CN1444033A - 测定生物活性物质的目视荧光免疫分析法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一个目视荧光免疫分析检测方法，它用于定性或半定量测定生物活性物质。该法是用镧系金属离子多重标记参与生物亲合反应的生物亲合性组份，反应后形成由镧系螯合物和荧光增强离子螯合物组成的凝聚微粒。在紫外光激发下，用肉眼目视检测由微粒发出的荧光。为了尽可能提高荧光强度以便于目视检测，在多重标记中使用载体蛋白(如牛甲状腺球蛋白)或大分子聚合物以提高镧系金属离子的标记数，生物素－霉链亲合素系统用作通用试剂系统。

Description

测定生物活性物质的目视荧光免疫分析法

本发明涉及目视荧光免疫分析(VFIA)检测生物活性物质的方法。它包括用镧系金属离子作多重标记，通过生物亲合反应后，形成强荧光凝聚微粒和用目视荧光进行检测。

某些物质被紫外光照射后，能够发出反映该物质特性的荧光，利用这一现象进行该物质的定性或定量分析，称为荧光分析。荧光分析已广泛应用在工农业生产，医学，卫生，生物科技和科学研究等许多领域。荧光的定性或定量分析，绝大部分采用仪器检测，以荧光强度的大小来判断某荧光物质的存在与否和存在量，也有一小部分物质可以仅仅借助于一只紫外灯，以目视检测判定其存在和大概的存在量。最典型的一个例子就是微量铀的目视荧光测定。微量铀与NaF或NaF+碳酸盐一起熔融生成的熔珠，在紫外光照射下能发出明显的黄绿色荧光，用肉眼观察即能测出10^-10克铀。然而，迄今为止，尚未见到仅仅使用紫外光和肉眼观察的目视荧光法在临床需要浓度范围内对生物活性物质进行检测的报道，这是因为大多数在临床上具有重要意义的生物活性物质在人的体液中含量甚微，要测定它们需要应用十分灵敏的方法，例如放射免疫分析(RIA)，酶免疫分析(EIA)，化学发光免疫分析(CLIA)和荧光免疫分析(FIA)，这些分析方法均需要精密而昂贵的测定仪器。所有免疫分析都是以抗体作为特异分析试剂，以抗原抗体的特异生物亲合反应即免疫反应为基础的分析方法。根据示踪其生物亲合反应所用标记物的不同，又可分为上述各种免疫分析。

在过去多年中已研究出了基于荧光检测定量测定生物活性物质的免疫分析方法，即荧光免疫分析(FIA)，这是一种以荧光物质作为标记物示踪免疫反应的免疫分析方法。在这一领域，最重要的改进之一是发展了时间分辨荧光免疫分析(TR-FIA)，该方法的基础是时间分辨荧光技术和镧系螯合物标记技术(U.S.patent No.4,058732和4,374,120)。某些镧系螯合物，如铕，铽和钐的螯合物，因其具有很高的荧光强度，大的斯托克斯位移和相当长的荧光寿命，从而成功地应用于时间分辨荧光免疫分析。标记物荧光的测量可以在它结合于抗原或抗体之上时进行，也可以在测量前将它从抗原或抗体上解离下来之后进行。为此，可加入一种含有β一二酮，协同化合物和表面活性剂的低pH值的荧光增强液以解离镧系离子并使之转变成新的荧光螯合物(U.S.Patent No.4,565,790)。

U.S.Patent No.5,316,909叙述了一个改进方法，即在荧光测量前，镧系离子转变成荧光极强的凝聚微粒，该微粒既含有镧系螯合物也含有荧光增强离子螯合物。在凝聚微粒中，被荧光增强离子螯合物吸收的激发光能量，通过分子间能量传递，能有效地传递给镧系离子螯合物，从而镧系离子螯合物的荧光得到了极大增强，该荧光增强被称为共荧光增强。应用共荧光增强，虽然极大地提高了荧光强度，但对一般的镧系离子标记水平而言，尚没有达到肉眼目视能够检测的水平。

本发明是将共荧光增强与镧系离子多重标记相结合，从这两个方面极大地提高亲合反应后被测标记物的荧光强度，从而能够在紫外灯照射下通过肉眼目视检测荧光来定性或半定量测定生物活性物质。本发明的目的是研制开发一种简单、灵敏、方便和便宜的定性或半定量测定生物活性物质的目视荧光免疫分析(VFIA)方法。

本发明选用Eu³⁺或Tb³⁺离子作为亲合反应中的标记物，这是因为这两个离子的螯合物都具有很高的荧光强度，相当长的发射波长和大的斯托克斯位移，以及具有很强的共荧光效应，这些特点均有利于目视检测。

