CN1429274A - 包括间接电化学再生nad(p)h的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在单加氧酶催化的酶催化底物反应中进行间接电化学再生NAD(P)H的方法。本发明特别涉及通过酶2－羟基联苯3－单加氧酶的催化来电酶解制备2，3－二羟基苯基衍生物的方法，同时将通过氧的还原分裂产生的NAD+进行电化学还原。

Description

包括间接电化学再生NAD(P)H的方法
本发明涉及从氧的酶催化还原分裂产生的NAD(P)H+间接电化学再生NAD(P)H的方法。本发明的电化学再生方法特别适于电酶解、消耗NAD(P)H的转化，尤其是通过单加氧酶进行的底物的氧化酶催化转化。本发明尤其涉及通过单加氧酶催化制备2，3-二羟基苯基衍生物的电酶解方法。
在实验室和多数工业应用的有机合成中，生物催化反应变得越来越重要。特别是，酶催化转化的高区域性和立体选择性以及其温和的条件和高产率使其成为合成计划中的有吸引力的方法。尽管氧化还原酶在合成中有很大的潜力，但是，与已经在许多不同方法中使用的水解酶相比，用于对映体选择性还原和化学、区域和对映体选择性氧化的氧化还原酶的使用还不是非常广泛。原因是有效进行辅因子再生的问题到现在还没有得到满意的解决。除了酶结合型辅因子再生[1a，b，c，d]的确定方法外，现在已发展了电化学方法并将其应用于NAD(P)+和NAD(P)H依赖型酶[2a，b，c]。间接进行电化学辅因子再生的优点在于仅需要生产酶，因此不需要对双酶体系进行经常的困难性优化。而且，不需要酶的辅被作用物。
单加氧酶在合成中非常重要，因为其能够将氧官能团区域性地和选择性地引入到其底物中。为了此目的，它们需要其O-O键用形成的水还原性地分开的氧分子[3a，b]。单加氧酶的天然辅因子、NADH或NADPH为该目的传递所需要的还原等价物。用单加氧酶作为生产酶的先前的体外法是利用甲酸脱氢酶[4a，b](为NADH或NADPH)和磷酸葡萄糖脱氢酶[5](为NADPH)基于酶结合型的辅因子再生。
Reipa等人[10]记载了假单孢氧还蛋白的电化学再生方法，该假单孢氧还蛋白是细胞色素CYP 101单加氧酶(E.C.1.14.15.1)的天然氧化还原配偶体。该方法建议使用适于假单孢氧还蛋白还原的特殊的搀杂锑的氧化锡电极。
Held等人[8]记载了利用大肠杆菌JM 101(PHDT 461)的完整细胞来生物催化制备3-苯基儿茶酚。将所述的重组微生物进行设计而用于制备酶2-羟基联苯3-单加氧酶。就此而言，不需要进行消耗NADH的电化学再生，因为完整的大肠杆菌细胞的酶催化体系能够使辅因子进行再生。
本发明的一个目的是提供间接电化学再生NAD(P)H的不使用酶的、选择性的有效方法，该方法通过与单加氧酶结合而适于用氧的还原分裂对底物进行氧化转化。另一个目的是提供一种利用间接电化学再生NAD(P)H促进2，3-二羟基苯基化合物(例如，2，3-二羟基联苯)的酶催化、单加氧酶催化合成的方法。
已发现该目的通过提供式I的2，3-二羟基苯基衍生物的电酶解制备方法来实现，
Figure A0180952800071
其中R是未取代的、一取代的或多取代的苯基、C1-C6烷基、卤素或CN；和
R′是H或OH；
该方法包括
a)在NADH和氧气存在下，利用2-羟基联苯3-单加氧酶
(HbpA)(E.C.1.14.13.44)转化式II的一羟基苯基化合物其中R和R′具有上面提到的含义；和
b)将形成的NAD+电化学还原成NADH。
上述目的还可通过提供在底物的消耗NAD(P)H的氧化酶催化转化中再生NAD(P)H的方法来实现，该方法包括在NAD(P)H存在下以及优选的耗氧的条件下进行可氧化型底物的消耗NAD(P)的氧化酶催化转化，然后将在底物的氧化过程中形成的NAD(P)+电化学还原成NAD(P)H。例如，将可氧化型底物和NAD(P)H依赖型单加氧酶(来自分类E.C.1.14.-.-)一起在NAD(P)H和氧气存在下保温，然后将在氧的还原分裂和底物的氧化过程中形成的NAD(P)+电化学还原成NAD(P)H。
