIAAQPQFVH PVHHTFVDLS GHNLANPHPF SVVPSTATghhhhhh

抗蛋白质(抗原R63和抗原R71)的抗血清是通过用磷酸缓冲盐溶液中的50μg蛋白质和完全弗氏佐剂作为初次注射、与不完全弗氏佐剂一起作为强化注射而在兔中产生的。抗Calsyntenin-1的抗体是从免疫血清中通过流过蛋白质-G柱和随后的抗原缀合的柱而亲和纯化得来的。

抗成熟蛋白质N-末端267个氨基酸的抗体R63可检测全长Calsyntenin-1以及由蛋白水解切割而得来的N-末端部分(图4E)。抗紧邻跨膜结构域的87个氨基酸的区段的抗体R71可检测由蛋白水解切割而产生的跨膜部分。在蛋白质印迹中，Calsyntenin-1的免疫反应条带专一地发现于脑抽提物和脑脊液中(CSF；图4D)。所有其他被检验的组织，包括心、肝、睾丸(图4D)以及肾、肺和脾(未显示)的抽提物未显示Calsyntenin-1免疫反应性。在成体鸡的脑抽提物中，用抗体R63发现了两个表观分子量为150和115kD的条带，然而用抗体R71只检测到33kD的单一条带(图4D)。115kD的条带与最初在区室化培养系统中鉴定为脊髓神经元轴-树区室释放的蛋白质共迁移。基于释放片段的估计大小和跨膜与细胞质区段的长度，150kD的条带极可能代表全长型的Calsyntenin-1。在脑脊液中，抗体R63只识别与Calsyntenin-1的可溶性N-末端切割产物相应的115kD的单一条带。与脑抽提物相反，CSF不包含全长的Calsyntenin-1或跨膜部分。总之，这些结果显示全长的Calsyntenin-1及其切割产物在脑组织中共存。蛋白水解切割后可溶的Calsyntenin-1 N-末端115kD片段也发现于CSF中。

对人CSF的检查显示，人Calsyntenin-1是以与其他脊椎动物的Calsyntenin-1一样的途径在细胞外部分进行切割的。如在图4E中证明的，在小鼠和鸡中发现了与Calsyntenin-1的N-末端切割片段具有相同分子量的明显Calsyntenin-1-免疫反应性条带。这些结果显示，Calsyntenin-1细胞外结构域中的蛋白水解切割是一个在进化中保守的特征。

实施例10：

光学显微镜水平上Calsyntenin-1蛋白质的亚细胞定位研究：细胞表面结合的Calsyntenin-1与已确立的突触标记蛋白质共定位

海马(图5A)和大脑皮层(未显示)组织切片的免疫过氧化物酶染色揭示Calsyntenin-1在富含突触的区域是丰富的。在更高的放大倍率时，发现了神经毡(neuropil)(图5A的插入部分)免疫染色的点状外观，提示Calsyntenin-1的突触定位。

通过在解离的海马神经元培养物中以免疫荧光共定位进行了细胞表面有关的Calsyntenin-1的亚细胞定位的详细研究。从E17小鼠脑中解剖的海马细胞悬浮液是通过用胰蛋白酶消化(0.25％，37℃进行10分钟)和用兰色Gilson枪头(Gilson tip)研磨而制备。然后将细胞铺到经酸洗涤的、聚-L-赖氨酸处理的玻璃盖玻片或聚-L-赖氨酸处理的塑料皿上，使用补充了B27(Gibco/Life Technologies)、0.25mg/ml Albumax(Gibco/Life Technologies)、2mM谷氨酰胺和0.1M丙酮酸钠的DMEM。使培养物含5％CO₂的湿润的培养箱中于37℃维持长达4星期。

使细胞在PBS中的4％低聚甲醛和4％蔗糖中于37℃固定30分钟。用PBS漂洗后，将细胞在室温于PBS中的10％胎牛血清和0.1％甘氨酸中预温育1小时，然后与初级抗体于4℃在PBS中的3％胎牛血清内温育24-48小时。对于双标记的实验，初级抗体要一起温育。将细胞洗涤至少30分钟，其中更换3次PBS。对于次级抗体，使用FITC-缀合的山羊抗兔IgG(Cappel)和Cy3-缀合的驴抗小鼠IgG(JacksonImmuno Research Laboratories，Inc.)。为了用抗-GluR2染色，将细胞用0.1％的皂苷透化。

已确立的突触标记如突触泡蛋白、GABA_A受体的α₂亚基和AMPA受体的GluR2亚基被分别用作突触前末端和突触后膜的标记。抗GABA_A受体α₂亚基的抗体是由Jean-Marc Fritschy提供的。抗突触泡蛋白、PSD95、GluR1和GluR2的抗体分别来自Roche、Pharmingen和Chemicon。如在图5，B-D中所证明的，Calsyntenin-1免疫反应性展示了沿神经突纤维束的块状模式。抗突触泡蛋白(图5B)和GABA_A受体(图5C)的抗体也有非常相似的染色模式。在覆盖图中，用抗突触泡蛋白和GABA_A受体的抗体标记的大区域的多数是与Calsyntenin-1免疫反应性部分地重叠的。利用商业上可用的抗GluR2胞质表位的抗体(需要细胞的透化并因此对表面暴露的和内部的AMPA受体都染色)，在非常接近并有时与Calsyntenin-1免疫反应性块部分重叠处发现了大的免疫反应块。合在一起，这些结果证明了Calsyntenin-1的突触定位。

实施例11：

用免疫电镜术对Calsyntenin-1蛋白质进行亚细胞定位研究：全长Calsyntenin-1是突触后膜的成分。

为了揭示Calsyntenin-1在CNS神经元中的亚细胞定位，我们使用了前包埋和后包埋的免疫电镜术。为了制备用于免疫-EM的脑组织，将8只两种性别的Wistar和OFA菌株大鼠(200-250g)用metiofane(甲氧氟烷，Pitman-Moore Inc.，USA)深度麻醉，并通过升主动脉灌注15-25分钟，首先用0.9％的盐水灌注1分钟，随后用含有配制在0.1M磷酸盐缓冲液中的3.5-4％低聚甲醛、0.015-0.05％戊二醛和0.2％苦味酸pH7.4的固定剂灌注。然后将脑从头骨中移动到冷的PB中，并在振动切片机上切出70μm(用于前包埋免疫细胞化学的6只大鼠)或500μm(用作冷冻置换的2只大鼠)厚的冠状切片。

对于包埋前免疫细胞化学，将切片在30％的蔗糖中冷冻保护，在液氮中迅速冷冻并在PB中融化。在20％的正常山羊血清(NGS；Vector Labs，USA)中预温育后，将切片于4℃在含有2％BSA和2％NGS的0.05mM Tris缓冲盐水中配制的初级抗体中温育2天。对于免疫金法，将切片在1∶40的与1.4nm金(Nanoprobes Inc.Stony Brook，NY)偶联的山羊抗兔IgG中温育过夜，在PBS中的1％戊二醛中后固定，随后用HQ Silver试剂盒(Nanoprobes Inc.)进行金颗粒的银增强。对于过氧化物酶反应，将切片于RT(室温)在生物素化的山羊抗兔IgG(Vector Labs)(于含有1％NGS的TBS中稀释1∶200)中温育4小时，随后在于TBS中稀释1∶100的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(ABC Kit；Vector Labs)中温育2小时。抗原性位点使用标准的3，3’-二氨基联苯胺四氢氯化物组织染色程序(0.05％DAB和0.01 H₂O₂在TB中，pH7.6)来揭示。将金-银和过氧化物酶反应的切片在于PB中的1％四氧化锇中后固定，用2％的乙酸双氧铀染色，在乙醇中分级脱水并在Durcupan ACM树脂(Fluka)中水平包埋在玻璃载玻片上，以用于电子显微镜术。

对于超薄切片的后包埋免疫细胞化学，我们采用了前述的冷冻置换和低温包埋程序(Baude等人，Neuron.1993；11(4)：771-87)。将振动切片机切片在1M蔗糖中冷冻保护，在ReichertMM80E仪器上冷冻，于-80℃在甲醇中脱水，然后用Leica CS自动仪器包埋于Lowicryl HM20中(Chemische Werke Lowi GmBH，德国)。将来自Lowicryl包埋封闭剂的80nm厚的超薄切片置于镍载网上，并在数滴封闭溶液上温育30分钟，所述封闭溶液由在含有0.1％Triton X-100的TBS中的1％BSA、0.1％冷水鱼皮肤明胶(Sigma)和5％NGS组成。该封闭溶液也用于稀释初级和次级抗体。将载网在初级抗体(16-24μg/ml)中温育过夜，随后在数滴与1.4nm金(Nanoprobes Inc.)偶联且稀释为1∶80的山羊抗兔IgG中温育2小时。在用HQ试剂盒(Nanoprobes Inc.)进行3-5分钟银增强之前，将抗体用2％的戊二醛固定4分钟。然后用饱和的乙酸双氧铀、随后用乙酸铅对切片进行对比，以用于电子显微镜观察。对于双面的免疫反应，将切片在免疫温育之前用乙醇酸钠(sodiumethanoate)蚀刻2-3秒(Matsubara等人，Dev.Biol.1996；180(2)：499-510)。

前包埋和后包埋免疫-EM两者都明确地证明Calsyntenin-1位于兴奋性和抑制性突触两者的突触后膜中。用过氧化物酶标记抗体进行的前包埋免疫-EM将Calsyntenin-1定位于somas、树突轴、树突棘上突触的突触后膜内(图6，A-C)。在一些突触中，在部分邻近的突触周膜上也发现了Calsyntenin-1的免疫反应性。在树突棘中很少发现絮状的免疫反应性。低温包埋的大鼠海马的后包埋免疫金染色证实了Calsyntenin-1在突触后膜的定位(图6，D-G)。具有圆形小泡和厚PSDs的不对称突触(根据Gray为1型(1959))和具有多形小泡和薄PSDs的对称突触(2型)两者均展示Calsyntenin-1的免疫反应性，于是证实了Calsyntenin-1是兴奋性和抑制性突触两者的突触后膜的成分。

在考虑Calsyntenin-1的突触后定位时(如在本实施例中显示的)，Calsyntenin-1的细胞质区段的钙结合能力变得特别有趣。我们的研究证明存在高亲和力和低亲和力的Ca²⁺-结合位点。我们发现，Ca²⁺在低至0.5μM的浓度时仍与Calsyntenin-1的细胞质结构域结合。因此，Calsyntenin-1的细胞质结构域在突触后Ca²⁺流入期间的浓度下仍结合Ca²⁺，提示Calsyntenin-1是突触后Ca²⁺信号的调节剂。与集钙蛋白的高能力、低亲和力的Ca²⁺-结合功能一样(其中的集钙蛋白显示相似的14个酸性残基毗邻成串式集中的酸性残基簇)，Calsyntenin-1的细胞质结构域也可能具有低亲和力Ca²⁺结合的能力。已发现具有连续酸性残基的肽的Ca²⁺-结合能力与一般的阳离子结合能力而不是特定的Ca²⁺位点有联系。对具有这样的酸性片段的蛋白质的比较提示，Ca²⁺-结合能力是与酸性残基的含量成比例的(Lucero等人，J Biol Chem.1994；269(37)：23112-9)。X-射线结晶学提示，低亲和力的Ca²⁺结合是通过在集钙蛋白二聚体的酸性C-末端区段之间Ca²⁺的嵌入而实现的(Wang等人，Nat Struct Biol.1998；5(6)：476-83)。相似地，Calsyntenin-1可通过在其细胞质部分之间的嵌入而结合Ca²⁺，其中所述胞质部分由跨膜锚定而维持有序的平行方向。

由于其在突触后膜上的锚定，Calsyntenin-1的细胞质结构域在突触后膜下面建立了固定的Ca²⁺缓冲液。与流动的缓冲液相反，固定的缓冲液限制了Ca²⁺的扩散(Kasai和Petersen，TrendsNeuroscience 1994；17(3)：95-101)。它们也降低了游离Ca²⁺的峰值，并通过Ca²⁺的延迟释放而延长Ca²⁺的上升。作为固定的Ca²⁺缓冲液，Calsyntenin-1可在突触下区带临时地保持Ca²⁺并延迟其消散。如此地，Calsyntenin-1可潜在地作为其中胞内Ca²⁺的瞬时升高比较重要的突触性过程如LTP(Bliss和Collingridge，Nature.1993；361(6407)：31-9)、LTD(Linden和Connor，Ann RevNeurosci.1995；18：319-57)以及在树突棘中的一致检测中的调节元件。已经报道突触后的瞬时Ca²⁺依赖于Ca²⁺变化的浓度和持续时间而可触发LTP或LTD。持续数秒的高水平Ca²⁺可诱导LTP，然而发现持续更长时间范围如约1分钟的较低水平的Ca²⁺可诱导LTD(Malenka等人，Neuron.1992；9(1)：121-8)。因此突触下空间Ca²⁺缓冲液的存在或缺乏可为确定瞬时Ca²⁺的结果是LTP还是LTD的机制的重要元件。新近报道的皮质或海马锥体神经元树突棘同时探测机制(Koester和Sakmann，Proc Natl Acad Sci USA.1998；95(16)：9596-601)显示，如果传入输入和回增(backpropagating)动作电位(AP)在200ms的时间窗内到达突触，即引起Ca²⁺信号的非线性叠加。当传入输入后伴随回增树突AP时，即发现Ca²⁺信号的超线性叠加。相反地，当回增AP先于传入输入时，导致Ca²⁺流入量降低。在AP伴随在EPSP之后而发生的Ca²⁺信号的增强已被归因于NMDA受体的Mg²⁺封闭的电压依赖性缓解，然而，Ca²⁺依赖性NMDA受体的失活已被认为是当AP首先到达突触时引起Ca²⁺流入量降低的机制(综述参见(Zucker，Curr OpinNeurobiol.1999；9(3)：305-13))。在两个过程中，在突触后膜下面的固定缓冲液均可起作用。通过其高亲和力的Ca²⁺结合，Calsyntenin-1可有助于超线性的Ca²⁺信号传导。已经提示，缓冲液的饱和程度可能是引起Ca²⁺信号超线性增加的机制的重要“无形”成分(Neher，Cell Calcium 1998；24(5-6)：345-57)。当通过NMDA-和电压门控Ca²⁺通道的Ca²⁺流入同时发生时，可生成更多的游离Ca²⁺，这是因为Ca²⁺缓冲液被第一类流入饱和了。通过在突触后膜下面低亲和力Ca²⁺结合，Calsyntenin-1可延长瞬时Ca²⁺，导致Ca²⁺依赖性NMDA受体失活增强，并因而使亚线性Ca²⁺信号窗延长。在新近对小脑浦肯野细胞的研究中，超线性的高亲和力Ca²⁺信号已被归因于流动的Ca²⁺缓冲液的饱和(解离常数为0.37μM)以及不动的低亲和力缓冲液的作用(Maeda等人，Neuron.1999；24(4)：989-1002)。在那项研究中，对从内部贮存处的Ca²⁺流入或Ca²⁺释放的调节已被排除在作为浦肯野细胞中Ca²⁺反应的超线性的主要来源之外；相反地，这种超线性反应因主要归因于流动的高亲和力缓冲液的饱和。不动的低亲和力缓冲液可能通过延长Ca²⁺的存在而加宽超线性叠加的时间窗(Maeda等人，Neuron.1999；24(4)：989-1002)。通过将高-和低-亲和力的Ca²⁺缓冲组合在固定突触位置的一个分子中，Calsyntenin-1可在突触的同时探测机制中起重要元件的作用。

实施例12：

通过突触小体的亚细胞分级分离和分离而对Calsyntenin-1的亚细胞定位研究：Calsyntenin-1位于突触后膜上，但没有锚定在突触后密集区。

为了研究Calsyntenin-1是否牢固地附着到所谓的突触后密集区(PSD)上，我们通过亚细胞分级分离的方法分离了突触小体。对于亚细胞分级分离，采用了Phelan和Gordon-Weeks的操作(Phelan和Gordon-Weeks，1997)。200只成体小鼠和20只成体鸡的脑分别在5体积补充了Mini Complete抑制剂混合液(Roche)的10mMHEPES、0.32M蔗糖中于Dounce匀浆器中进行匀浆。亚细胞分级分离是以如Phelan和Gordon-Weeks，1997所述的方法进行的(突触小体、生长锥和它们的亚细胞成分的分离，《神经化学——实践方法》(Neurochemistry-a practical approach)，2^nd edition，(eds.Turner AJ，Bachelard HS)IRL Press，pp 1-38)。对于用抗体R63和R71的蛋白质印迹分析，在每个泳道上上样100μg的总蛋白质。为了控制正确的分级分离，我们使用了针对AMPA受体GluR1亚基的商业上可用的抗体(来自Pharmingen)。PSD-95是突触后密集区的代表成分，而GluR1是AMPA型谷氨酸受体的成分，并已证明它展示了通过其C-末端的高亲和力结合位点与PSD的牢固附着(综述参见：O’Brien等人，1998)。对于GluR1和PSD95的免疫探测，在每个泳道上上样50μg的总蛋白质。

