CN116769686A - 一株高效利用二氧化碳电合成甲酸的希瓦氏工程菌及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效利用电能驱动CO2合成甲酸的希瓦氏基因工程菌及其构建方法与应用。所述基因工程菌敲除基因So_3920‑So_3921,So_1776‑So_1778,同时强化表达基因基因So_4513。使用不同表达强度的启动子替换基因工程菌中So_4513基因原始启动子,获得一系列高效利用二氧化碳电合成甲酸的菌株,通过添加钨酸盐强化关键甲酸脱氢酶催化中心后,甲酸产量显著提升。本发明公开的希瓦氏基因工程菌,利用电能催化CO2还原合成甲酸24 h后,甲酸产量达到300 mM,展现了良好的生产性能,具有较好的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效利用电能驱动CO2合成甲酸的希瓦氏基因工程菌及其构建方法与应用,属于生物技术和生物制造领域。
背景技术
石化燃料的大量消耗导致温室气体急剧升高,工业革命前近6000年大气中CO2浓度维持在280ppm上下水平,工业革命以来,CO2浓度逐年升高,2022年世界气象组织发布全球CO2平均浓度达到420ppm,比工业革命前增加50%以上,且这一趋势仍在延续。CO2浓度不断升高引起温室效应,海平面上升等问题是21世纪人类面临的重要挑战。减少CO2排放,降低大气中CO2浓度已经成为国际社会共识。近年来,中、美、欧盟等各国政府资助支持CO2的资源化开发,利用光能、电能等清洁能源将CO2转换为高价值化合物已经成为当前全球各国相关领域研究热点。
高效的催化反应需要优异的催化剂,高效稳定而特异的催化剂是电催化还原的CO2关键因素,当前大量研究深入改造阴极电极材料提升催化剂催化性能,在催化剂特异性持久性取得了重要进展,但反应条件方面、特异性和持久性方面仍有不足。生物催化剂具有条件温和,催化反应特异性强,能量消耗低,是绿色化工的重要备选策略。近年来,利用生物催化剂电合成催化CO2合成甲酸成为新的可能。早期科研人员依赖光电半导体材料钌,将高浓度Pseudomonas oxalaticus甲酸脱氢酶和甲基紫精混合,通过光照激发电子成功催化合成甲酸。近来,将来自Syntrophobacter fumaroxidans的钨依赖的甲酸脱氢酶吸附在电极表面,在-0.41V即可高效可逆地发生甲酸与CO2之间的转换,证明了甲酸脱氢酶利用电能催化CO2合成甲酸的可行性。
生物催化剂具有条件温和,催化反应特异性强,能量消耗低,是绿色化工的重要备选策略。近年来,利用生物催化剂电合成催化CO2合成甲酸成为新的可能。希瓦氏菌是电活性微生物,在电合成方面具有潜在优势。希瓦氏菌基因组编码四套甲酸脱氢酶,其中的关键催化元件尚未解析;作为电活性微生物胞外电子传递通路对甲酸产量的影响尚未见报道;此外,希瓦氏菌调控工具尚不充分。因此挖掘希瓦氏菌甲酸合成关键,探究甲酸合成电子通路,调控关键甲酸脱氢酶表达,创建希瓦氏菌高效电能细胞工厂催化CO2合成甲酸具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种高效利用二氧化碳电合成甲酸的希瓦氏基因工程菌构建方法及其应用,利用该工程菌可以实现电能驱动CO2高效生物合成甲酸,为微生物电合成还原CO2合成甲酸提供新的参考与借鉴。
本发明通过以下技术思路实现,为创建高效电能细胞工厂利用电能还原CO2合成甲酸,通过优化电合成胞外电子供给因素提升甲酸产量,利用基因工程手段鉴别关键碳还原元件,通过优化金属离子供给重塑关键甲酸脱氢酶催化活性中心,提升甲酸脱氢酶CO2还原活性。同时创建启动子文库筛选开发一系列不同表达强度且符合代谢工程需要的启动子,调控甲酸脱氢酶靶基因元件表达,提高希瓦氏菌利用电能催化CO2还原合成甲酸产量。
本发明所提供的一种高效利用二氧化碳电合成甲酸的希瓦氏基因工程菌,其特征在于在基因组水平上敲除或弱化基因So_3920-S_3921(hydAB;GenBank:AAN56895.1-AAN56895.1),So_1776-So_1778(mtrCAB;GenBank:AAN54829.1-GenBank:AAN54831.1),同时表达基因So_4513(fdhA;GenBank:AAN57477.1)。
