CN1477204A - 糖核苷酸的制造方法 - Google Patents

糖核苷酸的制造方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1477204A
CN1477204A CNA021506124A CN02150612A CN1477204A CN 1477204 A CN1477204 A CN 1477204A CN A021506124 A CNA021506124 A CN A021506124A CN 02150612 A CN02150612 A CN 02150612A CN 1477204 A CN1477204 A CN 1477204A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sugar
cell
nucleotide
manufacture method
yeast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA021506124A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100335647C (zh
Inventor
С
小泉聪司
河野久治
木野邦器
尾崎明夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KH Neochem Co Ltd
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Publication of CN1477204A publication Critical patent/CN1477204A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100335647C publication Critical patent/CN100335647C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/305—Pyrimidine nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及糖核苷酸的制造方法及复合糖类的制造方法。糖核苷酸的制造方法，其特征在于，以具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖的水性介质中进行酶反应，在该水性介质中产生并蓄积糖核苷酸，并从该水性介质中提取糖核苷酸。复合糖类的制造方法，其特征在于，以具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物培养液或该培养液的处理物、以及具有从糖核苷酸和复合糖类前体生成复合糖类能力的微生物或动物细胞的培养液或该培养液的处理物为酶源，在含有该酶源、核苷酸前体物质、糖以及复合糖类前体的水性介质中进行酶反应，在该水性介质中产生并蓄积复合糖类，并从该水性介质中提取复合糖类。

Description

糖核苷酸的制造方法
本申请是申请日为1997年9月12日，申请号为97191682.9，发明名称为“糖核苷酸类及复合糖类的制造方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细菌、病毒等的感染预防、心血管疾病的治疗、免疫治疗中有用的复合糖类的制造方法以及合成该复合糖类的重要基础物质糖核苷酸的制造方法。
背景技术
已知的糖核苷酸的制造方法有，1)化学合成法[Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.， 28 307(1973)、Bull.Chem.Soc.Japan， 46，3275(1973)、J.Org.Chem.， 57，146(1992)、Carbohydr.Res.， 242，69(1993)]，2)使用酶的制造方法〔J.Org.Chem.，55，1834(1990)、J.Org.Chem.，57，152(1992)、J.Am.Chem.Soc.，110，7159(1988)、特表平7-508413、特表平7-500248、WO96/27670〕，3)使用酵母等微生物菌体的方法(特公昭45-2073、特公昭46-40756、特公昭47-1837、特公昭47-26703、特公昭49-8278、特开平2-268692)，4)由耐盐性酵母的微生物菌体中提取的方法(特开平8-23993)等等。
1)的方法中必需有高价的尿苷-5’-一磷酸(以下简称UMP)的morpholidate衍生物、糖磷酸等；2)的方法中必需有UMP、尿苷-5’-二磷酸(以下简称UDP)、尿苷-5’-三磷酸(以下简称UTP)、腺苷-5’-三磷酸(以下简称ATP)、磷酸烯醇丙酮酸、糖磷酸等高价的原料和丙酮酸激酶等多种酶；3)的方法中需要进行酵母菌体的干燥处理，并且使用高价的UMP等作为原料。包括4)的方法在内，上述所有的方法中均使用高价的尿苷核苷酸、糖磷酸等作为原料，并在操作上难以大量生产，所以至今尚未确立糖核苷酸的工业规模上的制造方法。