利用该方法，我们发现Calsyntenin-1是突触后膜的蛋白质，但不具有与PSD的紧密结合。如在图7中所证明的，突触小体中富含全长Calsyntenin-1及其切割产物。突触小体的低渗破裂和用温和去污剂处理导致Calsyntenin-1的所有3种形式的可溶性。相反，突触后密集区的典型标记即PSD-95和G1uR1(O’Brien等人，Neuron.1998；21(5)：1067-78)保留在微粒级分中(P4和PSD，根据Phelan和Gordon-Weeks，1997(突触小体、生长锥和它们的亚细胞成分的分离(Isolation of synaptosomes，growth cones andtheir subcellular components)，《神经化学——实践方法》(Neurochemistry-a practical approach)，2^nd edition，(eds.Turner AJ，Bachelard HS)IRL Press，pp 1-38))。Calsyntenin-1从PSD级分中的清除显示其细胞质区段不与突触下分子支架结构牢固结合，该结构与在EM中观察到的PSD对应，且操作上地定义为用去污剂处理突触小体后所得的颗粒状物质。

实施例13：

用免疫电镜术对Calsyntenin-1跨膜切割产物定位的研究：蛋白水解切割的Calsyntenin-1的跨膜片段在棘突触的棘器和轴突触的突触后膜中累积

为了鉴定Calsyntenin-1在蛋白水解切割后的跨膜片段的命运，我们使用了抗膜附近区段的抗体R71，与过氧化物酶-和金-缀合的第二抗体一起用于免疫-EM。使棘突触中棘器的膜用过氧化物酶进行标记(图8，A和B)。在一些突触中，在突触后膜上也发现了较弱的免疫反应性(图8A)。相似地，在树突轴和神经元胞体(somas)的突触级分下存在的片状膜中发现有强的信号(未显示)。用已知不太灵敏的免疫金，发现标记专一地与棘器(图8，C-E)和轴突触的突触后膜有关联。因为没有发现N-末端抗体可标记突触后膜细胞器(图6)，我们推断棘器既不含全长的Calsyntenin-1也不含N-末端切割产物。因此，Calsyntenin-1的全长以及在突触小体蛋白质印迹中发现的115kD形式(图7)只能衍生自突触后膜。这些结果显示蛋白水解切割一定发生在细胞表面，即在突触间隙，此后跨膜部分发生内化。

细胞外区段中的蛋白水解切割导致Calsyntenin-1的主要细胞外部分的释放。该Calsyntenin-1可溶性片段在细胞外流体中扩散，如由其在脑脊液和眼玻璃体液中的累积所证明的。剩余的跨膜部分内化入棘器。由于其膜的拓扑学，内化的跨膜部分的Ca²⁺结合结构域覆盖了棘器的细胞质表面。因而，内化可将Calsyntenin-1-介导的Ca²⁺缓冲液从突触后膜转移到棘器的表面。

最近，已经鉴定出Ca²⁺从细胞内贮存处即ER和棘器中通过IP3受体活化引起的释放是树突棘内Ca²⁺信号的重要作用因素(Finch和Augustine，Nature 1998；396(6713)：753-6)。IP3-介导的Ca²⁺的释放是由细胞质的Ca²⁺以双相模式进行调节的(Taylor，BiochimBiophys Acta.1998；1436(1-2)：19-33)。该释放在高的和低的Ca²⁺浓度时都很低，但在200-300nM的中间浓度比较显著。通过其延长Ca²⁺上升的能力，Calsyntenin-1的细胞质结构域可调节对IP3-介导的Ca²⁺释放的作用。

对免疫-EM分析和亚细胞分级分离结果的比较显示，Calsyntenin-1的全长型和两种切割产物均发生在突触后膜中(说明见图9)。相反地，在内部细胞膜上既没有发现全长的Calsyntenin-1，也没有发现N-末端切割产物，而是专一地发现了跨膜部分。N-末端和C-末端切割产物分别完全被分离到组织液和内部细胞膜这一结果只能解释为Calsyntenin-1被位于突触间隙的蛋白酶进行了细胞外切割。内化过程对于Calsyntenin-1的跨膜部分的选择性显示突触间隙的蛋白水解切割在Calsyntenin-1的Ca²⁺结合结构域从突触后膜到棘器表面的转位中的调节作用。

实施例14：

Calsyntenin-1中具有蛋白水解切割位点的区域的确定。

Calsyntenin-1全长序列中蛋白水解切割位点的定位仍然需要确定。基于对胰蛋白水解切割所释放的115 kD片段进行的测序揭示的胰蛋白水解切割肽的定位(图2中以灰色标记)，所释放的片段一定有至少为747个氨基酸的长度(从成熟蛋白质的N-末端计数的)。此外，切割发生在细胞外部分上，即在跨膜区段的N-末端一侧。因而，切割位点必须定位于氨基酸746之后(测序肽7的最后一个氨基酸)和氨基酸834之前(跨膜区段的第一个氨基酸)。如此确定为具有蛋白水解切割位点的肽的Calsyntenin-1细胞外部分区段如下所示：

鸡Calsyntenin-1的切割序列(Seq.Id.No.29)：

           LIRYRNWHTVS LFDRKFKLVC SELNGRYVSN EFKVEVNVIH

TANPIEHANH IAAQPQFVHP VHHTFVDLSG HNLANPHPFS VVPSTATV

人Calsyntenin-1的切割序列(Seq.Id.No.30)：

        LLRYRNWHAR SLLDRKFKLI CSELNGRYIS NEFKVEVNVI

HTANPMEHAN HMAAQPQFVH PEHRSFVDLS GHNLANPHPF AVVPSTATV

第一个氨基酸是Calsyntenin-1的115 kD片段的测序肽7的最后一个氨基酸(参见实施例2和图2)。最后一个氨基酸是跨膜区段的第一个氨基酸(参见图2)。

目前尚未知道切割Calsyntenin-1的蛋白酶的本性，也不清楚赋予Calsyntenin-1的跨膜部分选择性内化的机制。已经报道有几种细胞外蛋白酶表达在神经系统中，包括组织纤溶酶原激活物、凝血酶、神经胰蛋白酶(neurotrypsin)和neuropsin。对于其中的两种，即tPA和neuropsin，已报道其转录受神经元活性调节(Chen等人，Neurochem.Int.1995；26(5)：455-64)。它们是Calsyntenin-1内化调节物的有兴趣的候选物。

实施例15：

生长的神经元中Calsyntenin-1亚细胞定位的研究：Calsyntenin-1发现存在于神经发育中生长的轴突的生长锥中

原位杂交显示，Calsyntenin-1 mRNA在发育中的神经系统生发层的神经元前体细胞中和在发育中的神经系统的所有区域中神经元的早期有丝分裂后期中表达。因此，我们也在细胞迁移和神经突生长期间检查了神经元中Calsyntenin-1的亚细胞定位。在本实施例中，如前所述培养了E18小鼠海马的神经元。当将从E18小鼠海马中解离的细胞以低密度铺板时，在培养的前10天它们的生长着的突起不与其他细胞接触。因此，这些培养物可用于对生长锥即生长中的轴突的前端进行显微镜检查。如在图10中所证明的，在神经元细胞胞体(somas)和两类突起即树突和轴突的表面发现了Calsyntenin-1的免疫反应性。在生长锥上发现了特别强的Calsyntenin-1免疫反应性，如通过用抗体R63(图10A)和抗轴突标记蛋白质Tau1的抗体(图10B)对Calsyntenin-1的双免疫荧光染色所证实的。在更高的放大倍率上，在生长锥中的calsyntenin-1免疫反应性展示块状模式，显示在生长锥中的Calsyntenin-1是以多个簇存在的。

本实施例中展示的结果显示，Calsyntenin-1在生长的神经元的表面丰富地表达，因而可能在发育过程中具有作用，如神经元迁移和轴突及树突的形成，或在神经组织损害后神经再生功能中有作用。生长锥中存在的特别强的Calsyntenin-1信号显示了Calsyntenin-1在生长锥中的功能，如轴突生长和指导作用。

实施例16：

利用转基因小鼠技术使Calsyntenin-1在CNS神经元中超表达

基因在转基因小鼠中的超表达是体内研究蛋白质功能的相对直接的途径。对于最初系列的实验，将鸡Calsyntenin-1在Thy-1基因启动子的控制之下表达。Thy-1基因在神经系统中相对晚地表达(依赖于位置，在出生后4-10天)。在Thy-1启动子控制下Calsyntenin-1的表达(Cordon等人，1987，Cell 50(3)，445-52)保证了较早的发育阶段不受影响。这一点是基本的。Calsyntenin-1相对早地在发育中的神经系统的一些区域表达，因而它可能在早期发育功能如细胞迁移和轴突寻找目标中发挥作用。通过利用晚启动的启动子，预计可预防转基因动物中神经发生早期的紊乱。然而，依赖于检查的目的，也可以用到其他启动子。

对于最初的转基因小鼠，我们选择超表达不含细胞质区段的鸡Calsyntenin-1，这是因为它可被物种特异性单克隆抗体选择性地进行检测。鸡Calsyntenin-1展示与其在小鼠中的对应物有84.7％的氨基酸序列一致性。因而，可以假定有高度保守的功能。

转基因的构建体是基于Thy-1基因的表达载体的，其中Thy-1的翻译区域已被Xho-I接头置换(Cordon等人，1987，Cell 50(3)，445-52)。用于超表达的鸡Calsyntenin-1的2682 bp长DNA片段是从用Afl III(起始ATG上游3bp处)和Cac8I(TAA终止密码子下游9bp处)消化的鸡cDNA中衍生的。将该片段通过平头末端连接而在Xho-I接头位点插入到Thy-1表达载体中，并由HindIII控制定向。回收质粒，通过两个侧翼PvuI位点处进行消化，切出用于注射到受精小鼠卵母细胞原核中的片段。9kb长的注射片段是在1％的琼脂糖凝胶上分离的，用QIAEXII试剂盒纯化条带，用注射缓冲液将DNA从QIAEX颗粒上洗脱。转基因小鼠的生成是通过根据标准操作进行原核注射实现的。通过PCR和Southern印迹筛选存在转基因的胎仔。

通过这个操作，得到了超表达鸡Calsyntenin-1的3个小鼠菌株和超表达小鼠Calsyntenin-1的2个菌株。转基因的表达在mRNA水平上通过RNA印迹和原位杂交、在蛋白质水平上通过蛋白质杂交证实。典型的超表达是在6到12倍的级别上的。

利用相同的方法，可生成表达全长Calsyntenin-1、以及其他截短形式的Calsyntenin-1或突变形式的Calsyntenin-1(点突变或缺失突变)的转基因动物。代替Thy-1启动子，可以使用其他的启动子，包括驱动转基因在神经元的特定亚群中表达的启动子，如浦肯野细胞特异性L7蛋白质或边缘系统(limbic system)特异性蛋白酶neuropsin的启动子。或者，可将转基因的表达置于诱导型启动子控制下。

实施例17：

人Calsyntenin-1在真核(HEK293)细胞中的表达

对于人Calsyntenin-1的真核表达，将完整的人Calsyntenin-1cDNA用限制性位点HindIII和XbaI连接到pcDNA3.1A表达载体(Invitrogen)上。用标准的磷酸钙转染技术将质粒用于转染HEK293细胞。3天后收集细胞上清液和细胞裂解液，进行SDS-PAGE并用R63抗体或R71抗体进行蛋白质印迹分析。在HEK293细胞的细胞裂解液中富含有全长人Calsyntenin-1(150 kD)，然而在HEK293细胞的上清液中只发现了释放的人Calsyntenin-1(116kD)(图11)。

或者，真核细胞中的表达可用多种真核表达载体(商业上可供利用的或自制的)来实现。经常使用的真核表达系统使用衍生自杆状病毒的载体。对于真核表达，可用到多种真核细胞系(如COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、H9细胞、Jurkat细胞、NIH3T3细胞、C127细胞、CV1细胞或Sf细胞)。对于COS细胞或CHO细胞或基于杆状病毒的表达系统的使用的详细描述，参见国际专利申请编号PCT/US96/16484或国际公开编号WO 98/16643。

实施例18：

Calsyntenin-1的胞质区段在真核(HEK293)细胞中的表达

对于Calsyntenin-1的真核表达，生成了在鸡Calsyntenin-1的细胞质区段的C-末端含有c-kappa轻链的融合蛋白质。由于融合蛋白质在HEK293细胞中是作为释放的蛋白质而表达的，所以在鸡Calsyntenin-1的N-末端克隆了NgCAM的信号肽。将融合蛋白质的三个DNA片段，即信号肽、细胞质区段和c-kappa轻链用限制性位点ApaLI和HindIII在阅读框内连接。然后将融合蛋白质的cDNA用限制性位点XbaI和BamHI连接到pcDNA3.1载体中(Invitrogen)。将质粒用标准的磷酸钙转染技术转染HEK293细胞。4天后收集细胞上清液并用187.1抗体偶联的亲和柱纯化融合蛋白质。

作为选择地，真核细胞中的表达可用多种真核表达载体(商业上可供利用的或自制的)来实现。经常使用的真核表达系统使用衍生自杆状病毒的载体。对于真核表达，可用到多种真核细胞系(如COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、H9细胞、Jurkat细胞、NIH3T3细胞、C127细胞、CV1细胞或Sf细胞)。对于COS细胞或CHO细胞或基于杆状病毒的表达系统的使用的详细描述，参见国际专利申请编号PCT/US96/16484或国际公开编号WO 98/16643。

实施例19：

人Calsyntenin-2的cDNA的克隆

用从Calsyntenin-1的蛋白质序列以程序tblastn对NCBI高流通量基因组序列数据库进行了检索。在录入号为AC010181的序列中发现了Calsyntenin家族一个新成员的12个推定的外显子，它编码一个与人Calsyntenin-1的C-末端713个氨基酸同源的肽。

为了确定这些推定的外显子是否属于转录的基因，根据第二个推定的外显子的序列(S3eBfwd：5’-CTCCTCTGGCATCATTGACCTC-3’)(Seq. Id.No.31)和最后一个外显子的序列(S3Rev：5’-CATTTCTTCCTCGGCTTCTTCC-3’)(Seq.Id.No.32)设计了PCR引物。第一链cDNA是用随机六聚体引物从来自人海马的多聚A⁺mRNA(Clontech，catalog # 6578-1)利用来自GibcoBRL LifeTechnologies的Thermoscript RT-PCR系统合成的，并用作模板，与引物S3eBfwd和S3Rev一起进行PCR反应。获得了预期长度的片段，将其亚克隆入pBluescript KS+，并完全测序。在大的区段上，所得的序列与从基因组序列预测的cDNA是相同的。然而，发现了一个额外的没有在基因组序列中预测到的外显子。将这个1762碱基对的片段进行放射性标记并用作筛选人胎儿脑cDNA文库(Clontech 5’STRETCH PLUS inλgt10，catalog # HL3003a)的探针。分离了10个克隆，将它们的插入片段亚克隆入pBluescript KS+，并完全测序。将克隆组装为连续的cDNA。仍缺乏N-末端的116个氨基酸(根据与Calsyntenin-1的同源性)。因此将代表Calsyntenin-2的最N-末端的400碱基对的EcoRI-EcoNI片段用于重筛选相同的cDNA文库。一个克隆含有109个额外的N-末端氨基酸，并显示与另一HTGS克隆AC009671的序列有100％的一致性。与该基因组克隆一起，我们能够组装人Calsyntenin-2的全长cDNA。N-末端的序列用PCR以引物hsCst2atgfwd(5’-TGCTGCGAGG ATGCTGC-3’(Seq.Id.No.33)，含有ATG起始密码子)和hCs2seq4r(5’-ATGATGCCAGAGGAGGC-3’)(Seq.Id.No.34)证实。

总之，我们发现了单一的2865个核苷酸的长ORF，它编码含955个氨基酸的蛋白质。该cDNA已经以Calsyntenin-2的名字递交到EMBL/Genbank/DDBJ数据库中，录入号为AJ 278018。人Calsyntenin-2的蛋白质翻译与人Calsyntenin-1显示57％的一致性和67％的相似性，与人Calsyntenin-3显示51％的一致性和59％的相似性。与Calsyntenin-1非常相似，Calsyntenin-2是具有19个氨基酸的单一跨膜区段的I型跨膜蛋白质。Calsyntenin-2的大N-末端部分包含834个氨基酸且定位于细胞外间隙。C-末端区段含有102个氨基酸并富含酸性残基。在细胞质区段的102个残基中有33个是酸性的。

在靠近跨膜区段的区域也与Calsyntenin-1有高度的序列一致性，该区域具有Calsyntenin-1的蛋白水解切割位点。这提示Calsyntenin-2在该区段中也具有蛋白水解切割位点。

与Calsyntenin-1的切割区段相应的Calsyntenin-2区段具有如下的氨基酸序列：

人Calsyntenin-2的推定的切割序列(Seq.Id.No.35)：

          HIRYR的WRPA SLEARRFRIK CSELNGERYTS NEFNLEVSIL

HEDQVSDKEH VNHLIVQPPF LQSVHHPESR SSIQHSSVVP SIATV

为了获得Calsyntenin-2在不同人体组织中表达模式的信息，将来自成人组织的poly(A)⁺RNA的RNA印迹(Cat.Nr.7760-1，Clontech)与用[α-³²P]dCTP(Amersham)标记的人Calsyntenin-2的1762 bp cDNA片段进行了杂交，其中的标记是用Prime-itII随机引物标记试剂盒(Stratagene)完成的。杂交在55℃进行2小时，且杂交信号用PhosphoImager(Molecular Dynamics)进行分析。发现了约5.5kb的Calsyntenin-2 mRNA单一种类。在脑、心和肾中观察到了Calsyntenin-2 mRNA的最高的表达。在骨骼肌中发现了低的信号。在胎盘、肺和肝中没有发现转录物。