用Eu³⁺或Tb³⁺作标记物的免疫分析可以是竞争型的，也可以是非竞争型的。在非竞争型免疫分析中，待测物抗原同时结合于固相抗体和Eu³⁺或Tb³⁺标记抗体形成夹心型免疫复合物，免疫反应后洗去过量的标记抗体，然后加入荧光增强溶液从标记抗体上解离Eu³⁺或Tb³⁺，在溶液中形成新的荧光螯合物，其荧光强度正比于待测抗原的量。

竞争型免疫分析在实际进行时又可以分为几种类型。在DELFIA型竞争免疫分析中，用能够俘获抗分析物抗体的抗体包被固相。如果抗分析物抗体是鼠产生的，则固相抗体应该是由羊或兔产生的抗鼠IgG抗体。分析物抗原与Eu³⁺或Tb³⁺-标记抗原竞争抗分析物抗体上的有限结合位点。免疫反应后洗去过量试剂，然后加入荧光增强液，将Eu³⁺或Tb³⁺离子从标记抗体上解离到溶液中，在溶液中形成新的荧光螯合物。另一类型竞争免疫分析是用分析物-载体蛋白连接物包被固相，分析物抗原和固相抗原竞争Eu³⁺或Tb³⁺标记的抗分析物抗体，免疫反应后洗去过量试剂，然后同上加入荧光增强溶液。在竞争型免疫分析中，最终待测标记物的荧光强度与样品中分析物含量呈反方向变化。

在本发明中，为了尽可能提高荧光强度以便能用肉眼即可进行目视检测，同时采用了下述两个手段。

第一个手段是共荧光增强(U.S.Patent No.5,316,909)。用此手段，将镧系离子转变成发强荧光的特有形式--凝聚微粒，在此微粒中不但含有发荧光的镧系螯合物，而且含有一种能增强荧光的离子螯合物。通过来自于激发能的分子间的能量传递，镧系螯合物的荧光强度可提高2～3个数量级。与采用最好的直接荧光增强液(如DELFIA增强液)相比，荧光强度可以提高50～70倍。第二个手段是镧系离子的多重标记。在仅仅采用共荧光增强的情况下，标记物的荧光强度水平尚不够高，不能够在临床浓度范围对大多数生物活性物质作目视检测。提高每个抗体(或抗原)分子上的镧系离子标记数将会提高总体荧光强度水平。由计算和观察得知，在采用共荧光增强的情况下，为满足目视检测要求，每个抗体分子IgG上镧系离子标记数必须在150个以上。当采用常规方法用镧系离子直接标记1gG时，比值Eu³⁺(或Tb³⁺)/lgG超过25，就会引起抗体活性的下降，生物素(B)-霉链亲合素(SA)系统己成为免疫分析和DNA杂交领域最有用的工具之一。SA对B具有特别强大的结合能力，其亲合常数Ka高达10¹⁵M^-1。而且SA本身也极其稳定，在很多相当苛刻的条件下，也能保持对B的结合活性。虽然在此系统中，总有放大系数存在，但是要想通过生物素化过程在每个IgG分子上引入多个生物素分子和用Eu³⁺或Tb³⁺标记霉链亲合素而获得超过150个镧系离子标记数仍然是困难的。借助于大分子量载体蛋白或大分子聚合物可以解决这一困难。牛甲状腺球蛋白(TG)曾用作为铕的配基4，7-二(氯磺苯基)-1，10-菲咯啉-2，9-二羧酸(BCPDA)的载体蛋白，在一个TG分子上可以标记多达160个BCPDA。我们发现TG和牛血清白蛋白(BSA)也可用作镧系离子的载体。当用对-异硫氰基苄基-DTTA作为双功能连接试剂时，可以得到不低于60的Eu³⁺(或Tb³⁺)/TG克分子连接比。将抗体生物素化，一般来说每个抗体分子可以连接上10个生物素分子。因此，如果SA连接于TG是以1∶1克分子比连接的，则可以得到不低于600的Eu³⁺(或Tb³⁺)/IgG比值。为连接SA到TG上，可以应用经典的蛋白交联剂如戊二醛和碳二亚胺等，也可以应用异性双功能交联剂和硫代琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯等。

将上述两个手段相结合，同时应用于VFIA，则标记物的荧光得到了极大增强可以达到目视检测水平，而仅仅采用其中之一，由于标记物的荧光尚不很强，不能获得满意的目视检测效果。

