CN1464051A - 疱疹病毒胸苷激酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离的疱疹病毒胸苷激酶突变体，所述疱疹病毒胸苷激酶突变体能较野生型更为高效地使核苷酸类似物磷酸化，其编码蛋白具有152位氨基酸突变，且当152位突变为缬氨酸时，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。本发明还提供了该突变体的编码序列、重组载体以及其提高细胞对核苷酸类似物依赖型杀伤的易感性和其在包括制备基因治疗在内的临床应用中的应用。上述突变体显著减轻GCV的临床用量，降低临床毒性，而且还提高了胸苷激酶的旁观者效应。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物学领域，更具体地涉及一种新的疱疹病毒胸苷激酶突变体、其编码序列及其在提高细胞对核苷酸类似物依赖型杀伤的易感性以及制备通过核苷酸类似物依赖型杀伤作用的抗肿瘤基因治疗药中的应用。
发明背景
疱疹病毒胸苷激酶例如单纯疱疹病毒I胸苷激酶(下文简称为“HSV1-TK”)，能有效地将丙氧鸟苷(ganciclovir，下文简称“GCV”)及无环鸟苷(acyclovir，下文简称“ACV”)等核苷酸类似物磷酸化而形成相应的单磷酸化中间体。继而这些中间体经宿主细胞自身的胸苷激酶作用而进一步磷酸化，成为二磷酸化中间体，直至三磷酸化的终体。这类三磷酸终体可在宿主细胞的DNA复制时，而以胸苷的身份掺入到新合成DNA链中，导致DNA链合成终止，最终引起细胞死亡[1]。真核生物细胞内源性的胸苷激酶不能对GCV及ACV直接磷酸化而产生相应的单磷酸化中间体，从而HSVTK-1基因表达与否决定着有关细胞对GCV等胸苷类似物是否易感。
GCV已广泛地用治疗单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等感染[2]。除了表达HSVTK-1基因的细胞对GCV为代表的胸苷类似物易感外，这类被HSVTK-1磷酸化的胸苷类似物可有效地通过胞间间隔(GAP JUNCTION)传导到毗邻的不表达HSVTK-1基因的细胞而制其于死地。这就是所谓的“旁观者效应”，它可显著地扩大这一方案的细胞毒效应，部分上克服了现有的基因转导方法的效率偏低的不足[4]。另外，HSVTK-1/GCV方案相关的旁观者效应与宿主因此而产生的抗肿瘤免疫反应有关[6]。通过在导入或表达水平上的基因靶向技术选择性地使HSVTK-1在肿瘤细胞内表达的方案已广泛地应用到肿瘤基因治疗中[7，8]。加之，HSVTK-1表达本身对细胞并无任一不良影响，胸苷类似物给药时间的选择可决定这一方案产生效应的时相。另外用组织专一性启动子来控制HSVTK-1在个体发育的中专一性的表达并与GCV的给药的时间的控制相结合，能有效地时空专一性地剔除表达该基因的细胞。这一手段已广泛地用于研究细胞分化以及特定细胞系在器官形成中的以及动物的个体发生中的作用[9]。
尽管GCV作为抗疱疹病毒及抗肿瘤基因治疗的临床应用已为时良久，它的广泛应用明显地受限于GCV的临床有效剂量所伴随着的毒性反应。GCV的剂量过高会引起短期的心、肝、肾急性损害及造血系统的改变[10]，还可以抑制机体的免疫反应[11]。另外，有些稳定表达HSV1-TK的肿瘤细胞对GCV依赖性细胞毒性反应有抗性[12，13]。当肿瘤周围的GCV的含量不足时，这些表达HSV1-TK的肿瘤细胞则得以生存[14，15]。所以，提高HSV1-TK对GCV等胸苷类似物的磷酸化活性，有望降低GCV的临床剂量，还可以提高TK的旁观者效应。
所以，为了降低GCV的临床有效剂量，并提高胸苷激酶介导的旁观者效应，本领域中需要有一种对诸如GCV、ACV等核苷酸类似物的磷酸化活性有显著增强的疱疹病毒胸苷激酶。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种对核苷酸类似物的磷酸化活性显著增强的疱疹病毒胸苷激酶。
本发明的另一目的是利用上述疱疹病毒胸苷激酶来提高细胞对核苷酸类似物依赖型杀伤的易感性。
本发明还有一个目的是用本发明疱疹病毒胸苷激酶突变体的多核苷酸序列来制备通过核苷酸类似物依赖型杀伤作用的抗肿瘤基因治疗药。
本发明一方面涉及一种分离的疱疹病毒胸苷激酶突变体，所述疱疹病毒胸苷激酶突变体能较野生型更为高效地使核苷酸类似物磷酸化，其编码蛋白具有152位氨基酸突变，且当152位突变为缬氨酸时，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。
在上述方案的一个较佳实例中，所述突变选自Ala152Val，Ala152Gly，Ala152Pro和Ala152Arg。
另外，当152位突变成非缬氨酸的氨基酸时，该疱疹病毒胸苷激酶突变体还可任选地有168位和169位的氨基酸突变。较佳的，所述168位和169位的氨基酸突变为Ala168Tyr和Leu169Phe。
