CN1470634A - 一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体 - Google Patents

Abstract

对肠激酶轻链基因第112位的半胱氨酸定点突变，用大肠杆菌和酵母表达肠激酶轻链变体，经Zn－Sepharose和STI－Sepharose亲和层析，获得高纯度的肠激酶轻链变体蛋白。与野生型肠激酶轻链相比，该变体具有较高的稳定性和酶活性。

Description

一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体

技术领域

本发明涉及一种丝氨酸蛋白水解酶，特别是肠激酶的轻链变体。

背景技术

肠激酶(Enterokinase，EK)是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一。在生理条件下，锚定在细胞膜上的EK将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶，胰蛋白酶再激活胰腺中的其他酶原进而形成一系列的蛋白水解酶混合物。

肠激酶由两条多肽链组成，即重链和轻链，并通过一对链间二硫键连接，其中轻链中的Cys¹¹²参与了和重链的连接。肠激酶的轻链具有完整的催化功能，其识别序列是 肠激酶对其识别序列具有高度的专一性，目前广泛应用于切割融合蛋白中载体蛋白和目标蛋白之间的肽键，因为P₁′位点的氨基酸残基对肠激酶的专一性及活性影响甚微。此外，融合蛋白经EK酶解获得的目标蛋白具有和野生型完全一致的氨基酸序列。

但目前市售的肠激酶价格非常昂贵，其中从组织中分离纯化的肠激酶往往存在其它蛋白酶类的污染，而通过基因工程制备的野生型肠激酶轻链(EKLC)稳定性较差，长时间保存容易产生聚合体或沉淀，导致酶活性下降。我们认为肠激酶轻链分子中游离存在的Cys¹¹²能够引起肠激酶轻链分子间的聚合，并导致酶活性的降低。

发明内容

本发明的目的是利用基因工程技术，克隆肠激酶轻链基因并对Cys¹¹²密码子进行定点突变，再分别装入原核或真核细胞表达载体，并采用原核或真核细胞发酵的方式获得稳定性和酶活性高的肠激酶轻链变体蛋白。

本发明的技术解决方案：

一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体，它用原核或真核细胞制备，其特征是通过基因工程方法，对肠激酶轻链蛋白第112位的半胱氨酸残基定点突变；最终的活性酶产物中没有游离的半胱氨酸残基，并使酶的稳定性及活性提高。

本发明的优点

1.对肠激酶轻链变体在原核或真核细胞中的表达产物采用Zn-Sepharose亲和层析进行纯化，方法简单，成本低。

2.当采用原核细胞制备肠激酶轻链或其变体时，肠激酶轻链变体的活性回收高于对应的野生型肠激酶轻链。

3.制备的肠激酶轻链变体对小分子底物的水解活性略高于野生型肠激酶轻链，且具有更高的酶学稳定性，表现为在与融合蛋白长时间保温后(＞10hr)，相同活性单位的肠激酶轻链变体对融合蛋白的酶解作用显著高于对应的野生型肠激酶轻链。

附图说明

图1是从酵母制备的野生型肠激酶轻链和肠激酶轻链变体对硫氧化还原蛋白-人脑钠素融合蛋白的酶解作用的电泳图谱。

图2是从大肠杆菌制备的野生型肠激酶轻链和肠激酶轻链变体对硫氧化还原蛋白-人脑钠素融合蛋白的酶解作用的电泳图谱。

图3是用酵母菌制备的野生型肠激酶轻链及其变体形成二聚体的电泳图谱。

具体实施方式

本发明是通过以下方式实现的：

1.十二指肠总RNA的制备，取新鲜的牛或人的十二指肠组织，按照Qigen kit(Catalog NO.74104)操作手册提取总RNA。

2.RT-PCR反应

RT-PCR试剂盒购自Invitrogen公司，(Catalog No.L1310-01)实验过程参照操作手册。取3μg总RNA，加水至终体积11.5μl，再加入1μl胸腺嘧啶寡核苷酸引物，混匀，置65℃保温10min，室温2min，再依次加入1μl RNase抑制剂，4μl 5x反应缓冲液，1μl 100mM dNTP，1μl 80mM焦磷酸钠，0.5μl AMV反转录酶，混匀置42℃反应60min。