实施例20：

人Calsyntenin-3的cDNA的克隆

在数据库搜索中，我们发现了未分类的人cDNA，即KIAA0726，它与人、小鼠和鸡Calsyntenin-1分别具有53.0％、52.3％和54.5％的序列一致性(表I)。如在下面段落中所描述的，我们用RT-PCR分离了与该序列匹配的重叠片段。我们发现了与KIAA0726序列在ORF的大部分相同但在N-末端区段不同的cDNA。我们将这个cDNA称为Calsyntenin-3并将其递交到EMBL/Genbank/DDBJ数据库中，录入号为277460。

人Calsyntenin-3 cDNA的克隆是基于RT-PCR策略的。在第一轮，我们克隆了KIAA0726的小鼠直向进化同源物的cDNA。筛选了成体小鼠BALB/c 5’片段加全脑cDNA文库的大约2×10⁶个斑点(ML3000a，Clontech，Palo Alto，CA)。分离了两个与KIAA0726同源的独立的克隆。对这些克隆的详细分析揭示在ORF的5’端与KIAA0726有显著的差异。两个克隆都含有与KIAA0726毫不同源的120 bp的5’UTR、翻译起始密码子(ATG)和ORF的起始部分。然而在更下游，这些克隆的序列与KIAA0726是同源的。与翻译密码子(ATG)邻近的核苷酸是和共有序列非常一致的，如由Kozak所确定的(Nucleic Acids Research 1987；15(20)：8125-48)。由于其与Calsyntenin-1同源，故将小鼠基因组的新基因称为Calsyntenin-3。

信号肽分析程序预测小鼠Calsyntenin-3含有19aa的信号肽。相反地，用相同的分析程序，对KIAA0726没有预测到信号肽。

在人EST数据库中的筛选揭示了与小鼠Calsyntenin-3具有79.4％的核苷酸序列一致性的人EST(已表达序列标志；访问号：AL133677)。EST AL133677的3’区域与KIAA0726的一个区段相同并展示与小鼠Calsyntenin-3有高度相似性。然而，5’区域展示与小鼠Calsyntenin-3 ORF的5’末端有相似性，但与KIAA0726的任何序列完全无关。与小鼠Calsyntenin-3相似，EST AL133677已翻译的核苷酸序列包含19aa长的信号肽。EST AL133677的ORF的信号肽展示了与小鼠Calsyntenin-3的信号肽有68.4％的氨基酸序列一致性。基于这些特征，我们推断从RT-PCR产物和EST AL133677中获得的新序列是人Calsyntenin-3。

为了获得人Calsyntenin-3 mRNA 5’区域的直接信息，采取了RT-PCR的方法。选择来自成年人海马的poly(A)⁺选择的RNA(Clontech，Palo Alto，CA)作为逆转录的模板。第一链cDNA是用oligo(dT)引发方法获得的(Thermoscript RT-PCR System，LifeTechnologies，Basel，瑞士)。PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)和下面的引物用于进行PCR反应：

正向的：hSyn2UTRfor1(起始于EST AL133677的5’末端)(Seq.Id.No.36)

5′CTG CAG TAG CGG GGT TG 3′

反向的：RFKIA02B(终止于KIAA0726的TAA终止密码子下游的58 nt处)(Seq.Id.No.37)

5′TGG AGT GTC TGT TTC ACC AGG 3′

用这种方法，获得了人Calsyntenin-3的完整编码序列和额外的5’UTR的275 bp。对RT-PCT片段两条链的DNA测序证实了人Calsyntenin-3的5’部分和KIAA0726之间的差异。人Calsyntenin-3的新cDNA含有2868bp的ORF，其编码956个氨基酸的蛋白质，其中包含19个氨基酸的信号肽和23个氨基酸的跨膜结构域。Calsyntenin-3的N-末端细胞外部分包含845个氨基酸，而C-末端细胞质部分包含88个氨基酸。在Calsyntenin-3的细胞质区段的88个氨基酸中，16个具有酸性侧链。

与Calsyntenin-1的高度的序列一致性也发现于靠近跨膜区段的区域，该区域具有Calsyntenin-1的蛋白水解切割位点。这提示Calsyntenin-3在该区段中也具有蛋白水解切割位点。

与Calsyntenin-1的切割区段相应的Calsyntenin-3区段具有如下的氨基酸序列：

人Calsyntenin-3的推定的切割序列(Seq.Id.No.38)：

         ILRQARYRLR HGAALYTRKF RLSCSEMNGR YSSNEFIVEV

NVLHSMNRVA HPSHVLSSQQ FLHRGHQPPP EMAGHSLASS HRNSMIP

Calsyntenin-3 mRNA在不同人组织中的表达模式用商业上可供利用的人多组织RNA印迹(Clontech)来确定。利用Prime-itII随机引物标记试剂盒(Stratagene)以[α-³²P]dCTP(Amersham)标记人Calsyntenin-3的1.15kb cDNA片段，用作探针。杂交在42℃进行2小时，杂交信号用PhosphoImager(Molecular Dynamics)进行分析。揭示了约4kb的Calsyntenin-3 mRNA单一种类(图12)。在脑中观察到了Calsyntenin-3 mRNA的最高的表达。在肾的mRNA中发现了中等强度的信号。在胰、肝、心、胎盘、骨骼肌和肺中探测到了低水平的信号。

Calsyntenin-3表达的细胞分辨率用以如前所述的方法进行的原位杂交确定(Schaeren-Wiemers和Gerfin-Moser，Histochemistry1993；100(6)：431-4)。在来自成体小鼠脑的冷冻切片中，Calsyntenin-3 mRNA在灰质的所有区域中都丰富。高放大倍率的检查显示在CNS和PNS所有区域中都展示神经元表达模式。然而，不是所有神经元均表达Calsyntenin-3 mRNA，并且表达水平有相当大的差异。Calsyntenin-3的细胞类型特异性表达的一个非常显著的实例发现于小脑中。如在图12中所显示的，小脑浦肯野细胞展示了对Calsyntenin-3的非常强的原位杂交信号，然而所有其他的小脑细胞都不表达可检测水平的Calsyntenin-3 mRNA。

实施例21：

Calsyntenin-1的胞质区段和Arp2/3复合物的结合

在学习研究细胞表面蛋白质和细胞骨架的相互作用的科学文献时，我们发现Calsyntenin家族所有蛋白质(即Calsyntenin-1、Calsyntenin-2和Calsyntenin-3)的细胞质部分都含有至少一个保守氨基酸序列基元。该基元包含具有保守的色氨酸的酸性氨基酸序列，该序列与在目前已知的大多数、甚至全部已知Arp2/3复合物激活物的Arp2/3结构域中包含保守色氨酸的酸性氨基酸基元高度相似。在Calsyntenin-1的细胞质区段中两次发现了具有保守色氨酸的酸性氨基酸序列，一次具有氨基酸序列...MDWDDS...而另一次具有...LEWDDS...(以单字母符号给出的氨基酸序列)。Calsyntenin-2的细胞质区段含有一个...MDWDDS...和一个...LEWDDS...，而Calsyntenin-3的细胞质区段含有一个这样的基元，即...LFWDDS...。Arp2/3复合物通过调节肌动蛋白丝生长和分支而在基于肌动蛋白的细胞游动性的调节中起重要的作用(综述参见：Borisy和Svitkina，Curr.Opin.Cell Biol.12：104-112，2000；Pantaloni等人，Biochem.，70：649-676，2001；Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；以及其中的参考文献)。含有具有保守色氨酸的相似的酸性氨基酸基元的Arp2/3激活物包括人WASP(Wiscott Aldrich综合症蛋白质的缩写)、相关的人N-WASP、人Scar/WAVE1蛋白质和cortactin，分别展示序列...DDEWDD、...DDEWED和...EVDWLE、和...ADDWET...(WASP、N-WASP和Scar/WAVE1参见Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；cortactin参见Uruno等人，Nature CellBiol.3：259-266，2001)。保守色氨酸和邻近的酸性氨基酸在Arp2/3结合和肌动蛋白多聚化中的功能的重要性已经由cortactin的定点诱变证实了(Uruno等人，Nature Cell Biol.3：259-266，2001)。对序列...ADDWET...中的色氨酸和色氨酸前的两个氨基酸残基的定点诱变导致Arp2/3结合和Arp2/3介导的肌动蛋白多聚化丧失。所有这些Arp2/3激活物蛋白质均位于细胞质，并已有报道说它们使由细胞外调节物(如生长因子、细胞因子等)的受体跨膜信号生成的细胞内信号与Arp2/3复合物的活化联系起来了。从活化的跨膜受体到Arp2/3激活物激活的信号级联放大中至关紧要的中间步骤归因于Rho家族的小GTP-结合蛋白质(综述参见：Takai等人，Physiol.Rev.81：153-207，2001)。活化的Arp2/3复合物依次起始了新肌动蛋白丝的生成和先前存在的肌动蛋白丝的分支(综述参见：Bori sy和Svitkina，Curr.Opin.Cell Biol.12：104-112，2000；Pantaloni等人，Science 292：1502-1506；Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；以及其中的参考文献)。由于增强的细胞骨架动力学，细胞生成和/或收回了质膜突出，如丝足和片状伪足(Borisy和Svitkina，Curr.Opin.CellBiol.12：104-112，2000)。在从神经元长出的轴突的生长端部，即所谓的生长锥中，这样生成的增强的活性转化为增强的探究活性以及增强的轴突生长和导航活性(Hu和Reichardt，Neuron 22，419-422，1999；Suter和Forscher，.8：106-116，1998；Dickson，Curr.Opin.Neurobiol.11：103-110，2001)。在中枢神经系统神经元的树突棘中增强的肌动蛋白丝的动力学导致了增强的游动性，这依次再调节棘的形态和电特性。结果，对突触前信号的突触后反应可发生改变(Segal等人，Trends Neurosci.23：53-57，2000；Halpain，Trends Neurosci.23：141-146，2000；Matus，Science290：754-758，2000；Scott和Luo，Nature Neurosci.4：359-365，2001)。在非神经元细胞中，由Arp2/3激活诱导的肌动蛋白丝动力学的增强导致细胞游动性增加，并伴随膜突出如片状伪足形成增加和迁移活性增强(Holt和Koffer，Trend Cell Biol.11：38-47，2001；Mullins，Curr.Opin.Cell Biol.12：91-96，2000；Prokopenko等人，J.Cell Biol.148：843-848，2000)。从细胞表面到细胞骨架的信号传输调节异常可导致细胞游动性改变，片状伪足的形成增强，并且运动增强，当存在于肿瘤细胞时，可加强肿瘤细胞侵入性生长和转移的能力。(Radisky等人，Seminars CancerBiol.11：87-95，2001；Kassis等人，Seminars Cancer Biol.11：105-119，2001；Condeelis等人，Seminars Cancer Biol.11：119-128，2001；Price和Collard，Seminars Cancer Biol.11：167-173，2001)。

也发现含有色氨酸的酸性序列在由单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)生成的肌动蛋白丝的诱导和分支中是至关重要的(Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001；Cameron等人，Curr.Biol.11：130-135，2001)。在侵入到宿主细胞的细胞溶胶中之后，这些细菌利用细胞肌动蛋白装置来完成它们自身的运动。细菌表面蛋白质ActA可启动单核细胞增生李斯特氏菌表面肌动蛋白丝的形成。与细胞自身的Arp2/3激活物非常相似，单核细胞增生李斯特氏菌的ActA含有侧翼为酸性残基的色氨酸。它具有氨基酸序列...DEWEE...(综述参见：Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001)。

基于与目前公布的Arp2/3激活物的Arp2/3结合和Arp2/3激活基元的高度相似性，我们推测Calsyntenin家族的蛋白质可通过结合到Arp2/3复合物上并调节其功能而调节肌动蛋白细胞骨架的动力学。为了检验此假说，我们生成了一个包含谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和Calsyntenin-1的细胞质区段(GST-Cst_C)的融合蛋白质。人Calsyntenin-1的COOH-末端结构域(Cst_C)在大肠杆菌中作为GST融合蛋白质而表达和纯化。编码人Calsyntenin-1的细胞质区段(Cst_C：残基881-981)的区域从人脑cDNA中分别以寡核苷酸hsCst1-881f(5’-CGGGATCCCGCATCCGGGCCGCACAT-3’)(Seq.Id.No.39)和hsCst1-981r(5’-GGGAATTCCTCAGTAGCTGAGGGTGGAG-3’)(Seq.Id.No.40)作为正向和反向引物通过PCR扩增。将Cst_C的PCR片段克隆入pGEX6P-1质粒的BamHI/EcoRI位点上。使所得的pGEX-GST-Cst_C质粒转染入大肠杆菌菌株BL21中，GST-Cst_C融合蛋白质的表达根据标准程序诱导。根据标准程序用谷胱甘肽-琼脂糖(Amersham Pharmacia Biotech)纯化GST-Cst_C融合蛋白质并置于4℃备用。为了生成亲和柱，通过分批温育而将3.5mg的GST-Cst_C结合到0.75ml的谷胱甘肽-琼脂糖上。其后，将GST-Cst_C缀合的谷胱甘肽-琼脂糖装填入柱中并用缓冲液B平衡(见下文)。牛脑提取物是根据前述的程序制备的(Uruno等人，Nature Cell Biol.3：259-266，2001)。简单地，用韦林氏搅拌器将100g冷冻的牛脑在100ml缓冲液Q(20mM Tris、100mM NaCl、5mM MgCl₂、5mMEGTA和1mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8.0)中绞碎，补充50μg/ml的苯甲基磺酰氟、5μg/ml的亮抑蛋白酶肽和1μg/ml的抑酶肽。绞碎的组织进一步用Dounce匀浆器进行匀浆并通过4℃以10,000g离心60分钟以澄清。将上清液在100ml用缓冲液Q平衡过的Q琼脂糖快流速柱中进行层析。收集流过液，补充0.1mM的ATP，并上样到用缓冲液B(50mM Tris、25mM KCl、1mM MgCl₂、0.5mM EDTA、1mM DTT、0.1mM ATP，pH7.5)平衡过的GST-Cst_C谷胱甘肽-琼脂糖柱中。在用缓冲液B洗涤后，起初用缓冲液B中的0.2M KCl开始洗脱，随后用含有0.2M MgCl₂的缓冲液B进行第二次洗脱。洗脱的蛋白质通过SDS-PAGE及随后用商业上可供利用的抗Arp2/3复合物Arp3亚基的抗体(Santa Cruz)进行蛋白质印迹而分析。如在图13中证明的，从牛脑中抽提的蛋白质复杂混合物中含有的Arp2/3复合物结合到固定的GST-Cst_C融合蛋白质上，且仅当采用洗脱条件(图13中的洗脱A)时才可释放。当牛脑提取物通过只含有GST部分的柱时没有观察到Arp2/3的结合。这显示观察到的Arp2/3与GST-Cst_C融合蛋白质的结合是由Calsyntenin-1的细胞质区段介导的。基于在Calsyntenin-2和Calsyntenin-3的细胞质部分含有侧翼为酸性氨基酸的保守色氨酸的高度相似区段，Calsyntenin家族的所有成员均结合并因而调节Arp2/3的活性。

为了证明Calsyntenin-1的细胞质区段和Arp2/3复合物的直接结合，根据公布的操作纯化了Arp2/3复合物(Egile等人，J.CellBiol.146：1319-1332，1999)。为了制备Arp2/3复合物的亲和配体，使人N-WASP的COOH-末端结构域(VCA)在大肠杆菌中以GST融合蛋白质进行表达，并用谷胱甘肽-琼脂糖柱进行纯化。如前所述，通过PCR从人脑cDNA扩增编码人N-WASP的VCA区段(残基392-505)的区域，其中分别以寡核苷酸phNW392(5’-ccggaattcCCTTCTGATGGGGACCATCAG-3’)(Seq.Id.No.41)和phNW505(5’-ccgctcgagTCAGTCTTCCCACTCATCATC-3’)(Seq.Id.No.42)作为正向和反向引物得来(Egile等人，J.Cell Biol.146：1319-1332，1999)。将编码N-WASP VCA的PCR片段克隆入pGEX6P-1质粒的XhoI位点中以生成pGEX-VCA质粒。根据标准的诱导和纯化程序，使GST-VCA蛋白质在大肠杆菌菌株BL21中表达。将GST-VCA融合蛋白质在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化，并根据供应商(AmershamPharmacia Biotech)推荐的操作进行洗脱。为了生成亲和柱，使纯化的GST-VCA通过分批温育而结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠上。将GST-VCA谷胱甘肽-琼脂糖珠置于4℃备用。

如前所述，将GST-VCA谷胱甘肽-琼脂糖用作亲和基质以纯化Arp2/3复合物(Uruno等人，Nature Cell Biol.3：259-266，2001)。简单地，用韦林氏搅切器将100g冷冻的牛脑在100ml缓冲液Q(20mM Tris、100mM NaCl、5mM MgCl₂、5mM EGTA和1mM二硫苏糖醇(DTT)，pH8.0)中绞碎，补充50μg/ml的苯甲基磺酰氟、5μg/ml的亮抑蛋白酶肽和1μg/ml的抑酶肽。绞碎的组织进一步用Dounce匀浆器进行匀浆并通过4℃以10,000g离心60分钟以澄清。将上清液在用缓冲液Q平衡过的100ml Q琼脂糖快流速柱中进行层析。收集含有Arp2/3复合物的流过液，补充0.1mM的ATP，并在用缓冲液B(50mM Tris、25mM KCl、1mM MgCl₂、0.5mM EDTA、1mM DTT、0.1mM ATP，pH7.5)平衡过的GST-VCA谷胱甘肽-琼脂糖柱中进行分级分离。在缓冲液B中用0.2KCl洗涤后，将Arp2/3复合物用含有0.2M MgCl₂的缓冲液B进行洗脱。然后将蛋白质对缓冲液B进行透析并用Centriprep 10柱体进行浓缩。将浓缩的Arp2/3复合物于-80℃贮存在含有30％甘油的缓冲液B中。蛋白质浓度用BCA方法(Pierce蛋白质测定)以BSA作为标准确定。

