CN1475578A - 一种新的基因芯片固相载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的基因芯片固相载体的制备方法。其要点是用一种化学物质对玻璃片、石英片和硅片进行处理，使玻璃片、石英片和硅片表面带有活性基团，此活性基团与核酸探针上的活性基团反应，通过形成二硫键将核酸探针固定于固相载体从而制成基因芯片。按本方法制备出的基因芯片可用于临床病原微生物诊断、食品卫生防疫、癌症和其他疾病的诊断。

Description

一种新的基因芯片固相载体的制备方法

本发明涉及一种新的基因芯片固相载体的制备方法。

本发明的目的在于开发新的基因芯片固相载体，即基因芯片的片基。

基因芯片的发展现状：

生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命。它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。常用的生物芯片分为三大类：即基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室。

基因芯片是生物芯片中研究最早、应用最广泛、最先实现商品化的芯片。

基因芯片(又称DNA芯片)是通过微阵列技术，将高密度的DNA片段阵列通过高速机器人以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。目前，该技术应用领域主要包括基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等诸多方面。

基因芯片产业是大有发展前景的世界高科技前沿产业。据专家预测，在未来几年里，世界基因芯片产业将以每年增长30％的速度发展，2005年全球基因芯片总营业额将从1998年的180亿美元增长到400亿美元，诊断的疾病种类可望从目前的100多种扩大到5000种，它的发展将带来医疗技术革命，并为互联网上远程医疗打开新的天地。

国外情况：美国继开展人类基因组计划以后，美国政府于1998年正式启动基因芯片计划，联合私人投资机构投入20亿美元以上的研究经费。美国国立卫生研究院、美国能源部、商业部、司法部、国防部和中央情报局参与了此项目，同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne、Oakridge等国家实验室也参与了该项目的开发和研究。美国政府和产业界在过去的10年共投入近20亿美元用于以基因芯片为主的生物芯片研究开发与产业化。

目前，国际上已经有许多从事生物芯片研究的公司，每家公司的芯片技术都各具特色，应用目的也不尽相同，如加利福尼亚州森尼维尔的Hyseq公司，声称拥有最快的基因分析器，它们由机器人制造，机器人把DNA探针滴到过滤纸上，其DNA阵具有优势，破译DNA的速度最快。帕洛阿尔托的Syntenl公司声称它的芯片衡量细胞中基因活动最有效，公司正在利用基因芯片研究前列腺癌等疾病。圣迭戈的Nanogen公司计划进入诊断艾滋病毒和其它传染病的市场。Incyte制药公司与Affymetrix公司合作生产针对各种疾病的基因分析芯片供药品研究使用。

美国Affymetrix公司是世界上最有影响的基因芯片开发制造商，该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专例。公司的第一种产品用于研究艾滋病毒的抗药性，第二种产品将检查在多种癌症中发生突变的一种基因，1998年生产出带有13.5万个基因探针的芯片，使人类DNA解码速度提高了25倍。目前，该公司正在努力提高其芯片探针阵列的“密集度”，它的原型芯片能容纳6.5万个探针，最近又推出了有40万个探针的芯片。公司总裁希望能生产出有100万个探针的DNA芯片。该公司的基因组研究主任正在设计能够同时监测5万个人体基因的芯片。Affymetrix公司已开发出的判断是否携带艾滋病病毒的逆转录酶基因HIV芯片；确定有无癌症可能的P53基因芯片以及诊断药物代谢缺乏症的细胞色素P450芯片，现已应用于临床。

英国剑桥大学、欧亚各国的跨国公司如摩托罗拉、惠普、IBM以及目立公司也正在从事基因芯片的研究。一些具有实力的大型制药公司对基因芯片用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域都非常感兴趣。相继投入巨资开发基因芯片技术和相应的设备，尝试利用基因芯片技术开展新药的超高量筛选和进行药理遗传学、药理基因组学的研究。

一项为期三年、耗资九百万美元的计划由摩托罗拉在坦佩的物理科学实验室承担，由亚利桑那州立大学、Hun tsville的CFD研究组和摩托罗拉生物芯片系统组共同研究，目的要研制出一种便宜、快速诊断传染疾病的基因芯片，以加快对致命的病毒感染的诊断。

国内研究进展：从我国的情况来看，作为人类基因组工程的参与国之一，虽然我国还处于初级阶段，与发达国家水平还有差距，但有差距并不意味着没有机会，挑战与机遇并存。从整个高科技领域来讲，生物技术是我国与国际先进国家水平差距最小的，故优先发展生物信息产业是一种运用智慧超越先进大国的战略。