同时将菌株在厌氧条件下培养,培养基配方为:10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/LNaCl,40mM富马酸钠、20mM DL-乳酸钠、1mM KNO3、5μM钨酸钠。在一个具体实施例中,通过创建启动子文库并筛选开发一系列不同表达强度的启动子,用使用不同表达强度的启动子替换基因工程菌中So_4513基因的自身启动子后,获得一系列高效利用二氧化碳电合成甲酸的菌株。
本发明所还提供了一种提高二氧化碳电合成甲酸效率的方法,通过添加不同浓度金属离子,优化金属离子供给重塑关键甲酸脱氢酶催化活性中心,提高希瓦氏电能细胞工厂的甲酸合成能力。
本发明提供一种高效利用二氧化碳电合成甲酸的希瓦氏基因工程菌,其在出发菌的基因组水平上敲除或弱化基因So_3920和基因S_3921(这是两个亚基),以及基因簇So_1776-So_1778。
进一步优选地,在出发菌中同时表达基因So_4513。
更具体地,基因So_3920的GenBank登录号为:AAN56895.1,基因So_3921的GenBank登录号为:AAN56896.1;所述基因So_1776的GenBank登录号为:AAN54829.1;所述基因So_1777的GenBank登录号为:AAN54830.1;所述基因So_1778的GenBank登录号为:AAN54831.1;所述基因So_4513的GenBank登录号为:AAN57477.1。
另外优选地,使用不同表达强度的启动子替换基因工程菌中So_4513基因的自身启动子。
进一步地,分别将p138,p102,p104或p110启动子敲入基因组So_4512-So_4513基因簇前端以其自身启动子。
本发明相应提供所述希瓦氏基因工程菌在利用二氧化碳电合成甲酸的应用。
本发明提供一种二氧化碳电合成甲酸的方法,其包括如下步骤:
在阴极室添加如权利要求1至5任一项所述希瓦氏菌的菌体为全细胞催化剂,以铜片或碳布为工作电极,Ag/AgCl参比电极,甲基紫精MV作为电子载体,同时阴极电解池以鼓入CO2,设置电压为-0.65至-0.85V vs Ag/AgCl,展开电合成甲酸。
优选地,甲基紫精MV的浓度1至10mM。
进一步优选地,所述希瓦氏菌的菌体的培养过程添加Na2MoO4和/或Na2WO4金属盐,更具体地,其培养过程中的培养基的配方为:10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L NaCl,40mM富马酸钠、20mM DL-乳酸钠、1mM KNO3、5μM钨酸钠;培养条件为厌氧条件。特别优选地,Na2MoO4和Na2WO4的添加量为1至100μM,优选为5μM-10μM。
本发明有益效果在于,设计构建了希瓦氏菌电能细胞基因工程菌,能够以二氧化碳为碳源,以电能做能源高效合成甲酸。创建高效电能驱动CO2转化的人工细胞体系,用于合成一碳等高附加值化学品,将有可能促进生物化工生产模式的变革,最终为打通电能到生物化学能转换提供新的前体供给和理论基础。
附图说明
图1、希瓦氏菌电合成甲酸的优化示意图。
图2、希瓦氏菌中关键甲酸脱氢酶的挖掘。
图3、强化甲酸脱氢酶催化中心提升甲酸产量。
图4、甲酸脱氢酶的体外表征。
图5、优化电子传递通路提升甲酸产量。
图6、调控甲酸脱氢酶表达提升甲酸产量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,并参照附图,对本发明作进一步的详细说明,但并不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、希瓦氏菌电催化合成甲酸系统的优化
以微生物全细胞作为催化剂,利用电能催化CO2还原合成甲酸研究较少,尚处于初级阶段,从反应器的搭建到电极材料选择,微生物全细胞菌体接种量等多种反应条件的设置影响电合成效率。为搭建微生物电合成系统,选取10mL双腔室电解池为基础搭建电化学催化平台,在阴极室添加希瓦氏菌为全细胞催化剂,以铜片为工作电极,Ag/AgCl参比电极,10mM甲基紫精MV作为电子载体,同时阴极电解池以大约60mL/min不断鼓入CO2,辰华恒电位仪作为供电装置,设置电压为-0.75V vs Ag/AgCl,作为电合成初始测试条件,展开电合成研究。开启电源后阴极电解池中甲基紫精MV逐渐被还原,颜色逐渐加深(甲基紫精MV氧化态为无色透明,被还原后变为深蓝色),说明供电装置运行良好。