已知的复合糖类的制造方法有，1)化学合成法[Method inEnzymol.47，193(1994)、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.21，155(1988)、Carbohydr.Res.211，c1(1991)]，2)使用水解酶的方法[Anal.Biochem.202，215(1992)、Trends Biotechnol.6，256(1998)]，以及3)使用糖转移酶的方法(特开平7-79792、特表平7-500248、特公平5-82200、WO94/25614)。
1)的方法中为了立体选择性合成需要导入保护基团；2)的方法中收率和选择性不高；而3)的方法中需要高价的原料；以上方法均未确立复合糖类的工业性制造方法。
有报道讲，棒状杆菌属的微生物中添加乳清酸而产生UMP[Amino Acid，Nucleic Acid，23，107(1971)]。
发明内容
本发明的目的在于，提供对细菌、病毒等的感染预防、心血管疾病的治疗、免疫治疗等有用的复合糖类的制造方法以及合成该复合糖类的重要基础物质糖核苷酸的廉价而高效率的制造方法。
发明人对利用微生物生产糖核苷酸的方法进行专门研究的结果发现，培养微生物时在培养基中添加糖核苷酸的前体物质及糖，从而可生成糖核苷酸，并且发现利用该糖核苷酸可生成复合糖类，从而完成了本发明。
本发明提供具有以下特征的糖核苷酸的制造方法：以具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖的水性介质中进行酶反应，在该水性介质中产生并蓄积糖核苷酸，并从该水性介质中提取糖核苷酸。
同时，本发明提供具有以下特征的复合糖类的制造方法：以具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物培养液或该培养液的处理物、以及具有从糖核苷酸和复合糖类前体生成复合糖类能力的微生物或动物细胞的培养液或该培养液的处理物为酶源，在含有该酶源、核苷酸前体物质、糖以及复合糖类前体的水性介质中进行酶反应，在水性介质中产生并蓄积复合糖类，并从该水性介质中提取复合糖类。
本发明提供，具有1)不必需使用尿苷核苷酸、糖磷酸等高价的原料，而可利用乳清酸等廉价的核苷酸前体物质及糖为原料；2)从UDP到UTP的转换中不必添加高价的磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸激酶；3)无需酶的分离操作等特征的糖核苷酸的新的制造方法和利用该糖核苷酸制造方法的新的复合糖类的制造方法。
下面详细说明本发明。
在本发明的糖核苷酸的制造中可使用的微生物，只要是具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物，就都可使用。例如可举出属于酵母的微生物。具体的可举例，如属于酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、酒香酵母属的微生物。优选的例子可举，属于酵母属的微生物酿酒酵母等；属于假丝酵母属的微生物产朊假丝酵母、近平滑假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、易变假丝酵母、解脂假丝酵母、涎沫假丝酵母、吉利蒙氏假丝酵母、白色假丝酵母、土生假丝酵母等；属于毕赤酵母属的微生物粉状毕赤酵母、奥默列氏毕赤酵母等；属于球拟酵母属的微生物白色球拟酵母、球面球拟酵母、木醋球拟酵母(Torulopsis xylinus)、无名球拟酵母、易变球拟酵母等；属于德巴利酵母属的微生物类球形德巴利酵母、坎塔雷利德巴利酵母(Debaryomyces cantarellii)、球形德巴利酵母、汉逊氏德巴利酵母、日本德巴利酵母等；属于接合酵母属的微生物鲁氏接合酵母、拜列氏接合酵母等；属于克鲁维酵母属的微生物马克斯克鲁维酵母；属于汉逊酵母属的微生物异常汉逊酵母、杰丁汉逊酵母等；属于酒香酵母属的微生物兰姆啤可酒香酵母、异酒香酵母等。
另外，作为在本发明的糖核苷酸的制造中所用的微生物，可以使用通过一般的变异处理等手段获得或提高从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物。
本发明中微生物的培养可按通常的方法进行培养。
作为培养该微生物的培养基，只要含有该微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等物质，并能有效地培养该微生物，不管是天然培养基还是合成培养基均可使用。
作为碳源，只要可为各种微生物同化就可以，可使用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物；丙酮酸、乳酸、枸橼酸、延胡索酸等各种有机酸；谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等各种氨基酸；乙醇、丙醇、甘油等醇类。
另外也可使用白糠、木薯、甘蔗纤维、玉米浆等天然有机营养源。