本发明所述的疱疹病毒包括疱疹病毒家族中的许多成员，例如单纯疱疹病毒1型(McKnight等人，Nuc.Acids Res 8：5949-5964，1980)，单纯疱疹病毒2型(Swain和Galloway，J.Virol.46：1045-1050，1983)，水痘-带状疱疹病毒(Davison和Scott，J.Gen.Virol.67：1759-1816，1986)，绒猴疱疹病毒(Otsuka和Kit，Virology 135：316-330，1984)，猫疱疹病毒1型(Nunberg等人，J.Virol.63：3240-3249，1989)，假狂犬病病毒(Kit和Kit，美国专利4,514,497，1985)，马疱疹病毒1型(Robertson和Whalley，Nuc.Acids Res.16：11303-11317，1988)，牛疱疹病毒1型(Mittal和Field，J.Virol 70：2901-2918，1989)，火鸡疱疹病毒(Martin等人，J Virol.63：2847-2852，1989)，Marek′s疾病病毒(Scott等人，J Gen.Virol.70：3055-3065，1989)，松鼠猴疱疹病毒(herpesvirus saimiri)(Honess等人，J.Gen.Virol.70：3003-3013，1989)和EB病毒(Baer等人，Nature(London)310：207-311，1984)。其中，较佳的病毒是单纯疱疹病毒1型。
本文所述的核苷酸类似物选自丙氧鸟苷、无环鸟苷、泛西洛维、布昔洛维、瓦昔洛维、三氟胸苷、1-2-脱氧、2-氟、δ-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT 1-δ-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脱氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-二脱氧尿苷、AZT、AIU、二脱氧胞苷和AraC。其中，较佳的核苷酸类似物是丙氧鸟苷和无环鸟苷。
在另一较佳的实施方案中，所述疱疹病毒胸苷激酶突变体相对于其野生型只有152位氨基酸突变。
本发明第二方面涉及一种分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码上述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体。
本发明第三方面涉及一种重组表达载体，该重组表达载体含有上述的编码上述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
本发明第四方面涉及一种提高细胞对核苷酸类似物依赖型杀伤的易感性的方法，其包括用上述重组表达载体转染所述细胞。
在一个较佳的实施方案中，所述转染方案采用磷酸钙转染、脂转染、显微注射、电穿孔和病毒性载体介导的方法。
本发明的第五方面涉及上述疱疹病毒胸苷激酶突变体、疱疹病毒胸苷激酶突变体多核苷酸序列或其重组表达载体在制备通过核苷酸类似物依赖型杀伤作用的抗肿瘤基因治疗药中的应用。
本发明提供了数种高生物活性的HSV1-TK突变株，它在GCV依赖性细胞内杀伤实验中对GCV所需要的有效剂量低于野生型的所需的5倍之多。使用这些高效HSV-1TK突变株显著地减轻了GCV使用的临床剂量所带来的临床毒性以及患者在治疗费用上的负效应，而且还提高了胸苷激酶的旁观者效应。
本发明的其它目的和优点将在下文的详细描述中有进一步揭示。
附图简述
图1显示了HA2质粒图谱及其多克隆位点附近的序列，其中Ampicillin和Neomycin分别表示氨苄青霉素和新霉素标记基因；HA tag是HA多肽序列。
图2显示了含有HSV1-TK基因的HA2质粒的图谱。
图3是构建突变株时所采用的双轮PCR搭桥法流程示意图。
图4是构建突变株时所采用的定点突变方法示意图。
图5显示了野生型TK和突变体mTk1的体外转录和翻译的结果。
图6显示了U-2 0S细胞磷酸钙沉淀转染效率的测定结果。
图7显示了HSV1-TK蛋白在U-2 0S细胞表达水平的Western印迹检测。
图8显示了野生型HSV1-TK以及各突变型HSV1-TK在瞬时转染试验GCV依赖型杀伤试验中的结果比较。
图9显示了野生型HSV1-TK以及HSV1-TK突变型1在瞬时转染试验GCV依赖型杀伤试验中的结果比较。
图10显示了野生型HSV1-TK以及各突变型HSV1-TK在稳定转染试验GCV依赖型杀伤试验中的结果比较。
图11显示了野生型HSV1-TK以及HSV1-TK的各种152氨基酸点突变型在稳定转染试验GCV依赖型杀伤试验中的结果比较。
具体实施方案
有关通过点突变来提高野生型HSV1-TK生物活性的方法已有报道(具体见下文)，这些点突变方案均是围绕着HSV1-TK的活性中心(155-172位氨基酸)开展的。但本发明者通过研究发现，仅仅通过改变HSV1-TK的152位氨基酸，就可使胸苷激酶的生物活性显著高于野生型，从而完成了本发明。