取3μl上述反应液作为PCR扩增模板。当采用原核细胞作为表达宿主菌时，PCR扩增的5′端引物为 CAT ATG GAC GAC GAT GAC AAG ATT GTC GGA GGA AGT GAC TCC，3′端引物为 CTC GAG ATG TAG AAA ACT TTG TAT CCA CTC；当采用酵母作为表达宿主菌时，PCR扩增的5′端引物为 CTC GAG AAA AGA ATT GTC GGA

                                    30个循环GGA AGT GAC TCC，3′端引物为 GTC GAC ATG TAG AAA ACT TTG TAT CCA CTC(注3′端引物中均不含终止密码子，而是采用表达载体上的6个多聚组氨酸及其终止密码)，再分别加入50pmol 5′端和3′端引物，5μl 10x的PCR缓冲液，5μl 10mM dNTP以及0.25U Taq酶，并用H₂O定容到50μl。PCR扩增的条件为：

3.肠激酶轻链基因克隆质粒(PCR2.1EKLC)的构建

将PCR扩增产物直接连接到PCR2.1载体上(Invitrogen公司产品，Catalog No.K2040-40)。取3μl PCR扩增产物，加入1μl PCR2.1载体，1μl盐溶液，1μl水，置室温连接4min。取3μl连接产物转化TOPO-10感受态细胞。在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂平板上挑取菌落，用EcoRI酶切筛选阳性克隆，并进一步进行序列鉴定。

4.肠激酶轻链Cys¹¹²的定点突变(PCR2.1EKLC/Cys¹¹²→Ala)

采用Stratagene公司的定点突变试剂盒进行Cys¹¹²的定点突变(Catalog No.200518)。突变引物为：

①GAT TAC ATA CAA CCT ATT GCT TTA CCG GAA GAA AATCAA

②TTG ATT TTC TTC CGG TAA AGC AAT AGG TTG TAT GTAATC

取PCR 2.1EKLC质粒200ng，分别加入50pmol引物1和2，5μl10x的扩增缓冲液，5μl 25mM dNTP，以及0.5u的Pfu酶，并用水定容到50μl。

扩增条件为：

                                            18循环

扩增完毕，加入1μl DpnI置37℃反应1小时。取3μl上述反应溶液转化JM109感受态细胞。在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂板上挑取菌落，并进行序列测定验证。

在对肠激酶蛋白序列的112位半胱氨酸残基进行点突变时，或保留其基因序列或蛋白序列的其他位点的野生型，或同时对肠激酶的基因序列或蛋白序列的其他单一位点或多位点进行突变或缺失或插入，都能达到本发明的效果。

5.肠激酶轻链变体基因表达载体的构建

在构建原核细胞表达质粒时，将PCR2.1EKLC/Cys¹¹²→Ala质粒和表达载体PET29b用NdeI/XhoI双酶切。PCR2.1EKLC/Cys¹¹²→Ala质粒酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，回收纯化小片段。PET29b酶切产物则纯化回收大片段。取上述两片段各8.5μl，加入2μl10x的连接缓冲液和1μl的连接酶，置15℃连接过夜。取5μl连接产物转化TOPO-10感受态细胞。在含卡那霉素的琼脂板上挑取菌落，并用NdeI/XhoI酶切筛选阳性克隆(PET29bEKLC/Cys112→Ala)。

在构建酵母表达系统时，将PCR2.1EKLC/Cys¹¹²→Ala质粒和表达载体pPICZαA用XhoI/AccI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离后，PCR2.1EKLC/Cys¹¹²→Ala质粒酶切产物纯化回收小片段，pPICZαA酶切产物纯化回收大片段。各取8.5μl上述片段混合，加入2μl连接缓冲液和1μl连接酶，置15℃连接过夜，取5μl连接产物转化TOPO-10感受态细胞。在含Zeocin的低盐LB琼脂平板上挑取菌落，用XhoI/AccI酶切筛选阳性克隆(pPICZαA EKLC/Cys112→Ala)。

6.工程菌的建立

①以大肠杆菌为宿主菌

用肠激酶轻链变体基因(PET29bEKLC/Cys¹¹²→Ala)转化BL21，在含卡那霉素的LB琼脂板上挑取菌落，用12％的还原SDS-PAGE分析比较各菌株经IPTG诱导的表达效率，筛选表达效率最高(15％±2％)的菌株作为工程菌。