作为氮源，可使用氨、氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机或有机铵盐类；谷氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸等氨基酸；胨、NZ胺、玉米浆、肉浸膏、酵母浸膏、麦芽浸膏、酪蛋白水解物、豆饼、豆饼水解物、鱼粉或其消化物等。
作为无机物可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁、氯化镁、氯化钠、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、碳酸钙等。
必要时可添加维生素、氨基酸、核酸等。
培养在振荡培养或通气搅拌培养等有氧条件下进行。培养温度15～45℃为宜，培养时间通常为5～100小时。培养中pH保持在3～9。必要时培养基pH的调整可利用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨、pH缓冲液等进行。
另外培养中必要时培养基中可添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。
通过该培养得到的微生物的培养液以及将该培养液经种种处理的培养液的处理物为酶源，可以应用在水性介质中进行糖核苷酸的生成。
培养液的处理物可以是培养液的浓缩物、培养液的干燥物、离心分离培养液得到的细胞(菌体)、该细胞的干燥物、该细胞的冻干物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固定化产物或该细胞中提取的酶制品等。
另外，也可以不进行培养而将市售的菌体、干燥处理菌体等作为糖核苷酸生成的酶源使用，该酶源的实例如市售的面包酵母、啤酒酵母等。
糖核苷酸的生成中使用的酶源的量为按湿菌体100～800g/l，优选50～600g/l。
糖核苷酸的生成中使用的水性介质，可以举例如水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、枸橼酸盐、Tris等缓冲液、甲醇、乙醇等醇类、乙酸乙酯等酯类、丙酮等酮类、乙酰胺等酰胺类等等。而且可以将作为酶源使用的微生物的培养液作为水性介质使用。
糖核苷酸的生成中使用的核苷酸前体物质可以举出乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷等，优选使用乳清酸。该核苷酸前体物质可以是纯品、前体物质的盐，其中若含有杂质，则以不阻碍反应进行为限，还可使用微生物发酵产生的含有该前体物质的培养液以及来自该培养液的该前体物质粗精制物。核苷酸前体物质的浓度为0.01～1.0M，优选0.01～0.3M。
糖核苷酸的生成中使用的糖可以举出葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺等。
该糖可以使用纯品，也可使用含有这些糖并且其中所含杂质不阻碍反应进行的物质，以0.01～1.0M的浓度使用。
糖核苷酸的生成过程中有必要时可以添加ATP再生所必需的能量供体、磷酸离子、镁离子、表面活性剂以及有机溶剂。
能量供体可举出葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物；丙酮酸、乳酸、醋酸等有机酸；甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸；以0.02～2.0M的浓度使用。
磷酸离子可举出正磷酸、焦磷酸、三聚磷酸、四聚磷酸、四聚偏磷酸等多磷酸、多偏磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等无机磷酸盐，以0.01～1.0M的浓度使用。
镁离子可举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等无机镁盐；枸橼酸镁等有机镁盐，通常以1～20mM的浓度使用。
表面活性剂可使用聚环氧乙烷十八烷胺(例如Nymeen S-215，日本油脂公司制)等非离子型表面活性剂；十六烷基三甲铵·溴化物或烷基二甲基·苄基铵氯化物(例如Cation F2-40E，日本油脂公司制)等阳离子型表面活性剂；月桂酰·肌氨酸盐等阴离子型表面活性剂；烷基二甲基胺(例如Tertiary Amine FB，日本油脂公司制)等叔胺类等等，促进各种糖核苷酸生成的物质均可以使用，可单独使用或多种混合使用。表面活性剂通常以0.1～50g/l的浓度使用，优选以1～20g/l的浓度使用。
有机溶剂可举二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以0.1～50ml/l的浓度使用，优选以1～20ml/l的浓度使用。
糖核苷酸的生成反应是在水性介质中，pH5～10，20～50℃条件下反应2～48小时，优选pH为6～8。
通过该方法可以生成糖核苷酸，该糖核苷酸可举出尿苷二磷酸化合物等。具体可举例尿苷-5’-二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)、尿苷-5’-二磷酸半乳糖(UDP-Gal)、尿苷-5’-二磷酸N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)、尿苷-5’-二磷酸N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)等。