在这里，术语“胸苷激酶的生物活性”是指胸苷激酶将丙氧鸟苷等核苷酸类似物(如胸苷类似物)磷酸化，并在细胞及活体内的系统中，表达该蛋白的细胞对核苷酸类似物依赖性杀伤有易感性。
本发明提供了一种分离的疱疹病毒胸苷激酶突变体，所述疱疹病毒胸苷激酶突变体能较野生型更为高效地使核苷酸类似物磷酸化，其编码蛋白具有152位氨基酸突变，且当152位突变为缬氨酸时，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。在上述方案的一个较佳实例中，所述突变选自Ala152Val，Ala152Gly，Ala152Pro和Ala152Arg。另外，当152位突变成非缬氨酸的氨基酸时，该疱疹病毒胸苷激酶突变体还可任选地有168位和169位的氨基酸突变。较佳的，所述168位和169位的氨基酸突变为Ala168Tyr和Leu169Phe。
本文所用的术语“疱疹病毒胸苷激酶”可以是具有天然野生型序列的疱疹病毒胸苷激酶，也可以是其具有突变序列的衍生型或重组型，前提条件是该突变型或重组型中不包括152位氨基酸突变。野生型疱疹病毒胸苷激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：17所示。
本文中所用的术语“Ala152Val”即表示152位氨基酸由丙氨酸(Ala)变为缬氨酸(Val)。“Ala152Gly”、“Ala152Pro”、“Ala152Arg”、“Ala168Tyr”和“Leu169Phe”可以此类推。
本文所用的术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
本发明所述的疱疹病毒包括疱疹病毒家族中的许多成员，例如单纯疱疹病毒1型(McKnight等人，Nuc.Acids Res 8：5949-5964，1980)，单纯疱疹病毒2型(Swain和Galloway，J.Virol.46：1045-1050，1983)，水痘-带状疱疹病毒(Davison和Scott，J.Gen.Virol.67：1759-1816，1986)，绒猴疱疹病毒(Otsuka和Kit，Virology 135：316-330，1984)，猫疱疹病毒1型(Nunberg等人，J.Virol.63：3240-3249，1989)，假狂犬病病毒(Kit和Kit，美国专利4,514,497，1985)，马疱疹病毒1型(Robertson和Whalley，Nuc.Acids Res.16：11303-11317，1988)，牛疱疹病毒1型(Mittal和Field，J.Virol 70：2901-2918，1989)，火鸡疱疹病毒(Martin等人，J Virol.63：2847-2852，1989)，Marek′s疾病病毒(Scott等人，J Gen.Virol.70：3055-3065，1989)，松鼠猴疱疹病毒(Honess等人，J.Gen.Virol.70：3003-3013，1989)和EB病毒(Baer等人，Nature(London)310：207-311，1984)。其中，较佳的病毒是单纯疱疹病毒1型。由于疱疹病毒家族中上述这些成员的胸苷激酶的酶活性中心氨基酸序列有高度的同源性，因此预计该家族中其它成员的相应突变株也有同样高的价值和应用前景。
本文所述的核苷酸类似物可选自丙氧鸟苷、无环鸟苷、泛西洛维、布昔洛维、瓦昔洛维、三氟胸苷、1-2-脱氧、2-氟、δ-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT 1-δ-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脱氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-二脱氧尿苷、AZT、AIU、二脱氧胞苷和AraC。其中，较佳的核苷酸类似物是丙氧鸟苷和无环鸟苷。然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于这些核苷酸类似物。
本发明还提供了编码上述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的多核苷酸序列。所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链或是双链形式，可以是编码链或非编码链。由于遗传密码的简并性，因此能够编码单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的所有多核苷酸序列均包括在本发明范围内。
本发明的编码上述单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体的多核苷酸序列可用本领域技术人员熟知的DNA重组、PCR等各种技术来获得，例如包括，但不局限于本发明较佳实施方案中采用的双轮PCR搭桥法以及Stratagene的quick change中描述的定点突变方法。