我国在99年3月国家科学技术部起草《医药生物技术“十五”及2015年规划》所列十五个关键技术项目中，就有八个项目(基因组学技术、重大疾病相关基因的分离和功能研究、基因药物工程、基因治疗技术、生物信息学技术、组合生物合成技术、新型诊断技术、蛋白质组学和生物芯片技术)要使用生物芯片，其中，生物芯片技术还被单列为一个专门项目进行规划，可见生物芯片在我国的重要性。

中国工程院2000年1月6日在京举办首次工程科技论坛，专题就是″生物芯片技术″，科学家提出：以生物芯片技术为核心的各相关产业正在全球崛起，世界工业发达国家已开始有计划、大投入、争先恐后地对该领域知识产权进行保护。我国应迅速制定适合中国国情的对策，以避免出现像计算机产业那样因没有自己的芯片专利和技术而受制于人的被动局面。最近国务院已决定成立国家生物芯片工程中心，对生物芯片的系统研发作倾斜性支持。

我国科学家从1998年开始正式涉及基因芯片领域以来，已有多家大学和研究院所以及高新技术公司开始生物芯片的研发工作，主要有复旦大学、中科院上海冶金所、中科院上海细胞所、军事医学科学院、清华大学等高校和科研单位以及诸多的公司企业。国家级研究经费从1998年至今共投入约700万元人民币。清华大学从1999年开始成立专门研究基因芯片的博奥公司，3年内共获得国家资助3亿元。全国范围内用于生物芯片研发的民间风险资本投入约为1.6亿元人民币，并在以很快的幅度增加。

基因芯片的制备：

基因芯片作为一项新兴的技术，是将特异性寡核苷酸探针固定在俗称为片基的固相支撑物上的。支持物分为很多种，如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，均需经过特殊处理，才能将探针固定在上面。

用于连接、吸附或包埋各种生物分子使其以水不溶性状态行使功能的固相材料统称为载体。这种用于色谱填料的载体，同样也适用于生物芯片的载体。用作色谱填料的载体绝大多数是以固体颗粒的形式填充到色谱柱中，而生物芯片所用的载体必须是固体片状或者是薄膜类，而且片状或薄膜类材料的表面和色谱颗粒填料表面一样应当具有各种不同的活性基因，以便与各种生物分子连接。除此之外，制作生物芯片的材料应当具有良好的光学性质，能适应透射或反射光的测量。制作生物芯片的片(板)状透明材料与用做色谱填料的不透明固体颗粒有着根本的区别。但是制作生物芯片的载体材料必须符合下列的要求：(a)载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联；(b)使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量；(c)载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学稳定性。所谓惰性的，就是说载体其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。稳定性是在进行分子杂交或结合时，可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化；(d)载体具有良好的生物兼容性，人们在从事科学研究和生物芯片的制作时，必须要全面衡量其利弊，选择适合于自己的研究体系，兼顾其他要求。

在制作生物芯片是，载体材料很多，大致可分为4类：无机材料、天然有机聚合物、人工合成的有机高分子聚合物、各种高分子聚合物制成的各种膜。总体来说有几十种甚至上百种载体材料。目前使用于制作生物芯片的载体材料只有少数几种，象玻璃片、金属片、各种有机高分子制作的薄膜等。其中玻璃片受到各国研究者的重视，其研究可能是来源方便，表面羟基可以用N，N-二乙氧基氨丙基三乙氧基硅烷作表面处理，然后能够偶联核酸、酶、抗体(抗原)、蛋白质多肽等各种生物分子。也可以用巯基标记的生物分子直接和玻璃表面作用等。另一个原因是大多数生物芯片采用了发光检测的方法，不管透射光或反射光它均合适。第三个原因是可以用光刻的方法在玻璃芯片上刻出微流路，或者它与刻好微流路的硅橡胶压紧联合使用的微流路，通过微量注射泵在载体上进行生物分子的连接，DNA杂交，清洗和检测等。

活化定义为载体的修饰过程，即通过化学反应用各种不同的活化试剂在载体表面健合上各种各样的活性基团，以便与配基共价结合，形成具不同的生物特异性的亲合载体，用来固定各种不同的活性生物分子，如蛋白质、核酸、酶、多肽、抗原、抗体等。

活化的方法有很多种，但到目前为止没有一种活化方法能够适合所有的载体的活化和配基的偶联，所以在活化开始的时候，应当有一个基本的估计，即活化的载体在偶联试剂作用与配基的偶联应当是容易进行的。不同载体可以用不同的活化试剂把载体表面活化，例如表面为羧基的载体，用EDC和NHS把表面变成活泼酯，然后再同各种不同的生物分子偶联。采用类似的方法，可以分别把羟基、氨基、醛基、巯基等的载体表面活化成活性基团，然后再进行不同的键合反应。值得提出的是，在金箔表面进行分子自组装也不难。用DTT还原DNA中的二硫键变成巯基或者直接利用DNA分子中的(-S-S-)二硫键，都可以把DNA探针特异的结合在金的表面。