水性介质中生成的糖核苷酸的定量可按众所周知的方法进行，例如UDP-Glc和UDP-Gal的分离定量可按Anal.Biochem.，216，188-194(1994)所记载的高效液相色谱法(以下简称HPLC)进行。UDP-GlcNAc的分离定量可按以下条件用HPLC法进行。
洗脱液：0.1M KH2PO4(利用H3PO4调pH至3.2)
流速：1ml/min
色谱柱：Partisil-10SAX(Whatman公司制)
检测：UV262nm
定量：与标准的吸光度值比较而计算得到。
反应液中生成的糖核苷酸的精制可按使用活性炭、离子交换树脂等的通常的方法进行(特开平8-23993)，例如，UDP-Gal及UDP-Glc可按J.Org.Chem.，57，152(1992)所记载的方法进行；UDP-GlcNAc可按J.Org.Chem.，57，146(1992)所记载的方法进行。本发明的复合糖类的制造中可使用的微生物或动物细胞，只要是具有从糖核苷酸和复合糖类前体生成复合糖类能力的微生物或动物细胞就可使用，例如产生β1，3-半乳糖基转移酶的人黑素瘤细胞WM266-4株(ATCC CRL1676)以及含有来自人黑素瘤细胞WM266-4株的β1，3-半乳糖基转移酶基因的纳茂瓦(namalwa)细胞KJM-1株等的重组株(特开平6-181759)、表达来自人黑素瘤细胞SK-Me1-28细胞的神经酰胺葡糖基转移酶基因的大肠杆菌(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，4638(1996))、表达来自人Hela细胞的β1，4-半乳糖基转移酶基因的大肠杆菌(EMBO J.，9，3171(1990))或酿酒酵母〔Biochem.Biophys.Res.Commun.，201，160(1994)〕、表达来自大鼠的β1，6-N-乙酰葡糖胺转移酶基因的COS-7细胞(ATCC，CRL1651)〔J.Biochem.，268，15381(1993)〕等动物细胞或微生物。
在本发明的复合糖类的制造中使用微生物时，该微生物可以在和培养上述具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物一样的培养基和培养条件下培养。
在本发明的复合糖类的制造中使用动物细胞时，培养该动物细胞的培养基可以使用通常使用的RPMI1640培养基、Eagle的MEM培养基或这些培养基中添加小牛血清等的培养基。培养在5％CO2存在等条件下进行。培养温度以35～37℃为宜，培养时间通常为3～7天。培养中有必要时，在培养基中可添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
以通过该培养得到的微生物或动物细胞的培养液及该培养液经种种处理后的培养液的处理物为酶源，用来在水性介质中进行复合糖类的生成。
培养液的处理物可举出培养液的浓缩物、培养液的干燥物、离心分离培养液得到的细胞(菌体)、该细胞的干燥物、该细胞的冻干物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的有机溶剂处理物、该细胞的溶菌酶处理物、该细胞的固定化产物或由该细胞中提取的酶制品等。
复合糖类的生成中使用的酶源的量为0.01U/l～100U/l，优选0.1U/l～100U/l，以在37℃下一分钟形成1μM复合糖类的酶活性为1单位(U)。
复合糖类的生成中使用的水性介质，可以举例如水、磷酸盐、碳酸盐、醋酸盐、硼酸盐、枸橼酸盐、Tris等缓冲液、甲醇、乙醇等醇类、乙酸乙酯等酯类、丙酮等酮类、乙酰胺等酰胺类等等。而且可以将作为酶源使用的微生物的培养液作为水性介质使用。
复合糖类的生成中使用的糖核苷酸可使用上述糖核苷酸生成中得到的反应液或从该反应液中精制出的糖核苷酸，以1～100mM的浓度使用，优选以5～100mM的浓度使用。
复合糖类的生成中使用的复合糖类前体可以使用糖类、寡糖、蛋白质、肽、糖蛋白、糖脂或糖肽。具体可举出N-乙酰葡糖胺、GlcNAc β1-3Gal β1-4Glc等。复合糖类前体以0.1～100mM的浓度，优选以0.5～50mM的浓度使用。
通过该方法可以合成各种复合糖类，该复合糖类可举出含葡萄糖的复合糖类、含葡糖胺的复合糖类、含半乳糖的复合糖类、含半乳糖胺的复合糖类、含甘露糖的复合糖类、含岩藻糖的复合糖类、含神经氨酸的复合糖类等等。具体可举出乳-N-四糖类、乳-N-新四糖类、N-乙酰乳糖胺等。
复合糖类的生成中有必要时可以添加MnCl2等无机盐、β-巯基乙醇等。
水性介质中生成的复合糖类的定量可依照众所周知的方法进行(特开平6-181759)。
反应液中生成的复合糖类的提取可以按使用活性炭、离子交换树脂等的通常方法进行(特开平8-23993)，例如N-乙酰乳糖胺可按J.Org.Chem.，47，5416(1982)记载的方法提取。