将上述突变的多核苷酸序列经适当酶切插入合适的表达载体中并与表达调控序列操作性相连，就得到了本发明的重组表达载体。在这里，术语“重组表达载体”指本领域技术人员熟知的各种细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、病毒或其他载体。在本发明较佳实施方案中使用的载体是以pcDNA3.1+(Invitrogen，CA，USA)为基本骨架/在其多克隆位点区中的EcoRI和XhoI之间插入了三个流感病毒血凝素抗原决定簇(HA)多肽序列构建而成的真核细胞壁表达载体。然而，本发明范围并局限于该载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。这里所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。典型的启动子例如有CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、以及其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。在上述重组表达载体中也可根据需要加入选择性标记基因。
由于本发明的疱疹病毒胸苷激酶突变体具有显著高于野生型的对胸苷类似物的磷酸化活性，因此本发明还提供了一种提高细胞对核苷酸类似物依赖性杀伤易感性的方法，该方法包括用上述的具有疱疹病毒胸苷激酶突变体编码序列的重组表达载体转染所述目标细胞。
用重组DNA转化宿主细胞的技术是本领域普通技术人员所熟知的的。由于本发明中涉及的目标细胞通常为真核细胞，因此通常采用的DNA转染方法例如有磷酸钙沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体转染和病毒载体介导等方法。在一个较佳的实施方案中，所述转染方案采用磷酸钙转染。
所以，本发明在抗肿瘤基因治疗方面也有广泛的应用前景。
本发明还涉及上述疱疹病毒胸苷激酶突变体、其多核苷酸编码序列或含该多核苷酸编码序列的重组表达载体在制备通过核苷酸类似物依赖型杀伤作用的抗肿瘤基因治疗药中的应用。在一个较佳的实施方案中，所述抗肿瘤基因治疗药可以采用单基因、联合基因(胸苷激酶和一个或几个其抗肿瘤机制不同的治疗蛋白的基因)或融合基因(胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶或任一其它种类蛋白的融合基因)的形式。
另外，利用本发明的高生物活性的HSV1-TK突变株来代替野生型HSV1-TK基因，能提高整体动物中进行组织剔除的选择性。
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施例仅用于描述本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 HSV1-TK突变株的构建
在本试验中采用的试剂如下：pfu购自Stratagene，CA，USA；限制性内切酶购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA连接酶购自Promega，WI，USA；胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。主要生化试剂为Sigma，MO，US的产品或国内RA级产品。HA抗体为Santa Crutz，CA，USA公司产品(F-7，小鼠单克隆抗体)。
本试验中所有的常规的分子遗传学操作均按照《分子克隆实验指南》[16]上的相关程序进行，除非另有特别描述。
首先构建HA3标记的野生型-HSV1-TK真核细胞壁表达载体。
流感病毒血凝素抗原决定簇(HA)载体是以pcDNA3.1+(invitrogen，CA，USA)为基本骨架，在其多克隆位点区中的EcoRI和XhoI之间插入了三个HA多肽序列构建而成的。图1中显示了pHA2质粒图谱及其多克隆位点附近的序列。HA野生型HA标记的TK基因是通过PCR方法，将HSV1-TK基因插入到XhoI/BglII切过的HA2载体中，其中本实验所用的HSV1-TK经Blastn和Blastp(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)核酸和蛋白质数据库查新及同源搜索确认与基因库中登陆号为BAA8399的HSV1-TK基因在蛋白质水平上只多了一个4位上的甘氨酸。由于该甘氨酸远离HSV1-TK的活性中心(氨基酸155到172)，这一个差别没有显著化影响HSV1-TK的酶活性。图2中显示了含有HSV1-TK基因的HA2质粒的图谱。
由于某些突变株涉及到多个氨基酸的改变，而且这些氨基酸的分布域很宽，因此采用双轮PCR搭桥法构建mTK-1，mTK-2和mTK-3。关于双轮PCR搭桥法可参见图3，其流程大致如下：首先用引物a和引物d、引物b和引物c分别进行PCR，然后用pfu进行聚合酶连反应。使胶回收产物在95℃变性，再40℃退火，然后用pfu在75℃延伸，进行3个循环。然后用引物a和d再进行PCR，做22个循环。