为了检查Calsyntenin-1的细胞质区段是否具有结合Arp2/3复合物的能力，将GST-Cst_C融合蛋白质通过分批温育而结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠上。作为对照，将已确立为Arp2/3复合物配体的GST-VCA融合蛋白质(Uruno等人，Nature Cell Biol.3：259-266，2001)和GST自身结合到谷胱甘肽-琼脂糖上。在谷胱甘肽-琼脂糖珠上固定的GST-Cst_C、GST-VCA或GST(5μg)在缓冲液A中(100μl50mM Tris、1％ Triton-X-100)与10pmol纯化的Arp2/3复合物混合，然后于4℃在旋转轮上温育2小时。将珠子用缓冲液A漂洗3次，然后在两倍的SDS样品缓冲液中煮沸。将所得的样品缓冲液上样到SDS-PAGE凝胶上。将电泳分离的蛋白质用标准操作电转移到硝酸纤维素膜上。Arp2/3复合物是根据标准的免疫印迹程序用多克隆的抗-Arp3抗体(购自Santa Cruz)来显示的。我们发现了Arp2/3复合物与GST-Cst_C和GST-VCA而非GST自身结合的明确证据。这些结果证明了在Calsyntenin-1的细胞质区段和Arp2/3复合物之间的直接结合反应。

总之，含有细胞质序列...MDWDDS...和...LEWDDS...的Calsyntenin-1能够结合Arp2/3复合物。这显示Calsyntenin-1使用与目前已知的Arp2/3活性调节物相同的结合位点与Arp2/3复合物进行相互作用，其中所述调节物包括人WASP、人N-WASP、人Scar/WAVE1蛋白质、cortactin、和单核细胞增生李斯特氏菌的ActA蛋白质，其中包含保守色氨酸的结合位点分别包括序列...DEWDD、...DEWED、...VDWLE、...ADDWET...和...DEWEE(综述参见：Higgs和Pollard，Annu.Rev.Biochem.70：649-676，2001以及其中的参考文献)。因而，Calsyntenin-1依靠其细胞质部分而与Arp2/3活性的已确立的调节物进行竞争，从而参与Arp2/3活性的调节。Calsyntenin-1是第一个跨膜蛋白类的Arp2/3复合物调节物。相反地，目前已知的Arp2/3调节物，包括WASP、N-WASP、Scar/WAVE1家族的蛋白质以及cortactin都是细胞质蛋白质，且依赖于细胞外信号的其他细胞内介质。Calsyntenin-1可将其细胞外部分接收的细胞外信号直接转导成Arp2/3复合物的活性调节信号。在Calsyntenin-2和Calsyntenin-3的细胞质部分含有保守色氨酸的高度相似的保守酸性区段的存在显示所有Calsyntenin家族成员均可结合、并因而可调节Arp2/3的活性。

尽管显示和描述了目前优选的本发明实施方案，应该清楚地理解本发明不局限于此，而可另外地在下面的权利要求书的范围内进行不同的具体化和实施。

             序列表<110>Universitt Zürich<120>钙结合蛋白<130>Calsyntenins<140><141><150>EP 00810830.0<151>2000-09-14<160>42<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3700<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(236)..(3178)<400>1gaattccgga gttgctgccg ctgccttcag caagacgctg ctctgaggcg gggagggcgc 60cgcgtcctga gcgcgcggcc cagcgtcacg gcggcggcgg cggcggctcc tccttggacc 120cccggagctc cccgcgccgc gagcagctgg ccccaggccc ctagagcccc gagagctccg 180agagctccgc tcggcgtccc gcgcgcctcc ctgccgctcc cgccccgggc tggcg atg  238

                                                         Met

                                                           1ctg cgc cgc ccc gct ccc gag ctg gcc ccg gcc gcc cgg ctg ctg ctg   286Leu Arg Arg Pro Ala Pro Glu Leu Ala Pro Ala Ala Arg Leu Leu Leu

          5                  10                  15gcc ggg ctg ctg tgc ggc ggc ggg gtc tgg gcc gcg cga gtt aac aag   334Ala Gly Leu Leu Cys Gly Gly Gly Val Trp Ala Ala Arg Val Asn Lys

     20                  25                  30cac aag ccc tgg ctg gag ccc acc tac cac ggc ata gtc aca gag aac   382His Lys Pro Trp Leu Glu Pro Thr Tyr His Gly Ile Val Thr Glu Asn

 35                  40                  45gac aac acc gtg ctc ctc gac ccc cca ctg atc gcg ctg gat aaa gat   430Asp Asn Thr Val Leu Leu Asp Pro Pro Leu Ile Ala Leu Asp Lys Asp50                  55                  60                  65gcg cct ctg cga ttt gca gag agt ttt gag gtg aca gtc acc aaa gaa   478Ala Pro Leu Arg Phe Ala Glu Ser Phe Glu Val Thr Val Thr Lys Glu

             70                  75                  80ggt gag att tgt gga ttt aaa att cac ggg cag aat gtc ccc ttt gat   526Gly Glu Ile Cys Gly Phe Lys Ile His Gly Gln Asn Val Pro Phe Asp

         85                  90                  95gca gtg gta gtg gat aaa tcc act ggt gag gga gtc att cgc tcc aaa   574Ala Val Val Val Asp Lys Ser Thr Gly Glu Gly Val Ile Arg Ser Lys

    100                 105                 110gag aaa ctg gac tgt gag ctg cag aaa gac tat tca ttc acc atc cag   622Glu Lys Leu Asp Cys Glu Leu Gln Lys Asp Tyr Ser Phe Thr Ile Gln

115                 120                 125gcc tat gat tgt ggg aag gga cct gat ggc acc aac gtg aaa aag tct   670Ala Tyr Asp Cys Gly Lys Gly Pro Asp Gly Thr Asn Val Lys Lys Ser130                 135                 140                 145cat aaa gca act gtt cat att cag gtg aac gac gtg aat gag tac gcg   718His Lys Ala Thr Val His Ile Gln Val Asn Asp Val Asn Glu Tyr Ala

            150                 155                 160ccc gtg ttc aag gag aag tcc tac aaa gcc acg gtc atc gag ggg aag   766Pro Val Phe Lys Glu Lys Ser Tyr Lys Ala Thr Val Ile Glu Gly Lys

        165                 170                 175cag tac gac agc att ttg agg gtg gag gcc gtg gat gcc gac tgc tcc   814Gln Tyr Asp Ser Ile Leu Arg Val Glu Ala Val Asp Ala Asp Cys Ser

    180                 185                 190cct cag ttc agc cag att tgc agc tac gaa atc atc act cca gac gtg   862Pro Gln Phe Ser Gln Ile Cys Ser Tyr Glu Ile Ile Thr Pro Asp Val

195                 200                 205ccc ttt act gtt gac aaa gat ggt tat ata aaa aac aca gag aaa tta   910Pro Phe Thr Val Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Lys Asn Thr Glu Lys Leu210                 215                 220                 225aac tac ggg aaa gaa cat caa tat aag ctg acc gtc act gcc tat gac   958Asn Tyr Gly Lys Glu His Gln Tyr Lys Leu Thr Val Thr Ala Tyr Asp

            230                 235                 240tgt ggg aag aaa aga gcc aca gaa gat gtt ttg gtg aag atc agc att   1006Cys Gly Lys Lys Arg Ala Thr Glu Asp Val Leu Val Lys Ile Ser Ile

        245                 250                 255aag ccc acc tgc acc cct ggg tgg caa gga tgg aac aac agg att gag   1054Lys Pro Thr Cys Thr Pro Gly Trp Gln Gly Trp Asn Asn Arg Ile Glu

    260                 265                 270tat gag ccg ggc acc ggc gcg ttg gcc gtc ttt cca aat atc cac ctg   1102Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ala Leu Ala Val Phe Pro Asn Ile His Leu

275                 280                 285gag aca tgt gac gag cca gtc gcc tca gta cag gcc aca gtg gag cta   1150Glu Thr Cys Asp Glu Pro Val Ala Ser Val Gln Ala Thr Val Glu Leu290                 295                 300                 305gaa acc agc cac ata ggg aaa ggc tgc gac cga gac acc tac tca gag   1198Glu Thr Ser His Ile Gly Lys Gly Cys Asp Arg Asp Thr Tyr Ser Glu

            310                 315                 320aag tcc ctc cac cgg ctc tgt ggt gcg gcc gcg ggc act gcc gag ctg   1246Lys Ser Leu His Arg Leu Cys Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Glu Leu

        325                 330                 335ctg cca tcc ccg agt gga tcc ctc aac tgg acc atg ggc ctg ccc acc   1294Leu Pro Ser Pro Ser Gly Ser Leu Asn Trp Thr Met Gly Leu Pro Thr

    340                 345                 350gac aat ggc cac gac agc gac cag gtg ttt gag ttc aac ggc acc cag   1342Asp Asn Gly His Asp Ser Asp Gln Val Phe Glu Phe Asn Gly Thr Gln

355                 360                 365gca gtg agg atc ccg gat ggc gtc gtg tcg gtc agc ccc aaa gag ccg   1390Ala Val Arg Ile Pro Asp Gly Val Val Ser Val Ser Pro Lys Glu Pro370                 375                 380                 385ttc acc atc tcg gtg tgg atg aga cat ggg cca ttc ggc agg aag aag   1438Phe Thr Ile Ser Val Trp Met Arg His Gly Pro Phe Gly Arg Lys Lys

            390                 395                 400gag aca att ctt tgc agt tct gat aaa aca gat atg aat cgg cac cac   1486Glu Thr Ile Leu Cys Ser Ser Asp Lys Thr Asp Met Asn Arg His His

        405                 410                 415tac tcc ctc tat gtc cac ggg tgc cgg ctg atc ttc ctc ttc cgt cag   1534Tyr Ser Leu Tyr Val His Gly Cys Arg Leu Ile Phe Leu Phe Arg Gln

    420                 425                 430gat cct tct gag gag aag aaa tac aga cct gca gag ttc cac tgg aag   1582Asp Pro Ser Glu Glu Lys Lys Tyr Arg Pro Ala Glu Phe His Trp Lys

435                 440                 445ttg aat cag gtc tgt gat gag gaa tgg cac cac tac gtc ctc aat gta   1630Leu Asn Gln Val Cys Asp Glu Glu Trp His His Tyr Val Leu Asn Val450                 455                 460                 465gaa ttc ccg agt gtg act ctc tat gtg gat ggc acg tcc cac gag ccc   1678Glu Phe Pro Ser Val Thr Leu Tyr Val Asp Gly Thr ger His Glu Pro

            470                 475                 480ttc tct gtg act gag gat tac ccg ctc cat cca tcc aag ata gaa act   1726Phe Ser Val Thr Glu Asp Tyr Pro Leu His Pro Ser Lys Ile Glu Thr

        485                 490                 495cag ctc gtg gtg ggg gct tgc tgg caa gag ttt tca gga gtt gaa aat   1774Gln Leu Val Val Gly Ala Cys Trp Gln Glu Phe Ser Gly Val Glu Asn

    500                 505                 510gac aat gaa act gag cct gtg act gtg gcc tct gca ggt ggc gac ctg   1822Asp Asn Glu Thr Glu Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Gly Gly Asp Leu

515                 520                 525cac atg acc cag ttt ttc cga ggc aat ctg gct ggc tta act ctc cgt   1870His Met Thr Gln Phe Phe Arg Gly Asn Leu Ala Gly Leu Thr Leu Arg530                 535                 540                 545tcc ggg aaa ctc gcg gat aag aag gtg atc gac tgt ctg tat acc tgc   1918Ser Gly Lys Leu Ala Asp Lys Lys Val Ile Asp Cys Leu Tyr Thr Cys

            550                 555                 560aag gag ggg ctg gac ctg cag gtc ctc gaa gac agt ggc aga ggc gtg   1966Lys Glu Gly Leu Asp Leu Gln Val Leu Glu Asp Ser Gly Arg Gly Val

        565                 570                 575cag atc caa gca cac ccc agc cag ttg gta ttg acc ttg gag gga gaa   2014Gln Ile Gln Ala His Pro Ser Gln Leu Val Leu Thr Leu Glu Gly Glu

    580                 585                 590gac ctc ggg gaa ttg gat aag gcc atg cag cac atc tcg tac ctg aac   2062Asp Leu Gly Glu Leu Asp Lys Ala Met Gln His Ile Ser Tyr Leu Asn

595                 600                 605tcc cgg cag ttc ccc acg ccc gga att cgc aga ctc aaa atc acc agc   2110Ser Arg Gln Phe Pro Thr Pro Gly Ile Arg Arg Leu Lys Ile Thr Ser610                 615                 620                 625aca atc aag tgt ttt aac gag gcc acc tgc att tcg gtc ccc ccg gta   2158Thr Ile Lys Cys Phe Asn Glu Ala Thr Cys Ile Ser Val Pro Pro Val

            630                 635                 640gat ggc tac gtg atg gtt tta cag ccc gag gag ccc aag atc agc ctg   2206Asp Gly Tyr Val Met Val Leu Gln Pro Glu Glu Pro Lys Ile Ser Leu

        645                 650                 655agt ggc gtc cac cat ttt gcc cga gca gct tct gaa ttt gaa agc tca   2254Ser Gly Val His His Phe Ala Arg Ala Ala Ser Glu Phe Glu Ser Ser

    660                 665                 670gaa ggg gtg ttc ctt ttc cct gag ctt cgc atc atc agc acc atc acg   2302Glu Gly Val Phe Leu Phe Pro Glu Leu Arg Ile Ile Ser Thr Ile Thr

675                 680                 685aga gaa gtg gag cct gaa ggg gac ggg gct gag gac ccc aca gtt caa   2350Arg Glu Val Glu Pro Glu Gly Asp Gly Ala Glu Asp Pro Thr Val Gln690                 695                 700                 705gaa tca ctg gtg tcc gag gag atc gtg cac gac ctg gat acc tgt gag   2398Glu Ser Leu Val Ser Glu Glu Ile Val His Asp Leu Asp Thr Cys Glu

            710                 715                 720gtc acg gtg gag gga gag gag ctg aac cac gag cag gag agc ctg gag   2446Val Thr Val Glu Gly Glu Glu Leu Asn His Glu Gln Glu Ser Leu Glu

        725                 730                 735gtg gac atg gcc cgc ctg cag cag aag ggc att gaa gtg agc agc tct   2494Val Asp Met Ala Arg Leu Gln Gln Lys Gly Ile Glu Val Ser Ser Ser

    740                 745                 750gaa ctg ggc atg acc ttc aca ggc gtg gac acc atg gcc agc tac gag   2542Glu Leu Gly Met Thr Phe Thr Gly Val Asp Thr Met Ala Ser Tyr Glu

755                 760                 765gag gtt ttg cac ctg ctg cgc tat cgg aac tgg cat gcc agg tcc ttg   2590Glu Val Leu His Leu Leu Arg Tyr Arg Asn Trp His Ala Arg Ser Leu770                 775                 780                 785ctt gac cgg aag ttt aag ctc atc tgc tca gag ctg aat ggc cgc tac   2638Leu Asp Arg Lys Phe Lys Leu Ile Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg Tyr

            790                 795                 800atc agc aac gaa ttt aag gtg gag gtg aat gta atc cac acg gcc aac   2686Ile Ser Asn Glu Phe Lys Val Glu Val Asn Val Ile His Thr Ala Asn

        805                 810                 815ccc atg gaa cac gcc aac cac atg gct gcc cag cca cag ttc gtg cac   2734Pro Met Glu His Ala Asn His Met Ala Ala Gln Pro Gln Phe Val His

    820                 825                 830ccg gaa cac cgc tcc ttt gtt gac ctg tca ggc cac aac ctg gcc aac   2782Pro Glu His Arg Ser Phe Val Asp Leu Ser Gly His Asn Leu Ala Asn

835                 840                 845ccc cac ccg ttc gca gtc gtc ccc agc act gcg aca gtt gtg atc gtg   2830Pro His Pro Phe Ala Val Val Pro Ser Thr Ala Thr Val Val Ile Val850                 855                 860                 865gtg tgc gtc agc ttc ctg gtg ttc atg att atc ctg ggg gta ttt cgg   2878Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val Phe Arg

            870                 875                 880atc cgg gcc gca cat cgg cgg acc atg cgg gat cag gac acc ggg aag   2926Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg Asp Gln Asp Thr Gly Lys

        885                 890                 895gag aac gag atg gac tgg gac gac tct gcc ctg acc atc acc gtc aac   2974Glu Asn Glu Met Asp Trp Asp Asp Ser Ala Leu Thr Ile Thr Val Asn

    900                 905                 910ccc atg gag acc tat gag gac cag cac agc agt gag gag gag gag gaa   3022Pro Met Glu Thr Tyr Glu Asp Gln His Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu

915                 920                 925gag gaa gag gaa gag gaa agc gag gac ggc gaa gaa gag gat gac atc   3070Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Glu Asp Gly Glu Glu Glu Asp Asp Ile930                 935                 940                 945acc agc gcc gag tcg gag agc agc gag gag gag gag ggg gag cag ggc   3118Thr Ser Ala Glu Ser Glu Ser Ser Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gln Gly