下面说明本发明的实施例，但本发明并不限定于这些实施例。本发明最佳实施方案实施例1.UDP-Glc的生产
装有2.5L由葡萄糖100g/l、MgSO4·7H2O 1g/l、K2HPO4 35g/l、乳清酸(钾盐)3g/l组成的反应液，容积为5L的培养槽中加市售的面包酵母(Dia酵母；协和发酵工业株式会社制)的干燥处理物悬浮成100g/l(干燥重量换算)，在28℃下，以600rpm搅拌、通气量为2L/min的条件进行6小时的反应。
该反应中，用4N KOH维持反应液的pH值在6.5～7.5。
反应结束后，用Anal.Biochem.，216，188-194(1994)记载的方法对反应液上清中的UDP-Glc进行定量，结果生成UDP-Glc7.4g/l(2Na盐换算)。
利用经离心分离该反应液去除菌体后得到的上清2L，按特开平8-23993记载的方法精制UDP-Glc，得到含有高纯度UDP-Glc的溶出液。
浓缩该溶出液后添加过量的99％乙醇，生成的沉淀物经真空干燥后得到6.8g白色粉末。该白色粉末为高纯度(纯度97％以上)的UDP-Glc。实施例2.UDP-Gal的生产
装有20ml由葡萄糖50g/l、酵母浸膏2g/l、胨5g/l、(NH4)2HPO4 2g/l、KH2PO4 2g/l、MgSO4·7H2O 1g/l(用6N H2SO4调整pH至6.0)组成的液体培养基，容积为300ml的三角烧瓶中接种马克斯克鲁维酵母保加利亚变种( Kluyveromyces  marxianusvar. bulugaricus)ATCC16045菌株，在28℃，220rpm的条件下振荡培养24小时。将得到的培养液作为第一次种子培养液。
装有240ml由乳糖50g/l、酵母浸膏2g/l、胨5g/l、(NH4)2HPO42g/l、KH2PO4 2g/l、MgSO4·7H2O 1g/l(用6N H2SO4调整pH至6.0)组成的液体培养基，容积为2L的带挡板的三角烧瓶中添加20ml上述种子培养液，在28℃，220rpm的条件下振荡培养24小时。将得到的培养液作为第二次种子培养液。
装有2.5L由乳糖100g/l、酵母浸膏2g/l、胨5g/l、(NH4)2HPO42g/l、KH2PO4 2g/l、MgSO4·7H2O 1g/l(用6N H2SO4调整pH至6.0)组成的液体培养基，容积为5.0L的培养槽中接种250ml第二次种子培养液，在28℃，600rpm，通气量为2.5L/min的培养条件下进行24小时培养。该培养过程中利用28％氨水维持培养液的pH在5.5(±0.1)。
培养结束后，在该培养液中添加Nymeen S-215 4g/l、乳清酸(钾盐)3g/l、硫酸镁1g/l、KH2PO4 3g/l、K2HPO4 4g/l、半乳糖18g/l，在28℃，600rpm，通气量为2.0L/min的条件下反应15分钟。
该反应过程中利用4N KOH维持反应液的pH在6.0～7.0。
反应结束后，用Anal.Biochem.，216，188-194(1994)记载的方法对上清中的UDP-Gal进行定量，结果生成UDP-Gal2.3g/l(2Na盐换算)。
利用经离心分离该反应液去除菌体后得到的上清2L，按与实施例1同样的方法进行精制，得到高纯度(97％以上)的UDP-Gal白色粉末2.5g。实施例3.UDP-GlcNAc的生产
除了用100g/l麦芽糖代替葡萄糖，在反应液中新添加葡糖胺盐酸盐3.5g/l以外，在与实施例1同样的条件下生产UDP-GlcNAc。
反应结束后按上述的HPLC法对反应液上清中的UDP-GlcNAc进行定量，结果生成UDP-GlcNAc 7g/l(2Na盐换算)利用经离心分离该反应液去除菌体后得到的上清2L，按与实施例1同样的方法进行精制，得到高纯度(97％以上)的UDP-GlcNAc白色粉末5.7g。实施例4.β1，3-半乳糖基转移酶的制备
将由含有编码蛋白质A的IgG结合区和β1，3-半乳糖基转移酶之融合蛋白基因的质粒pAMoERSAW1(特开平6-181759)转化的namalwa KJM-1株加到含有0.5mg/ml G418(Gibco公司制)的RPMI640·ITPSGF培养基30ml中，使之悬浮成5×104细胞/ml，并在CO2孵箱中37℃下培养8天。
离心分离该培养液去除细胞后回收上清。该上清液在有必要时可以保存在-80℃，使用前解冻然后使用。
生成该蛋白质A的IgG结合区和β1，3-半乳糖基转移酶之融合蛋白的培养液上清中添加叠氮化钠至最终浓度为0.1％，然后添加按产品说明书预处理的IgG琼脂糖(Pharmacia公司制)50μl，并在4℃下缓慢搅拌过夜。
搅拌后经离心分离回收结合β1，3-半乳糖基转移酶的IgG琼脂糖，用RPMI640·ITPSGF培养基1ml洗净3遍后，将该IgG琼脂糖作为β1，3-半乳糖基转移酶的酶源。实施例5.乳-N-四糖类的生产
乳-N-四糖类(Oxford Glycosystems公司制)按常用法〔Agric.Biol.Chem.，54，2169(1990)〕用氨基吡啶荧光标记，然后加100mU的β-半乳糖苷酶(生化学工业公司制)在37℃反应16个小时，以除去非还原末端的半乳糖。
将该反应液在100℃加热5分钟，使β-半乳糖苷酶失活。