本发明第一次在耗氧、单加氧酶催化的反应内进行不依赖于酶的间接电化学再生NADH或NADPH。由于间接电化学再生辅因子，所以能够进行连续的底物转化。
按照本发明的“间接”电化学再生NAD(P)H的方法，辅因子通过适当的氧化还原催化剂进行再生，该催化剂将还原所需的电子从阴极传递到被氧化的辅因子。
本发明的第一方面涉及制备式I的2，3-二羟基苯基衍生物的电酶解方法，
Figure A0180952800081
其中R是未取代的苯基或者是被例如卤素(例如，F、Cl、Br或I)、CN或OH、特别是OH单取代的或者多取代的苯基；直链或支链的C1-C6烷基，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基以及正戊基或正己基；卤素，例如F、Cl、Br或I；或者是CN；R′是H或OH，R′在苯环的2-羟基基团的间位或对位，优选在对位，其中a)在NADH和氧气存在下，利用2-羟基联苯3-单加氧酶(HbpA)(E.C.1.14.13.44)转化式II的一羟基苯基化合物
Figure A0180952800091
其中R和R′具有上面提到的含义；和b)将生成的NAD+电化学还原成NADH。
优选电化学还原NAD+在氢化铑氧化还原催化剂存在下进行，该催化剂可通过阴极制备并能够再生。在该上下文中，氧化还原催化剂是优选的可溶性铑络合物，该铑络合物于阴极电势-650～-800mV(相对于Ag/AgCl(饱和的)的测定值)电化学转化成氢化铑络合物(pH＝6-9；T＝20-60℃，特别是约20至35℃，例如大约30℃)。
为了进行HbpA催化的反应，特别优选式III的铑络合物
           [CpRh(III)(bpy)Cl]Cl     (III)其中Cp是环戊二烯基或五甲基环戊二烯基，和bpy是2，2′-二吡啶基，所有的吡啶环都是未取代的或者是被供电子基团单取代或者多取代的，特别是单取代的，所述的供电子基团选自甲基、甲氧基和乙酰氨基。优选所有的吡啶环在4位或5位具有一个所述的取代基。特别是，具有相同供电子基团的吡啶环被取代。
在本发明的HbpA催化参与的方法中，将式III的铑络合物阴极还原成式IIIa的氢化铑络合物
[CpRh(I)(bpy)H]Cl，其中H作为质子
或                                            (IIIa)
[CpRh(III)(bpy)H]Cl，其中H作为氢化物离子其中Cp和bpy具有式III的上面提到的含义，然后所述的氢化铑络合物能还原NAD+。
本发明的式I的二羟基化合物的制备优选在如下条件下进行：
a)底物浓度：(式II的化合物)：0.01-50mM，特别是0.1-4mM；
b)NAD+浓度：0.01-5mM，特别是0.01-0.5mM；
c)铑络合物浓度：1μM至5mM，特别是5μM至0.5mM；
d)HbpA浓度：1-5000U/l，特别是10-1000U/l；
e)FAD浓度：0-200μM，特别是0-20或1-20μM；
f)过氧化氢酶浓度：0至1×107U/l；
g)pH：4-9，特别是6-7.5；
h)温度：10-40℃，特别是20-35℃或约30℃；
i)阴极电势：-600至-900mV，特别是-650至-800mV；
j)氧气输入量：20-120cm3/(min·l)，通过吹入或特别是通过氧气可渗透性膜或管料进行无气泡吹入，例如按照[11]中描述的方式进行。
例如，本发明所用的电极系统记载于[12]和[13]中。适当的阴极/阳极对的代表性非限制性例子为：碳阴极/铂阳极，例如特别是圆柱形的碳阴极(碳垫，Sigraflex)/铂丝阳极。