            950                 955                 960gac ccc cag aac gca acc cgg cag cag cag ctg gag tgg gat gac tcc   3166Asp Pro Gln Asn Ala Thr Arg Gln Gln Gln Leu Glu Trp Asp Asp Ser

        965                 970                 975acc ctc agc tac tgacccgtgc ccccggccac ctcggtttct gctttcgaag       3218Thr Leu Ser Tyr

    980actctgctgc catccgttct cccagtccca agggtccacg atgtacaaag tcatttcggc 3278cagtaggtgt gcagacccct ccccgccacg atcgtcgctg tgcttggtgt gtaggaccct 3338aggctccccg cccaccctct gcctggtcgc gctcttcagt cccacgagga gctgacacgt 3398cctctctggc cgccatccgg ctcgcacagg ggcctcccag cgcctcaggc cccgcgtttg 3458tgtctggagt ctccccccgg ggagaggaca ctggcccctc gcactccaga aaagccatgc 3518cagctgggct cgttgacaaa gggtaaaaca tgctcatccc acccggtaat tcattttttt 3578ctttttttta aaaaaagttt ttattttttt ccaaactagt gcatgtatta aataatgggc 3638aggggggggg gtatgtttta ggatgattaa ctggactttt taatattttt tgtaaaataa 3698aa                                                                3700<210>2<211>981<212>PRT<213>人<400>2Met Leu Arg Arg Pro Ala Pro Glu Leu Ala Pro Ala Ala Arg Leu Leu1               5                  10                  15Leu Ala Gly Leu Leu Cys Gly Gly Gly Val Trp Ala Ala Arg Val Asn

         20                  25                  30Lys His Lys Pro Trp Leu Glu Pro Thr Tyr His Gly Ile Val Thr Glu

     35                  40                  45Asn Asp Asn Thr Val Leu Leu Asp Pro Pro Leu Ile Ala Leu Asp Lys

 50                  55                  60Asp Ala Pro Leu Arg Phe Ala Glu Ser Phe Glu Val Thr Val Thr Lys65                  70                  75                  80Glu Gly Glu Ile Cys Gly Phe Lys Ile His Gly Gln Asn Val Pro Phe

             85                  90                  95Asp Ala Val Val Val Asp Lys Ser Thr Gly Glu Gly Val Ile Arg Ser

        100                 105                 110Lys Glu Lys Leu Asp Cys Glu Leu Gln Lys Asp Tyr Ser Phe Thr Ile

    115                 120                 125Gln Ala Tyr Asp Cys Gly Lys Gly Pro Asp Gly Thr Asn Val Lys Lys

130                 135                 140Ser His Lys Ala Thr Val His Ile Gln Val Asn Asp Val Asn Glu Tyr145                 150                 155                 160Ala Pro Val Phe Lys Glu Lys Ser Tyr Lys Ala Thr Val Ile Glu Gly

            165                 170                 175Lys Gln Tyr Asp Ser Ile Leu Arg Val Glu Ala Val Asp Ala Asp Cys

        180                 185                 190Ser Pro Gln Phe Ser Gln Ile Cys Ser Tyr Glu Ile Ile Thr Pro Asp

    195                 200                 205Val Pro Phe Thr Val Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Lys Asn Thr Glu Lys

210                 215                 220Leu Asn Tyr Gly Lys Glu His Gln Tyr Lys Leu Thr Val Thr Ala Tyr225                 230                 235                 240Asp Cys Gly Lys Lys Arg Ala Thr Glu Asp Val Leu Val Lys Ile Ser

            245                 250                 255Ile Lys Pro Thr Cys Thr Pro Gly Trp Gln Gly Trp Asn Asn Arg Ile

        260                 265                 270Glu Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ala Leu Ala Val Phe Pro Asn Ile His

    275                 280                 285Leu Glu Thr Cys Asp Glu Pro Val Ala Ser Val Gln Ala Thr Val Glu

290                 295                 300Leu Glu Thr Ser His Ile Gly Lys Gly Cys Asp Arg Asp Thr Tyr Ser305                 310                 315                 320Glu Lys Ser Leu His Arg Leu Cys Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Glu

            325                 330                 335Leu Leu Pro Ser Pro Ser Gly Ser Leu Asn Trp Thr Met Gly Leu Pro

        340                 345                 350Thr Asp Asn Gly His Asp Ser Asp Gln Val Phe Glu Phe Asn Gly Thr

    355                 360                 365Gln Ala Val Arg Ile Pro Asp Gly Val Val Ser Val Ser Pro Lys Glu

370                 375                 380Pro Phe Thr Ile Ser Val Trp Met Arg His Gly Pro Phe Gly Arg Lys385                 390                 395                 400Lys Glu Thr Ile Leu Cys Ser Ser Asp Lys Thr Asp Met Asn Arg His

            405                 410                 415His Tyr Ser Leu Tyr Val His Gly Cys Arg Leu Ile Phe Leu Phe Arg

        420                 425                 430Gln Asp Pro Ser Glu Glu Lys Lys Tyr Arg Pro Ala Glu Phe His Trp

    435                 440                 445Lys Leu Asn Gln Val Cys Asp Glu Glu Trp His His Tyr Val Leu Asn

450                 455                 460Val Glu Phe Pro Ser Val Thr Leu Tyr Val Asp Gly Thr Ser His Glu465                 470                 475                 480Pro Phe Ser Val Thr Glu Asp Tyr Pro Leu His Pro Ser Lys Ile Glu

            485                 490                 495Thr Gln Leu Val Val Gly Ala Cys Trp Gln Glu Phe Ser Gly Val Glu

        500                 505                 510Asn Asp Asn Glu Thr Glu Pro Val Thr Val Ala Ser Ala Gly Gly Asp

    515                 520                 525Leu His Met Thr Gln Phe Phe Arg Gly Asn Leu Ala Gly Leu Thr Leu

530                 535                 540Arg Ser Gly Lys Leu Ala Asp Lys Lys Val Ile Asp Cys Leu Tyr Thr545                 550                 555                 560Cys Lys Glu Gly Leu Asp Leu Gln Val Leu Glu Asp Ser Gly Arg Gly

            565                 570                 575Val Gln Ile Gln Ala His Pro Ser Gln Leu Val Leu Thr Leu Glu Gly

        580                 585                 590Glu Asp Leu Gly Glu Leu Asp Lys Ala Met Gln His Ile Ser Tyr Leu

    595                 600                 605Asn Ser Arg Gln Phe Pro Thr Pro Gly Ile Arg Arg Leu Lys Ile Thr

610                 615                 620Ser Thr Ile Lys Cys Phe Asn Glu Ala Thr Cys Ile Ser Val Pro Pro625                 630                 635                 640Val Asp Gly Tyr Val Met Val Leu Gln Pro Glu Glu Pro Lys Ile Ser

            645                 650                 655Leu Ser Gly Val His His Phe Ala Arg Ala Ala Ser Glu Phe Glu Ser

        660                 665                 670Ser Glu Gly Val Phe Leu Phe Pro Glu Leu Arg Ile Ile Ser Thr Ile

    675                 680                 685Thr Arg Glu Val Glu Pro Glu Gly Asp Gly Ala Glu Asp Pro Thr Val

690                 695                 700Gln Glu Ser Leu Val Ser Glu Glu Ile Val His Asp Leu Asp Thr Cys705                 710                 715                 720Glu Val Thr Val Glu Gly Glu Glu Leu Asn His Glu Gln Glu Ser Leu

            725                 730                 735Glu Val Asp Met Ala Arg Leu Gln Gln Lys Gly Ile Glu Val Ser Ser

        740                 745                 750Ser Glu Leu Gly Met Thr Phe Thr Gly Val Asp Thr Met Ala Ser Tyr

    755                 760                 765Glu Glu Val Leu His Leu Leu Arg Tyr Arg Asn Trp His Ala Arg Ser

770                 775                 780Leu Leu Asp Arg Lys Phe Lys Leu Ile Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg785                 790                 795                 800Tyr Ile Ser Asn Glu Phe Lys Val Glu Val Asn Val Ile His Thr Ala

            805                 810                 815Asn Pro Met Glu His Ala Asn His Met Ala Ala Gln Pro Gln Phe Val

        820                 825                 830His Pro Glu His Arg Ser Phe Val Asp Leu Ser Gly His Asn Leu Ala

    835                 840                 845Asn Pro His Pro Phe Ala Val Val Pro Ser Thr Ala Thr Val Val Ile

850                 855                 860Val Val Cys Val Ser Phe Leu Val Phe Met Ile Ile Leu Gly Val Phe865                 870                 875                 880Arg Ile Arg Ala Ala His Arg Arg Thr Met Arg Asp Gln Asp Thr Gly

            885                 890                 895Lys Glu Asn Glu Met Asp Trp Asp Asp Ser Ala Leu Thr Ile Thr Val

        900                 905                 910Asn pro Met Glu Thr Tyr Glu Asp Gln His Ser Ser Glu Glu Glu Glu

    915                 920                 925Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ser Glu Asp Gly Glu Glu Glu Asp Asp

930                 935                 940Ile Thr Ser Ala Glu Ser Glu Ser Ser Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gln945                 950                 955                 960Gly Asp Pro Gln Asn Ala Thr Arg Gln Gln Gln Leu Glu Trp Asp Asp

            965                 970                 975Ser Thr Leu Ser Tyr

        980<210>3<211>4421<212>DNA<213>人<220><221>5′UTR<222>(1)..(10)<220><221>CDS<222>(11)..(2875)<220><221>3′UTR<222>(2876)..(4421)<400>3tgctgcgagg atg ctg cct ggg cgg ctg tgc tgg gtg ccg ctc ctg ctg    49

       Met Leu Pro Gly Arg Leu Cys Trp Val Pro Leu Leu Leu

         1               5                  10gcg ctg ggc gtg ggg agc ggc agc ggc ggt ggc ggg gac agc cgg cag    97Ala Leu Gly Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ser Arg Gln

 15                  20                  25cgc cgc ctc ctc gcg gct aaa gtc aat aag cac aag cca tgg atc gag    145Arg Arg Leu Leu Ala Ala Lys Val Asn Lys His Lys Pro Trp Ile Glu30                  35                  40                  45act tca tat cat gga gtc ata act gag aac aat gac aca gtc att ttg   193Thr Ser Tyr His Gly Val Ile Thr Glu Asn Asn Asp Thr Val Ile Leu

            50                  55                  60gac cca cca ctg gta gcc ctg gat aaa gat gca ccg gtt cct ttt gca   241Asp Pro Pro Leu Val Ala Leu Asp Lys Asp Ala Pro Val Pro Phe Ala

         65                  70                  75ggg gaa atc tgt gcg ttc aag atc cat ggc cag gag ctg ccc ttt gag   289Gly Glu Ile Cys Ala Phe Lys Ile His Gly Gln Glu Leu Pro Phe Glu

     80                  85                  90gct gtg gtg ctc aac aag aca tca gga gag ggc cgg ctc cgt gcc aag   337Ala Val Val Leu Asn Lys Thr Ser Gly Glu Gly Arg Leu Arg Ala Lys

 95                 100                 105agc ccc att gac tgt gag ttg cag aag gag tac aca ttc atc atc cag   385Ser Pro Ile Asp Cys Glu Leu Gln Lys Glu Tyr Thr Phe Ile Ile Gln110                 115                 120                 125gcc tat gac tgt ggt gct ggg ccc cac gag aca gcc tgg aaa aag tca   433Ala Tyr Asp Cys Gly Ala Gly Pro His Glu Thr Ala Trp Lys Lys Ser

            130                 135                 140cac aag gcc gtg gtc cat ata cag gtg aag gat gtc aac gag ttt gct   481His Lys Ala Val Val His Ile Gln Val Lys Asp Val Asn Glu Phe Ala

        145                 150                 155ccc acc ttc aaa gag cca gcc tac aag gct gtt gtg acg gag ggc aag   529Pro Thr Phe Lys Glu Pro Ala Tyr Lys Ala Val Val Thr Glu Gly Lys

    160                 165                 170atc tat gac agc att ctg cag gtg gag gcc att gac gag gac tgc tcc   577Ile Tyr Asp Ser Ile Leu Gln Val Glu Ala Ile Asp Glu Asp Cys Ser

175                 180                 185cca cag tac agc cag atc tgc aac tat gaa atc gtc acc aca gat gtg   625Pro Gln Tyr Ser Gln Ile Cys Asn Tyr Glu Ile Val Thr Thr Asp Val190                 195                 200                 205cct ttt gcc atc gac aga aat ggc aac atc agg aac act gag aag ctg   673Pro Phe Ala Ile Asp Arg Asn Gly Asn Ile Arg Asn Thr Glu Lys Leu

            210                 215                 220agc tat gac aaa caa cac cag tat gag atc ctg gtg acc gcc tac gac   721Ser Tyr Asp Lys Gln His Gln Tyr Glu Ile Leu Val Thr Ala Tyr Asp

        225                 230                 235tgt gga cag aag ccc gct gct cag gac acc ctg gtg cag gtg gat gtg   769Cys Gly Gln Lys Pro Ala Ala Gln Asp Thr Leu Val Gln Val Asp Val

    240                 245                 250aag cca gtt tgc aag cct ggc tgg caa gac tgg acc aag agg att gag   817Lys Pro Val Cys Lys Pro Gly Trp Gln Asp Trp Thr Lys Arg Ile Glu

255                 260                 265tac cag cct ggc tcc ggg agc atg ccc ctg ttc ccc agc atc cac ctg   865Tyr Gln Pro Gly Ser Gly Ser Met Pro Leu Phe Pro Ser Ile His Leu270                 275                 280                 285gag acg tgc gat gga gcc gtg tct tcc ctc cag atc gtc aca gag ctg   913Glu Thr Cys Asp Gly Ala Val Ser Ser Leu Gln Ile Val Thr Glu Leu

            290                 295                 300cag act aat tac att ggg aag ggt tgt gac cgg gag acc tac tct gag   961Gln Thr Asn Tyr Ile Gly Lys Gly Cys Asp Arg Glu Thr Tyr Ser Glu

        305                 310                 315aaa tcc ctt cag aag tta tgt gga gcc tcc tct ggc atc att gac ctc   1009Lys Ser Leu Gln Lys Leu Cys Gly Ala Ser Ser Gly Ile Ile Asp Leu

    320                 325                 330ttg cca tcc cct agc gct gcc acc aac tgg act gca gga ctg ctg gtg   1057Leu Pro Ser Pro Ser Ala Ala Thr Asn Trp Thr Ala Gly Leu Leu Val

335                 340                 345gac agc agt gag atg atc ttc aag ttt gac ggc agg cag ggt gcc aaa   1105Asp Ser Ser Glu Met Ile Phe Lys Phe Asp Gly Arg Gln Gly Ala Lys350                 355                 360                 365atc ccc gat ggg att gtg ccc aag aac ctg acc gat cag ttc acc atc   1153Ile Pro Asp Gly Ile Val Pro Lys Asn Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ile

            370                 375                 380acc atg tgg atg aaa cac ggc ccc agc cct ggt gtg aga gcc gag aag   1201Thr Met Trp Met Lys His Gly Pro Ser Pro Gly Val Arg Ala Glu Lys

        385                 390                 395gaa acc atc ctc tgc aac tca gac aaa acc gaa atg aac cgg cat cac   1249Glu Thr Ile Leu Cys Asn Ser Asp Lys Thr Glu Met Asn Arg His His

    400                 405                 410tat gcc ctg tat gtg cac aac tgc cgc ctc gtc ttt ctc ttg cgg aag   1297Tyr Ala Leu Tyr Val His Asn Cys Arg Leu Val Phe Leu Leu Arg Lys

415                 420                 425gac ttc gac cag gct gac acc ttt cgc ccc gcg gag ttc cac tgg aag    1345Asp Phe Asp Gln Ala Asp Thr Phe Arg Pro Ala Glu Phe His Trp Lys430                 435                 440                 445ctg gat cag att tgt gac aaa gag tgg cac tac tat gtc atc aat gtg   1393Leu Asp Gln Ile Cys Asp Lys Glu Trp His Tyr Tyr Val Ile Asn Val

            450                 455                 460gag ttt cct gtg gta acc tta tac atg gat gga gca aca tat gaa cca   1441Glu Phe Pro Val Val Thr Leu Tyr Met Asp Gly Ala Thr Tyr Glu Pro

        465                 470                 475tac ctg gtg acc aac gac tgg ccc att cat cca tct cac ata gcc atg   1489Tyr Leu Val Thr Asn Asp Trp Pro Ile His Pro Ser His Ile Ala Met

    480                 485                 490caa ctc aca gtc ggc gct tgt tgg caa gga gga gaa gtc acc aaa cca   1537Gln Leu Thr Val Gly Ala Cys Trp Gln Gly Gly Glu Val Thr Lys Pro

495                 500                 505cag ttt gct cag ttc ttt cat gga agc ctg gcc agt ctc acc atc cgc   1585Gln Phe Ala Gln Phe Phe His Gly Ser Leu Ala Ser Leu Thr Ile Arg510                 515                 520                 525cct ggc aaa atg gaa agc cag aag gtg atc tcc tgc ctg cag gcc tgc   1633Pro Gly Lys Met Glu Ser Gln Lys Val Ile Ser Cys Leu Gln Ala Cys

            530                 535                 540aag gaa ggg ctg gac att aat tcc ttg gaa agc ctt ggc caa gga ata   1681Lys Glu Gly Leu Asp Ile Asn Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gln Gly Ile

        545                 550                 555aag tat cac ttc aac ccc tcg cag tcc atc ctg gtg atg gaa ggt gac   1729Lys Tyr His Phe Asn Pro Ser Gln Ser Ile Leu Val Met Glu Gly Asp