将该反应中得到的GlcNAc β1-3Galβ1-4Glc作为复合糖类前体使用。
将含有该复合糖类前体0.5mM、实施例4中得到的IgG琼脂糖结合β1，3-半乳糖基转移酶0.5U、实施例2中得到的UDP-Gal5mM、Tris-HCl(pH7.9)100mM、MnCl2 10mM、β巯基乙醇2mM的反应液36μl在32℃下放置65小时进行反应。
反应结束后在下列条件下利用HPLC法定量该反应液中蓄积的生成物。
色谱柱：TSKgel ODS-80TM柱(4.6mm×30cm，TOSOH公司制)
液相：0.02M醋酸铵缓冲液(pH4.0)
温度：50℃
流速：1ml/min
检测：荧光检测器(激发波长320nm，放射波长400nm)
生成物的鉴别是通过比较氨基吡啶标记的乳-N-四糖类和标记的生成物的洗脱时间而进行。
通过该反应生成0.17mM(0.12g/l)的乳-N-四糖类。实施例6.乳-N-新四糖类的生产
将含有实施例5中制备的复合糖类前体GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc 0.5mM、β1，4-半乳糖基转移酶(Sigma公司制)0.5U、实施例2中得到的UDP-Gal 5mM、Tris-HCl(pH7.9)100mM、MnCl210mM、β巯基乙醇2mM、α-乳清蛋白0.2mg/ml的反应液36μl在32℃下放置65小时进行反应。
反应结束后，在与实施例5相同的条件下利用HPLC定量该反应液中蓄积的生成物。生成物的鉴别是通过比较氨基吡啶标记的乳-N-新四糖类和生成物的洗脱时间而进行。
通过该反应生成0.2mM(0.14g/l)的乳-N-新四糖类。
工业实用性通过该方法可以在工业上高效率地由核苷酸前体物质和糖生产糖核苷酸，由该糖核苷酸和复合糖类前体生产复合糖类。

Claims (9)

1.糖核苷酸的制造方法，其特征在于，以具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物培养液或该培养液的处理物为酶源，在含有该酶源、核苷酸前体物质和糖的水性介质中进行酶反应，在该水性介质中产生并蓄积糖核苷酸，并从该水性介质中提取糖核苷酸。
2.权利要求1的制造方法，其特征在于，培养液的处理物为培养液的浓缩物、培养液的干燥物、离心分离培养液得到的细胞、该细胞的干燥物、该细胞的冻干物、该细胞的表面活性剂处理物、该细胞的超声波处理物、该细胞的机械磨碎处理物、该细胞的溶剂处理物、该细胞的酶处理物、该细胞的蛋白质部分、该细胞的固定化产物或由该细胞中提取的酶制品。
3.权利要求1的制造方法，其中核苷酸前体物质选自乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷以及尿苷。
4.权利要求1的制造方法，其中糖核苷酸为尿苷二磷酸糖。
5.权利要求4的制造方法，其中尿苷二磷酸糖选自尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺、尿苷二磷酸-N-乙酰半乳糖胺。
6.权利要求1的制造方法，其中糖选自葡萄糖、半乳糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺。
7.权利要求1的制造方法，其特征在于，具有从核苷酸前体物质和糖生成糖核苷酸能力的微生物为酵母。
8.权利要求7的制造方法，其特征在于，酵母选自酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、德巴利酵母属、接合酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属和酒香酵母属的微生物。
9.权利要求8记载的制造方法，其特征在于，酵母选自酿酒酵母、产朊假丝酵母、近平滑假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、易变假丝酵母、解脂假丝酵母、涎沫假丝酵母、吉利蒙氏假丝酵母、白色假丝酵母、土生假丝酵母、粉状毕赤酵母、奥默列氏毕赤酵母、白色球拟酵母、球面球拟酵母、木醋球拟酵母、无名球拟酵母、易变球拟酵母、类球形德巴利酵母、坎塔雷利德巴利酵母、球形德巴利酵母、汉逊氏德巴利酵母、日本德巴利酵母、鲁氏接合酵母、拜列氏接合酵母、马克斯克鲁维酵母、异常汉逊酵母、杰丁汉逊酵母、兰姆啤可酒香酵母以及异酒香酵母。
CNB021506124A 1996-09-13 1997-09-12 糖核苷酸的制造方法 Expired - Fee Related CN100335647C (zh)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP24312096 1996-09-13
JP243120/96 1996-09-13
JP243120/1996 1996-09-13
JP28506596 1996-10-28
JP285065/96 1996-10-28
JP285065/1996 1996-10-28