所需引物具体如下：
1)mTK-1(152位丙氨酸→缬氨酸)和mTK-2(152位丙氨酸→缬氨酸，168位丙氨酸→缬氨酸，169位亮氨酸→苯丙氨酸)所用的引物：
引物a TKa：AAA
CTC GAG ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAG CAC(SEQ ID NO：1)，其中下划线的是Bgl II的识别顺序
引物b TKb：AAA AGA TCT TTA GCC TCC CCC ATC TCC CGG GCA AAC(SEQ ID NO：2)，其中下划线的是Xba I的识别顺序
引物c mt-L：ACC ATC CTC GCC GAC CGC CAT CCC ATC GCC TAC TTCCTG TGC(SEQ ID NO：3)
引物d mt-R：GGC GAG GAT GGT GAG GGC CGG GGG CGG GAC ATG(SEQ ID NO：4)
2)mTK-3(将亮氨酸插入到161位苯丙氨酸后，168位亮氨酸→苯丙氨酸，169亮氨酸→甲硫氨酸)所用的引物
引物a Z-TKa：AAA CTC GAC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT CAA(SEQID NO：5)
引物b Z-TKb：AAA AGA TCT TCA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG GGC(SEQ ID NO：6)
引物c 2m-L：GAC CGC CAT CCC ATC GCC TTC ATG CTG TGC TAC(SEQID NO：7)
引物d 2m-R：GGC GAT GGG ATG GCG GTC TAA GAA GAT GGT GAG(SEQID NO：8)
3)mTK-4(159位亮氨酸→丝氨酸，160位异亮氨酸→苯丙氨酸，161位苯丙氨酸→亮氨酸，168位丙氨酸→苯丙氨酸，169位亮氨酸→甲硫氨酸)所用的引物
Z-TKa、Z-TKb如2)所述；
引物c SR39-A：GCC CCC GGC CCT CAC TAG TTT CTT AGA CCG CCA TC(SEQ ID NO：9)
引物d SR39-B：GAT GGC GGT CTA AGA AAC TAG TGA GGG CCG GGG GC(SEQ ID NO：10)
4)mTK-5(152位丙氨酸→脯氨酸)
PL：GGG AGG CTG GGA GTT CAC ATC CAC CGC CCC CGG CCC(SEQ ID NO：11)
PR：GGG CCG GGG GCG GTG GAT GTG AAC TCC CAG CCT CCC(SEQ IDNO：12)
5)mTK-6(152位丙氨酸→甘氨酸)
GL：GGG AGG CTG GGA GTT CAC ATG GAC CGC CCC CGG CCC(SEQ IDNO：13)
GR：GGG CCG GGG GCG GTC CAT GTG AAC TCC CAG CCT CCC(SEQ IDNO：14)
6)mTK-7(152位丙氨酸→精氨酸)
RL：GGG AGG CTG GGA GTT CAC ATA GAC CGC CCC CGG CCC(SEQ IDNO：15)
RR：GGG CCG GGG GCG GTC TAT GTG AAC TCC CAG CCT CCC(SEQ ID NO：16)
如图3所示，第一轮PCR反应以野生型HSV1-TK为模板，分别以引物ab和cd为引物，得到二个片段；第二轮PCR先将经胶回收的两个片段退火，经搭桥形成模板，进行三轮PCR循环后，再加ad引物，经25轮PCR循环得到全长突变型TK(mTK-1，mTK-2和mTK-3)。
全长TK和载体HA用XhoI、BglII酶切，电泳，胶回收，构建得到重组质粒HA-mTK。经上海基康公司测序鉴定，序列正确。
进而采用Stratagene的quick change(参照Stratagene网站，产品号#200519)中描述的定点突变方法(图4)，在mTK-3的基础上产生mTK-4；在mTK-1的基础上产生了152P(mTK-5)，152G(mTK-6)和152R(mTK-7)的突变体。下表1中列出了HSV1-TK突变株的各突变位点。
表1 HSV1-TK突变株的位点
实施例2 HSV1-TK突变株的鉴定1)HSV1-TK突变体的完整性的鉴定
| 152 | 159 | 160 | 161 | 168 | 169 | |
| 野生型 | A | L | I | F | A | L |
| mTK-1 | V | |||||
| mTK-2 | V | Y | F | |||
| mTK-3 | L | I | F，L | F | M | |
| mTK-4 | S | F | L | F | M | |