    560                 565                 570gac att ggg aac att aac cgt gct ctc cag aaa gtc tcc tac atc aac   1777Asp Ile Gly Asn Ile Asn Arg Ala Leu Gln Lys Val Ser Tyr Ile Asn

575                 580                 585tcc agg cag ttc cca acg gcg ggt gtg cgg cgc ctc aaa gta tcc tcc   1825Ser Arg Gln Phe Pro Thr Ala Gly Val Arg Arg Leu Lys Val Ser Ser590                 595                 600                 605aaa gtc cag tgc ttt ggg gaa gac gta tgc atc agt atc cct gag gta   1873Lys Val Gln Cys Phe Gly Glu Asp Val Cys Ile Ser Ile Pro Glu Val

            610                 615                 620gat gcc tat gtg atg gtc ctc cag gcc atc gag ccc cgg atc acc ctc   1921Asp Ala Tyr Val Met Val Leu Gln Ala Ile Glu Pro Arg Ile Thr Leu

        625                 630                 635cgg ggc aca gac cac ttc tgg aga cct gct gcc cag ttt gaa agt gcc   1969Arg Gly Thr Asp His Phe Trp Arg Pro Ala Ala Gln Phe Glu Ser Ala

    640                 645                 650agg gga gtg acc ctc ttc cct gat atc aag att gtg agc acc ttc gcc   2017Arg Gly Val Thr Leu Phe Pro Asp Ile Lys Ile Val Ser Thr Phe Ala

655                 660                 665aaa acc gaa gcc ccc ggg gac gtg aaa acc aca gac ccc aaa tca gaa   2065Lys Thr Glu Ala Pro Gly Asp Val Lys Thr Thr Asp Pro Lys Ser Glu670                 675                 680                 685gtc tta gag gaa atg ctt cat aac tta gat ttc tgt gac att ttg gtg   2113Val Leu Glu Glu Met Leu His Asn Leu Asp Phe Cys Asp Ile Leu Val

            690                 695                 700atc gga ggg gac ttg gac cca agg cag gag tgc ttg gag ctc aac cac   2161Ile Gly Gly Asp Leu Asp Pro Arg Gln Glu Cys Leu Glu Leu Asn His

        705                 710                 715agt gag ctc cac caa cga cac ctg gat gcc act aat tct act gca ggc   2209Ser Glu Leu His Gln Arg His Leu Asp Ala Thr Asn Ser Thr Ala Gly

    720                 725                 730tac tcc atc tac ggt gtg ggc tcc atg agc cgc tat gag cag gtg cta   2257Tyr Ser Ile Tyr Gly Val Gly Ser Met Ser Arg Tyr Glu Gln Val Leu

735                 740                 745cat cac atc cgc tac cgc aac tgg cgt ccg gct tcc ctt gag gcc cgg   2305His His Ile Arg Tyr Arg Asn Trp Arg Pro Ala Ser Leu Glu Ala Arg750                 755                 760                 765cgt ttc cgg att aag tgc tca gaa ctc aat ggg cgc tac act agc aat   2353Arg Phe Arg Ile Lys Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg Tyr Thr Ser Asn

            770                 775                 780gag ttc aac ttg gag gtc agc atc ctt cat gaa gac caa gtc tca gat   2401Glu Phe Asn Leu Glu Val Ser Ile Leu His Glu Asp Gln Val Ser Asp

        785                 790                 795aag gag cat gtc aat cat ctg att gtg cag cct ccc ttc ctc cag tct   2449Lys Glu His Val Asn His Leu Ile Val Gln Pro Pro Phe Leu Gln Ser

    800                 805                 810gtc cat cat cct gag tcc cgg agt agc atc cag cac agt tca gtg gtc   2497Val His His Pro Glu Ser Arg Ser Ser Ile Gln His Ser Ser Val Val

815                 820                 825cca agc att gcc aca gtg gtc atc atc atc tcc gtg tgc atg ctt gtg   2545Pro Ser Ile Ala Thr Val Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val830                 835                 840                 845ttt gtc gtg gcc atg ggt gtg tac cgg gtc cgg atc gcc cac cag cac   2593Phe Val Val Ala Met Gly Val Tyr Arg Val Arg Ile Ala His Gln His

            850                 855                 860ttc atc cag gag act gag gct gcc aag gaa tct gag atg gac tgg gac   2641Phe Ile Gln Glu Thr Glu Ala Ala Lys Glu Ser Glu Met Asp Trp Asp

        865                 870                 875gat tct gcg ctg act atc aca gtc aac ccc atg gag aaa cat gaa gga   2689Asp Ser Ala Leu Thr Ile Thr Val Asn Pro Met Glu Lys His Glu Gly

    880                 885                 890cca ggg cat ggg gaa gat gag act gag gga gaa gag gag gaa gaa gcc   2737Pro Gly His Gly Glu Asp Glu Thr Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala

895                 900                 905gag gaa gaa atg agc tcc agc agt ggc tct gac gac agc gaa gag gag   2785Glu Glu Glu Met Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Asp Ser Glu Glu Glu910                 915                 920                 925gag gag gag gaa ggg atg ggc aga ggc aga cat ggg cag aat gga gcc   2833Glu Glu Glu Glu Gly Met GlyArg Gly Arg His Gly Gln Asn Gly Ala

            930                935                 940agg caa gcc cag ctg gag tgg gat gac tcc acc ctc ccc tac           2875Arg Gln Ala Gln Leu Glu Trp Asp Asp Ser Thr Leu Pro Tyr

        945                 950                 955tagtgcccag gggtctgctg cctggcccac atgtcccttt tgtaaaccct gacccagtgt 2935atgcccatgt ctatcatacc tcacctctga tgtctgtgac atgtctggga aggccttctc 2995cagcttcctg gagcccaccc tttaagcctt gggcactccc tgtgtttcat ccatggggaa 3055gttccaagaa gcccagcatg gccatcagtg aggacttcag ggtagacttt gtcctgtagc 3115ctccacttct gccctaagtt ccccagcatc ctgactacct gtctgcagag tttgcctttg 3175ttttttcctg cagggaagaa ggcccacctt tgtgtcactc acctccccag gctcagagtc 3235cccaaggccc tggggttcca actcactgtg cgtctcctcc acacagacca gtaggttctc 3295ctatgctgac tccaggttgc ttcatacaag gagggtggtt gaacttcaca cacgtaaggt 3355cttagtgctt aacagtttaa aggaaagtcc ttgttgaggc agaactaagt ttacagggaa 3415aggtacacac attctctctc tctctctctc tctgtctatc tagttcccca gcttggagag 3475cctttcccct tgcttctttc tgaggccata taagcttata agaaaagtcc caaaccaaga 3535ataggtcctt ggccacaagc agggtctgat cccccatcag agctatctga gcctgcctgt 3595ctgggcacct gctgcaacca tgcagctacc ctgccagggg cactcagcaa acagaaccac 3655agggcccagg aggcattcca cacaggcact gccccaggac aacacaacaa ggacagtcac 3715aacaaggaca acaaggacac aacacaacac acaacaagga cagtcacaac aagcctagag 3775ccagaaagca gatggaaatg ctaatgaggt caaacgtagg cttcatggtg ggtggagtgg 3835gggtggctgg gctcccccag gacagagggg accctgaggt tggcaaggct ctcaccactc 3895agccttatgg tcccttatct cctatcttcc ctcttgagaa aatacacgct ttctgcatgt 3955attagaaacg cacgagctcc accaagtcta caatgaaagt ttgaaattta actgcaagga 4015attagaagca tatttgcaat cattgcagct tcttctttct tctgctcata aaaggaggaa 4075cactttagat agagggcaaa tatatctgaa aacctaattt ctttcttttt ttgataagga 4135aatcttttcc atctccatcc taacatgcac aacctgtgaa gagaattgtt tctatagtaa 4195ctggtctgtg atcttttgtg gccaagagaa tagcaggcaa gaattagggc cttgacagaa 4255tttccacgaa gctctgagaa catgtttgtt tcgaatgtct gattcctctt tgtcatcaat 4315gtgtatgctc tgtccccatc cttcactcct cctcaagctc acaccaattg gtttggcaca 4375ggcacagagc tggtccctag ttaagtggca tttatgttaa aaaaaa                4421<210>4<211>955<212>PRT<213>人<400>4Met Leu Pro Gly Arg Leu Cys Trp Val Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly1               5                  10                  15Val Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Asp Ser Arg Gln Arg Arg Leu

         20                  25                  30Leu Ala Ala Lys Val Asn Lys His Lys Pro Trp Ile Glu Thr Ser Tyr

     35                  40                  45His Gly Val Ile Thr Glu Asn Asn Asp Thr Val Ile Leu Asp Pro Pro

 50                  55                  60Leu Val Ala Leu Asp Lys Asp Ala Pro Val Pro Phe Ala Gly Glu Ile65                  70                  75                  80Cys Ala Phe Lys Ile His Gly Gln Glu Leu Pro Phe Glu Ala Val Val

             85                  90                  95Leu Asn Lys Thr Ser Gly Glu Gly Arg Leu Arg Ala Lys Ser Pro Ile

        100                 105                 110Asp Cys Glu Leu Gln Lys Glu Tyr Thr Phe Ile Ile Gln Ala Tyr Asp

    115                 120                 125Cys Gly Ala Gly Pro His Glu Thr Ala Trp Lys Lys Ser His Lys Ala

130                 135                 140Val Val His Ile Gln Val Lys Asp Val Asn Glu Phe Ala Pro Thr Phe145                 150                 155                 160Lys Glu Pro Ala Tyr Lys Ala Val Val Thr Glu Gly Lys Ile Tyr Asp

            165                 170                 175Ser Ile Leu Gln Val Glu Ala Ile Asp Glu Asp Cys Ser Pro Gln Tyr

        180                 185                 190Ser Gln Ile Cys Asn Tyr Glu Ile Val Thr Thr Asp Val Pro Phe Ala

    195                 200                 205Ile Asp Arg Asn Gly Asn Ile Arg Asn Thr Glu Lys Leu Ser Tyr Asp

210                 215                 220Lys Gln His Gln Tyr Glu Ile Leu Val Thr Ala Tyr Asp Cys Gly Gln225                 230                 235                 240Lys Pro Ala Ala Gln Asp Thr Leu Val Gln Val Asp Val Lys Pro Val

            245                 250                 255Cys Lys Pro Gly Trp Gln Asp Trp Thr Lys Arg Ile Glu Tyr Gln Pro

        260                 265                 270Gly Ser Gly Ser Met Pro Leu Phe Pro Ser Ile His Leu Glu Thr Cys

    275                 280                 285Asp Gly Ala Val Ser Ser Leu Gln Ile Val Thr Glu Leu Gln Thr Asn

290                 295                 300Tyr Ile Gly Lys Gly Cys Asp Arg Glu Thr Tyr Ser Glu Lys Ser Leu305                 310                 315                 320Gln Lys Leu Cys Gly Ala Ser Ser Gly Ile Ile Asp Leu Leu Pro Ser

            325                 330                 335Pro Ser Ala Ala Thr Asn Trp Thr Ala Gly Leu Leu Val Asp Ser Ser

        340                 345                 350Glu Met Ile Phe Lys Phe Asp Gly Arg Gln Gly Ala Lys Ile Pro Asp

    355                 360                 365Gly Ile Val Pro Lys Asn Leu Thr Asp Gln Phe Thr Ile Thr Met Trp

370                 375                 380Met Lys His Gly Pro Ser Pro Gly Val Arg Ala Glu Lys Glu Thr Ile385                 390                 395                 400Leu Cys Asn Ser Asp Lys Thr Glu Met Asn Arg His His Tyr Ala Leu

            405                 410                 415Tyr Val His Asn Cys Arg Leu Val Phe Leu Leu Arg Lys Asp Phe Asp

        420                 425                 430Gln Ala Asp Thr Phe Arg Pro Ala Glu Phe His Trp Lys Leu Asp Gln

    435                 440                 445Ile Cys Asp Lys Glu Trp His Tyr Tyr Val Ile Asn Val Glu Phe Pro

450                 455                 460Val Val Thr Leu Tyr Met Asp Gly Ala Thr Tyr Glu Pro Tyr Leu Val465                 470                 475                 480Thr Asn Asp Trp Pro Ile His Pro Ser His Ile Ala Met Gln Leu Thr

            485                 490                 495Val Gly Ala Cys Trp Gln Gly Gly Glu Val Thr Lys Pro Gln Phe Ala

        500                 505                 510Gln Phe Phe His Gly Ser Leu Ala Ser Leu Thr Ile Arg Pro Gly Lys

    515                 520                 525Met Glu Ser Gln Lys Val Ile Ser Cys Leu Gln Ala Cys Lys Glu Gly

530                 535                 540Leu Asp Ile Asn Ser Leu Glu Ser Leu Gly Gln Gly Ile Lys Tyr His545                 550                 555                 560Phe Asn Pro Ser Gln Ser Ile Leu Val Met Glu Gly Asp Asp Ile Gly

            565                 570                 575Asn Ile Asn Arg Ala Leu Gln Lys Val Ser Tyr Ile Asn Ser Arg Gln

        580                 585                 590Phe Pro Thr Ala Gly Val Arg Arg Leu Lys Val Ser Ser Lys Val Gln

    595                 600                 605Cys Phe Gly Glu Asp Val Cys Ile Ser Ile Pro Glu Val Asp Ala Tyr

610                 615                 620Val Met Val Leu Gln Ala Ile Glu Pro Arg Ile Thr Leu Arg Gly Thr625                 630                 635                 640Asp His Phe Trp Arg Pro Ala Ala Gln Phe Glu Ser Ala Arg Gly Val

            645                 650                 655Thr Leu Phe Pro Asp Ile Lys Ile Val Ser Thr Phe Ala Lys Thr Glu

        660                 665                 670Ala Pro Gly Asp Val Lys Thr Thr Asp Pro Lys Ser Glu Val Leu Glu

    675                 680                 685Glu Met Leu His Asn Leu Asp Phe Cys Asp Ile Leu Val Ile Gly Gly

690                 695                 700Asp Leu Asp Pro Arg Gln Glu Cys Leu Glu Leu Asn His Ser Glu Leu705                 710                 715                 720His Gln Arg His Leu Asp Ala Thr Asn Ser Thr Ala Gly Tyr Ser Ile

            725                 730                 735Tyr Gly Val Gly Ser Met Ser Arg Tyr Glu Gln Val Leu His His Ile

        740                 745                 750Arg Tyr Arg Asn Trp Arg Pro Ala Ser Leu Glu Ala Arg Arg Phe Arg

    755                 760                 765Ile Lys Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg Tyr Thr Ser Asn Glu Phe Asn

770                 775                 780Leu Glu Val Ser Ile Leu His Glu Asp Gln Val Ser Asp Lys Glu His785                 790                 795                 800Val Asn His Leu Ile Val Gln Pro Pro Phe Leu Gln Ser Val His His

            805                 810                 815Pro Glu Ser Arg Ser Ser Ile Gln His Ser Ser Val Val Pro Ser Ile

        820                 825                 830Ala Thr Val Val Ile Ile Ile Ser Val Cys Met Leu Val Phe Val Val

    835                 840                 845Ala Met Gly Val Tyr Arg Val Arg Ile Ala His Gln His Phe Ile Gln

850                 855                 860Glu Thr Glu Ala Ala Lys Glu Ser Glu Met Asp Trp Asp Asp Ser Ala865                 870                 875                 880Leu Thr Ile Thr Val Asn Pro Met Glu Lys His Glu Gly Pro Gly His

            885                 890                 895Gly Glu Asp Glu Thr Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu

        900                 905                 910Met Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Asp Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu

    915                 920                 925Glu Gly Met Gly Arg Gly Arg His Gly Gln Asn Gly Ala Arg Gln Ala

930                 935                 940GlnLeu Glu Trp Asp Asp Ser Thr Leu Pro Tyr945                950                 955<210>5<211>3187<212>DNA<213>人<220><221>5′UTR<222>(1)..(275)<220><221>CDS<222>(276)..(3143)<400>5ctgcagtagc ggggttgggg tgggagtgag agagtgagga cgctgggctg ggggaaacgg 60gaagccgctg caagtccacc gcctcagcta cccagattgg gatctgccca ggcccgcttt 120atggactagt gtgggcggca ggctcctttc cgtccctgcc ctgctgtacc ccgctccttg 180gagaccccct gtatccctcc cgcaaggtgg aatccgcagg ctggaggctc ccaggggagg 240caaacgcctg gccctgccct gccccacgcc gcacc atg acc ctc ctg ctg ctg    293

                                   Met Thr Leu Leu Leu Leu

                                     1               5ccc ctt ctg ctg gcc tct ctg ctc gcg tcc tgc tcc tgt aac aaa gcc   341Pro Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Ser Cys Ser Cys Asn Lys Ala

         10                  15                  20aac aag cac aag cca tgg att gag gca gag tac cag ggc atc gtc atg   389Asn Lys His Lys Pro Trp Ile Glu Ala Glu Tyr Gln Gly Ile Val Met

     25                  30                  35gag aat gac aac acg gtc cta ctg aat cca cca ctc ttt gcc ttg gac   437Glu Asn Asp Asn Thr Val Leu Leu Asn Pro Pro Leu Phe Ala Leu Asp