②以酵母为宿主菌

用SacI单酶切肠激酶轻链变体基因(pPICZαAEKLC/Cys¹¹²→Ala)，使质粒线性化，按照Invitrogen操作手册，将上述线性化的质粒转化GS115毕赤(pichia)感受态细胞。在含Zeocin的YPDS琼脂板上挑取单菌落，接种于25ml BMGY培养基，在30℃以280rpm转速振摇18小时，使酵母菌的菌密度OD₆₀₀＝5左右。在室温以3000g离心5分钟，去上清，用BMMY培养基稀释菌体至OD₆₀₀＝1，每隔24小时加入甲醇至终浓度为0.5％以诱导肠激酶轻链的分泌表达，比较各菌株的表达效率。

7.肠激酶轻链变体的制备

①大肠杆菌作为表达宿主菌

1)工程菌经IPTG诱导后离心收集菌体，按每克菌体5ml的比例加入裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，6M盐酸胍，10mM β-巯基乙醇，pH7.9)，超声破菌，离心取上清液，上样至Zn-Sepharose亲和柱，用洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl，8M尿素，20mM咪唑，0.5M NaCl，10mM β-巯基乙醇，pH7.9)洗去杂质成份，用洗脱缓冲液(25mMTris-HCl，8M尿素，200mM咪唑，0.3M NaCl，10mM-β巯基乙醇，pH7.9)洗脱肠激酶轻链变体。

2)将收集的肠激酶轻链样品用复性缓冲液(25mM Tris-HCl，2M尿素，2mM CaCl₂，1.5mM氧化型谷胱甘肽，0.75mM还原型谷胱甘肽，pH8.0)稀释25倍，在室温放置18小时后，对25mM Tris-HCl，2mM CaCl₂，pH7.5的缓冲液充分透析，离心取上清液。

3)将上清液上样至STI-Sepharose柱，用洗涤缓冲液(25mMTris-HCl，0.5M NaCl，pH7.5)充分洗涤，用洗脱缓冲液(25mM甲酸钠，0.3M NaCl，pH3.0)将肠激酶轻链变体洗脱，洗脱峰对25mMTris-HCl，pH7.5充分透析，备用。

②用酵母作为表达宿主菌

用甲醇诱导肠激酶轻链分泌表达72小时后，在4℃以7500rpm离心15分钟收集上清液，对25mM Tris-HCl pH7.9缓冲液充分透析并上样至Zn-Sepharose柱，用10倍床体积的洗涤缓冲液(25mMTris-HCl，20mM咪唑，0.5M NaCl，pH7.9)充分洗涤，用洗脱缓冲液(25mM Tris-HCl，200mM咪唑，0.3M NaCl，pH7.9)将肠激酶轻链或其变体蛋白从Zn-Sepharose柱上洗脱。

8.肠激酶轻链变体的性质分析

①对小分子底物(Gly-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide)的酶反应动力学测定

酶反应动力学测定参照Grant和Hermon-Taylor的方法^[1]，测定结果：从大肠杆菌制备的肠激酶轻链其Km为0.52mM，kcat为37.2S^-1；肠激酶轻链变体其Km为0.58mM，kcat为46.5^-1；从酵母制备的肠激酶轻链其Km为0.76mM，kcat为59.4S^-1；肠激酶轻链变体Km为0.81mM，kcat为68.3S^-1。上述结果表明肠激酶轻链变体对小分子底物的水解活性略高于对应的野生型肠激酶轻链。

②对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白的酶解作用

在200μl酶解缓冲液中(20mM Tris-HCl，2mM CaCl₂，0.1M NaCl，pH7.5)分别加入400μg硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白以及8u的肠激酶轻链蛋白或肠激酶轻链变体，置37℃保温6～18小时后，取30μl样品，用16％的Tricine SDS-PAGE检测融合蛋白的酶解程度。

图1显示了从酵母制备的野生型肠激酶轻链(EKLC/Cys¹¹²)和肠激酶轻链变体(EKLC/Cys¹¹²→Ala)对硫氧化还原蛋白-人脑钠素融合蛋白(Trx-BNP)的酶解作用。图中Trx和BNP分别代表硫氧化还原蛋白和人脑钠素。第5泳道为Trx-BNP对照；第2，4，7泳道分别为8u的野生型肠激酶轻链在37℃酶解Trx-BNP 12，6，16小时；第1，3，6泳道分别为8u的肠激酶轻链变体在37℃酶解Trx-BNP 12，6，16小时。该结果说明用酵母菌制备的肠激酶轻链变体对Trx-BNP融合蛋白的酶解活性高于野生型肠激酶轻链。