我们的基因芯片固相载体的制备方法：

本发明的基因芯片固相载体的制备方法，所用的材料包括，但不限于，普通玻璃片、石英片和硅片等，通过表面化学修饰，使这些材料表面带有巯基(-SH)而完成的。

采用本发明的基因芯片固相载体的制备方法，可制备出带有活性巯基(-SH)的基因芯片片基。基因芯片片基上的活性巯基(-SH)可以与在5’端或3’端被修饰(连接)有活性巯基(-SH)的寡核苷酸的巯基(-SH)反应，生成二硫键(-S-S-)，从而将寡核苷酸通过二硫键(-S-S-)固定(连接)在基因芯片片基上。这些固定在基因芯片片基上的寡核苷酸通常是作为分子探针，它们与某些基因的DNA序列互补或高度同源，可以与这些序列互补的DNA单链通过退火而形成杂交分子，从而将这些序列互补的DNA单链捕捉、固定在基因芯片上。这些被捕捉、固定的DNA单链被人为标记上荧光素、同位素或酶，可以在基因芯片上显现出来，人们据此就可判断出被捕捉的基因。

采用本发明的基因芯片固相载体的制备方法，制备出带有活性巯基(-SH)的基因芯片片基后，利用微排序法按照设计将所述的被修饰有活性巯基(-SH)的核酸探针有序地点样到载体上，通过核酸探针末端修饰的活性基团与载体表面相应的活性基团反应，形成二硫键(-S-S-)，将探针固定于载体上，从而制成基因芯片。同时，在所制备的基因芯片上，每一种核酸探针都有固定的位置，因此在与样品杂交后，通过对所捕获阳性信号的寻址即可明确其对应的特定核酸探针，从而确定与其对应的目标DNA序列。

采用本发明的基因芯片固相载体的制备方法所制备的基因芯片，可以用于医疗(诊断、治疗、疗效判断)、海关检疫、卫生防疫、军方生物战剂的快速检定传感器等应用领域。

本发明通过以下实施例对本发明的基因芯片固相载体的制备方法及其应用进行描述。需说明的是，下述实施例只是用来说明而非限制本发明，本领域技术人员所熟知的、其他通过采用本发明的基因芯片固相载体的制备方法而制备的基因芯片的应用均在本发明的范围内。实施例1、基因芯片玻璃固相载体的制备方法

材料：

1、普通载玻片

2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巯丙基)三甲氧硅烷(ACROS)

3、氩气：北京氧气厂

方法：

载玻片用强酸浸泡后，用去离子水反复洗涤，用无水乙醇洗涤并浸泡48小时。

将载玻片取出，浸于25％氨水中48小时，取出后，用去离子水冲洗，然后用无水乙醇洗涤。

洗涤结束后，将载玻片浸于以下溶液中一小时，进行硅化：1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。

配制方法：取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶于50ml去离子水中，加入1L容量瓶中，用无水乙醇加至1000ml刻度，测其pH为4.5。取5.8ml 85％的(3-巯丙基)三甲氧硅烷于1L的烧杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。

将载玻片逐片放入“3”的溶液中，室温放置1小时。

将载玻片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然后将载玻片再浸泡入1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然后取出，每片单独码放于支架上。

将支架移入真空干燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氩气再抽真空至-0.75mPa，放入氩气至与大气等压，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氩气，如此，可将真空干燥起器中的空气都置换掉。

置室温(20℃)至少48小时。

用1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷浸泡后，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍后，于氩气中放置48小时，取出。

置于阴凉闭光处保存。基因芯片玻璃固相载体即制备完成。实施例2、基因芯片石英固相载体的制备方法

材料：

1、石英片

2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巯丙基)三甲氧硅烷(ACROS)

3、氩气：北京氧气厂

方法：

石英片用强酸浸泡后，用去离子水反复洗涤，用无水乙醇洗涤并浸泡48小时。

将石英片取出，浸于25％氨水中48小时，取出后，用去离子水冲洗，然后用无水乙醇洗涤。

洗涤结束后，将石英片浸于以下溶液中一小时，进行硅化：1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。

配制方法：取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶于50ml去离子水中，加入1L容量瓶中，用无水乙醇加至1000ml刻度，测其pH为4.5。取5.8ml 85％的(3-巯丙基)三甲氧硅烷于1L的烧杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。

将石英片逐片放入“3”的溶液中，室温放置1小时。

将石英片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然后将石英片再浸泡入1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然后取出，每片单独码放于支架上。