VFIA可以在微滴定板条的孔中进行，孔用抗体包被。免疫反应后，加入共荧光增强液，Eu³⁺或Tb³⁺离子从固相上解离下并形成强荧光凝聚微粒。在紫外灯照射下于暗处目视观察孔中溶液的荧光。紫外灯可做成台式，也可以做成便携式的，如市售的验钞器，其发射波长在300nm～400nm均可。目视观察可以在暗室中进行，但也可以用一块黑市将自然光遮蔽，制造一个光线较暗的环境，后者具有更大的方便和灵活性。将未知样品的荧光强度和标准样品的荧光强度比较后即可得到定性或半定量的结果。本方法的灵敏度优于其他目视技术，如凝结试验，免疫色谱和酶免疫法等。

VFIA所需要的全部检测设备仅仅是一个简单的紫外灯和一块黑布，所以该方法不仅仅可用于各种医院和诊所，而且可以用于家庭作自我检测诊断。

以下通过两个例子对本发明作进一步的阐述和说明。

                         例一

     用目视荧光免疫分析定性检测新生儿脐血或足跟血中hTSH

采用双抗体夹心法进行检测，抗体之一固化于样品板小孔的内壁，另一抗体生物素化，带有标记物Eu³⁺的大分子TG与SA相连，在免疫反应中形成固相抗体-hTSH-抗体-B-SA-TG-Eu³⁺复合物，免疫反应后，将Eu³⁺解离进入溶液，在溶液中Eu³⁺与加入的其他组份形成可发射强荧光的凝聚微粒，在紫外光照射下进行肉眼目视检测。

单克隆抗-hTSH抗体的包被：在样品板的小孔中加入200μl浓度为5μg/ml的单克隆抗-hTSH抗体溶液，包被介质为pH9.5的碳酸盐缓冲液。置室温下16小时，洗涤后，每孔加300μl的0.1％BSA进行封闭，室温放置3小时，吸去封闭液，置4℃保存。

单克隆抗-hTSH抗体的生物素化：用于生物素化的单克隆抗-hTSH抗体与包被用抗体不同，两者在hTSH分子上具有不同的特异抗原结合位点。生物素化在pH9.5的0.1mol/l的碳酸盐缓冲液中进行。生物素化试剂采用N-羟基琥珀酰亚胺活性生物素(NHS-Biotin)，试剂用量为：抗体/NHS-Biotin＝2/1(重量)。两者混合均匀，置4℃过夜。第二天，用SephadexG50凝胶柱，将生物素化抗体从过量的NHS-Biotin中分离出来，4℃保存。

牛甲状腺球蛋白(TG)的标记：在pH9.5的碳酸盐缓冲液以300倍克分子过量的N¹-(对-异硫氰基)-二乙三胺-N¹，N²，N³，N³-四乙酸的铕螯合物对TG进行标记，室温温育16小时，用凝胶过滤柱把TG-Eu³⁺从游离标记试剂中分离出来。

标记了的牛甲状腺球蛋白与霉链亲合素(SA)的连接：使用蛋白交联剂碳二亚胺(EDC)将TG-Eu³⁺连接于SA。将SA，TG-Eu³⁺和EDC按克分子比1∶5∶30溶于水溶液中，缓慢搅动1小时，用Sephadex G-200凝胶柱将SA-TG-Eu³⁺从未反应的SA和EDC中分离出来，于4℃保存。该凝胶柱不能分离SA-TG-Eu³⁺和TG-Eu³⁺，通过实验证实，此分离已无必要，因为大量TG-Eu³⁺的存在并不使背景荧光有明显的上升。

共荧光增强液的配制：共荧光增强液用于将Eu³⁺解离到溶液中并形成发强荧光的凝聚微粒。它由解离部分Ea和增强部分Eb组成，其组成为Ea：30μM TTA，1.5μM Y³⁺，0.06％(W/V)曲拉通X-100和20％乙醇，溶液用乙酸调节pH至3.2；Eb：0.4mM 1，10-菲咯啉，0.2M Tris。

阴性和阳性控制样制备：阴性控制样制备是取正常健康人血50μl，垂直滴加在水平放置的滤纸上，放置至少2小时，以使血斑干燥，置4℃保存。阳性控制样制备是取正常健康人血若干毫升，离心使血浆和血球分离，弃上层血浆，加等量生理盐水，缓慢搅动使混合均匀，再次离心，如此洗涤血球6次，最后加入生理盐水和标准hTSH至原体积，使最终全血中hTSH含量为20μU/ml，搅拌均匀后取50μl滴于滤纸上。同上制备阳性控制样。阴阳性控制样均置于4℃保存。

样品收集：新生儿脐血样品收集是在新生儿出生时，直接将脐血滴于滤纸上，水平放置至少2小时使其干燥。足跟血收集是在新生儿出生后3-5天收集，将滤纸一次靠在穿刺后足跟出血处，使血形成直径为2cm的血斑，水平放置至少2小时，使其干燥，4℃保存。

目视荧光免疫分析过程：在包被了单克隆抗-hTSH抗体的样品板小孔中加入直径3mm的干血纸片样品(阴性或阳性控制样，或待测样品)，50ng生物素化单克隆抗-hTSH抗体，(在200μl含有9g/l NaCl，0.05％NaN₃，0.5％BSA，0.05％牛球蛋白和0.01％吐温40的pH7.7 0.05M Tris-HCl试验缓冲液中)，室温振荡4小时，作第一次温育，取出纸片并吸去温育液，洗涤3次后，每孔加入200ng SA-TG-Eu³⁺(在200μl试验缓冲液中)，室温振荡1小时，作第二次温育，洗涤6次后，每孔加入200μl Ea，振荡3分钟以解离Eu³⁺离子，然后每孔再加入20μl Eb，振荡7分钟后，在紫外灯下，用肉眼观察比较荧光。该荧光为红色，若样品的荧光强度等于或超过阳性控制样的荧光强度，则判定样品为阳性，反之为阴性。

目前，在包括中国在内的全世界各个国家，以测定新生儿脐血或足跟血中hTSH含量对新生儿是否为甲低(与先天性痴呆有关)进行筛查已成为新生儿出生后的例行检查。当前所用的检查方法RIA，EIA，FIA等均需采用价格昂贵的高性能仪器，因为该项目检查需要很高的灵敏度才行。本发明仅借助一盏价格非常低廉的紫外灯，使用VFIA法即能进行该项检查，这不但说明本发明提出的VFIA具有特别高的灵敏度，同时为新生儿甲低筛查提供了一个简单、方便、便宜的方法，这将为中国和其他发展中国家的优生优育作出贡献。

                         例二

       用目视荧光免疫分析半定量测定人血中hAFP

单克隆抗-hAFP抗体的包被，单克隆抗-hAFP抗体的生物素化，TG的标记，TG-Eu³⁺与SA的连接共荧光增强液的配置均与例一相同。

hAFP标准干血纸片样品的制备：收集若干正常健康人血和新生儿脐血，各取少许离心分离出血清，用DELFIA hAFP试剂盒测定其hAFP含量，再换算成全血中hAFP含量。根据所测数据，将两种血按不同的体积比混合，使混合血中hAFP的浓度为5，20，80，320U/ml，各取50μl垂直滴于水平放置的滤纸上，放置至少2小时，干燥后于4℃保存。

样品收集：取静脉血或耳血或指血50μl垂直滴加在滤纸上，放置至少2小时，干燥后于4℃保存。

目视荧光免疫分析过程：基本同例一，作第一和第二次温育都是在室温下振荡1小时。在观察荧光时，可将未知样与4个标准样逐个比较，看其与哪个标准荧光强度接近，或介于两个标准之间，即可半定量测得未知样品含量，若含量达到或超过20U/ml，则判定为阳性样品，建议患者去医院作进一步检查。

肝癌是目前临床上经常出现且恶性度较高的癌症之一，早期发现早期治疗尤其重要。对易患人群(如乙肝患者)测定血中hAFP水平进行筛查是达到早期发现的非常好的途径，本发明提出的VFIA法为该大规模筛查提供了一个简单、方便、便宜和切实可行的方法。

Claims (5)

1.一种用于定性或半定量测定生物活性物质的目视荧光免疫分析检测方法，其特征在于它包括下列步骤：

(1)用镧系金属离子多重标记参与生物亲合反应的生物亲合性组份；

(2)标记组份参加生物亲合反应；

(3)亲合反应完成后，解离镧系离子并使之形成强荧光的凝聚微粒；

(4)在紫外光的激发下，用肉眼目视检测由微粒发出的荧光。

2.按照权利要求1，镧系金属离子是Eu³⁺或Tb³⁺。

3.按照权利要求1，在镧系离子的多重标记中采用载体蛋白或大分子聚合物以提高标记数。

4.按照权利要求1，生物素-霉链亲合素系统用作通用试剂系统。

5.按照权利要求1，强荧光凝聚微粒是经共荧光增强法形成，它既含有镧系螯合物，也含有荧光增强离子螯合物。