 40                  45                  50aag gat gcc ccg ctg cgc tat gca ggt gag atc tgc ggc ttc cgg ctc   485Lys Asp Ala Pro Leu Arg Tyr Ala Gly Glu Ile Cys Gly Phe Arg Leu55                  60                  65                  70cat ggg tct ggg gtg ccc ttt gag gct gtg atc ctt gac aag gcg aca   533His Gly Ser Gly Val Pro Phe Glu Ala Val Ile Leu Asp Lys Ala Thr

             75                  80                  85gga gag ggg ctg atc cgg gcc aag gag cct gtg gac tgc gag gcc cag   581Gly Glu Gly Leu Ile Arg Ala Lys Glu Pro Val Asp Cys Glu Ala Gln

         90                  95                 100aag gaa cac acc ttc acc atc cag gcc tat gac tgt ggc gag ggc ccc   629Lys Glu His Thr Phe Thr Ile Gln Ala Tyr Asp Cys Gly Glu Gly Pro

    105                 110                 115gac ggg gcc aac acc aag aag tcc cac aag gcc act gtg cat gtg cgg   677Asp Gly Ala Asn Thr Lys Lys Ser His Lys Ala Thr Val His Val Arg

120                 125                 130gtc aac gat gtg aac gag ttt gcc cca gtg ttt gtg gaa cgg ctg tat   725Val Asn Asp Val Asn Glu Phe Ala Pro Val Phe Val Glu Arg Leu Tyr135                 140                 145                 150cgt gcg gct gtg aca gag ggg aag ctg tac gat cgc atc ctg cgg gtg   773Arg Ala Ala Val Thr Glu Gly Lys Leu Tyr Asp Arg Ile Leu Arg Val

            155                 160                 165gaa gcc att gac ggt gac tgc tcc ccc cag tac agc cag atc tgc tac   821Glu Ala Ile Asp Gly Asp Cys Ser Pro Gln Tyr Ser Gln Ile Cys Tyr

        170                 175                 180tat gag att ctc aca ccc aac acc cct ttc ctc att gac aat gac ggg   869Tyr Glu Ile Leu Thr Pro Asn Thr Pro Phe Leu Ile Asp Asn Asp Gly

    185                 190                 195aac att gag aac aca gag aag ctg cag tac agt ggt gag agg ctc tat   917Asn Ile Glu Asn Thr Glu Lys Leu Gln Tyr Ser Gly Glu Arg Leu Tyr

200                 205                 210aag ttt aca gtg aca gct tat gac tgt ggg aag aag cgg gca gca gat   965Lys Phe Thr Val Thr Ala Tyr Asp Cys Gly Lys Lys Arg Ala Ala Asp215                 220                 225                 230gat gct gag gtg gag att cag gtg aag ccc acc tgt aaa ccc agc tgg   1013Asp Ala Glu Val Glu Ile Gln Val Lys Pro Thr Cys Lys Pro Ser Trp

            235                 240                 245caa ggc tgg aac aaa agg atc gaa tat gca cca ggt gct ggg agc ttg   1061Gln Gly Trp Asn Lys Arg Ile Glu Tyr Ala Pro Gly Ala Gly Ser Leu

        250                 255                 260gct ttg ttc cct ggt atc cgc ctg gag acc tgt gat gaa cca ctc tgg   1109Ala Leu Phe Pro Gly Ile Arg Leu Glu Thr Cys Asp Glu Pro Leu Trp

    265                 270                 275aac att cag gcc acc ata gag ctg cag acc agc cat gtg gcc aag ggc   1157Asn Ile Gln Ala Thr Ile Glu Leu Gln Thr Ser His Val Ala Lys Gly

280                 285                 290tgt gac cgt gac aac tac tca gag cgg gcg ctg cgg aaa ctc tgt ggt   1205Cys Asp Arg Asp Asn Tyr Ser Glu Arg Ala Leu Arg Lys Leu Cys Gly295                 300                 305                 310gct gcc act ggg gag gtg gat ctg ttg ccc atg cct ggc ccc aat gcc   1253Ala Ala Thr Gly Glu Val Asp Leu Leu Pro Met Pro Gly Pro Asn Ala

            315                 320                 325aac tgg aca gca gga ctc tcg gtg cac tac agc cag gac agc agc ctg   1301Asn Trp Thr Ala Gly Leu Ser Val His Tyr Ser Gln Asp Ser Ser Leu

        330                 335                 340atc tac tgg ttc aat ggc acc cag gct gtg cag gtg ccc ctg ggt ggc   1349Ile Tyr Trp Phe Asn Gly Thr Gln Ala Val Gln Val Pro Leu Gly Gly

    345                 350                 355ccc agt ggg ctg ggc tct ggg ccc cag gac age ctc agt gac cac ttc   1397Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Pro Gln Asp Ser Leu Ser Asp His Phe

360                 365                 370acc ctg tcc ttc tgg atg aag cat ggc gta act ccc aac aag ggc aag   1445Thr Leu Ser Phe Trp Met Lys His Gly Val Thr Pro Asn Lys Gly Lys375                 380                 385                 390aag gaa gag gaa acc atc gta tgt aac act gtc cag aat gag gac ggc   1493Lys Glu Glu Glu Thr Ile Val Cys Asn Thr Val Gln Asn Glu Asp Gly

            395                 400                 405ttc tct cac tac tcg ctg act gtc cac ggc tgt agg att gcc ttc ctc   1541Phe Ser His Tyr Ser Leu Thr Val His Gly Cys Arg Ile Ala Phe Leu

        410                 415                 420tac tgg ccc ctg ctt gag agt gcc cgc cca gtc aag ttc ctc tgg aag   1589Tyr Trp Pro Leu Leu Glu Ser Ala Arg Pro Val Lys Phe Leu Trp Lys

    425                 430                 435ctg gag cag gtc tgt gat gat gag tgg cac cac tac gct ctg aac ctc   1637Leu Glu Gln Val Cys Asp Asp Glu Trp His His Tyr Ala Leu Asn Leu

440                 445                 450gag ttc ccc aca gtc aca ctc tat acc gac ggc atc tcc ttc gac cct   1685Glu Phe Pro Thr Val Thr Leu Tyr Thr Asp Gly Ile Ser Phe Asp Pro455                 460                 465                 470gcc ctc atc cat gac aat ggc ctc atc cac cca ccc cga agg gag cct   1733Ala Leu Ile His Asp Asn Gly Leu Ile His Pro Pro Arg Arg Glu Pro

            475                 480                 485gct ctc atg att ggg gcc tgc tgg act gag gag aag aac aaa gag aag   1781Ala Leu Met Ile Gly Ala Cys Trp Thr Glu Glu Lys Asn Lys Glu Lys

        490                 495                 500gaa aag gga gac aac agt aca gac acc acc caa gga gac cct ttg tcg   1829Glu Lys Gly Asp Asn Ser Thr Asp Thr Thr Gln Gly Asp Pro Leu Ser

    505                 510                 515atc cac cac tac ttc cat ggc tac ctg gct ggt ttc agc gtg cgc tca   1877Ile His His Tyr Phe His Gly Tyr Leu Ala Gly Phe Ser Val Arg Ser

520                 525                 530ggt cgc ctg gag agc cgc gag gtc atc gag tgc ctc tat gca tgt cgg   1925Gly Arg Leu Glu Ser Arg Glu Val Ile Glu Cys Leu Tyr Ala Cys Arg535                 540                 545                 550gag ggg ctg gac tat agg gat ttc gag agc ctg ggc aaa ggc atg aag   1973Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asp Phe Glu Ser Leu Gly Lys Gly Met Lys

            555                 560                 565gtc cac gtg aac ccc tca cag tcc ctg ctc acc ctg gag ggg gat gat   2021Val His Val Asn Pro Ser Gln Ser Leu Leu Thr Leu Glu Gly Asp Asp

        570                 575                 580gtg gag acc ttc aac cat gcc ctg cag cat gtg gct tac atg aac act   2069Val Glu Thr Phe Asn His Ala Leu Gln His Val Ala Tyr Met Asn Thr

    585                 590                 595ctg cgc ttt gcc acg ccc ggc gtc agg ccc ctg cgc ctc acc act gct   2117Leu Arg Phe Ala Thr Pro Gly Val Arg Pro Leu Arg Leu Thr Thr Ala

600                 605                 610gtc aag tgc ttc agc gaa gag tcc tgc gtc tcc atc cct gaa gtg gag   2165Val Lys Cys Phe Ser Glu Glu Ser Cys Val Ser Ile Pro Glu Val Glu615                 620                 625                 630ggc tac gtg gtc gtc ctt cag cct gac gcc ccc cag atc ctg ctg agt   2213Gly Tyr Val Val Val Leu Gln Pro Asp Ala Pro Gln Ile Leu Leu Ser

            635                 640                 645ggc act gct cat ttt gcc cgc cca gct gtg gac ttt gag gga acc aac   2261Gly Thr Ala His Phe Ala Arg Pro Ala Val Asp Phe Glu Gly Thr Asn

        650                 655                 660ggc gtc cct ttg ttc cct gat ctt caa atc acc tgc tcc att tct cac   2309Gly Val Pro Leu Phe Pro Asp Leu Gln Ile Thr Cys Ser Ile Ser His

    665                 670                 675cag gtg gag gcc aaa aag gat gag agt tgg cag ggc aca gtg aca gac   2357Gln Val Glu Ala Lys Lys Asp Glu Ser Trp Gln Gly Thr Val Thr Asp

680                 685                 690aca cgc atg tcg gat gag att gtg cac aac ctg gat ggc tgt gaa att   2405Thr Arg Met Ser Asp Glu Ile Val His Asn Leu Asp Gly Cys Glu Ile695                 700                 705                 710tct ctg gtg ggg gat gac ctg gat ccc gag cgg gaa agc ctg ctc ctg   2453Ser Leu Val Gly Asp Asp Leu Asp Pro Glu Arg Glu Ser Leu Leu Leu

            715                 720                 725gac aca acc tct ctg cag cag cgg ggg ctg gag ctc acc aac aca tct   2501Asp Thr Thr Ser Leu Gln Gln Arg Gly Leu Glu Leu Thr Asn Thr Ser

        730                 735                 740gcc tac ctc act att gct ggg gtg gag agc atc act gtg tat gaa gag   2549Ala Tyr Leu Thr Ile Ala Gly Val Glu Ser Ile Thr Val Tyr Glu Glu

    745                 750                 755atc ctg agg cag gct cgt tat cgg ctg cga cac gga gct gcc ctc tac   2597Ile Leu Arg Gln Ala Arg Tyr Arg Leu Arg His Gly Ala Ala Leu Tyr

760                 765                 770acc agg aag ttc cgg ctt tcc tgc tcg gaa atg aat ggc cgt tac tcc   2645Thr Arg Lys Phe Arg Leu Ser Cys Ser Glu Met Asn Gly Arg Tyr Ser775                 780                 785                 790agc aat gaa ttc atc gtg gag gtc aat gtc ctg cac agc atg aac cgg   2693Ser Asn Glu Phe Ile Val Glu Val Asn Val Leu His Ser Met Asn Arg

            795                 800                 805gtt gcc cac ccc agc cac gtg ctc agc tcc cag cag ttc ctg cac cgt   2741Val Ala His Pro Ser His Val Leu Ser Ser Gln Gln Phe Leu His Arg

        810                 815                 820ggt cac cag ccc ccg cct gag atg gct gga cac agc cta gcc agc tcc   2789Gly His Gln Pro Pro Pro Glu Met Ala Gly His Ser Leu Ala Ser Ser

    825                 830                 835cac aga aac tcc atg ata ccc agc gcc gca acc ctc atc att gtg gtg   2837His Arg Asn Ser Met Ile Pro Ser Ala Ala Thr Leu Ile Ile Val Val

840                 845                 850tgc gtg ggc ttc ctg gtg ctc atg gtc gtc ctg ggc ctg gtg cgc atc   2885Cys Val Gly Phe Leu Val Leu Met Val Val Leu Gly Leu Val Arg Ile855                 860                 865                 870cat tcc ctt cac cgc cgc gtc tca ggg gcc ggc ggg cct cca ggg gcc   2933His Ser Leu His Arg Arg Val Ser Gly Ala Gly Gly Pro Pro Gly Ala

            875                 880                 885tcc agt gac ccc aag gac cca gac ctc ttc tgg gat gac tca gct ctc   2981Ser Ser Asp Pro Lys Asp Pro Asp Leu Phe Trp Asp Asp Ser Ala Leu

        890                 895                 900acc atc att gtg aac ccc atg gag tcc tac cag aat cgg cag tcc tgt   3029Thr Ile Ile Val Asn Pro Met Glu Ser Tyr Gln Asn Arg Gln Ser Cys

    905                 910                 915gtg acg ggg gct gtt ggg ggc cag cag gag gat gag gac agc agt gac   3077Val Thr Gly Ala Val Gly Gly Gln Gln Glu Asp Glu Asp Ser Ser Asp

920                 925                 930tcg gag gtg gcc gat tcc ccc agc agc gac gag aga cgc atc atc gag   3125Ser Glu Val Ala Asp Ser Pro Ser Ser Asp Glu Arg Arg Ile Ile Glu935                 940                 945                 950acc ccc cca cac cgc tac taaggcctac acctctcccc acgcagaggg          3173Thr Pro Pro His Arg Tyr

            955ggaattcgc cctg                                                    3187<210>6<211>956<212>PRT<213>人<400> 6Met Thr Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Ser1               5                  10                  15Cys Ser Cys Asn Lys Ala Asn Lys His Lys Pro Trp Ile Glu Ala Glu

         20                  25                  30Tyr Gln Gly Ile Val Met Glu Asn Asp Asn Thr Val Leu Leu Asn Pro

     35                  40                  45Pro Leu Phe Ala Leu Asp Lys Asp Ala Pro Leu Arg Tyr Ala Gly Glu

 50                  55                  60Ile Cys Gly Phe Arg Leu His Gly Ser Gly Val Pro Phe Glu Ala Val65                  70                      75              80Ile Leu Asp Lys Ala Thr Gly Glu Gly Leu Ile Arg Ala Lys Glu Pro

             85                      90              95Val Asp Cys Glu Ala Gln Lys Glu His Thr Phe Thr Ile Gln Ala Tyr

        100                     105                 110Asp Cys Gly Glu Gly Pro Asp Gly Ala Asn Thr Lys Lys Ser His Lys

    115                     120                 125Ala Thr Val His Val Arg Val Asn Asp Val Asn Glu Phe Ala Pro Val

130                 135                 140Phe Val Glu Arg Leu Tyr Arg Ala Ala Val Thr Glu Gly Lys Leu Tyr145                 150                 155                 160Asp Arg Ile Leu Arg Val Glu Ala Ile Asp Gly Asp Cys Ser Pro Gln

            165                 170                 175Tyr Ser Gln Ile Cys Tyr Tyr Glu Ile Leu Thr Pro Asn Thr Pro Phe

        180                 185                 190Leu Ile Asp Asn Asp Gly Asn Ile Glu Asn Thr Glu Lys Leu Gln Tyr

    195                 200                 205Ser Gly Glu Arg Leu Tyr Lys Phe Thr Val Thr Ala Tyr Asp Cys Gly

210                 215                 220Lys Lys Arg Ala Ala Asp Asp Ala Glu Val Glu Ile Gln Val Lys Pro225                 230                 235                 240Thr Cys Lys Pro Ser Trp Gln Gly Trp Asn Lys Arg Ile Glu Tyr Ala

            245                 250                 255Pro Gly Ala Gly Ser Leu Ala Leu Phe Pro Gly Ile Arg Leu Glu Thr

        260                 265                 270Cys Asp Glu Pro Leu Trp Asn Ile Gln Ala Thr Ile Glu Leu Gln Thr

    275                 280                 285Ser His Val Ala Lys Gly Cys Asp Arg Asp Asn Tyr Ser Glu Arg Ala

290                 295                 300Leu Arg Lys Leu Cys Gly Ala Ala Thr Gly Glu Val Asp Leu Leu Pro305                 310                 315                 320Met Pro Gly Pro Asn Ala Asn Trp Thr Ala Gly Leu Ser Val His Tyr

            325                 330                 335Ser Gln Asp Ser Ser Leu Ile Tyr Trp Phe Asn Gly Thr Gln Ala Val

        340                 345                 350Gln Val Pro Leu Gly Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Pro Gln Asp

    355                 360                 365Ser Leu Ser Asp His Phe Thr Leu Ser Phe Trp Met Lys His Gly Val

370                 375                 380Thr Pro Asn Lys Gly Lys Lys Glu Glu Glu Thr Ile Val Cys Asn Thr385                 390                 395                 400Val Gln Asn Glu Asp Gly Phe Ser His Tyr Ser Leu Thr Val His Gly

            405                 410                 415Cys Arg Ile Ala Phe Leu Tyr Trp Pro Leu Leu Glu Ser Ala Arg Pro

        420                 425                 430Val Lys Phe Leu Trp Lys Leu Glu Gln Val Cys Asp Asp Glu Trp His

    435                 440                 445His Tyr Ala Leu Asn Leu Glu Phe Pro Thr Val Thr Leu Tyr Thr Asp

450                 455                 460Gly Ile Ser Phe Asp Pro Ala Leu Ile His Asp Ash Gly Leu Ile His465                 470                 475                 480Pro Pro Arg Arg Glu Pro Ala Leu Met Ile Gly Ala Cys Trp Thr Glu

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        500                 505                 510Gln Gly Asp Pro Leu Ser Ile His His Tyr Phe His Gly Tyr Leu Ala

    515                 520                 525Gly Phe Ser Val Arg Ser Gly Arg Leu Glu Ser Arg Glu Val Ile Glu