| mTK-5 | P | |||||
| mTK-6 | G | |||||
| mTK-7 | R |
用T7噬菌体转录酶系统对上述实施例1获得的各突变株进行试管外转录转译分析。用35S标记的甲硫氨酸作为标记底物，转录翻译后的产物经SDS-PAGE电泳干胶后，放射自显影检测。从图5的结果可以看出，HSVI-TK突变体1(mTK-1)与野生型HA HSV1-TK一样，能产生预期大小的蛋白质。
2)HSV1-TK及其点突变体的功能检验：瞬时转染试验
用磷酸钙沉淀法分别将野生型及突变型HSV1-TK的质粒DNA转染到U-2 0S细胞(购自中国细胞库，上海生化细胞所)中，因此有必要对所用的U-2 0S细胞转染效率进行测定。
(A)用含增强性绿色萤光蛋白基因的真核细胞表达性质粒EGFP DNA转染U-20S细胞，并用碘化丙啶(PI)染色。转染了EGFP DNA的细胞发出绿色荧光。细胞核均被碘化丙啶染色发出红色荧光，可用来计算细胞总数。随机取二个视野，计数绿色荧光细胞数占总细胞数的百分比，作为转染效率。根据图6所示结果，测得转染效率10％。
(B)用Western印迹来核定野生型HSV1-TK及其突变株在转染细胞中的蛋白水平上表达的测定。如图7所示，与增殖胞核抗原PCNA(proliferation cell nuclearantigen)(一种真核细胞普遍表达的一种核蛋白，常常被用来作为上样量的内参照)带的强度相比，mTK的表达量并不比野生型TK的表达量大(抗HA抗体)。所以据信下文所述的mTK-1和mTK-2的GCV依赖性杀伤能力的提高是由于所述氨基酸突变引起的。
C)HSV1-TK及其点突变株的功能检验：瞬时转染试验、GCV依赖性的杀伤实验及统计分析
采用磷酸钙沉淀法分别将野生型及突变型HSV1-TK的质粒DNA转染到U-2 0S细胞中，隔天后将受转染的细胞以1×104/孔的量分板接种到96孔板中。待细胞贴壁后，加入如下表2所示浓度的GCV。处理三天后，采用MTS(Promega)对细胞对GCV存在的反应进行结果分析。每个样品重复五次，每组GCV浓度不同的样品的均值及方差(SD)按有关数量方法处理后，用GCV浓度不同组的均值/GCV浓度为零的MTT值的比值对GCV浓度作图，方差放入。
表2GCV的 野生型 TK mTK-1 mTK-2 mTK-3 mTK-4 HA3载体剂量 生存 生存 生存 生存 生存率 生存率((M) 率％ SD 率％ SD 率％ SD 率％ SD (％) SD (％) SD0 100 2.8 100 2.5 100 3.3 100 1.3 100 5.7 100 2.60.3 100 2.3 61.4 1.8 70.7 0.3 83.0 5.5 97.4 1.9 105.9 2.91.25 107.9 10.1 55.9 1.6 66.7 1.0 88.3 2.3 91.8 1.5 96.4 5.55 102.5 3.2 52.1 3.1 65.7 1.7 85.3 2.0 92.8 2.4 87.8 6.020 80.8 6.2 51.6 1.6 59.0 1.2 84.4 3.0 92.6 0.5 94.1 4.180 75.4 6.7 47.9 2.0 58.5 2.4 86.5 2.4 91.3 2.1 95.9 4.5
将HSV1-TK野生型和突变体进一步相比较可以更清楚地看到这两者之间的差别(图8和图9)。
在相同条件下，重复实验三次，结果类似。用寇氏法计算TK的IC50(即半数细胞死亡时GCV的用量)。突变型HSV-1 TK的IC50为12.07uM(95％可信限：9.22uM～15.81uM)远小于野生型HSV-1 TK的IC50 89.26uM(95％可信限：72.85uM～109.37uM)，P值小于0.001，有显著统计意义。
同时对其表达量进行研究。Western印迹和体外转录翻译试验都表明(图7)，突变后并没有表达量的增加。这进一步说明，152位氨基酸的突变(由丙氨酸突变成缬氨酸)提高了对肿瘤细胞的杀伤能力。
用SPSS软件作多因素方差分析。结果显示mTK-1和mTK-2的杀伤效果与野生型和其它TK的突变体有明显区别，统计学检验有显著性差异(P＜0.05)，因此可以认为mTK-1和mTK-2突变体比其野生型以及其它TK突变体(mTK-3和mTK-4)杀伤效果要好。而mTK-3和mTK-4的杀伤效果则比野生型TK差。
鉴于HSV1-mTK1表现出远较野生型HSV1-TK为高的酶活性，下面进一步对用定点突变法对152氨基酸进行下列三个点突变的突变株进行酶活性比较分析：152位精氨酸(mTK-5)、152位脯氨酸(mTK-6)和152位甘氨酸(mTK-7)(表1)。
为了在实验动物体内比较HSV1-TK突变株与其野生型的活性，用大鼠C63神经胶质瘤细胞株作为受体细胞来建立稳定细胞株。利用HA载体上所带有G418抗性为选择性标记，筛选出抗G418的C63细胞的混合群体(其中只有部分C6细胞表达HSV1-TK蛋白)，然后对这些细胞群体开展GCV依赖性的细胞试验。
