CN1435489A - 用于转基因玉米实时荧光pcr检测的探针序列和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，给出检测转基因玉米不同品种，检测相应外源基因、内源基因的探针序列，最大、最小及优选序列，按探针序列制成的试剂盒，用于转基因产品定量检测和定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明实时荧光PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及基因的扩增与检测。
(二)背景技术：
随着转基因产品不断商品化，其安全性问题一直被世人关注，并不断发生争议。为了保障人类的身体健康，消除消费者顾虑，有利于国际贸易和商品流通，以欧盟为代表的很多国家，在经历了短暂的争议后，对此类特殊产品都制定出安全管理条例，以便严格管理。欧洲、日本等多国还制定了相应的限量法规。我国农业部也于今年出台了转基因产品的管理办法。然而，要使消费者了解或接受转基因产品，各项法规能得以实施，除了给以相关信息及增加透明度外，关键问题是能够有相应的科学检测方法来分析与鉴别传统产品与转基因产品。尤其面对国内外贸易中对转基因产品的限量要求，更应有相应的、准确地定量方法对转基因产品，尤其是转基因食品进行定性、定量检测。在目前国内外常用的转基因产品的检测方法中，主要是以核酸为基础的PCR检测方法。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶链式反应已广泛应用于基于核酸的各个研究和临床诊断等领域，该方法使用两段(约17～20多个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液由包括含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通过温度的变化，DNA变性及退火而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以扩增。经25～30个循环，扩增倍数达106。用该方法检测转基因产品整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电脉和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。
(三)发明内容：
本发明根据实时荧光定量PCR法原理，即是在定性PCR方法的基础上，加入了一条荧光标记的探针，收集记录荧光信号，从而可以检测出待测样品的初始拷贝数，判定待测玉米样品中是否含有转基因成份，从而确定待测玉米样品及其加工产品是否为转基因产品。
本发明的技术方案是：是在常规PCR检测基础上，添加了一条标记了两个荧光基团的探针。荧光报告基团(R)标记在探针的5′端，荧光淬灭基团(Q)标记在探针的3′端，两者可构成能量传递结构，即荧光报告基团所发出的荧光可被荧光淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强。在PCR过程中，探针同PCR产物杂交，由于Taq酶具有5′到3′的外切酶活性，在引物延伸阶段将探针切断，荧光淬灭基团(Q)抑制作用消失，报告基团荧光信号增强。伴随PCR产物的增加，荧光信号随之增强，第n循环时的荧光信号增加值ΔRn等于Rn/Qn减去R0/Q0，Rn、R0分别为第n循环和PCR反应开始时的报告基团荧光值，Qn、Q0分别为第n循环和PCR反应开始时的淬灭基团荧光值。PCR反应的第3-15个循环的荧光值作为荧光本底信号，3-15个循环的ΔRn的标准偏差的10倍被设定为荧光阈值(thresho1d)，当信号达到该荧光阈值时的循环次数(Ct值)同PCR反应的初始模板量成正比。
用于检测转基因玉米BT11品种，检测IVS2和PAT基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-cgagggaacacgggagtctg-3’，该探针的最大序列是：5’-tgtcgagatccgagggaacacgggagtc tgcccctgagac-3’，该探针的最小序列是：5’-ggaacacgggag-3’。
用于检测转基因玉米MON810品种，检测Maize genome和CaMV35S基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-gcccagctatctgtcacttt-3’ ， 该探针的最大序列是：5’-ctttgccattgcccagctatctgtcactttattgtgaaga-3’，该探针的最小序列是：5’-agctatctgtca-3’。
用于检测转基因玉米MON810品种，检测HSP70和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-ccaactgacactatattgct-3’ ， 该探针的最大序列是：5’-ctagtatctaccaactgacactatattgcttctctttaca-3’，该探针的最小序列是：5’-ctgacactatat-3’。
用于检测转基因玉米176品种，检测CDPK和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-atggacaacaaccccaacatc-3’，该探针的最大序列是：5’-ggatccaacaatggacaacaaccccaacatcaacgagtgca-3’，该探针的最小序列是：5’-caacaaccccaa-3’。
用于检测转基因玉米T14和/或T25品种，检测PAT和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-atctgggaactactcacaca-3’，该探针的最大序列是：5’-taattcccttatctgggaactactcacacattattatagaga-3’，该探针的最小序列是：5’-gggaactactca-3’。
用于检测转基因玉米T14和/或T25品种，检测CaMV35S和PAT基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-tggctctgtcctaaagttca-3’，该探针的最大序列是：5’-tttgtggctctgtcctaaagttcactgtagacgtc-3’，该探针的最小序列是：5’-tctgtcctaaag-3’。
用于检测转基因玉米CBH351品种，检测Cry9C和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-cgtgcccgtgaacccagctc-3’，该探针的最大序列是：5’-gatcgtgcccgtgaacccagctcgcgaggccga-3’，该探针的最小序列是：5’-cccgtgaaccca-3’。
用于检测转基因玉米GA21品种，检测OTP和mEPSPS基因的边界相连基因片段的探针序列是：5’-acctgccgccgctgtctatg-3’，该探针的最大序列是：5’-cgctgtcgtacctgccgccgctgtctatggcgcccaccgt-3’，该探针的最小序列是：5’-gccgccgctgtc-3’。
用于检测玉米Zein内源基因的探针序列是：5’-taagatgccagctgcgattg-3’，该探针的最大序列是：5’-gggtgataaaggtaagatgccagctgcgattgcctgttggatcc-3’，该探针的最小序列是：5’-atgccagctgcg-3’。
按上述探针序列制成的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的试剂盒。
本发明的有益效果是：通过检测作物本身所具有的内源参照基因(Endogenous Reference Gene)，如：玉米的醇溶蛋白基因(Zein)，可以测定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源基因，如：IVS2和PAT基因的边界相连基因片段等可以测定样品中转基因作物的DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因Ct值之差(ΔCt)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品及其加工产品中转基因成分的百分含量。用于转基因产品定量检测的引物和探针也可以对转基因产品进行定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明实时荧光PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
(四)附图说明：
图1为实时荧光PCR检测原理示意图。
图2转基因产品实时荧光检测曲线图。
(a)外源基因出现PCR扩增，