将支架移入真空干燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氩气再抽真空至-0.75mPa，放入氩气至与大气等压，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氩气，如此，可将真空干燥起器中的空气都置换掉。

置室温(20℃)至少48小时。

用1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷浸泡后，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍后，于氩气中放置48小时，取出。

置于阴凉闭光处保存。基因芯片石英固相载体即制备完成。实施例3、基因芯片硅片固相载体的制备方法

材料：

1、硅片

2、(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane 85％(3-巯丙基)三甲氧硅烷(ACROS)

3、氩气：北京氧气厂

方法：

硅片用强酸浸泡后，用去离子水反复洗涤，用无水乙醇洗涤并浸泡48小时。

将硅片取出，浸于25％氨水中48小时，取出后，用去离子水冲洗，然后用无水乙醇洗涤。

洗涤结束后，将硅片浸于以下溶液中一小时，进行硅化：1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷；95％乙醇；16mM冰醋酸(pH 4.5)。

配制方法：取36％冰醋酸(分子量60.05)2.67ml，溶于50ml去离子水中，加入1L容量瓶中，用无水乙醇加至1000ml刻度，测其pH为4.5。取5.8ml 85％的(3-巯丙基)三甲氧硅烷于1L的烧杯中，加入上述醋酸乙醇溶液至500ml。

将硅片逐片放入“3”的溶液中，室温放置1小时。

将硅片取出，用95％乙醇/16mM醋酸溶液洗一遍，然后将硅片再浸泡入1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷/95％乙醇/16mM醋酸溶液中，然后取出，每片单独码放于支架上。

将支架移入真空干燥器中，抽真空至-0.07mPa，放入氩气再抽真空至-0.75mPa，放入氩气至与大气等压，再次抽真空至-0.75mPa，再放入氩气，如此，可将真空干燥起器中的空气都置换掉。

置室温(20℃)至少48小时。

用1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷浸泡后，再用95％乙醇/16mM醋酸洗一遍后，于氩气中放置48小时，取出。

置于阴凉闭光处保存。基因芯片硅片固相载体即制备完成。实施例4、用带有活性巯基(-SH)的基因芯片玻璃片基制备基因芯片

利用微排序法，将被修饰有活性巯基(-SH)的核酸探针有序地点样到所述的“实施例1”、“实施例2”、“实施例3”所制备的基因芯片固相载体上，通过核酸探针末端修饰的活性基团与载体表面相应的活性基团反应，形成二硫键(-S-S-)，将探针固定于载体上，从而制成基因芯片。

同时，在所制备的基因芯片上，每一种核酸探针都有固定的位置，因此在与样品杂交后，通过对所捕获阳性信号的寻址即可明确其对应的特定核酸探针，从而确定与其对应的目标DNA序列。实施例5、将本发明的基因芯片固相载体用于临床病原微生物诊断

在“实施例4”中，如果所述的核酸探针是针对某种病原微生物的，则使用所述的“实施例4”所制备的基因芯片就可以检测出该病原微生物。如肝炎病毒、性病病原微生物、腹泻病原微生物、呼吸道致病微生物、耐药细菌的耐药基因等。实施例6、将本发明的基因芯片固相载体用于食品、卫生防疫

在“实施例4”中，如果所述的核酸探针是针对某种通过消化道传播的病原微生物的，则使用所述的“实施例4”所制备的基因芯片就可以检测出该通过消化道传播的病原微生物。如大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌等。实施例6、将本发明的基因芯片固相载体用于癌症诊断

在“实施例4”中，如果所述的核酸探针是针对癌基因的，则使用所述的“实施例4”所制备的基因芯片就可以诊断出癌症。实施例7、将本发明的基因芯片固相载体用于其他疾病诊断

在“实施例4”中，如果所述的核酸探针是针对遗传病基因的，则使用所述的“实施例4”所制备的基因芯片就可以诊断出该遗传病，如血友病、先天性心脏病等。

Claims (4)

1.基因芯片固相载体的制备方法，其特征在于用1％(3-巯丙基)三甲氧硅烷对洗涤干净的玻璃片、硅片和石英片进行硅化。

2.权利要求1的基因芯片固相载体的制备方法，其特征在于所制备出的基因芯片固相载体的表面带有活性巯基(-SH)。

3.按权利要求1所制备出的、具备权利要求2所述特征的基因芯片固相载体，通过其表面的活性巯基(-SH)与被修饰有活性巯基(-SH)的核酸探针通过形成二硫键(-S-S-)，将核酸探针固定于载体上，从而制成基因芯片。

4.将权利要求3所述的基因芯片用于临床病原微生物诊断、食品卫生防疫、癌症和其他疾病的诊断。