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971916829A Division CN1309837C (zh) 1996-09-13 1997-09-12 糖核苷酸类及复合糖类的制造方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1477204A true CN1477204A (zh) 2004-02-25
CN100335647C CN100335647C (zh) 2007-09-05

Family

ID=26536107

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971916829A Expired - Fee Related CN1309837C (zh) 1996-09-13 1997-09-12 糖核苷酸类及复合糖类的制造方法
CNB021506124A Expired - Fee Related CN100335647C (zh) 1996-09-13 1997-09-12 糖核苷酸的制造方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB971916829A Expired - Fee Related CN1309837C (zh) 1996-09-13 1997-09-12 糖核苷酸类及复合糖类的制造方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20010007763A1 (zh)
EP (1) EP0861902A4 (zh)
KR (1) KR100556051B1 (zh)
CN (2) CN1309837C (zh)
AU (1) AU4220297A (zh)
CA (1) CA2237586A1 (zh)
TW (1) TW577925B (zh)
WO (1) WO1998011247A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265434A (zh) * 2021-05-19 2021-08-17 吉林大学 一种合成udp-半乳糖及合成半乳糖基化合物的方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3403205B2 (ja) 1996-09-17 2003-05-06 協和醗酵工業株式会社 糖ヌクレオチド類および複合糖質の製造法
WO2000012747A1 (en) * 1998-08-31 2000-03-09 Kurt Nilsson Method for enzymatic synthesis of glycosides, disaccharides, and oligosaccharides
JP2002335988A (ja) * 2001-05-22 2002-11-26 Yamasa Shoyu Co Ltd オリゴ糖の製造法
JP2006271372A (ja) * 2005-03-01 2006-10-12 Yamasa Shoyu Co Ltd 糖鎖の製造法
WO2007023830A1 (ja) * 2005-08-23 2007-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. シチジンジリン酸コリンの製造法
DE102012024435A1 (de) 2012-12-14 2014-07-10 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Identifizierung einer Zelle mit gegenüber ihrem Wildtyp erhöhten intrazellulären Konzentration eines bestimmten Metaboliten, wobei die Veränderung der Zelle durch Rekombi-neering erreicht wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer gegenüber ihrem Wildtyp genetisch veränderten Produktionszelle mit optimierter Produktion eines bestimmten Metaboliten, ein Verfahren zur Herstellung dieses Metaboliten, sowie dafür geeignete Nukleinsäuren
CN112198150B (zh) * 2020-07-07 2022-10-25 山东省临沂生态环境监测中心 生物发光法监测污染水体的方法
CN114350729B (zh) * 2022-01-06 2022-12-13 安徽翠鸟生物技术有限公司 一种基于多技术融合的尿苷二磷酸制备工艺