(b)内源参照基因出现PCR扩增。
图3非转基因产品实时荧光检测曲线图。
(a)外源基因未出现PCR扩增，
(b)内源参照基因出现PCR扩增。
(五)具体实施方式：
实施例1
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测BT11玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：IVS2和PAT基因的边界相连基因片段。
引物：5’-ctgggaggccaaggtatctaat-3’5’-gctgctgtagctggcctaatct-3’。
探针：5’-cgagggaacacgggagtctg-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米BT11品种的试剂盒。
实施例2
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测MON810玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：Maize genome和CaMV35S基因的边界相连基因片段。
引物：5’-t cgaaggacgaaggactctaacg-3’、5’-tccatctttgggaccactgtcg-3’。
探针：5’-gcccagctatctgtcacttt-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米MON810的Maizegenome和CaMV35S基因的边界相连基因片段的试剂盒。
实施例3
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测MON810玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：HSP70和CryIA(b)基因的边界相连基因片段。
引物：5’-agtttcctttttgttgctctcct-3’、5’-gatgtttgggttgttgtccat-3’。
探针：5’-ccaactgacactatattgct-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米MON810的HSP70和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的试剂盒。
实施例4
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测176玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：CDPK和CryIA(b)基因的边界相连基因片段。
引物：5’-ctctcgccgttcatgttcgt-3’、5’-ggtcaggctcaggctgatgt-3’。
探针：5’-atggacaacaaccccaacatc-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米176的试剂盒。
实施例5
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测T14/T25玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：PAT和CaMV35S！基因的边界相连基因片段。
引物：5’-atggtggatggcatgatgttg-3’、5’-tgagcgaaaccctataagaaccc-3’。
探针：5’-atctgggaactactcacaca-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米T14/T25的PAT和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的试剂盒。
实施例6
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测T14/T25玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：CaMV35S和PAT基因的边界相连基因片段。
引物：5’-ccttcgcaagacccttcctctata-3、5’-agatcatcaatccactcttgtggtg-3’。
探针：5’-tggctctgtcctaaagttca-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米T14/T25的CaMV35S和PAT基因的边界相连基因片段的试剂盒。
实施例7
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测CBH-351玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：Cry9C和CaMV35S！基因的边界相连基因片段。
引物：5’-tactacatcgaccgcatcga-3’、5’-cctaattcccttatctggga-3’。
探针：5’-cgtgcccgtgaacccagctc-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米CBH-351的试剂盒。
实施例8
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，检测GA21玉米转基因产品外源基因(转基因成分)。
检测基因：OTP和mEPSPS基因的边界相连基因片段。
引物：5’-acggtggaagagttcaatgtatg-3’、5’-tctccttgatgggctgca-3’。
探针：5’-acctgccgccgctgtctatg-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测转基因玉米GA21的试剂盒。
实施例9
用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列和试剂盒，用于检测玉米内源基因。
检测基因：zein。
引物：5’-cctatagcttcccttcttcc-3’、5’-tgctgtaatagggctgatga-3’。
探针：5’-taagatgccagctgcgattg-3’。
试剂盒：应用该探针制成的用于检测玉米和/或转基因玉米内源基因的试剂盒。
检测主要仪器：超净工作台、消毒灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机、低温冰箱，冷藏冷冻冰箱、纯水器、双蒸水器、旋涡震荡器、微量进样器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
检测主要试剂：10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、引物和探针(按探针序列制成试剂盒)等。
实时荧光PCR检验所用引物和探针序列如实施例1～9所述。
实时荧光PCR反应体系：
试剂名称 贮备液浓度 加入体积(μL)
10×PCR缓冲液 5.0
MgCl2 25mol/μL 5.0
dNTP 2.5mol/μL 2.0
UNG酶 1U/μL 0.5
引物 20p mol/μL 正0.25反0.25
探针 10p mol/μL 0.3
Taq酶 5U/μL 0.25
DNA模板a 20ng/μL～30ng/μL 5μL
ddH2O 补足至反应总体积50μL
注1：a为原料的模板量，加工产品应视加工程度增加模板量。
注2：不同仪器，PCR反应体积不同，各试剂应按比例调整。
实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃/2min(使用UNG酶时需此步骤)，预变性95℃/10min，40个循环：95℃/15s，60℃/1min。
注：不同仪器应将反应参数作适当调整。
仪器检测通道的选择：PCR反应管荧光信号收集的设置，应与探针所标记的报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
上机运行：按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器，开始运行进行实时荧光PCR反应。
结果分析与计算：
定性分析：
基线的设置：实时荧光PCR反应结束并分析后，应设置无效基线范围。无论采用任何荧光通道基线范围选择在3-20个循环；阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
结果判断：待测样品外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测Ct值23-30者，表明未检出×××基因；待测样品外源基因检测Ct值28-34，内参照基因检测Ct值23-30者。表明检出×××基因。