从图10和图11可清楚地看出，凡是涉及到152氨基酸突变(除了152脯氨酸以外)的突变体(mTK-1、mTK-2、mTK-6和们mTK-7)均较野生型HSV1-TK的活性为高。
很早就有人对HSV1-TK在自然界中多态性以及对其人为突变体开展酶学方面的研究。他们的初衷是研究某些疱疹病毒对已胸苷激酶为对象而设计的抗疱疹药物的耐药性机制。某些HSV1-TK的点突变体可导致疱疹病毒对GCV等胸苷类似物性的临床药物产生的耐药性[17，18]。后来的研究者是通过点突变来探讨HSV-1 TK和底物或抑制剂结合区的关键氨基酸的功能，来揭示TK的酶活性的生化机制[19]。现在，学者们对TK突变体的研究是为了找到一个在基因治疗实践中更为有效的治疗基因。[20-22]
Kokoris[20]等人构建的mutant 30含有6个氨基酸突变：152位的A变成V，159位L变成I，160为I变成L，161位F变成A，168位A变成Y，169位L变成F。据报道该突变体30的胸苷激酶活性比野生型高出10倍，根据HSV1-TK蛋白质/GCV复合体三维结构的分析，168位和169位氨基酸的改变是mutant 30生物活性提高的关键。另外，Black等人[21]还在159位、160位、161位及168位、169位进行了多位点突变，他们认为这几个位点位于162-164位和170-172位的保守区的旁边，是TK活性改变的关键位点。他们构建的SR39突变体具有5个位点氨基酸改变：159位的亮氨酸(L)变成异亮氨酸(I)，160位的异亮氨酸(I)变成苯丙氨酸(F)，161位的苯丙氨酸(F)变成亮氨酸(L)，168位的丙氨酸(A)变成苯丙氨酸(F)，169位的亮氨酸(L)变成甲硫氨酸(M)。据称，SR39突变株的IC50是野生型TK的294倍。
与他们报道的极为不同的是，在本发明的GCV依赖性细胞毒性实验系统中，mTK-3和mTK-4的活性比野生型弱。mTK-3仅比SR39在160F后多了一个F。而mTK-4与SR39相比，仅在159位改F位S。其中尤以突变株3为差，其活性近全无(图9-11)。
本发明构建了HSV-1 TK的7个突变体，并将其克隆到真核表达载体HA上，瞬时转染U-2 OS细胞，用Western印迹测定它们的表达，并通过GCV杀伤实验筛选到数个高活性的都与152氨基酸突变有关的TK突变株。另外，另外，mTK-1和mTK-2的活性接近，这也说明mTK-2的活性显著提高并不与活性中心(155位-172位氨基酸)中的168位和169位氨基酸突变明显相关，而是与152位氨基酸极为相关。
下面列出了在本发明中提及的所有参考文献，所有这些文献均纳入本文作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种变化或修改，这些变化或修改均包括在本申请所附权利要求书所限定的范围内。
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20 25 30Arg Gln Gln Glu Ala Thr Glu Val Arg Leu Glu Gln Lys Met Pro Thr
35 40 45Leu Leu Arg Val Tyr Ile Asp Gly Pro His Gly Met Gly Lys Thr Thr
50 55 60Thr Thr Gln Leu Leu Val Ala Leu Gly Ser Arg Asp Asp Ile Val Tyr65 70 75 80Val Pro Glu Pro Met Thr Tyr Trp Gln Val Leu Gly Ala Ser Glu Thr
85 90 95Ile Ala Asn Ile Tyr Thr Thr Gln His Arg Leu Asp Gln Gly Glu Ile
100 105 110Ser Ala Gly Asp Ala Ala Val Val Met Thr Ser Ala Gln Ile Thr Met
115 120 125Gly Met Pro Tyr Ala Val Thr Asp Ala Val Leu Ala Pro His Ile Gly
130 135 140Gly Glu Ala Gly Ser Ser His Ala Pro Pro Pro Ala Leu Thr Leu Ile145 150 155 160Phe Asp Arg His Pro Ile Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Ala Arg
165 170 175Tyr Leu Met Gly Ser Met Thr Pro Gln Ala Val Leu Ala Phe Val Ala
180 185 190Leu Ile Pro Pro Thr Leu Pro Gly Thr Asn Ile Val Leu Gly Ala Leu
195 200 205Pro Glu Asp Arg His Ile Asp Arg Leu Ala Lys Arg Gln Arg Pro Gly