530                 535                 540Cys Leu Tyr Ala Cys Arg Glu Gly Leu Asp Tyr Arg Asp Phe Glu Ser545                 550                 555                 560Leu Gly Lys Gly Met Lys Val His Val Asn Pro Ser Gln Ser Leu Leu

            565                 570                 575Thr Leu Glu Gly Asp Asp Val Glu Thr Phe Asn His Ala Leu Gln His

        580                 585                 590Val Ala Tyr Met Asn Thr Leu Arg Phe Ala Thr Pro Gly Val Arg Pro

    595                 600                 605Leu Arg Leu Thr Thr Ala Val Lys Cys Phe Ser Glu Glu Ser Cys Val

610                 615                 620Ser Ile Pro Glu Val Glu Gly Tyr Val Val Val Leu Gln Pro Asp Ala625                 630                 635                 640Pro Gln Ile Leu Leu Ser Gly Thr Ala His Phe Ala Arg Pro Ala Val

            645                 650                 655Asp Phe Glu Gly Thr Asn Gly Val Pro Leu Phe Pro Asp Leu Gln Ile

        660                 665                 670Thr Cys Ser Ile Ser His Gln Val Glu Ala Lys Lys Asp Glu Ser Trp

    675                 680                 685Gln Gly Thr Val Thr Asp Thr Arg Met Ser Asp Glu Ile Val His Asn

690                 695                 700Leu Asp Gly Cys Glu Ile Ser Leu Val Gly Asp Asp Leu Asp Pro Glu705                 710                 715                 720Arg Glu Ser Leu Leu Leu Asp Thr Thr Ser Leu Gln Gln Arg Gly Leu

            725                 730                 735Glu Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Leu Thr Ile Ala Gly Val Glu Ser

        740                 745                 750Ile Thr Val Tyr Glu Glu Ile Leu Arg Gln Ala Arg Tyr Arg Leu Arg

    755                 760                 765His Gly Ala Ala Leu Tyr Thr Arg Lys Phe Arg Leu Ser Cys Ser Glu

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            805                 810                 815Gln Gln Phe Leu His Arg Gly His Gln Pro Pro Pro Glu Met Ala Gly

        820                 825                 830His Ser Leu Ala Ser Ser His Arg Asn Ser Met Ile Pro Ser Ala Ala

    835                 840                 845Thr Leu Ile Ile Val Val Cys Val Gly Phe Leu Val Leu Met Val Val

850                 855                 860Leu Gly Leu Val Arg Ile His Ser Leu His Arg Arg Val Ser Gly Ala865                 870                 875                 880Gly Gly Pro Pro Gly Ala Ser Ser Asp Pro Lys Asp Pro Asp Leu Phe

            885                 890                 895Trp Asp Asp Ser Ala Leu Thr Ile Ile Val Asn Pro Met Glu Ser Tyr

        900                 905                 910Gln Asn Arg Gln Ser Cys Val Thr Gly Ala Val Gly Gly Gln Gln Glu

    915                 920                 925Asp Glu Asp Ser Ser Asp Ser Glu Val Ala Asp Ser Pro Ser Ser Asp

930                 935                 940Glu Arg Arg Ile Ile Glu Thr Pro Pro His Arg Tyr945                 950                 955<210>7<211>14<212>PRT<213>Gallus gallus<400>7Ala Arg Val Asn Lys His Lys Pro Trp Ile Glu Thr Thr Tyr1               5                  10<210>8<211>24<212>PRT<213>Gallus gallus<400>8His Lys Pro Trp Ile Glu Thr Thr Tyr His GlyIle Val Thr Glu Asn1               5                  10                 15Asp Asn Thr Val Leu Leu Asp Pro

         20<210>9<211>6<212>PRT<213>Gallus gallus<400>9Val Glu Ala Val Asp Ala1               5<210>10<211>17<212>PRT<213>Gallus gallus<400>10Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Ala Leu Phe Pro Ser Met1               5                  10                  15Arg<210>11<211>7<212>PRT<213>Gallus gallus<400>11Ile Pro Asp Gly Val Val Thr1               5<210>12<211>9<212>PRT<213>Gallus gallus<400>12Thr Tyr Lys Pro Ala Glu Phe His Trp1               5<210>13<211>11<212>PRT<213>Gallus gallus<400>13Glu Gly Leu Asp Leu Gln Ile Ala Asp Gly Val1               5                  10<210>14<211>28<212>PRT<213>Gallus gallus<400>14Gly Ile Glu Met Ser Ser Ser Asn Leu Gly Met Ile Ile Thr Gly Val1               5                  10                  15Asp Thr Met Ala Ser Tyr Glu Glu Val Leu His Leu

         20                  25<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>15gtaaamaagc ayaagccatg gat                               23<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>16caggaathgt aacagagaat gataa                             25<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>17ccagtaccag gctcatactc dat                               23<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>18gtatcaacac catadatdat catacc                26<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>19acaccatcag cdatctgaaa atc                   23<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>20gcatcaaact cagcctcctt ataaaa                26<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>21ggggaacaga agagctgcac atcagcgaac g          31<210>22<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>22ccccctcgag ttagtagctg agtgtggag                          29<210>23<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>23gggccatggc tcgtgttaac aagcataagc cctggattg               39<210>24<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>24cccaagctta gtggtggtgg tgatggtgtg gttcatcaca tgtgtcc      47<210>25<211>268<212>PRT<213>Gallus gallus<400>25Ala Arg Val Asn Lys His Lys Pro Trp Ile Glu Thr Thr Tyr His Gly1               5                  10                  15Ile Val Thr Glu Asn Asp Asn Thr Val Leu Leu Asp Pro Pro Leu Ile

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        100                 105                 110Ala Asn Ala Lys Lys Ser His Lys Ala Thr Val His Ile Gln Val Asn

    115                 120                 125Asp Val Asn Glu Tyr Ser Pro Val Phe Lys Glu Lys Ser Tyr Lys Ala

130                 135                 140Thr Val Ile Glu Gly Lys Arg Tyr Asp Asn Ile Leu Lys Val Glu Ala145                 150                 155                 160Val Asp Ala Asp Cys Ser Pro Gln Phe Ser Gln Ile Cys Asn Tyr Glu

           165                  170                 175Ile Val Thr Pro Asp Val Pro Phe Ala Ile Asp Lys Asp Gly Tyr Ile

        180                 185                 190Lys Asn Thr Glu Lys Leu Ser Tyr Gly Lys Glu His Gln Tyr Lys Leu

    195                 200                 205Thr Val Thr Ala Tyr Asp Cys Gly Lys Lys Arg Ala Ala Glu Asp Val

210                 215                 220Leu Val Lys Ile Ser Ile Lys Pro Thr Cys Lys Pro Gly Trp Gln Gly225                 230                 235                 240Trp Ser Lys Arg Ile Glu Tyr Glu Pro Gly Thr Gly Ser Leu Ala Leu

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        260                 265<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>26gggccatgat acgctacaga aactggcac                          29<210>27<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>27cccaagctta gtggtggtgg tgatggtgag tggctgtact tggaacaac    49<210>28<211>87<212>PRT<213>Gallus gallus<400>28Ile Arg Tyr Arg Asn Trp His Thr Val Ser Leu Phe Asp Arg Iys Phe1               5                  10                  15Lys Leu Val Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg Tyr Val Ser Asn Glu Phe

         20                  25                  30Iys Val Glu Val Asn Val Ile His Thr Ala Asn Pro Ile Glu His Ala

     35                  40                  45Asn His Ile Ala Ala Gln Pro Gln Phe Val His Pro Val His His Thr

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    35                   40                  45Ala Asn His Ile Ala Ala Gln Pro Gln Phe Val His Pro Val His His

 50                  55                  60Thr Phe Val Asp Leu Ser Gly His Asn Leu Ala Asn Pro His Pro Phe65                  70                  75                  80Ser Val val Pro Ser Thr Ala Thr Val

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             85<210>31<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>31ctcctctggc atcattgacc tc                                   22<210>32<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>32catttcttcc tcggcttctt cc                                   22<210>33<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>33tgctgcgagg atgctgc                                         17<210>34<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>34atgatgccag aggaggc                                         17<210>35<211>85<212>PRT<213>人<400>35His Ile Arg Tyr Arg Asn Trp Arg Pro Ala Ser Leu Glu Ala Arg Arg1               5                  10                  15Phe Arg Ile Lys Cys Ser Glu Leu Asn Gly Arg Tyr Thr Ser Asn Glu

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             85<210>36<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>36ctgcagtagc ggggttg                                        17<210>37<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：引物<400>37tggagtgtct gtttcaccag g                                   21<210>38<211>87<212>PRT<213>人<400>38Ile Leu Arg Gln Ala Arg Tyr Arg Leu Arg His Gly Ala Ala Leu Tyr1               5                  10                  15Thr Arg Lys Phe Arg Leu Ser Cys Ser Glu Met Asn Gly Arg Tyr Ser

         20                  25                  30Ser Asn Glu Phe Ile Val Glu Val Asn Val Leu His Ser Met Asn Arg

     35                  40                  45Val Ala His Pro Ser His Val Leu Ser Ser Gln Gln Phe Leu His Arg

 50                  55                  60Gly His Gln Pro Pro Pro Glu Met Ala Gly His Ser Leu Ala Ser Ser65                  70                  75                  80His Arg Asn Ser Met Ile Pro

             85<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>39cgggatcccg catccgggcc gcacat                              26<210>40<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>40gggaattcct cagtagctga gggtggag                            28<210>41<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>41ccggaattcc cttctgatgg ggaccatcag                          30<210>42<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>42ccgctcgagt cagtcttccc actcatcatc                          30

Claims (42)

1. 一种用作药物的分离的多肽，该多肽包含与选自下面的序列具有至少50％一致性的氨基酸序列：

a)一种选自Seq.Id.No.2，Seq.Id.No.4和Seq.Id.No.6的全长氨基酸序列，

b)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.2的约46到约165位残基的序列、约166到约257位残基的序列、约774到约861位残基的序列和约881到约981位残基的序列，

c)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.4的约66到约158位残基的序列、约182到约259位残基的序列、约751到约834位残基的序列和约854到约955位残基的序列，

d)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.6的约51到约142位残基的序列、约167到约244位残基的序列、约759到约845位残基的序列和约869到约956位残基的序列，

e)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.2的约881到约981位残基的序列、Seq.Id.No.4的约854到约955位残基的序列和Seq.Id.No.6的约869到约956位残基的序列，

并且具有钙结合活性和/或具有结合Arp2/3复合物的能力。

2.权利要求1的多肽，其中所述多肽序列与选自下面的氨基酸序列具有至少60％的一致性，更优选地超过65％的一致性：

a)一种选自Seq.Id.No.2，Seq.Id.No.4和Seq.Id.No.6的全长氨基酸序列，

b)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.2的约46到约165位残基的序列、约166到约257位残基的序列、约774到约861位残基的序列和约881到约981位残基的序列，

c)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.4的约66到约158位残基的序列、约182到约259位残基的序列、约751到约834位残基的序列和约854到约955位残基的序列，

d)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.6的约51到约142位残基的序列、约167到约244位残基的序列、约759到约845位残基的序列和约869到约956位残基的序列，

e)一种包含选自下述的至少1个、优选地为2个、最优选地为3个氨基酸序列的多肽：Seq.Id.No.2的约881到约981位残基的序列、Seq.Id.No.4的约854到约955位残基的序列和Seq.Id.No.6的约869到约956位残基的序列，

并且具有钙结合活性和/或具有结合Arp2/3复合物的能力。

3.一种用作药物的分离的多肽，该多肽包含选自下述的氨基酸序列：

含有一段至少100个氨基酸、并与选自Seq.Id.No.2、Seq.Id.No.4和Seq.Id.No.6的氨基酸序列具有最少50％、优选地为55％且更优选地为60％的一致性百分比的序列，所述序列具有钙结合活性和/或具有结合Arp2/3复合物的能力。

4.根据前述任一权利要求的多肽，该多肽

是一种跨膜蛋白质，且

主要在神经系统细胞中表达。

5.根据权利要求4的多肽，其在神经元中表达。

6.根据权利要求5的多肽，其定位于突触的突触后膜。

7.根据权利要求6的多肽，其定位于棘突触的棘器膜内或轴突触的突触后内质网膜内。

8.根据权利要求4到7中任何一项的多肽，其在肿瘤细胞中表达。

9.根据前述权利要求中任何一项的多肽，该多肽在细胞质区室中具有其主要的钙结合结构域。

10.根据前述权利要求中任何一项的多肽，该多肽具有至少一个Arp2/3复合物结合位点。

11.一种编码前述任一权利要求所述用作药物的多肽的分离核苷酸序列。

12.一种编码前述任一权利要求所述多肽的分离的核苷酸序列，该核苷酸序列由于至少一个点突变、插入或缺失而失去其功能。

13.根据权利要求12的核苷酸序列，其用作诊断工具。

14.一种包含根据权利要求1到10中任何一项的多肽的药物组合物。

15.包含权利要求1到10任何一项所述的多肽和/或根据权利要求11所述的核苷酸序列的药物组合物。

16.前述任一权利要求所述多肽或其部分序列用作药物开发的工具。

17.前述任一权利要求所述蛋白质或DNA序列用于筛选和制备治疗紊乱，具体而言地是神经系统紊乱，更具体而言地是中枢神经系统紊乱，最优选地是脑紊乱的药物的用途。

18.根据权利要求17的用途，特征在于该紊乱，具体而言地是神经系统紊乱，更具体而言地是脑紊乱，是由于由至少一种蛋白酶诱导的权利要求1到11中任何一项所述蛋白质的缺乏切割、异常切割或过度切割引起的紊乱。

19.根据权利要求18的用途，特征在于该蛋白酶是组织型纤溶酶原激活物，缩写为tPA，尿激酶型纤溶酶原激活物，缩写为uPA，或纤溶酶、或神经胰蛋白酶(neurotrypsin)、或凝血酶、或neuropsin。

20.根据权利要求17到19中任何一项的用途，特征在于该紊乱，具体而言地是神经系统紊乱，是由于细胞内钙信号的混乱加工而引起的。

21.根据权利要求17到20中任何一项的用途，特征在于该紊乱，具体而言地是神经系统紊乱，是由于通过调节Arp2/3复合物的活性而调节细胞游动性过程的细胞外信号的混乱加工而引起的。

22.根据权利要求17到21中任何一项的用途，特征在于该药物是可在中风期间和/或中风后使组织破坏最小化的药物。

23.根据权利要求17到22中任何一项的用途，特征在于该药物可防止神经系统细胞的细胞死亡。

24.权利要求1到10中任何一项所述DNA序列或蛋白质的用途，用于制备可治疗肿瘤的药物，包括防止或降低原发性和转移性肿瘤、尤其是脑肿瘤或视网膜肿瘤的生长、扩展、渗入和转移。

25.根据权利要求24的用途，特征在于该肿瘤在其生长、扩展、渗入、转移和促进血管或新血管发生中涉及Arp2/3复合物增强的活性。

26.根据权利要求25的用途，特征在于该Arp2/3复合物增强的活性是由权利要求1到10任何一项所述序列之一的调节功能异常或过度或减少而介导的。

27.根据权利要求24到26中任何一项的用途，特征在于该肿瘤在其生长、扩展、渗入、转移和促进血管或新血管发生中涉及至少一种与权利要求1到10中任何一项所述多肽功能性地有关的蛋白酶。

28.根据权利要求27的用途，特征在于该酶是下面一个蛋白酶家族的成员：

-丝氨酸蛋白酶家族，如组织型纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶、凝血酶、神经胰蛋白酶、neuropsin、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G，

-基质金属蛋白酶家族，如胶原酶、明胶酶、溶基质素、matrylisins，

-半胱氨酸蛋白酶家族，如组织蛋白酶B和组织蛋白酶D。

29.一种生产权利要求1到10中任何一项所述多肽或表达这样的多肽的细胞的方法，特征在于用处于能确保所述DNA序列在所述宿主细胞中表达的载体内的权利要求12所述DNA序列转染合适的宿主细胞，并在允许该表达的适当条件下培养所述转染细胞。

30.一种生产多肽、肽或核酸序列的合成或化学方法，其中所述序列代表了权利要求1到13中描述的序列的至少部分，且能够模拟或阻断Calsyntenin的生物学活性，尤其是钙结合活性。

31.权利要求1到13中任何一项所述DNA序列和/或多肽作为药物筛选工具的用途。

32.权利要求11所述序列作为生产抗原的方法或作为生产抗体的抗原的用途。

33.非人类的转基因动物，特征在于它在允许蛋白质表达的环境中包含权利要求12所述的外源DNA序列。

34.权利要求12或13所述DNA序列或其片段的用途，用于制备可用于对因含有根据权利要求11的DNA序列的基因组序列中的缺陷而引起的紊乱进行诊断的诊断制剂。

35.包含权利要求12所述DNA序列的载体或人工染色体，用于人和动物的基因治疗应用。

36.一种分离的多肽，其包含与Seq.Id.No.4的氨基酸序列具有至少60％一致性的氨基酸序列。

37.权利要求36的多肽，其中所述氨基酸序列与Seq.Id.No.4相同。

38.一种分离的多肽，其包含与Seq.Id.No.6的氨基酸序列具有至少98.5％一致性的氨基酸序列。

39.权利要求37的多肽，其中所述氨基酸序列与Seq.Id.No.6相同。

40.一种编码权利要求36到39任何一项所述多肽的核苷酸序列。

41.一种蛋白酶，它可在细胞外部分切割权利要求1到10任何一项所述的多肽。

42.一种细胞提取物，其中包含可切割权利要求1-10任何一项所述多肽的蛋白酶。

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