根据本发明进行转化的式II的底物通常是易得到的化合物，并且可以是购买的或在有机化学中利用常规方法制备的化合物。可提到的非限制性例子为：
2-羟基-C1-C6-烷基苯、2-羟基卤代苯、2-羟基苯甲腈以及所述的苯衍生物的2，5-二羟基类似物；2-羟基联苯和多羟基化的联苯，例如2，4-、2，5-或2，6-二羟基联苯；2，n′-二羟基联苯(n′＝2，3或4)；或2，n′，m′-三羟基联苯(n′和m′互不相同，在每种情况下可为2、3或4)。
本发明所用的氧化还原催化剂是优选的[CpRh(bpy)Cl]Cl络合物。所述络合物的制备通常是公知的并且按照[14]或[15]中记载的方法进行。于-700mV(相对于Ag/AgCl饱和)进行电化学还原后形成的或利用甲酸盐的其它化学还原形成的氢化铑络合物将NAD(P)+迅速地并定量地转化成活性酶1，4-NAD(P)H形式[2，6]。
可提到的可用型酶的代表性例子是来自P.azelaica的2-羟基联苯3-单加氧酶(HbpA，E.C.1.14.13.44)(以黄素依赖型单加氧酶分类来表示)，其需要NADH作为辅因子[7]。所述的酶是总量为256kDa的同型四聚体，能对许多α-取代的苯酚衍生物进行选择性的邻位羟基化。不可能以可比的选择性以化学方式进行所述反应。
图1：HbpA反应的原理HbpA催化的反应优选在含水反应介质中进行，利用常用的缓冲物质(例如HEPES、PIPES和特殊的磷酸钾缓冲剂和Tris/HCl缓冲剂)将该含水反应介质的pH调节到适当的值，同时并没有对转化和电化学过程产生不利影响。该缓冲剂的浓度为20mM至0.2M，特别是约20-50mM。将pH调节至优选约6-8，特别是约7.5。
所述的反应介质还可含有常用添加剂，例如底物的加溶剂，用于所用酶的辅因子例如FAD或FMN，等。
对于氧化敏感型酶体系，抗氧化剂的适当使用是正确的。如果例如该方法导致形成对酶活性产生不利影响的过氧化氢，则反应可在以浓度1·105U/l加入的过氧化氢酶的存在下进行。
本发明还涉及电化学再生NAD(P)H的方法，该方法可用于消耗NAD(P)H的对底物的氧化酶催化转化，其中，可氧化型底物的消耗NAD(P)H的氧化酶催化转化在NAD(P)H存在下以及优选的耗氧条件下进行，并且将底物氧化过程中形成的NAD(P)+电化学还原成NAD(P)。所述的方法优选适于在单加氧酶催化的反应中进行。就此而言，将可氧化型底物和NAD(P)H依赖型单加氧酶(来自分类E.C.1.14.-.-)一起在NAD(P)H和氧气的存在下保温，然后将在氧的还原分裂和底物氧化过程中形成的NAD(P)+电化学还原成NAD(P)H。
根据本发明的优选变体，电化学还原NAD(P)+在优选的可溶性氢化铑氧化还原催化剂存在下进行，该催化剂可通过阴极制备并能够进行再生。
在本发明的方法中，NAD(P)H再生所用的氧化还原催化剂优选是铑催化剂，该铑催化剂可于阴极电势-650mV至-800mV(相对于Ag/AgCl(饱和的)的测定值)电化学转化成氢化铑络合物(pH＝6-9；T＝20-60℃，特别是约20至35℃，例如大约30℃)。
在本发明的NAD(P)H再生方法中优选使用式III′的铑络合物
             [CpRh(III)(bpy)Cl]Cl       (III′)其中Cp是环戊二烯基或五甲基环戊二烯基，和bpy是2，2’-双吡啶基，所有的吡啶环都是未取代的或者是被供电子基团单取代或多取代的，特别是单取代的，所述的供电子基团选自甲基、甲氧基和乙酰氨基。而且，含有的供电子基团可以是衍生自聚乙二醇(例如，从PEG2000至20000)的基团。优选所有的吡啶环在4位或5位具有一个所述的取代基。特别是，具有相同供电子基团的吡啶环被取代。
将式III′的铑络合物阴极还原成式IIIa′的氢化铑络合物
[CpRh(I)(bpy)H]Cl，其中H作为质子
 或                                            (IIIa′)