将希瓦氏菌转接到反应器中,电合成系统供电启动后,分别在10h与24h用注射器吸取少量阴极池反应液,用HPLC检测电合成反应产物。HPLC结果显示,在含有希瓦氏菌的阴极池反应液中检测到有甲酸合成。为进一步验证甲酸的合成是由于希瓦氏菌全细胞利用电能催化CO2而来,我们设置相同的催化装置,以不含希瓦氏菌的反应池组作为对照实验进行测试。结果显示,在不含希瓦氏菌的电化学系统中,无法监测到甲酸的合成。由此,我们推测希瓦氏菌是电合成系统中合成甲酸的唯一催化剂。
微生物电合成过程中,阴极电子的高效供给是电合成中的重要因素。以铜片作为阴极电极是电催化还原CO2的常用材料,但是实验过程中在我们的电解池中存在口径的限制,难以使用较大面积的铜片。为提高甲酸合成产量,将1cm2的铜片电极更换为4cm2的碳布作为阴极电极进行测试。结果如图1显示,以较大面积的碳布作为阴极供电电极,甲酸产量显著提升由10.5mM提升至39.6mM。电子载体负责电极与菌体之间电子的传递,提高电子载体浓度有利于电子传递穿梭速度。为测试电子载体对甲酸产量的影响,分别以1mM,2.5mM,5mM,10mM浓度甲基紫精MV装配电合成系统,测试电催化还原CO2合成甲酸的能力。结果显示,反应器中不添加甲基紫精无法合成甲酸,甲酸产量随甲基紫精MV浓度增加而增加,24h甲酸产量分别为5.5mM,17.8mM,28.7mM,39.6mM,进一步说明外源电子供给的重要性。
实施例2、希瓦氏菌中催化CO2还原关键元件的挖掘鉴定
甲酸脱氢酶是电能催化CO2还原的潜在催化元件。生物信息学分析显示,希瓦氏菌编码四套甲酸脱氢酶,其中三套(So_0101-So_0103,FdnGHI;So_4508-So_4511,Fdh1αβγ;So_4512-So_4515,Fdh2αβγ)是以基因簇形式存在于基因组,并且这些亚基均含有翻译后双精氨酸转运信号肽(twin-arginine translocase,Tat),并且末位亚基γ亚基含有多次跨膜疏水区,因此推测这三套蛋白是锚定于希瓦氏菌细胞内膜外侧周质空间的多亚基复合体。另外基因组So_0988编码一个不含Tat信号肽的单亚基甲酸脱氢酶,因此推测可能位于细胞质内,参与细胞内甲酸其他氧化还原代谢。
以希瓦氏菌中催化大亚基氨基酸序列进一步通过进化树分析发现,四套甲酸脱氢酶分别位于进化树三个分支,So_4509和So_4513相似度较高,可能是在基因组进化中发生基因重复导致。此外,在进化树上二者与扭脱甲基杆菌FDH处于同一分支,扭脱甲基杆菌中Fdh是高效的碳还原元件,因此,二者是潜在的高效CO2催化合成甲酸元件。So_0101和大肠杆菌FDH-O,FDH-N处于同一亚分支,可能参与甲酸的氧化或用于还原硝酸盐呼吸。So_0988和大肠杆菌中FDH-H位于同一分支,因而可能参与H2的代谢。
为挖掘关键催化元件,利用基因工程手段构建了系列缺失关键催化亚基(α亚基)的甲酸脱氢酶突变体,并采用实施例一优化的条件测试相应突变体利用电能催化CO2还原合成甲酸效果。结果显示,在单突变体中ΔSo_0101菌株对于电合成甲酸影响不大,ΔSo_4509与ΔSo_4513显著降低了甲酸的产量,基因的缺失导致甲酸产量下降了50.7%和73.4%,因此这两者是潜在的靶标元件。电合成过程中甲酸脱氢酶可能共同催化合成甲酸,为进一步阐明三个甲酸脱氢酶对甲酸的产量的影响,我们又以双突、三突等多突变体进行全细胞电合成测试。结果如图2显示,以菌株ΔSo_0101ΔSo_4509ΔSo_4513为催化剂未能检测到甲酸的合成,由此说明以上三个基因编码的甲酸脱氢酶中存在重要的催化元件。ΔSo_4509ΔSo_4513菌株电合成甲酸产量仅为2.0mM,以ΔSo_0101ΔSo_4509菌株为催化剂电合成甲酸产量为38.8mM,与野生型相当水平。以ΔSo_0101ΔSo_4513菌株为催化剂电合成合成甲酸产量18.8mM,甲酸产量下降明显。以上结果初步确定So_4513编码的FDH是关键的碳还原元件。
除此之外,目标元件的表达是影响电合成效果的重要因素。由于目标基因在基因组上以基因簇形式存在,因此,我们将目标基因所在的基因簇启动子克隆(目标基因簇ORF上游400bp),并以lacZ为报告基因做进一步表征。结果显示,厌氧条件下在p0101启动子驱动下lacZ表达水平最高为(332.9U/mg),p4508表达居于中等水平为(76.4U/mg),p4513启动子表达强度最低为(15.3U/mg)。由此推测在基因组上相应的甲酸脱氢酶表达水平与此相似,结合电合成产甲酸产量以及启动子表达强度,综上所述,推测So_4513编码的甲酸脱氢酶是希瓦氏菌中的关键碳还原元件。