定量分析：
用EXCEL或其它方法计算数据，可以创建以DNA浓度(x)对应循环数Ct值(Y)的标准曲线。对于样品DNA的浓度，可以根据回归方程logX＝Y-b/m计算(b为交叉点值，m为斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-内源基因Ct值。将ΔCt值代入方程，即可得出样品中某一外源基因的相对含量。
如图2所示，(b)内源基因出现了PCR扩增，(a)外源基因也出现了PCR扩增，表明该样品检测出了外源转基因成分，即为转基因产品。
如图3所示，(b)内源基因出现了PCR扩增，(a)外源基因未出现PCR扩增，表明该样品未检测出外源转基因成分。
按常规探针制备合成方法制造。
Claims (20)
1、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米BT11品种，检测IVS2和PAT基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-tgtcgagatccgagggaacacgggagtctgcccctgagac-3’，探针的最小序列是：5’-ggaacacgggag-3’。
2、根据权利要求1所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米BT11品种，检测IVS2和PAT基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-cgagggaacacgggagtctg-3’。
3、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米MON810品种，检测Maize genome和CaMV35S基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-ctttgccattgcccagctatctgtcactttattgtgaaga-3’，探针的最小序列是：5’-agctatctgtca-3’。
4、根据权利要求3所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米MON810品种，检测Maizegenome和CaMV35S基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-gcccagctatctgtcacttt-3’。
5、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米MON810品种，检测HSP70和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-ctagtatctaccaactgacactatattgcttctctttaca-3’，探针的最小序列是：5’-ctgacactatat-3’。
6、根据权利要求5所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米MON810品种，检测HSP70和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-ccaactgacactatattgct-3’。
7、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米176品种，检测CDPK和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-ggatccaacaatggacaacaaccccaacatcaacgagtgca-3’，探针的最小序列是：5’-caacaaccccaa-3’。
8、根据权利要求7所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米176品种，检测CDPK和CryIA(b)基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-atggacaacaaccccaacatc-3’。
9、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米T14和/或T25品种，检测PAT和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-taattcccttatctgggaactactcacacattattatagaga-3’，探针的最小序列是：5’-gggaactactca-3’。
10、根据权利要求9所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米T14和/或T25品种，检测PAT和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-atctgggaactactcacaca-3’。
11、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米T14和/或T25品种，检测CaMV35S和PAT基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-tttgtggctctgtcctaaagttcactgtagacgtc-3’，探针的最小序列是：5’-tctgtcctaaag-3’。
12、根据权利要求11所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米T14和/或T25品种，检测CaMV35S和PAT基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-tggctctgtcctaaagttca-3’。
13、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米CBH351品种，检测Cry9C和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-gatcgtgcccgtgaacccagctcgcgaggccga-3’，探针的最小序列是：5’-cccgtgaaccca-3’。
14、根据权利要求13所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米CBH351品种，检测Cry9C和CaMV35S！基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-cgtgcccgtgaacccagctc-3’。
15、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米GA21品种，检测OTP和mEPSPS基因的边界相连基因片段的探针的最大序列是：5’-cgctgtcgtacctgccgccgctgtctatggcgcccaccgt-3’，探针的最小序列是：5’-gccgccgctgtc-3’。
16、根据权利要求15所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测转基因玉米GA21品种，检测OTP和mEPSPS基因的边界相连基因片段的探针优选序列是：5’-acctgccgccgctgtctatg-3’。
17、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测玉米Zein内源基因的探针的最大序列是：5’-gggtgataaaggtaagatgccagctgcgattgcctgttggatcc-3’，探针的最小序列是：5’-atgccagctgcg-3’。
18、根据权利要求17所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：用于检测玉米Zein内源基因的探针优选序列是：5’-taagatgccagctgcgattg-3’。
19、根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18所述的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的探针序列，其特征是：探针的5′端标记荧光报告基团，探针的3′端标记荧光淬灭基团，两者可构成能量传递结构。
20、用于转基因玉米实时荧光PCR检测的试剂盒，其特征是：如权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19的探针序列制成的用于转基因玉米实时荧光PCR检测的试剂盒。
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