[CpRh(III)(bpy)H]Cl，其中H作为氢化物离子其中Cp和bpy具有式III′的上面提到的含义，然后所述的氢化铑络合物能够还原NAD+。
本发明的NAD(P)H再生方法优选在如下实验条件下进行：
a)NAD(P)+浓度：0.01-5mM，特别是0.01-0.5mM；
b)铑络合物浓度：1μM至5mM，特别是5μM至0.5mM；
c)单加氧酶浓度：1-5000U/l，特别是10-1000U/l；
d)辅因子浓度(例如FAD)：0-200μM，特别是0-20或1-20μM；
e)过氧化氢酶浓度：0至1·107U/l；
f)pH：4-9，特别是6-7.5；
g)温度：10-40℃，特别是20-35℃或约30℃；
h)阴极电势：-600至-900mV，特别是-650至-800mV；
i)氧气输入量：20-120cm3/(min·l)，通过吹入或特别是通过氧气可渗透性膜或管料进行无气泡吹入，例如按照[11]中描述的方式进行。
根据本发明进行转化的底物通常是易得到的化合物，并且可以是购买的或者在有机化学中利用常规方法制备的化合物。
本发明所用的氧化还原催化剂优选是[CpRh(bpy)Cl]Cl络合物。所述络合物的制备通常是公知的并且可按照[14]或[15]中描述的方法进行。于-700mV(相对于Ag/AgCl饱和)进行电化学还原后形成的或利用甲酸盐的其它化学还原形成的氢化铑络合物将NAD(P)+迅速并定量地转化成活性酶1，4-NAD(P)H形式[2，6]。
反应优选在含水反应介质中进行，已经用不会对转化和电化学过程产生不利影响的常规缓冲物质，例如HEPES、PIPES和特别是磷酸钾缓冲剂和Tris/HCl缓冲剂，调节该反应介质的pH，该缓冲剂的浓度为20mM至0.2M，特别是约20-50mM。将pH调节至优选约6-8，特别是约7.5。
反应介质还可含有常用添加剂，例如底物的加溶剂，用于所用酶的辅因子例如FAD或FMN，等。
对于氧化敏感型酶体系，抗氧化剂的适当使用是正确的。如果该方法导致形成对酶的活性产生不利影响的过氧化氢，则反应可在例如以浓度1·105U/l加入的过氧化氢酶的存在下进行。
本发明的NAD(P)H再生方法优选用于包含氧化酶催化转化的如下反应类型：
a)饱和或不饱和的脂肪族或芳香族碳原子的氧化，特别是通过羟基化、环氧化和Baeyer-Villiger氧化进行的氧化；
b)硫或硒的氧化；
c)氮的氧化或磷的氧化；
d)卤化物的氧化。
反应类型a)的非限制性例子：
(1)例如记载于JP 75/54957(Takeda)中的脂肪族碳的羟基化：
(2)利用细胞色素P450单加氧酶催化的长链脂肪酸的ω-羟基化；例如，其记载于DE-A-199 35 115.5(BASF AG)中。
(3)烯丙型或苄型碳的羟基化
Figure A0180952800141
H.Fretz，W.D.Woggon，R.Voges Hel.Chim.Acta，1989，72，391-400
H.L.Holland，T.S.Manoharan，F.Schweizer Tetrahedron：Asymmetry，1991，2，335-338
(4)环氧化：
Figure A0180952800143
S.W.May，B.J.Abbot J.Biol.Chem.1973，248，1725-1730(5)Baeyer-Villiger氧化：Robert等人，J.Mol.Cat.B Enzymatic，1998，4，111，ff(6)杂芳族化合物的氧化：在所有情况下都是用环己酮单加氧酶进行催化；记载于Walsh，C.T.等人的Angew.Chem.，1988，100，242和Roberts等人的J.Mol.Cat.BEnzymatic，1998，4，111。
本发明还涉及在连续或不连续的电化学再生NAD(P)H中、优选在耗氧的氧化反应中、特别是在单加氧酶催化的氧化反应中、特别是在上述类型的氧化反应中所定义的氧化还原催化剂的用途。