210 215 220Glu Arg Leu Asp Leu Ala Met Leu Ala Ala Ile Arg Arg Val Tyr Gly225 230 235 240Leu Leu Ala Asn Thr Val Arg Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Trp Arg
245 250 255Glu Asp Trp Gly Gln Leu Ser Gly Thr Ala Val Pro Pro Gln Gly Ala
260 265 270Glu Pro Gln Ser Asn Ala Gly Pro Arg Pro His Ile Gly Asp Thr Leu
275 280 285Phe Thr Leu Phe Arg Ala Pro Glu Leu Leu Ala Pro Asn Gly Asp Leu
290 295 300Tyr Asn Val Phe Ala Trp Ala Leu Asp Val Leu Ala Lys Arg Leu Arg305 3l0 3l5 320Pro Met His Val Phe Ile Leu Asp Tyr Asp Gln Ser Pro Ala Gly Cys
325 330 335Arg Asp Ala Leu Leu Gln Leu Thr Ser Gly Met Val Gln Thr His Val
340 345 350Thr Thr Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ile Cys Asp Leu Ala Arg Thr Phe
355 360 365Ala Arg Glu Met Gly Glu Ala Asn
370 375
Claims (10)
1.一种分离的疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于，所述疱疹病毒胸苷激酶突变体能较野生型更为高效地使核苷酸类似物磷酸化，其编码蛋白具有152位氨基酸突变，且当152位突变为缬氨酸时，168位和169位氨基酸不是酪氨酸和苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于，所述突变选自Ala152Val，Ala152Gly，Ala152Pro和Ala152Arg。
3.根据权利要求1所述的疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于，当152位突变成非缬氨酸的氨基酸时，它还可具有168位和169位氨基酸突变Ala168Tyr和Leu169Phe。
4.根据权利要求1所述的疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于，所述疱疹病毒选自：单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、水痘-带状疱疹病毒、绒猴疱疹病毒、猫疱疹病毒1型、假狂犬病病毒、马疱疹病毒1型、牛疱疹病毒1型、火鸡疱疹病毒、Marek′s疾病病毒、松鼠猴疱疹病毒和EB病毒。
5.根据权利要求1所述的疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于，所述核苷酸类似物丙氧鸟苷、无环鸟苷、泛西洛维、布昔洛维、瓦昔洛维、三氟胸苷、1-2-脱氧、2-氟、δ-D-阿拉伯呋喃糖-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT 1-δ-D-阿拉伯呋喃糖胸腺嘧啶、5-乙基-2’-脱氧尿苷、5-碘-5’-氨基-2，5’-二脱氧尿苷、AZT、AIU、二脱氧胞苷和AraC。
6.根据权利要求1所述的疱疹病毒胸苷激酶突变体，其特征在于，所述疱疹病毒胸苷激酶突变体只有152位氨基酸突变。
7.一种分离的多核苷酸序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的单纯疱疹病毒胸苷激酶突变体。
8.一种重组表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求7所述的多核苷酸序列和所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
9.一种提高细胞对核苷酸类似物依赖型杀伤的易感性的方法，其特征在于，该方法包括用权利要求8所述的重组表达载体转染所述细胞。
10.权利要求1所述的疱疹病毒胸苷激酶突变体、权利要求7所述的分离的多核苷酸序列或权利要求8所述的重组表达载体在制备通过核苷酸类似物依赖型杀伤作用来起作用的抗肿瘤基因治疗药中的应用。
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