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5384249A (en) * 1991-12-17 1995-01-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α2→3 sialyltransferase
KR0177841B1 (ko) * 1992-01-30 1999-04-01 나까무라 간노스께 시티딘 디인산 콜린의 제조방법
EP0785988A1 (en) * 1993-07-15 1997-07-30 Neose Pharmaceuticals, Inc Method of synthesizing saccharide compositions
JP2767198B2 (ja) * 1994-05-12 1998-06-18 富田製薬株式会社 ウリジン二リン酸ｎ−アセチルグルコサミンの製造方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265434A (zh) * 2021-05-19 2021-08-17 吉林大学 一种合成udp-半乳糖及合成半乳糖基化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU4220297A (en) 1998-04-02
EP0861902A1 (en) 1998-09-02
US20040166568A1 (en) 2004-08-26
CN100335647C (zh) 2007-09-05
CN1309837C (zh) 2007-04-11
US20010007763A1 (en) 2001-07-12
EP0861902A4 (en) 2001-07-25
TW577925B (en) 2004-03-01
CA2237586A1 (en) 1998-03-19
WO1998011247A1 (fr) 1998-03-19
KR19990067496A (ko) 1999-08-25
CN1208440A (zh) 1999-02-17
KR100556051B1 (ko) 2006-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR19990067658A (ko) 당 뉴클레오티드류 및 복합 당질의 제조법
CA2317118C (en) Process for producing n-acetylneuraminic acid
CN1074938A (zh) 胞苷二磷酸胆碱的制造方法
CN100335647C (zh) 糖核苷酸的制造方法
EP0282989B1 (en) Process for producing 5'-inosinic acid
CN101052724B (zh) 尿苷5＇-二磷酸-n-乙酰半乳糖胺的制备方法
CN101113420A (zh) 一种高产核苷磷酸化酶的菌种及阿糖核苷的合成方法
EP0251489B1 (en) Process for producing 5'-guanylic acid
JPH0630599B2 (ja) フルクトース―１，６―二リン酸の製造法
CN113717886B (zh) 一种凝结芽孢杆菌及其催化生产2’-脱氧腺苷的方法
JP3117707B2 (ja) ５´―イノシン酸の製造法
KR920009525B1 (ko) 아스코르빈산-2-포스페이트의 제조방법
Shimizu et al. An Improved Method for the Fermentative Production of Coenzyme A from Pantothenic Acid, Cysteine, and 5′-AMP
EP1632567B1 (en) Process for producing phosphorylase
JPH02177891A (ja) 複合酵素反応によるシチジン‐５′‐モノホスフオシアル酸の合成方法
Ghisalba Biocatalyzed reactions
JP2927882B2 (ja) 醗酵法によるオロチン酸および／またはオロチジンの製造法
JPH0669387B2 (ja) Ｓ−アデノシルメチオニンの製造法
KR920009514B1 (ko) 5'-아데닐산 재생계를 이용한 연속적 5'-구아닐산의 제조방법
CN1111061A (zh) 嗜热细菌用于制造三唑核苷类的用途
KR900004068B1 (ko) 미생물을 이용한 이노신의 제조방법
JP4439153B2 (ja) 耐熱性マンノースイソメラーゼ及び該酵素を用いたマンノースの製造法
CN104694598A (zh) 一种糖核苷酸的制备方法
Tangri et al. Improvement in xylitol production from wheat straw hemicellulosic hydrolysate achieved by the use of immobilized Aspergillus terreus cells
JPS5951799A (ja) アデノシン−５′−三燐酸の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee