CN1458975A - 基于转座因子的用于检测植物基因组多态性的标志物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种利用转座因子检测植物基因组中多态性的标志物及其制备方法。该方法用于制备检测植物基因组中多态性的标志物，其特征包括利用植物基因组中的转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备用于核酸扩增的引物。

Description

基于转座因子的用于检测植物基因组 多态性的标志物及其制备方法

发明领域

本发明涉及用于检测植物基因组多态性的标志物及其制备方法。

本申请要求2000年8月2日提交的日本专利申请特愿2000-234557号的优先权，该申请的内容已经掺入本文。

背景技术

遗传的多态性

同一物种中不同正常个体之间某些性状或形态存在的多样性称为“多态性(polymorphism)”。特别是，由于遗传差异导致的多态性称为“遗传多态性(genetic polymorphism)”。已有证据表明，天然种群携带众多遗传变异，如涉及染色体结构和功能的、能通过细胞遗传学方法检测的多态性，和涉及特定基因座的等位基因的多态性(生化学辞典，第3版，第835页，1998年10月8日发行，株式会社东京化学同人)。

遗传多态性的一个典型例子可见于异色瓢虫(Harmonia axyridis)的鞘翅斑中，它包括至少4个等位基因。物种中以倒位或其它染色体异常为特征的染色体多态性(chromosome polymorphism)在果蝇(Drosophila)的不同种属内得到深入研究。在各种染色体多态性中，“DNA多态性(DNApolymorphism)”是指在一个氨基酸位点或核苷酸位点发现的变异(岩波生物学辞典，第4版，第81页，1996年3月21日发行，株式会社岩波书店)。

目前已在植物基因组中检测出多种DNA多态性(例如，水稻、小麦、玉米等单子叶植物；拟南芥(Arabidopsis)和烟草等双子叶植物；梨树(pearwood)和日本雪松(Japanese cedar)等木本植物)。例如，利用基于DNA多态性的一种标志物制备了水稻的连锁图谱，并将其用于遗传分析或育种筛选(Harushima等，Genetics 148：pp.479-494，January 1998)。

检测DNA多态性的常规方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)；通过测序进行的直接方法；或涉及用一种识别8-碱基的限制酶进行切割，然后对末端进行放射性标记，用识别6-碱基和4-碱基的限制被切割并通过双向电泳显影的方法(RLGS：限制性地标基因组扫描(Restriction LandmarkGenome Scanning))。AFLP(扩增片段的长度多态性：P.Vos等，Nucleic AcidsRes.，Vol.23，pp.4407-4414(1995))分析也可以用于通过聚合酶链式反应(PCR)扩增/检测RFLP。但每种方法都存在问题，需要另一种能更有效检测多态性的方法。

更具体地，常规方法依赖于通过PCR扩增检测RFLP(将RFLP标志物转换成PCR标志物)或依赖于通过PCR检测微卫星中的多态性(微卫星标志物)，例如以下所述。

(1) 将RFLP标志物转换成PCR标志物

A.基于基因组区域多态性的PCR标志物对应于RFLP探针(D.E.Harry，B.Temesgen，D.B.Neale；Codominant PCR-based markers for Pinus taedadeveloped from mapped cDNA clones，Theor.Appl.Genet.(1998)97：pp.327-336)。

针对RFLP标志物探针序列设计引物，(“RFLP”是用DNA片段作为探针通过Southern分析观察到的一种多态性。用作探针的DNA片段的核苷酸序列称为“RFLP标志物探针序列”)，用该引物进行基因组PCR后，可以通过以下两种方法中的任一种获得PCR标志物。第一种方法涉及用一系列限制酶处理产物，以便找出一种导致片段长度多态性的限制酶，第二种方法设计通过对产物的核苷酸序列进行种间比较，从而找出多态性，并在此多态性基础上获得PCR标志物。

但这种方法的问题是：品种间多态性频率较低，以至于当比较约1000bp的PCR产物时，不仅不能获得RFLP，而且在很多情况下，即使在核苷酸序列水平上也不能发现品种间多态性。针对较长区域的比较是可能的，但工作量更大。

B.基于对导致RFLP的位点的鉴定的PCR标志物

可通过鉴定RFLP标志物探针序列中及其附近(通过在数千碱基以内)的导致RFLP的位点(参与比较的两个品种中，仅由其中一种携带的限制酶识别位点)来获得PCR标志物。

但这种方法的问题是：耗时又耗力，因为要鉴定导致RFLP的位点，必需对包含对应于RFLP标志物探针的基因组区域及其附近区域的基因组克隆进行分离/分析。具体地，需要进行一系列实验，包括筛选基因组文库(杂交)，扩增并分离阳性克隆，制备所分离的克隆的限制酶谱，鉴定导致多态性的限制性位点，设计合适的引物并鉴定多态性，即使每一步进展顺利，大概也需要一个月才能完成。

(2) 微卫星标志物

微卫星是大量出现在基因组中的约2-4个核苷酸的重复序列，如(CA)n。如果存在重复数量的品种间多态性，可以用设计在邻接区域中的引物通过PCR观察到PCR产物长度的多态性，从而检测出DNA多态性。用于通过微卫星检测多态性的标志物称为微卫星标志物(O.Parnaud，X.Chen，S.R.McCouch，Development of microsatellite markers和characterization ofsimple sequence length polymorphism(SSLP)in rice(Oryza sativa L.)，Mol.Gen.Genet.(1996)252：pp.597-607)。

但这种方法的问题是：随机选择的微卫星通常不能显示多态性。而且，仅仅在分析了丙烯酰胺凝胶后才能利用众多微卫星标志物清楚观察到多态性，而所述凝胶分析比常规的琼脂糖凝胶分析复杂得多。

如上所述，用于检测DNA多态性的各种方法都进行了研究，但仍然需要更有效检测多态性的标志物和方法。

转座因子

“转座因子”是“可转座的遗传元件”、“移动性遗传元件”或“移动元件”的同义词，是指具有特定结构、可以在DNA上从一个位点转座至另一个位点的DNA单元。它的两侧通常都是约10-50个碱基对的反向序列，而且它一般在内部包含编码转座酶(即，识别上述末端反向序列以便控制转座反应的酶)的序列。它可以通过转座反应来介导基因组重排，从而仅仅通过插入或切出，或者通过缺失、倒位、重复和重复子融合，使基因失活或改变基因结构。

玉米遗传系统中转座因子的存在已由B.McClintock证实。原核生物中的实例包括插入序列(IS)、携带抗生素抗性基因等的转座子(Tn)、以及溶原性噬菌体如Mu。真核生物中众所周知的实例是玉米中的Ac和Spm，金鱼草(Antirrhinum majus)中的Tam，果蝇中的P元件，以及线虫中的Tc1。

通过转座进行的重组反应以靶位点处数个碱基对的序列的重复为特征，这也可见于真核生物中，逆转录病毒/逆(反)转座子RNA经逆转录产生的cDNA通过整合酶(IN蛋白)的作用而整合的事件中。因此，这些元件也包括在广义上的转座因子中。基于诸如转座子等转座因子的转座能力作为标记进行的基因工程技术已经应用于多种生物系统(岩波生物学辞典第4版，第966-967页，1996年3月21日由株式会社岩波书店发行)。

(1)转座子

广义上的转座因子，或者尤其是在原核生物染色体或质粒上携带标志物基因如抗药基因的那些，都称为“转座子”(Iwanami′s Dictionary of Biology，4th Edition，p.1011，同上)。

根据标志物的来源或类型可以将转座子分为Tn1，Tn2，Tn3...。根据结构特征可以将它们分为：两翼为插入序列或相关序列的那些，以及侧翼仅为反向重复序列的那些。前者的实例包括Tn5和Tn9，后者的实例包括Tn3。Tn5约5.8千个碱基对(bp)长，两端含有互为反向的1533bp插入序列(IS50)，内部含有卡那霉素抗性基因。Tn9在两端含有同向的插入序列(IS1)，内部含有氯霉素抗性基因。这些Tn都带有转座酶，这是一种使它们自身的插入序列转座所必需的酶。Tn3与这些转座子的区别在于，它的每一端都是38bp的反向重复序列，内部是编码其自身转座酶的序列以及氨苄青霉素抗性基因。

一般认为，一旦转座因子插入DNA，这种插入所针对的核苷酸序列在该转座因子以外重复，所重复的核苷酸数目(通常约3-12个碱基对)取决于转座酶的类型。这种靶位点的重复是转座因子整合的特征。

术语“转座子”有时泛指广义上的转座因子，包括下述真核生物中的逆转座子。

(2)逆转座子

将基因组中某一位点上的信息(DNA)转录为RNA，然后通过逆转录酶的作用转为互补DNA，并重新插入基因组中另一位点，这样的DNA统称为“逆转座子”。相反，以DNA的形式转座而无任何中间形式的DNA称为狭义的“转座子”。大多数散在的重复序列都是逆转座子(岩波生物学辞典第4版，第1500页，同上)。

逆转座子主要可分为以下两大类：

(1)病毒型：包括逆转录病毒和由其自身编码逆转录酶的逆转录子(如果蝇中的Copia元件，酵母中的Ty元件和人体中的L1元件)。除了逆转录病毒以外的其它病毒家族中的逆转录子统称为逆转座子，它们的转座事件称为逆转座。

(2)非病毒型：包括由编码蛋白的基因经RNA聚合酶II转录得到mRNA、再经逆转录产生的假基因，核内小分子RNA的假基因，以及由RNA聚合酶III转录的统称为SINE的散布重复序列。SINE包括人类基因组中的Alu家族和众多衍生自tRNA的其它已知实例(P.L.Deininger(1989)，SINEs：Short interspersed repeated DNA elements in higher eukaryotes.In：Mobile DNA(eds.：D.E.Berg和M.M.Howe)，pp.619-636 American Society forMicrobiology，Washington，D.C.)。狭义而言，有时仅非病毒家族的逆转录子称为逆转录子。一般认为逆转录子是不具有功能的寄生元件，但在极少数情况中，逆转录子获得功能，或者通过逆转座产生新的基因。

另有报道称植物中存在多种转座因子。在此根据日本人大坪的分类法，将植物转座因子分为I类和II类(Cell Technology，Supplementary Volume，Plant Cell Technology Series 5，Plant Genome Science，pp.102-113，publishedon October 1，1996 by Shujunsha Co.Ltd.)。I类由通过RNA中间体转座的逆转录子组成，包括逆转座子、LINE和SINE。II类由以DNA形式转座但不形成任何中间体的转座子组成，包括Ac/Ds、En/Spm和Mu。最近从植物基因组中发现的称为MITE(微小反向重复转座因子)的新转座子为方便起见，也归类在II类中，但它们的转座机制尚不明了。

MITE的结构特征在于，它们相对较短(至多约400bp)、不编码任何基因、每一末端都有反向重复序列、可能具有DNA的二级结构、以及每种MITE元件具有特异性的靶序列(S.R.Wessler等，Current Opinion in Genetics& Development 1995，Vol.5，pp.814-821)。据推测，每种MITE元件在整个植物基因组中大量出现。例如，属于Stowaway的Tnrl在水稻基因组中有大约3500个拷贝(T.Tenzen等，Mol Gen Genet(1994)Vol.245：pp.441-448)。属于Tourist的B2和Hbr元件在玉米中分别约有至少10,000个拷贝(S.R.Wessler等，Current Opinion in Genetics & Development 1995，Vol.5，pp.814-821)。

植物转座因子可见于水稻，玉米，烟草等。特别是在水稻中，已知的逆转座子有Tos(H.Hirochika等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)Vol.93，pp.7783-7788)，RIRE1(K.Noma等，Genes Genet.Syst.(1997)Vol.72PP.131-140)，RIRE2(H.Ohtsubo等，Genes Genet.Syst.(1999)Vol.74 pp.83-91)，以及SINE如p-SINE1(K.Mochizuki等，Jpn.J.Genet.(1992)57，pp.155-166)。在II类中，已知有属于En/Spm的Tnr3(R.Motohashi等，Mol GenGenet(1996)Vol.250，pp.148-152)和MITE。最近，W.-Y.Song等人(Mol GenGenet(1998)Vol.258：449-456)发现了新的II类元件，如Krispie，Snap，Crackle，Pop和Truncator。

已知的MITE包括Gaijin，Castaway，Ditto，Wanderer和Explorer(T.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，PP.8524-8529，August 1996)，Tourist(T.E.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)Vol.91，pp.1411-1415)，Stowaway(T.E.Bureau等，The Plant Cell(1994)Vol.6，pp.907-916)，Amy/LTP(N.Huang等，Gene(1992)Vol.111，pp.223-228，F.Vignols等，Gene(1994)Vol.142，pp.265-270，T.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，pp.8524-8529，August 1996)，Tnr2(K.Mochizuki等，Jpn.J.Genet.(1993)Vol.68，pp.205-217)等。

本发明的转座因子不限于上述所列已知转座因子。

上文中提到的K.Mochizuki等，Jpn.J.Genet.(1992)57，pp.155-166的文章指出，在p-SINEL1，重复序列比单一序列更容易发生突变碱基的取代。但是，他们既没有具体讨论转座因子与多态性之间的联系，也没有提到转座因子可作为检测多态性的标志物来应用。

发明公开

本发明的目的是提供制备用于检测植物基因组多态性的标志物的方法。本发明的方法的特征为，包括利用植物基因组中转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备用于核酸扩增的引物。

在一个实施方案中，本发明的方法包括：

i)基于目标植物的基因组中转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备一对引物，用于扩增上述转座因子，或该转座因子及其邻接区域；

ii)以目标植物基因组DNA为模板进行核酸扩增反应；和

iii)基于在上述核酸扩增产物中发现的多肽性，制备检测植物基因组多态性的标志物。

本发明的另一目的是提供一种以本发明的方法制备的检测植物基因组多态性的标志物。

附图说明

图1显示用于扩增Gaijin区的引物序列。

图2显示Gaijin 1区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Gaijin-Os1序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。

图3显示Gaijin 2区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Gaijin-Os2序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图4显示Gaijin 3区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Gaijin-Os3序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图5显示作为检测Gaijin区中多态性的(PCR)标志物的引物序列。

图6显示用于扩增Wanderer区的引物序列。

图7显示Wanderer 1区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Wanderer-Os1序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图8显示Wanderer 2区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Wanderer-Os2序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。

图9显示Wanderer 3区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Wanderer-Os3序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图10显示Wanderer 4区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Wanderer-Os4序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图11显示作为检测Wanderer区中多态性的(PCR)标志物的引物序列。

图12显示用于扩增Castaway区的引物序列。

图13显示Castaway 1区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Castaway-Os1序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图14显示Castaway 2区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Wanderer-Os2序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。其后的大写字母指示另一转座因子Explorer-Os2。

图15显示作为检测Castaway区中多态性所用的(PCR)标志物的引物序列。

图16显示用于扩增Diito区的引物序列。

图17显示Ditto 1区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Ditto-Os1序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。其后的大写字母指示另一转座因子Explorer-Os1。

图18显示Ditto 2区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示Ditto-Os2序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。

图19显示p-SINE-r1区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r1序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。单下划线指示正向重复序列。

图20显示p-SINE-r2区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r2序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。单下划线指示正向重复序列。

图21显示p-SINE-r3区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r3序列及其邻接序列。单下划线指示正向重复序列。

图22显示p-SINE-r4区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r4序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。单下划线指示正向重复序列。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图23显示p-SINE-r5区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r5序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。单下划线指示正向重复序列。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图24显示p-SINE-r6区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r6序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。单下划线指示正向重复序列。

图25显示p-SINE-r7区核苷酸序列的种间比较。大写字母和小写字母分别指示p-SINE-r7序列及其邻接序列。空格指示不同于Asominori序列的多态性位点。单下划线指示正向重复序列。双下划线指示用于制备PCR标志物的多态性。

图26显示作为检测p-SINE区中多态性的(PCR)标志物的引物序列。

发明详述

为解决上述问题，我们进行了深入研究，结果发现在植物基因组的转座因子中或其附近以(极高)频率出现遗传多态性，基于这一点完成了本发明。

因此，本发明涉及制备用于检测植物基因组多态性的标志物的方法，其特征为，该方法包括利用植物基因组转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备核酸扩增的引物。优选地，本发明的方法包括：

i)基于目标植物基因组中转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备一对引物，用来扩增上述转座因子，或该转座因子及其邻接区域；

ii)以目标植物基因组DNA为模板进行核酸扩增反应；和

iii)基于在上述核酸扩增产物中发现的多态性，制备用于检测植物基因组多态性的标志物。

本发明的目标植物种类没有特别的限定，但优选单子叶植物如水稻，玉米和大麦。特别优选水稻。

转座因子

在本发明制备用于检测植物基因组DNA多态性的标志物的方法中，首先根据已知转座因子的序列信息，通过对基因库进行Southern杂交筛选和测序或在数据库中查找，而确定了目标植物基因组的转座因子及其邻接区域的核苷酸序列。

转座因子通过生物进化过程的多次转座而增加了拷贝数，而核苷酸序列的变异在每个拷贝的内部序列中积累。因此，具有高度同源的核苷酸序列的转座因子可被认为是同源的，甚至那些同源性较低的转座因子只要具有同类转座因子的特征，也被认为是同源的。例如，MITE的特征在于末端反向序列，目标序列，假定的二级结构和全长等(T.E.Bureau等，The PlantCell，Vol.6，907-916 1994，T.E.Bureau等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA Vol.91，pp.1411-1415，1994)。

植物基因组文库可以通过已知方法制备，例如参见Maniatis，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd Edition，1989。或者，可购买植物基因组文库商品(例如，CLONTECH的水水稻基因组文库，STRATAGENE的玉米基因组文库，等)。

多种植物基因组序列和转座因子序列已被登记在数据库中，本领域技术人员可以通过在这些数据库中检索，来寻找/选择可用于检测多态性的转座因子。可用的数据库包括，但不限于，GenBank，EMBL等。

本文中，如本领域技术人员通常理解的那样，术语“转座因子”是指具有特定结构、能在DNA上从一个座位转位至另一座位的DNA单元。因此，“转座因子”还包括经由RNA中间体转座的逆转录子如逆转座子，LINE，SINE；以DNA形式转座、不形成任何中间体的转座子；和，最近发现的、称为MITE(微小反向重复转座因子)的新的植物转座子。

本发明利用植物基因组中的转座因子来检测植物基因组中的多态性。在众多植物基因组转座因子中，最便于利用的是那些属于MITE(微小反向重复转座因子)或SINE(短型散布状核元件)的转座因子，因为它们的结构相对较短，但不限于此。

属于MITE的已知转座因子包括，例如，水稻中的转座因子、Gaijin，Castaway，Ditto，Wanderer，Explorer，Stowaway，Tourist和Tnr2等。在下述实施例中，针对Gaijin(Gaijin-Os1，2，3)，Castaway(Castaway-Os1，2)，Ditto(Ditto-1，2)和Wanderer(Wanderer-Os1，2，3，4)的邻接区设计引物，以水稻品种Asominori，IR24和Kasalath的总DNA为模板，进行PCR。对扩增产物核苷酸序列的种间比较显示，每种转座因子序列及其邻接区以极高频率出现多态性。MITE似乎大量存在于整个水稻基因组中，因此它们可用于产生覆盖整个水稻基因组的众多标志物。

这些转座因子中，Castaway也可见于玉米中(T.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，pp.8524-8529，August 1996)，Tourist也可见于玉米、高梁和大麦中(T.E.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)Vol.91，pp.1411-1415)，Stowaway可见于禾本科植物以及双子叶植物(T.E.Bureau等，The Plant Cell(1994)Vol.6，pp.907-916)。因此，很容易推测，MITE不仅在水稻中而且在其它植物中都以极高频率显示多态性。

属于SINE的已知转座因子包括，例如，水稻中的p-SINE1(K.Mochizukiet al.，同上)。在以下实施例中，用Mochizuki(1992)等人用于扩增p-SINE1序列及其周边区域的引物，对水稻转座因子p-SINE1(p-SINE1-r1，r2，r3，r4，r5，r6和r7)实施了类似于上述对MITE的实验。结果表明，不同p-SINE1元件之间的种间多态性频率有差异，其中的一些不表现出种间多态性，但总体上表明，这些区域比对应于RFLP标志物探针的基因组区域更富有多态性。

在整个水稻基因组中有多达大约4500个拷贝的p-SINE1(大坪：CellTechnology，Supplementary Volume，Plant Cell Technology Series 5，PlantGenome Science，第102-113页，1996年10月1日由株式会社秀润社发行)，这表明，这些元件可用于制备对应于整个水稻基因组的多种标志物。

根据GenBank数据库的信息，SINE也可见于烟草和十字花科植物。因此，推测SINE不仅在水稻中而且在其它植物中都表现多态性。

II类中不属于MITE的转座子包括Ac/Ds，En/Spm和Mu，它们可见于多种植物。例如，在水稻中，已知属于En/Spm的Tnr3，最近还发现了诸如Krispie，Snap，Crackle，Pop和Truncator(W.-Y.Song等，Mol Gen Genet(1998)Vol.258：449-456)新因子。I类中不属于SINE的逆转录子也可见于多种植物中。例如，在水稻中，已知RIRE1和RERE3。它们有时带有内部基因编码序列，但在非编码区可能富含与MITE和SINE相同的DNA多态性。由于它们的结构相对较长，它们不象MITE那样便于用来制备标志物，但可以按照下文实施例2中针对Wanderer-Os3的方法转变成标志物。

正如本发明所发现的，种间多态性的频率取决于转座因子的类型。因此，通过适当选择所用的转座因子可以更有效地制备PCR标志物。

本文中，对转座因子的“邻接区”无特别限制，但转座因子区域的长度、所用的核酸扩增反应的类型等可能不同。在本发明中，根据在植物基因组中DNA多态性频繁出现在转座因子附近这一事实，通过制备必需能扩增包含转座因子或同时包含转座因子及其邻接区的核酸的核酸扩增引物对，可以提供用于检测多态性的标志物。因此，优选引物对的间距中适于根据所用核酸扩增反应类型扩增核酸的长度之内。

本文中，转座因子的“邻接区”是指包含转座因子或包含转座因子及其邻接区这两者、处在适于核酸扩增的距离之内的区域。包含转座因子及其邻接区的区域优选在约50-3000个碱基的范围内，更优选约50-2000个碱基的范围内，还更优选约100-1000个碱基的范围内，但不限于此。邻接区优选在转座因子的5′侧或3′侧约0-3000个碱基的范围内，更优选在约0-2000个碱基的范围内，还更优选在约0-1000个碱基的范围内，但不限于此。

核酸扩增

本发明中，优选根据所确定的目标植物基因组中转座因子及其邻接区的核苷酸序列，制备用于扩增所述转座因子或转座因子及其邻接区的引物对。然后，以所述目标植物的基因组DNA为模板，用所述引物对进行核酸扩增。

核酸扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)(Saiki等，1985，Science 230，pp.1350-1354)。

可以根据转座因子及其邻接区的核苷酸序列，用任何已知方法制备用于核酸扩增的引物对。具体地，可基于转座因子和/或其邻接区的碱基序列，用以下举例的方法制备引物对，包括制备单链DNA，使其具有与转座因子或其邻接区的核苷酸序列相同或互补的核苷酸序列，必要时，包括制备包含修饰的单链DNA，所述修饰不影响转座因子或其邻接区的核苷酸序列的结合特异性，只要符合下列条件：

1)每一引物长15-30个碱基；

2)每一引物的碱基序列中G+C含量为30-70％；

3)每一引物的碱基序列中，A，T，G和C的分布并非过度不均匀；

4)用所述引物对扩增的核酸产物长度为50-3000个碱基，优选100-2000个碱基；及

5)每一引物自身或引物相互间在碱基序列中不包含互补序列。

基因组中不同转座因子的拷贝数各不相同，但总会在基因组中出现多个拷贝数。设计在转座因子内的引物对似乎更易于生成与多态性无关的不想要的扩增产物。因此，优选将引物对设计在包含多态性的转座因子的邻接区中。

但某些情况下可以将引物设计在转座因子区域中，例如：转座因子区太长，以致于不能仅仅将引物设计在转座因子以外；或者不能有效扩增核酸；或者多态性仅出现在转座因子内部；以及多态性被用于设计检测该多态性的错配引物。既便是在这些情况下，也可以根据需要，利用设计在转座因子区内部的引物，通过核酸扩增反应来检测多态性。例如，在实施例2中Wanderer-Os3的情况中，其中一个引物(SEQ ID NO：42)的靶位点完全由转座因子组成(图9)，但它可以作为标志物应用在核酸扩增反应中，没有任何问题。

对核酸扩增反应的方法和条件没有特别限制，都是本领域技术人员已知的。可以由本领域技术人员根据多种因素来选择适当的条件，这些因素包括转座因子或其邻接区的核苷酸序列、引物对的核苷酸序列和长度，等。通常，当引物对较长，或G+C含量较高，或A，T，G和C的分布较均匀，或基因组中转座因子的拷贝数较多时，可以在较严格的条件(在较高温度进行退火反应和核酸延伸反应，并进行较少的循环)下进行核酸扩增反应。应用较严格的条件可以使扩增反应具有较高特异性。

扩增反应优选，但不限于，包括90-95℃变性30秒-2分钟，55-65℃退火30秒-2分钟和70-75℃延伸30秒-2分钟，共25-40个循环，更优选94℃变性1分钟，58℃退火1分钟和72℃延伸2分钟，共30个循环。

制备用于检测多态性的标志物

在用引物对经核酸扩增反应得到扩增产物，并检验出其中是否存在多态性之后，根据所发现的多态性制备用于检测该多态性的标志物。可以在扩增产物中检测到的多态性的非限制性实例如下。

a)上述核酸扩增产物中的多态性包括带有缺失区的类型

在这种情况中，制备位于所述缺失区两侧的核酸扩增引物对来制备用于检测多态性的标志物。所述引物对的制备可以按照上述检测多态性的步骤i)的方法来进行。步骤i)中所用引物对也可以直接用作检测所述多态性的标志物。

如果缺失区足够大，可以通过扩增产物在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳的泳动性能差异来检测多态性。如果是琼脂糖凝胶电泳，当碱基对数量差异至少为约5％时，可以检测多态性；如果是聚丙烯酰胺凝胶电泳，当长度差异至少为约1个碱基时，可以检测多态性。或者，可以用具有与除该缺失区以外的核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸或DNA片段作为分析探针，通过其与上述核酸扩增产物的杂交来检测多态性。或者，可以在必要时，通过测定上述扩增产物的核苷酸序列来证实多态性。本领域技术人员可以根据需要适当采用已知用于核酸电泳、杂交、测序等的技术。

在这种情况中，扩增产物长度的差异直接反映多态性，基于此的多态性检测标志物被称为ALP(扩增子长度多态性)标志物。如实施例1中的Gaijin-Os1区，实施例2中的Wanderer-Os2区和实施例4中的Ditto-Os2区。在这些情况中，步骤i)所采用的扩增引物对直接用作了检测多态性的标志物。

b)核酸扩增产物中的多态性包括导致限制酶识别差异的碱基取代

在这种情况中，制备位于所述取代位点两侧的核酸扩增引物对来制备用于检测多态性的标志物。所述引物对的制备可以按照上述检测多态性的步骤i)的方法来进行。步骤i)中所用引物对也可以直接用作检测所述多态性的标志物。

在这种情况下，在核酸扩增产物的多态性中出现了导致限制酶识别差异的碱基取代，即所述核酸扩增产物可以或不可以被一或多种特异性限制酶切割。这样一来，可以将扩增产物用限制酶处理并在琼脂糖凝胶上电泳，以便根据泳动性的差异来检测多态性。必要时，可通过测定扩增产物的核苷酸序列来证实多态性。

在这种情况下，PCR等方法所得扩增产物的限制性片段长度的差异可以反映多态性，基于这一点的多态性检测标志物被称为PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)标志物或CAPS(切割扩增多态性序列)标志物(A.Konieczny，F.M.Ausubel，A procedure for mapping Arabidopsis mutations usingco-dominant ecotype-specific PCR-based markers，(1993)，Plant J.4(2)pp.403-410)。如，实施例1中的Gaijin-Os3区，实施例2中的Wanderer-Os1区和-Os4区，实施例3中的Castaway-Os2区，实施例4中的Ditto-Os1区，以及实施例5中的p-SINE1-r5区和-r7区。其中，对实施例4的Ditto-Os1区而言，步骤i)所用扩增引物对被直接用作多态性检测的标志物。

即便可以如以上a)所述，利用核酸扩增产物的长度来检测多态性，在某些情况(如实施例2的Wanderer-Os2区)下，与限制酶处理相结合更易于检测多态性。

c)核酸扩增产物中的多态性包括未导致限制酶识别差异的碱基取代。

在这种情况下，制备错配引入型引物对用作多态性检测的标志物，所述引物对包括碱基取代位点，并将核酸扩增产物中包含所述碱基取代位点的区域修饰为导致限制酶识别差异的碱基序列。

具体地，可以按照上文中检测多态性的步骤i)所述来制备该引物对。但是，步骤i)所用的引物对导致核酸扩增产物的多态性而非限制酶识别的差异，因此，在两引物之一或两者中引入错配，以便将核酸扩增产物中包含碱基取代位点(多态性)的区域修饰为导致限制酶识别差异的碱基序列。可以使用Mikaelian等，Nucl.Acids.Res.20：376.1992所述方法，作为通过PCR引入位点特异性突变，从而取代、缺失或添加特定核苷酸的标准技术。用错配引入型引物对作为多态性检测标志物得到的扩增产物可以或者不可以用一或多种特异性限制酶切割，因为它的错配引入位点存在限制酶识别差异。这样一来，如上文b)所述，扩增产物可以用限制酶处理并在琼脂糖凝胶上电泳，以便根据泳动性的差异来检测多态性。

错配的引入必需是，既不影响引物与植物基因组标靶的结合，也不影响多态性碱基取代。多态性碱基取代被用来在其附近引入错配，从而通过碱基取代和错配的共同作用导致限制酶识别差异。用于引入这种错配的方法是本领域已知的，例如，可参见Michaels，S.D.和Amasino，R.M.(1998)，Neff，M.M.，Neff，J.D.，Chory，J.和Pepper，A.E.(1998)的详述。

这种情况中的标志物是对上文b)中所述CAPS标志物的改进，它们被称为dCAPS(衍生的CAPS)标志物。如，实施例1中的Gaijin-Os2区，实施例2中的Wanderer-Os3区，实施例3中的Castaway-Os1区和实施例5中的p-SINE1-r4区。

如果上述b)或c)的情况中，有很多额外的限制性位点与种间多态性无关，可能就难以根据多态性来鉴定限制性位点识别中的任何差异。这时，可以视情况不同而在引物中引入错配，从而去掉不必要的限制性位点。例如，在实施例2的Wanderer-Os3区域中，在5′-引物中引入错配，从而去掉了与多态性无关的MseI位点。

多态性检测的标志物

本发明还提供了用上述方法制备的检测植物基因组中多态性所用的标志物。根据本发明的方法，可以制备广泛多种检测植物基因组多态性的标志物。因此，由本发明方法制备的标志物并无特别限制。

在以下的非限制性实例中，水稻的属于MITE或SINE类的多种转座因子常常出现多态性。因此利用这些转座因子的水稻多态性检测标志物也包括在本发明的范围内。具有本文序列表中SEQ ID NOs：1-2，16-19，22-23，40-45，48-49，56-57，58-61和95-100的具体序列的引物，经证实可以用作后文实施例中检测水稻多态性所用的标志物，它们也作为例子包括在本发明的范围内。

如上所述，本发明总体上为利用转座因子有效检测多态性和制备标志物提供了可能性。通过选用特定的转座因子可以更有效地制备PCR标志物，因为种间多态性的频率取决于转座因子的类型。

用本发明所得标志物检测多态性的方法相比于传统的多态性检测方法有显著的优势。具体地，核苷酸序列中的种间多态性频率，比利用基于基因组区(其对应于RFLP探针)多态性的标志物进行PCR所得频率更高。因此，可以以更高频率制备标志物，而且相应地，可以有效制备标志物。与基于RFLP引发位点的鉴定的PCR标志物相反，通过利用数据库中已有的多种转座因子，可以省去正如基因组文库筛选和所分离的克隆的分析等复杂步骤。因此，可以通过大大减少用于开发标志物的时间/劳动而有效地制备标志物(如果一切顺利，需约1周的时间)。与微卫星标志物不同的是，可以通过琼脂糖凝胶电泳而用PCR标志物检测多态性，这比聚丙烯酰胺电泳更易于操作，而且核苷酸序列中的种间多态性频率较高。如此一来，可以制备适于在琼脂糖凝胶上检测多态性的简易(easy-to-use)PCR标志物，而且由于能够以更高频率产生这些标志物，使得它们的制备方法更有效。

实施例

以下实施例进一步描述了本发明，但不视为对本发明技术范围的限制。本领域技术人员可以很容易地根据本说明书的描述对本发明进行改动，这些改动都包括在本发明是技术范围内。

实施例1：利用Gaijin开发标志物

材料与方法

Gaijin-Os1，2和3是提交到数据库(GenBank)中的OS4CL(X52623)，RICCBP3(D10985)和RICAP(D32165)基因中的Gaijin-Os转座因子(Bureau等1996)。

如图1所示设计用于扩增Gaijin-Os序列及其邻接区域的引物对(SEQID NOs：1-6)。这些引物对用于以水稻品种Asominori，Kasalath和IR24的基因组DNA为模板进行PCR反应(94℃1分钟，58℃1分钟和72℃2分钟，30个循环)。对PCR产物进行电泳，用QIAEXII(QIAGEN)回收所需DNA片段。用所回收的DNA为模板，在dRhodamine Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(ABI)上进行测序反应，在ABI Model 310上测出核苷酸序列。

结果和讨论

上述品种的PCR产物的核苷酸序列对比结果见图2-图4和SEQ ID NOs：7-15。图2(SEQ ID NOs：7-9)显示Gaijin-Os1区，图3(SEQ ID NOs：10-12)显示Gaijin-Os2区，图4(SEQ ID NOs：13-15)显示Gaijin-Os3区。在图2-图4的每张图中，5’引物和3’引物的序列都以相同于以下实施例中各种扩增引物对的方式置于图2-图4中所示序列的5’侧和3’侧。

1)Gaijin-Os1区

当使用针对Gaijin-Os1的引物(SEQ ID NOs：1和2)时，在Asominori与Kasalath或IR24之间观察到PCR产物长度的多态性。具体地，Asominori的PCR产物长度为434个碱基对(不包括引物区)，Kasalath和IR24的分别为278个碱基对和277个碱基对，见图2。这表明，Kasalath和IR24由于不合有Gajjin-Os1，而与Asominori出现多态性。这种基于PCR产物长度差异的多态性被用作ALP(扩增子长度多态性)标志物。在Asominori-IR24的71例RIL(重组近交系)中为该标志物作图，结果表明OS4CL(Gaijin-Os1)基因座位于8号染色体上。

当使用针对Gaijin-Os2和Gaijin-Os3的引物(分别为SEQ ID NOs：3-4和5-6)时，未观察到PCR产物长度中的多态性，但在核苷酸序列水平上显示多态性。比较Gaijin-Os序列与其邻接区之间的多态性频率，发现前者有频率较高的倾向。但是，Gaijin-Os邻接区中的多态性频率倾向于比对应于常规RFLP标志物的基因组序列中的更高，这提示转座因子的邻接区可能存在多处种间差异。

2)Gaijin-Os2区

在Gaijin-Os2区的情况中，基于Asominori与Kasalath或IR24之间的多态性，用dCAPS(衍生的切割扩增多态性序列)方法(Michaels和Amasino1998；Neff等1998)制备多态性检测的标志物。

具体地，Asominori的Gaijin-Os2区中第136位核苷酸是″C″，而Kasalath和IR24的相应位点上是″T″，参见图3(除非特别说明，本实施例中以下所称核苷酸编号是指Asominori中的编号)。据此制备图5A所示的引物(SEQ IDNOs：16和17)作为多态性检测的标志物，来进行PCR(PCR条件为：94℃30秒，58℃30秒和72℃30秒，共35循环)。SEQ ID NOs：16和17的序列分别对应于图3所示Asominori序列(SEQ ID NO：10)中的核苷酸编号负10-16和138-161，但3’引物(其具有核苷酸序列SEQ ID NO：17)被设计成：将第143-144位的核苷酸″ta″取代为″gt″。当用这种多态性检测标志物作为引物时，扩增得到图3中负10-161的序列(SEQ ID NOs：10-12)，但3’-引物所致取代仅在Asominori中得到序列″CACNNNNGTG″，在Kasalath和IR24中得到序列″TACNNNNGTG″。序列″CACNNNNGTG″由限制酶MslI识别。因此，当用这种酶处理扩增产物时，仅Asominori的Gaijin-Os2区的扩增产物被切割，Kasalath和IR24的扩增产物不被切割。这一点可以用来检测多态性。

3)Gaijin-Os3区

在Gaijin-Os3区的情况中，用常规CAPS方法制备了多态性检测的标志物。具体是，Asominori的Gaijin-Os3区的第355-358位核苷酸是″T TAA″，而Kasalath和IR24的相应位点上是″T CAA″，见图4。据此制备图5B所示的引物(SEQ ID NOs：18和19)作为检测多态性的标志物来进行PCR(PCR条件为：94℃30秒，58℃30秒和72℃30秒，共35循环)。SEQ ID NOs：18和19的序列分别对应于图4所示Asominori序列(SEQ ID NO：13)中的核苷酸编号212-235和416-439，这种多态性检测标志物被用作引物，以便扩增图4中212-439的序列(SEQ ID NOs：13-15)。Asominori中第355-358位的序列″TTAA″由限制酶MseI识别。对应于Asominori中第401-404位的核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″TTAA″。因此，当用这种酶处理扩增产物时，Asominori的Gaijin-Os3区的扩增产物在两处位点被切割(355-358和401-404)，Kasalath和IR24的扩增产物仅在一个位点被切割(401-404)。

在Asominori-IR24的71例RIL(重组近交系)中作图，结果表明RICCBP3(Gaijin-Os2)基因座和RICAP(Gaijin-Os3)基因座分别位于2号和5号染色体上。

实施例2：利用Wanderer开发标志物

材料与方法

Wanderer-Os 1，2，3和4是提交到数据库(GenBank)中的RIC3H3M(L28995)，RIC3H3M(L28995)，RICGLUTE(D00584)和OSALAM(X16509，S50948)基因中的Wanderer-Os转座因子(Bureau等1996)。

如图6所示设计用于扩增Wanderer-Os序列及其邻接区域的引物对(SEQ ID NOs：20-27)。这些引物对用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因组DNA为模板进行PCR，按照实施例1对Gaijin区的方式测定核苷酸序列。

结果和讨论

上述品种的PCR产物的核苷酸序列对比结果见图7-图10和SEQ IDNOs：28-39。图7(SEQ ID NOs：28-30)显示Wanderer-Os1区，图8(SEQ IDNOs：31-33)显示Wanderer-Os2区，图9(SEQ ID NOs：34-36)显示Wanderer-Os3区，图10(SEQ ID NOs：37-39)显示Wanderer-Os4区。

1)Wandere-Os2区

当使用针对Wanderer-Os2的引物时，在Asominori与Kasalath或IR24之间观察到PCR产物长度的多态性。具体地，Asominori的PCR产物长度为320个碱基对(不包括引物区)，Kasalath和IR24的分别为298个碱基对和297个碱基对，见图8。这表明，由于Kasalath和IR24缺失Wanderer-Os2的一部分而产生了多态性。

在Wanderer-Os2的情况中，仅通过PCR产物长度的差异就能检测多态性，但可以通过与限制酶处理(CAPS)相结合，使多态性的检测更便利。具体地，Kasalath的第114-199位核苷酸的序列以及IR24的第113-118位相关序列是″TTTAAA″，它可以被限制酶DraI切割。但Asominori的相关序列(第136-141位核苷酸)是″TGAAAA″，它不能被DraI切割。因此，用DraI处理Wanderer-Os2区的扩增产物，仅Kasalath和IR24的扩增产物可被切割，Asominori的扩增产物不被切割。

这种基于Wanderer-Os2的PCR产物长度差异的多态性可以用作ALP标志物。在Asominori-IR24的71例RIL中为该标志物作图，结果表明RIC3H3M(Wandere-Os2)基因座位于2号染色体上。

当使用针对Wanderer-Os1，Wanderer-Os3和Wanderer-Os4的引物时，未观察到PCR产物长度中的多态性，但在核苷酸序列水平上显示多态性。比较Wanderer-Os序列与其邻接区之间的多态性频率，发现前者有频率较高的倾向。但是，即使在Wanderer-Os邻接区中的多态性频率也倾向于比对应于常规RFLP标志物的基因组序列中的更高，这提示转座因子的邻接区可能存在多处种间差异。

2)Wanderer-Os1区

在Wanderer-Os1区的情况中，用常规CAPS方法制备了多态性检测的标志物。具体是，Asominori的Wanderer-Os1区的第226-231位核苷酸是″TT TAAA″，而Kasalath和IR24的相应位点上是″TT CAAA″，见图7。据此制备图11A所示的引物(SEQ ID NOs：40和41)作为检测多态性的标志物，按照实施例1的方法进行PCR。SEQ ID NOs：40和41的序列分别对应于图7所示Asominori序列(SEQ ID NO：28)中的核苷酸编号42-65和300-323，这种多态性检测标志物被用作引物，以便扩增图7中42-323的序列(SEQ IDNOs：28-30)。Asominori中第226-231位的序列″TTTAAA″由限制酶DraI识别。对应于Asominori中第197-202位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″TTTAAA″。因此，当用这种限制酶处理扩增产物时，Asominori的Wanderer-Os1区的扩增产物在两处位点被切割(226-231和197-202)，Kasalath和IR24的扩增产物仅在一个位点被切割(197-202)。

3)Wanderer-Os3区

在Wanderer-Os3区的情况中，用dCAPS方法，按照对Gaijin-Os2区的相同方式，基于Asominori与Kasalath或IR24之间的多态性，来制备多态性检测的标志物。

具体是，Asominori的Wanderer-Os3区的第206位核苷酸是″A″，而Kasalath和IR24的相应位点上是″T″，见图9。据此制备图11B所示的引物(SEQ ID NOs：42和43)作为检测多态性的标志物，按照上述方式进行PCR。SEQ ID NOs：42和43的序列分别对应于图9所示Asominori序列(SEQ IDNO：34)中的核苷酸177-205和269-292，但5’引物(其具有核苷酸序列SEQ IDNO：42)被设计成：将第203位的核苷酸″A″取代为″T″。当采用这种多态性检测标志物作为引物时，扩增得到图9中177-292的序列(SEQ ID NOs：34-36)，但5’-引物所致取代仅在Asominori中第203-206位得到序列″TTAA″，在Kasalath和IR24中得到序列″TTAT″。序列″TTAA″由限制酶MseI识别。5’引物(SEQ ID NO：42)还使185位的核苷酸由“T”变为“A”，并使192位的核苷酸由“A”变为“T”。这些都是特别引入的错配，它们除去了扩增区中除203-203位点以外的其它“TTAA”位点。因此，当用MseI处理扩增产物时，仅Asominori的Wanderer-Os3区的扩增产物被切割，Kasalath和IR24的扩增产物不被切割。这一点可以用来检测多态性。

4)Wanderer-Os4区

在Wanderer-Os4区的情况中，用常规CAPS方法制备多态性检测的标志物。具体是，Asominori的Wanderer-Os4区的第284-294位核苷酸是″ Gctctgtgtgc″，而Kasalath和IR24的相应位点上的核苷酸序列是″ Actctgtgtgc″，见图10。据此制备图11C所示的引物(SEQ ID NOs：44和45)作为检测多态性的标志物，按照实施例1的方法进行PCR。SEQ ID NOs：44和45的序列分别对应于图10所示Asominori序列(SEQ ID NO：37)中的核苷酸52-75和348-371，这种多态性检测标志物被用作引物，以便扩增图10中52-371的序列(SEQ ID NOs：37-39)。Asominori中第284-294位的序列″ Gctctgtgtgc″由限制酶MwoI识别(它识别″ GCNNNNNNN GC″)。对应于Asominori中第235-245位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″ GCTCGTTTT GC″。因此，当用这种限制酶处理扩增产物时，Asominori的Wanderer-Os1区的扩增产物在两处位点被切割(284-294和235-245)，Kasalath和IR24的扩增产物仅在一个位点被切割(235-245)。

在Asominori-IR24的71例RIL中作图，结果表明RIC3H3M(Wanderer-Os1)，RICGLUTE(Wanderer-Os3)和OSALAM(Wanderer-Os4)基因座分别位于2、10和2号染色体上。

实施例3：利用Castaway开发标志物

材料与方法

Castaway-Os1和2是提交到数据库(GenBank)中的OSSALT(Z25811)和RICRTH(D26547)基因中的Castaway-Os转座因子(Bureau等1996)。

如图12所示设计用于扩增Castaway-Os序列及其邻接区域的引物对(SEQ ID NOs：46-49)。这些引物对用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因组DNA为模板进行PCR反应，按照实施例1所述测定核苷酸序列。

结果和讨论

上述品种的PCR产物的核苷酸序列对比结果见图13-图14和SEQ IDNOs：50-55。图13(SEQ ID NOs：50-52)显示Castaway-Os1区，图14(SEQ IDNOs：53-55)显示Castaway-Os2区。

研究表明，Castaway-Os1仅存在于Kasalath中，但Asominori与IR24之间的多态性也存在于其周边区。当使用针对Castaway-Os2的引物时，未发现PCR产物长度的多态性，但核苷酸序列水平上显示多态性。多态性的频率倾向于比对应于常规RFLP标志物的基因组序列中的更高，这提示转座因子及其邻接区可能存在多处种间差异。

1)Castaway-Os1区

在Castaway-Os1区的情况中，用dCAPS方法，基于Asominori与IR24之间的多态性，来制备多态性检测的标志物。

具体是，Asominori和Kasalath的Castaway-Os1区的第205位核苷酸是″A″，而IR24的相应位点上是″C″，见图13。据此制备图15所示的引物(SEQID NOs：56和57)作为检测多态性的标志物，按照上述方式进行PCR。SEQ IDNOs：56和57的序列分别对应于图13所示Asominori序列(SEQ ID NO：50)中的核苷酸102-125和209-234，但3’引物(其具有核苷酸序列SEQ ID NO：42)被设计成：将第214位的″a″取代为″g″。当采用这种多态性检测标志物作为引物时，扩增得到图13中102-234的序列(SEQ ID NOs：50-52)，但3’-引物所致取代仅在IR24中第204-214位得到序列″cccatgcatgg″，在Kasalath和Asominori中得到序列″cacatgcatgg″。序列″ CCNNNNNNN GG″由限制酶BslI识别。对应于Asominori中第121-131位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″ ccaaggctt gg″。因此，当用限制酶BslI处理扩增产物时，IR24的Castaway-Os1区的扩增产物在两处位点被切割(204-214和121-131)，Kasalath和Asominori的扩增产物仅在一个位点被切割(121-131)。

2)Castaway-Os2区

在Castaway-Os2区的情况中，用常规CAPS方法制备多态性检测的标志物。具体是，Asominori的Castaway-Os2区的第355-365位核苷酸是″C TTTTGCTTGG″，而Kasalath和IR24的相应位点上的核苷酸序列是″C CTTTGCTTGG″，见图14。据此制备图12B所示的引物(SEQ ID NOs：48和49)作为检测多态性的标志物，按照实施例1的方法进行PCR。对应于Asominori中第355-365位核苷酸的Kasalath和IR24序列″C CTTTGCTTGG″由限制酶BslI识别(它识别″ CCNNNNNNN GG″)。因此，当用这种限制酶处理扩增产物时，Kasalath和IR24的Castaway-Os2区的扩增产物被切割，而Asominori的扩增产物不被切割。

在Asominori-IR24的71例RIL中作图，结果表明OSSALT(Castaway-Os1)和RICRTH(Castaway-Os2)基因座分别位于1和7号染色体上。

实施例4：利用Ditto开发标志物

材料与方法

Ditto-Os1和2是提交到数据库(GenBank)中的RICHSEA(M80938)和RICOSH1(D16507)基因中的Ditto-Os转座因子(Bureau等1996)。

如图16所示设计用于扩增Ditto-Os序列及其邻接区域的引物对(SEQID NOs：58-61)。这些引物对用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因组DNA为模板进行PCR反应，按照实施例1所述测定核苷酸序列。

结果和讨论

上述品种的PCR产物的核苷酸序列对比结果见图17-图18和SEQ IDNOs：62-67。图17(SEQ ID NOs：62-64)显示Ditto-Os1区，图18(SEQ ID NOs：65-67)显示Ditto-Os2区。

1)Ditto-Os2区

当使用针对Ditto-Os2的引物时，在3个品种之间发现了PCR产物长度的多态性。具体地，Asominori的PCR产物长度为267个碱基对，Kasalath的为246个碱基对，IR24的为312个碱基对，见图18。这种多态性经证实是Asominori和Kasalath分别在Ditto-Os2序列内部包含1个和2个缺失的结果。这种基于PCR产物长度差异的多态性被用作ALP标志物。在Asominori-IR24的71例RIL中为该标志物作图，结果表明RICOSH1(Ditto-Os2)基因座位于3号染色体上。

2)Ditto-Os1区

当使用针对Ditto-Os1的引物时，未发现PCR产物长度的多态性，但核苷酸序列水平上显示多态性。在Ditto-Os1序列及其邻接区中多态性的频率倾向于比对应于常规RFLP标志物的基因组序列中的更高，这提示转座因子的邻接区可能存在多处种间差异。

在Ditto-Os1区的情况中，用常规CAPS方法制备多态性检测的标志物。具体是，Asominori的Ditto-Os1区的第206-209位核苷酸是″ GGCT″，而Kasalath和IR24的相应位点上的核苷酸序列是″ AGCT″，见图17。而且，Asominori的第273-276位核苷酸是″agc c″，而Kasalath和IR24的相应位点上的核苷酸序列是″agc t″。据此制备图16A所示的引物(SEQ ID NOs：58和59)作为检测多态性的标志物，按照实施例1的方法进行PCR。对应于Asominori中第206-209和273-276位核苷酸的Kasalath和IR24序列″AGCT″由限制酶AluI识别。对应于Asominori中第29-32和39-42位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″AGCT″。因此，当用限制酶AluI处理扩增产物时，Asominori的Ditto-Os1区的扩增产物在两处位点被切割(29-32和39-42)，Kasalath和IR24的扩增产物在4处位点被切割(206-209和273-276以及29-32和39-42)。

在Asominori-IR24的71例RIL中作图，结果表明RICHSEA(Ditto-Os1)基因座位于1号染色体上。

实施例5：利用p-SINE1开发标志物

材料与方法

p-SINE1-r1至r7是Mochizuki等(1992，同上)所述的转座因子。根据Mochizuki等(SEQ ID NOs：68-73，针对p-SINE1-r4，-r5和r7)的文献设计用于扩增p-SINE1序列(p-SINE1-r1至-r7)及其邻接区域的引物对。这些引物对用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因组DNA为模板进行PCR反应，按照实施例1所述测定核苷酸序列。

结果和讨论

上述品种的PCR产物的核苷酸序列对比结果见图19-图25和SEQ IDNOs：74-94。图19(SEQ ID NOs：74-76)显示p-SINE1-r1区，图20(SEQ IDNOs：77-79)显示p-SINE1-r2区，图21(SEQ ID NOs：80-82)显示p-SINE1-r3区，图22(SEQ ID NOs：83-85)显示p-SINE1-r4区，图23(SEQ ID NOs：86-88)显示p-SINE1-r5区，图24(SEQ ID NOs：89-91)显示p-SINE1-r6区，图25(SEQ ID NOs：92-94)显示p-SINE1-r7区。

3个品种的p-SINE1-r3区未显示多态性。至于p-SINE-r1，p-SINE1-r2和p-SINE1-r6区，在Asominori与Kasalath之间显示多态性，但在Asominori与IR24之间未显示多态性。对p-SINE1-r4，p-SINE1-r5和p-SINE1-r7区而言，在Asominori与IR24之间显示多态性。上述多态性的频率低于已知在MITE区中的频率，但高于常规基因组序列中的频率。这提示，MITE区以及p-SINE1区都可能存在多处种间差异。

1)p-SINE1-r4区

在p-SINE1-r4区的情况中，用dCAPS方法，基于Asominori与Kasalath或IR24之间的多态性，来制备多态性检测的标志物。

具体是，Asominori的p-SINE1-r4区的第82-85位核苷酸是″GGGT″，而Kasalath的相应位点上是″AAT″，IR24的相应位点上是″GGT″，见图22。据此制备图26A所示的引物(SEQ ID NOs：95和96)作为检测多态性的标志物，按照上述方式进行PCR。SEQ ID NOs：95和96的序列分别对应于图22所示Asominori序列(SEQ ID NO：83)中的核苷酸60-86和223-246，但5’引物(其具有核苷酸序列SEQ ID NO：95)被设计成：将第84位的核苷酸″a″取代为″c″。当采用这种多态性检测标志物作为引物时，扩增得到图22中60-246的序列(SEQ ID NOs：83-85)，但3’-引物所致取代仅在Asominori中第84-94位得到序列″CCGCTCAG GGG″，在Kasalath和IR24中分别得到序列″CCGCTCAG AA″和″CCGCTCAG GG″。Asominori中第84-94位的序列″ CCGCTCAGG GG″由限制酶BslI识别(它识别″ CCNNNNNNN GG″)。对应于Asominori中第109-119位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″CCNNNNNNNGG″。因此，当用限制酶BslI处理扩增产物时，Asominori的p-SINE1-r4区的扩增产物在两处位点被切割(84-94和109-119)，Kasalath和IR2的扩增产物仅在一个位点被切割(109-119)。

2)p-SINE1-r5区

在SINE1-r5区的情况中，用常规CAPS方法制备多态性检测的标志物。具体是，Asominori的SINE1-r5区的第85-88位核苷酸是″ TTAG″，而Kasalath和IR24的相应位点上的核苷酸序列是″ CTAG″，见图23。据此制备图26B所示的引物(SEQ ID NOs：97和98)作为检测多态性的标志物，按照实施例1的方法进行PCR。SEQ ID NOs：97和98的序列分别对应于图23所示Asominori序列(SEQ ID NO：86)中的核苷酸3-26和168-190，这种多态性检测标志物被用作引物，以便扩增图23中3-190的序列(SEQ ID NOs：86-88)。Kasalath和IR24中核苷酸85-88位的序列″CATG″由限制酶BfaI识别。对应于Asominori中第64-67位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″CTAG″。因此，当用这种限制酶处理扩增产物时，Kasalath和IR24的p-SINE1-r5区的扩增产物在两处位点被切割(85-88和64-67)，Asominori的扩增产物仅在一处位点被切割(85-88)。

3)p-SINE1-r7区

在p-SINE1-r7区的情况中，用常规CAPS方法制备多态性检测的标志物。具体是，IR24的p-SINE1-r7区的第65-69位核苷酸是″cttag″，而Kasalath和Asominori的相应位点上的核苷酸序列是″ cagtagga ttag″(多了7个核苷酸)，见图25。据此制备图26C所示的引物(SEQ ID NOs：99和100)作为检测多态性的标志物，按照实施例1的方法进行PCR。SEQ ID NOs：99和100的序列分别对应于图25所示Asominori序列(SEQ ID NO：92)中的核苷酸17-7和73-96，这种多态性检测标志物被用作引物，以便扩增图25中负17-96的序列(SEQ ID NOs：92-94)。IR24中第65-69位核苷酸的序列″cttag″由限制酶DdeI识别(它识别″CTNAG″)。因此，当用这种限制酶处理扩增产物时，IR24的p-SINE1-r7的扩增产物被切割，而Kasalath和Asominori的扩增产物不被切割。

在Asominori-IR24的71例RIL(重组近交系)中作图，结果表明p-SINE1-r4，p-SINE1-r5和p-SINE1-r7基因座都位于2号染色体上。

以下文件被引入本文作参考。

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               序列表

                            序列表<110>日本烟草产业株式会社(JAPAN TOBACCO INC.)

 欣根塔有限公司(syngenta Limited)<120>基于转座因子的用于检测植物基因组多态性的标记物及其制备方法<130>YCT 638<160>100<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>1aacgtgtgaa ggactcaaga agcc                                   24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>2cctcagatgt tgacttgagc caac                                   24<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>3ctgatgctaa tgctgcgaaa agtt                     24<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>4atgtgtgttt tcggcatggt ttg                      23<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>5attcgtagga aaggcttcac ttgc                     24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>6cgtgctttgc gtttagaggg tcgg                                                24<210>7<211>434<212>DNA<213>稻<400>7cttcttttca cgtttttatt taggttttga tacaatatat acgcaatagg tgttgttttt         60taaaaaaaat aaacaaaatg gacattacat tattggctgt gtttagatcc aaaatttaga         120tccaaacttc aatccttttc catcacatca acctgtcata cacacacaac ttttcagtca         180catcatctcc aatttcaacc aaaatccaaa ctttggatcc aactaaacac aaccattgtt         240attattatta ttataaactt ataaaaagga catgaaaaca attaatgaaa ctaaggacag         300atttcatttc actgacatgc ttagaaagta tagttgccaa tatatgttat ctttttaatg         360cgtgtgtgtg tgtgtgtaaa gtggagctcc actcccacac acaaacatga tggcatgact         420atttaataag ctaa                                                           434<210>8<211>278<212>DNA<213>稻<400>8cttcttttca cgtttttatt tagttttaga tactacaata tacacaatag gtgttgtttt         60tttaaaaaat aaacaaaatg gacattacat tgttgttatt attattataa acttataaaa         120aggacatgaa aacaattaag gaaactaagg acaaaattca tttcactgac atgtttagaa         180agtatagttg ccaatatatg gaacttttta atgtgtgttt agagtggagc tccactccca         240cacacaaaca tgatggcatg actatttaat aagctaaa                                 278<210>9<211>277<212>DNA<213>稻<400>9cttcttttca cgtttttatt tagttttaga tactacaata tacacaatag gtgttgtttt         60tttaaaaaat aaacaaaatg gacattacat tgttgttatt attattataa acttataaaa         120aggacatgaa aacaattaag gaaactaagg acaaaattca tttcactgac atgtttagaa         180agtatagttg ccaatatatg gaacttttta atgtgtgttt agagtggagc tccactccca         240cacacaaaca tgatggcatg actatttaat aagctaa                                  277<210>10<211>301<212>DNA<213>稻<400>10ttatgatact actagggttg tgtttagatc caaactttca actttttcca tcacatcaac         60ctgtcataca cacataactt ttcagtcaca tcgtactaat ttcaacccaa atttctaact         120ttagaaggaa ctaaacacag cctagcttct ctagcacagc agcatgttca cttcttaatt         180agtggcatct gaaccatgtg atttttgaaa gtgaaactat tattaactga tcgagttgcc         240gagataagga cagctccatg ttaaggtggg gcatcacatt ctccagcctt tcaagcaacc         300c                                                                         301<210>11<211>299<212>DNA<213>稻<400>11ttatgatact actagggttg tgtttagatc caaactttca actttttcca tcacatcaac         60ctgtcataca cacaactttt cagtcacatc gtaccaattt caacccaaac ttctaacttt         120ggaaggaact aaatacagcc tagcttctct agcacagcag catgttcact tcttaattag         180tggcatctga accatgtgat ttttgaaagt gaaactattg ttaactgatc gagttgccga         240gataaggaca gctccatgtt aaggtggggc atcacattct ccagcctttc aagcaaccc          299<210>12<211>301<212>DNA<213>稻<400>12ttatgatact actagggttg tgtttagatc taaactttca actttttcca tcacatcaac         60ctgtcataca cacacaactt ttcagtcaca tcgtaccaat ttcaacccaa atttctaact         120ttagaaggaa ctaaatacag cctagcttct ctagcacagc agcatgttca cttcttaatt         180agtggcatct gaaccatgtg atttttgaaa gtgaaactat tattaactga tcgagttgcc         240gagataagga cagctccatg ttaaggtggg gcatcacatt ctccagcctt tcaagcaacc         300c                                                                         301<210>13<211>468<212>DNA<213>稻<400>13aaatcattgc tactcctgct ttcaatacag tactactgct gctggtaaat gcagatttga         60tattggaaat ggcctattgg cttgtattta aatcttaagc attttcttaa caggatgtac         120tgacttaatc atcaatgcag catgttgttt atgaaaaaaa tattgctata tttttgtagc         180tagttgtttc tgtgaaggtg aaaatctgag cagggaatat ctcggtgaag gaagcaaaaa         240cctcatgctc tgaatgaccc attttctttg acagagccct tgtttagttt ctaacttttt         300cttcaaactt tcaacttttt catcacatca aaactttcct atacacataa acttttaact         360tttccgttgt atcgttccaa tttcaaccaa actttcaatt ttaacgtgaa ttgaacacac         420cctctgaatg accattttaa tagttaatgt atcatgtaat gagatatt                      468<210>14<211>468<212>DNA<213>稻<400>14aaatcattgc tactcctgct ttcaatacag tactactgct gctggtaaat gcagatttga         60tattggaaat ggcatattgg cttgtattta aatcttaagc tttttcttaa caggatgtac         120tgacttaatc atcaatgcag cgtgttgttt atgaaaaaaa tattgctata tttttgtagc         180tagttgtctc tgtgaaggtg aaaatctgag cagggaatat ctcggtgaag gaagcaaaaa         240cctcatgctc tgaatgaccc cttttctttg acagagccct tgtttagttt ctaacttttt         300cttcaaactt tcaacttttt catcacatca aaacttttct atacacataa actttcaact         360tttccgttat atcgtttcaa tttcaaccaa actttcaatt ttaacgtgaa ttgaacacac         420cctctgaatg accattttaa tagttaatgt atcatgtaat gagatatt                      468<210>15<211>4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11>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>99tggtacactg attactgaag tagc                                 24<210>100<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>100cagaagacct ctactgaatc ctaa                                24

Claims (9)

1.制备用于检测植物基因组多态性的标志物的方法，该方法包括利用植物基因组中转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备用于核酸扩增的引物。

2.权利要求1的制备用于检测多态性的标志物的方法，包括

i)基于目标植物基因组中转座因子和/或其邻接区域的碱基序列制备一对引物，用于扩增上述转座因子，或该转座因子及其邻接区域；

ii)以目标植物基因组DNA为模板进行核酸扩增反应；和

iii)基于在上述核酸扩增的产物中发现的多态性，制备用于检测植物基因组多态性的标志物。

3.权利要求2的制备用于检测多态性的标志物的方法，其中制备标志物的步骤iii)包括下列a)-c)中任一项：

a)当所述核酸扩增产物中的多态性包含具有缺失区的类型时，制备一对用于核酸扩增的引物，使所述引物定位于所述缺失区的两侧，以此制备检测多态性的标志物；

b)当所述核酸扩增产物中的多态性包含导致限制酶识别差异的碱基取代时，制备一对用于核酸扩增的引物，使所述引物定位于所述碱基取代位点的两侧，以此制备检测多态性的标志物；或

c)当所述核酸扩增产物中的多态性包含不导致限制酶识别差异的碱基取代时，制备一对用于引入错配的引物，使所述引物包含所述碱基取代位点并将所述核酸扩增产物中包含该碱基取代位点的区域修饰为导致限制酶识别位点差异的碱基序列，以此制备检测多态性的标志物。

4.权利要求2或3的制备用于检测多态性的标志物的方法，其中步骤i)和iii)的引物对制备满足以下1)-5)条件：

1)每个引物的长度为15-30个碱基；

2)每个引物的碱基序列中G+C含量比为30-70％；

3)每个引物的碱基序列中A、T、G和C的分布略有偏差；

4)该引物对扩增的核酸产物长度为50-2000碱基；和

5)每一引物自身的碱基序列内部或不同引物的碱基序列之间不存在互补的部分。

5.权利要求1-4中任一项的制备用于检测多态性的标志物的方法，其中步骤ii)的核酸扩增应用聚合酶链式反应进行。

6.权利要求1-5中任一项的制备用于检测多态性的标志物的方法，其中所述目标植物为单子叶植物。

7.权利要求1-6中任一项的制备用于检测多态性的标志物的方法，其中所述目标植物为水稻。

8.权利要求1-7中任一项的制备用于检测多态性的标志物的方法，其中所述转座因子为MITE(微小反向重复转座因子)或SINE(短型散布状核元件)。

9.权利要求1-8中任一项的方法制备的用于检测植物基因组中的多态性的标志物。

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