最后，本发明涉及连续或不连续地进行耗氧反应、特别是单加氧酶催化的电酶解反应的生物反应器，该生物反应器包括反应室内的一对电极和单相或双相液体反应介质，所述的反应介质含有酶、特别是单加氧酶、底物、NAD(P)H辅因子和如上定义的氧化还原催化剂，电极电势适于将氧化还原等价物(电子)传递到阴极上的氧化还原催化剂。
生物反应器的适当类型的例子记载于[16]和[17]中，在此将该文献引入作为参考。
本领域的技术人员可以将反应器的操作和工艺控制调节至所需的氧化还原反应的特殊需要。单相或双相反应介质可以将反应室进行分隔。双相反应体系例如在底物的转化和/或产物的形成中是有利的，该产物(如果有的话)在含水反应介质中仅仅是微溶的。例如，能够在有机相中提供底物。将所述的底物连续地释放到在其中进行转化的水相中，然后将形成的产物适当地释放回到有机相。例如，分隔使得酶催化反应和电极反应在空间和时间上分离。优选通过通入气体而引入氧气，特别是按照Rissom在[4b]中描述的无气泡穿过，在此将该文献引入作为参考。
下面参照附图更详细地解释本发明。
图1表示本发明的2，3-二羟基联苯的形成和同时进行的电化学再生NADH的电酶解过程；在阴极形成并再生氢化铑(III)氧化还原催化剂。将氢化物离子传递到NAD+形成NADH后，所述的NADH还原单加氧酶(例如2-羟基联苯3-单加氧酶的辅基FAD)生成具有活性的FADH2官能团。然后酶的所述的还原形式在氧气存在下对底物的氧合进行催化，例如将2-羟基联苯生成2，3-二羟基联苯。
图2表示在间接电化学再生中O2对NADH形成的影响(■表示没有引入加压空气；○表示以10cm3/min引入加压空气)。
图3表示氢化物氧化的假定机理。
图4表示在间接电化学再生辅因子中氧气含量对2，3-二羟基联苯形成的影响(○表示没有将氧气引入溶液；■表示1小时后开始引入氧气)。
图5表示对化学的和间接电化学的氢化铑形成的转化速率进行的比较(○表示用甲酸盐作为还原剂的氧化还原催化的化学再生；■表示间接电化学再生)。
图6表示包括配备有搅拌器的反应容器、环阴极、中心阳极、参比电极和将加压空气引入反应介质的进料在内的适当的间歇式反应器。
实施例1：2-羟基联苯生成2，3-二羟基联苯的电酶解氧化
根据图1，电酶解转化在图6中示意描述的间歇式电解池中进行。在此所用的阴极是圆柱形碳垫电极(体积约为27cm3)。利用渗析管(除去量10kDa)将铂反电极封住而获得分开电池的条件。
将阴极电势相对于Ag/AgCl饱和管电极调节至-750mV。将氧化辅因子NAD+(0.2mM)、[Cp*Rh(bpy)Cl]2+(0.1mM)、FAD(20μM)、过氧化氢酶(250000U)、HbpA(19U)和底物(2mM)溶于100ml KPi缓冲剂(50mM，pH7.5)。转化于T＝30℃在5小时内进行。
通过HPLC色谱在RP-18柱上监测反应的进行，利用甲醇/水(0.1％H3PO4)60∶40作为洗脱剂。
实施例2：溶解的氧气对NADH再生的影响
由于氧气是反应顺序的一部分，所以必须检验溶解的氧气对体系组分的影响。这说明氧气通过甲酸盐化学形成的氢化铑络合物以及通过本发明(图2)电化学形成的氢化铑络合物抑制NADH的再生。从图2可以明显看出，氧气的输入量10cm3/min将NADH形成的速率从1.1mmol/l·h减小到0.27mmol/l·h。在氧气输入量为15cm3/min时，再也检测不到NADH的形成。但是，抑制作用是可逆的，因为随后将氧气的流量中断，NADH形成的速率几乎恢复到其最佳值。另外，NADH浓度达到其最大值。利用氧分子能检测到作为氢化铑络合物的反应产物的过氧化氢，图3表示可能的过氧化氢的形成。而且，通过阴极上氧气的直接还原还可在外加电势上形成过氧化氢。因此，加入过氧化氢酶是有用的，因为所述的过氧化氢酶在酶催化转化过程中分解过氧化氢。
实施例3：氧气进料对转化的影响
图4的结果表明在没有外部氧气进料的反应中，转化在一会儿后停滞约20％(开口圆圈和实心正方形分别达到约1小时)。1小时后开始氧气进料(8cm3/min)，转化速率和产物形成最高增至1.1mmol/l·h(202mg/l·h)。在该种情况下通过介质产生的转换数是11h-1。当利用甲酸钠化学产生氢化铑络合物时可以获得类似值。图5表示在上述条件下间接电化学再生辅因子的转化速率，但是连续的氧气输入量为10cm3/min，并且通过甲酸盐(c(NaHCO2)＝160mM；其它条件相同)进行氧化还原过程。产率接近经最优化的发酵或者是体外法进行酶结合的NADH再生(390mg/l·h)的50％[8]。
反应速率不是通过阴极上氢化铑络合物的形成来限制，而是通过氧分子竞争反应的氧化还原催化剂的竞争性抑制来限制(图4)。
在本发明的连续电酶解方法中，通过将整个系统分成独立的组件而能够很容易地消除溶解的氧气对间接电化学再生NADH的负面影响。随着电化学步骤在空间和时间上进行以及计量酶催化所必需的氧气将所述的氧气对NADH再生的抑制效应最小化。
通过减小无气泡穿过气体的变性作用来改善进行间歇式电解的长期稳定性。这是因为在液/气相边界处出现强烈的剪切力，并且在介质范围内导致酶的变性。对照实验表明：在恒温30℃并进行搅拌(250分钟-1)的条件下，甚至12小时后HbpA的初始活性仍大于85％。随着加压空气开始进料，所述的初始活性在1小时内最多降低70％(与进料速率有关)。利用酶催化膜反应器[9]可避免生产酶受到不均匀氧气输入的不利影响，因此可获得较长的过程运行时间。特别是，双相反应和底物的原位计量的应用以及儿茶酚产物的萃取使得能够进行有效的连续过程。
本发明第一次能够利用间接电化学再生NADH成功地进行黄素依赖型单加氧酶催化的转化。
本发明为将单加氧酶引入实验室规模以及工业使用的有机合成奠定了基础。所述的氧化酶的种类与合成有很大的关系，因为所述的酶能够将羟基引入芳族体系以及无活性的纯烃类。随着环氧化物的形成，所述的酶还将氧传递到杂原子或者双键上。另外，所述的酶还能够催化Baeyer-Villiger氧化反应。在所有的情况下，可容易得到对映体的纯产物。
下面的电化学再生NAD(P)H的概念为先前的体外法或者那些利用酶催化再生体系的方法提出了有效的且简单应用的替代品。在氧气依赖型单加氧酶的转化条件下也能够证实通用性。
参考文献
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Claims (18)

1.制备式I的2，3-二羟基苯基衍生物的电酶解方法其中R是未取代的、单取代的或多取代的苯基、C1-C6烷基、卤素或CN；和R′是H或OH；该方法包括：a)利用2-羟基联苯3-单加氧酶(HbpA)(E.C.1.14.13.44)在NADH和氧气存在下转化式II的一羟基苯基化合物其中R和R′具有上面提到的含义；和b)将形成的NAD+电化学还原成NADH。
2.按照权利要求1所述的方法，其中电化学还原NAD+在氢化铑氧化还原催化剂存在下进行，该催化剂通过阴极制备并能够再生。
3.按照权利要求2所述的方法，其中所用的氧化还原催化剂是铑络合物，该铑络合物在相对于Ag/AgCl(饱和的)测定的阴极电势-650至-800mV下电化学转化成氢化铑络合物(pH＝6-9；T＝20-30℃)。
4.按照权利要求3所述的方法，其中利用式III的铑络合物
            [CpRh(III)(bpy)Cl]Cl    (III)其中Cp是环戊二烯基或五甲基环戊二烯基，和bpy是2，2′-二吡啶基，所有的吡啶环是未取代的或者是被供电子基团单取代或多取代的。
5.按照权利要求4所述的方法，其中将式III的铑络合物阴极还原而得到能够还原NAD+的式IIIa的氢化铑络合物。
           [CpRh(I)(bpy)H]Cl         (IIIa)
6.按照权利要求1至5中的任何一项所述的方法，该方法在如下条件下进行：a)底物浓度：0.1-4mM；b)NAD+浓度：0.01-0.5mM；c)铑络合物浓度：5μM至0.5mM；d)HbpA浓度：10-1000U/l；e)FAD浓度：0-200μM；f)过氧化氢酶浓度：0至1·107U/l；g)pH：6-7.5h)温度：20-30℃i)阴极电势：-650至-800mVj)氧气输入量：20-120cm3/(min·l)。
7.从酶催化形成的NAD(P)+电化学再生NAD(P)H的方法，其中可氧化型底物的消耗NAD(P)H的氧化酶催化转化在NAD(P)H存在下进行，然后将在底物的氧化过程中形成的NAD(P)+电化学还原成NAD(P)H。
8.按照权利要求7所述的方法，其中将NAD(P)H依赖型单加氧酶(属于分类E.C.1.4.-.-)和可氧化型底物一起在NAD(P)H和氧气存在下保温，然后将在氧的还原分裂和底物的氧化过程中形成的NAD(P)+电化学还原成NAD(P)H。
9.按照权利要求8所述的方法，其中电化学还原NAD(P)+在氢化铑氧化还原催化剂存在下进行，该催化剂通过阴极制备并能够再生。
10.按照权利要求9所述的方法，所用的氧化还原催化剂是铑络合物，该铑络合物在相对于Ag/AgCl(饱和的)测定的阴极电势-650至-800mV下电化学转化成氢化铑络合物(pH＝6-9；T＝20-35℃)。
11.按照权利要求10所述的方法，其中利用式III的铑络合物
           [CpRh(III)(bpy)Cl]Cl          (III)其中Cp是环戊二烯基或五甲基环戊二烯基，和bpy是2，2′-二吡啶基，所有的吡啶环是未取代的或者是被供电子基团单取代或多取代的。
12.按照权利要求11所述的方法，其中将式III的铑络合物阴极还原而得到能够还原NAD+的式IIIa的氢化铑络合物。
            [CpRh(I)(bpy)H]Cl          (IIIa)
13.按照权利要求7至12中的任何一项所述的方法，该方法在如下条件下进行：a)NAD(P)+浓度：10μM至0.5mM；b)铑络合物浓度：5μM至0.5mM；c)单加氧酶浓度：10-1000U/l；d)FAD浓度：0-200μM；e)过氧化氢酶浓度：0至1·107U/l；f)pH：5-9g)温度：20-35℃h)阴极电势：-650至-800mVi)氧气输入量：20-120cm3/(min·l)
14.按照权利要求7至13中的任何一项所述的方法，其中氧化酶催化转化包括如下反应类型中的一种：
a)饱和或不饱和的脂肪族或芳香族碳原子的氧化，特别通过羟基化、环氧化和Baeyer-Villinger氧化进行的氧化；
b)硫或硒的氧化；
c)氮的氧化或者是磷的氧化；
d)卤化物的氧化。
15.权利要求9至12中的任何一项所定义的氧化还原催化剂在单加氧酶催化的氧化反应中连续或不连续地电化学再生NAD(P)H的用途。
16.按照权利要求15所述的用途，其中氧化反应选自：
a)饱和或不饱和的脂肪族或芳香族碳原子的氧化，特别是通过羟基化、环氧化和Baeyer-Villinger氧化进行的氧化；
b)硫或硒的氧化；
c)氮的氧化或磷的氧化；
d)卤化物的氧化。
17.以连续或不连续的方式进行单加氧酶催化的电酶解反应的生物反应器，该反应器包括反应室内的一对电极和液体反应介质，所述的液体反应介质含有单加氧酶、底物、NAD(P)H辅因子和权利要求2至5中的任何一项所定义的氧化还原催化剂，电极电势适于将氧化还原等价物(电子)传递到阴极上的氧化还原催化剂。
18.按照权利要求17所述的生物反应器，其中液体反应介质是单相或者是双相的。
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