图2显示了从大肠杆菌制备的野生型肠激酶轻链(EKLC/Cys¹¹²)和肠激酶轻链变体(EKLC/Cys¹¹²→Ala)对Trx-BNP融合蛋白的酶解作用。其中第1，3，5泳道分别为8u的野生型肠激酶轻链在37℃酶解Trx-BNP 18，6，12小时；第2，4，6泳道分别为肠激酶轻链变体在37℃酶解Trx-BNP 18，6，12小时。该结果说明从大肠杆菌制备的肠激酶轻链变体(EKLC/Cys¹¹²→Ala)对融合蛋白的酶解活性高于野生型肠激酶轻链(EKLC/Cys¹¹²)。

③肠激酶轻链及其变体蛋白的稳定性

用20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，5mM EDTA，100KIU/ml Aprotinin，pH7.5缓冲液配制0.4mg/ml的肠激酶轻链及其变体蛋白，置37℃保温24小时或置室温72hr后，用12％的非还原SDS-PAGE检定上述样品的聚合体含量。

图3显示了用酵母菌制备的野生型肠激酶轻链(EKLC/Cys¹¹²)及其变体(EKLC/Cys¹¹²→Ala)形成二聚体的作用。图中肠激酶轻链单体的分子量为34K道尔顿，肠激酶轻链二聚体分子量为68K道尔顿。第1泳道为分子量标准(从上至下，5条带的分子量分别为97Kd，66Kd，43Kd，31Kd，14.4Kd)；第2，3泳道分别为肠激酶轻链变体和野生型肠激酶轻链；第4，5泳道分别为肠激酶轻链和野生型肠激酶轻链在37℃保温24小时；第6，7泳道分别为肠激酶轻链变体和野生型肠激酶轻链在室温放置3天。结果表明，野生型肠激酶轻链在室温或37℃放置会产生二聚体，而肠激酶轻链变体在同样条件下未观察到聚合体的形成，说明肠激酶轻链变体比其野生型具有更高的稳定性。

实施例一

采用肠激酶轻链变体的BL21工程菌发酵。以10升发酵罐为例(发酵时间持续2天)，每升发酵液可得菌体27.8克，含肠激酶轻链变体蛋白约578mg，经Zn-Sepharose亲和层析得到415mg变性的肠激酶轻链变体蛋白，经复性处理每升得到肠激酶活性2.19×10⁵u，经STI-Sepharose亲和层析，回收肠激酶活性1.64×10⁵u，每10升发酵液获得1.64×10⁶u肠激酶活性。按每个单位肠激酶活性水解50ug融合蛋白计算，每10升发酵液获得的肠激酶可降解82克的融合蛋白。

采用上述方法制备野生型的肠激酶轻链蛋白，每10升发酵液仅获得1.18×10⁶u的肠激酶活性。这是因为肠激酶轻链变体的复性效率较野生型高32±5％。

实施例二

采用肠激酶轻链变体的酵母工程菌发酵(发酵时间持续96小时)。以10升发酵罐为例，每升发酵液上清中含有的肠激酶活性为1.45×10⁶u，经Zn-Sepharose亲和层析后，回收肠激酶活性1.03×10⁶u，10升发酵液获得1.03×10⁷u肠激酶活性，按每个单位肠激酶活性水解50μg融合蛋白计算，10升发酵液获得的肠激酶可降解515克融合蛋白。

参考文献：Grant，D.A.W.& Hermon-Taylar，J.Hydrolysis of artificial substrates byenterokinase and trypsin and the development of a sensitive specific assayfor enterokinase in serum.Biochim.Biophys.Acta，(1979)；567，207-215.

Claims (3)

1.一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体，它用原核或真核细胞制备，其特征是通过基因工程方法，对肠激酶轻链蛋白第112位的半胱氨酸残基(Cys)定点突变。

2.根据权利要求1所述的一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体，其特征是它以原核或真核细胞制备，最终的活性酶产物中没有游离的半胱氨酸残基，并使酶的稳定性及活性提高。

3.根据权利要求1所述的一种具有高活性和高稳定性的肠激酶轻链变体，其特征是在对肠激酶蛋白序列的112位半胱氨酸残基进行点突变时，或保留其基因序列或蛋白序列的其他位点的野生型，或同时对肠激酶的基因序列或蛋白序列的其他单一位点或多位点进行突变或缺失或插入。

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