其中p4513启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO:5):
GTTCTAGATCAAATCCTACTCAATTTTTTCCTACTATATTGCCGTCACGCGCGATGATTAACGGCAAGCAAGATGATTTA
ATTATCTTTTTCACCTCTAATCTTCACTTTTTGATAACAAGCACCATCTCCTCGAAAAGTCGCGCCGTCCCAAAAACCAT
AACCCCTATTTCAGGAGTCAGCATGAAGCAACAACCTAGCGATTTATCTCGCCGTTCTTTGCTTAAAGCACTCACCGTTG
GCAGCGTAGCCGGCGCAGCAATTGCCGCTACCGGCATCAGTGCAGCCCAAGCCAGCGAGAGCAGCAAGGTAACAACTAAAGAGCCTAAGGGTTACCACGAAACTGCGCACATTATCAGCTATTACGATAGCCTGCGTAGCTAATCTAGGAGAAGTCAGCG。p0101启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO:6):
GTCTATCCATCTAAAACAAGTAAATCTGAGGCTGTTTTAGTCTTTGCTTATTTCGTTTTGTATTTATATTGAAGCTTGAT
ATAACCATAGTTGCATATTGTGGGACAAAATGGGCTTGATAATGTGGACAAAATGTCTTTTTATTGTATTTGGTTTTTTA
GGCTTTGGTTTTGTGATTTGTCAGTTATATATTCTTTGTTTTATTACTTAAAGTTGTTTGTTTGGGTGTTAATCCTGTCG
TTGGTTATTTGAGATCTTGATCTCATGTCATTATTTGTTATCTATTTGCACTTTGAGGATAATCTTAAATTAAGTGAGGACTTTATTGGCTCACTCAAACGATTGCAGCTTTACCACTGCAATCATCTAACTCATAACGACAAAAGTGTGAGAGAACGCT。p4508启动子的核苷酸序列(SEQ ID NO:7):
AACAAGCGGAATTAATGAACTAAAAGGCAACTTGCGATGAGCATCTGCATGCCTACCGCATATAAGTTTGATAGGCAAAG
GTGGGCTTAAAGTTCACCTTTGCCACAAAAAGGAAGCTTAAGCTTCCACAGTAACCGAGGTGGTCTGGCTACAAATCACC
TCACTCAGTAACACAAGGAGACACTATGAAGAAGCAAGCTTCCGACATGGGCCGTCGTCAACTGCTCAAAGCATTGGCTC
TTGGCAGTGCGGCTGGCGCGGTCGCGACGGTGAGTAGCCAAGCATTGGCTGCCACACCCACTGTTGCCCCAAGCGAACCTAAGAGTGACAACTATCGCGAAACCGACCATATCCGTAATTACTATGCGTCGTTGAACAACTAACCAGAGGAGTGTGTGTG。
实施例3、强化金属催化中心提升甲酸催化活性
多种微生物中将目标金属盐(Na2MoO4和Na2WO4)直接添加到培养基(配方为:10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L NaCl,40mM富马酸钠、20mM DL-乳酸钠、1mM KNO3)中,能够促进细胞金属辅因子合成,蛋白组装折叠过程中可以在一定程度上强化金属催化中心催化活性。我们推测,希瓦氏菌培养过程中添加不同浓度金属离子,也能够强化甲酸脱氢酶金属催化中心组装,提升甲酸脱氢酶催化活性,并在电能细胞工厂中提升甲酸产量。为此,我们在希瓦氏菌厌氧培养基中分别设置不同浓度钨酸盐和钼酸盐进行培养,收集菌体后进行电合成测试。结果如图3显示,添加两种金属元素都能显著提升甲酸的产量,Na2MoO4和Na2WO4金属盐都能够显著提升甲酸产量,Na2MoO4和Na2WO4在5μM条件下都能够将甲酸产量提升4倍以上,由原来的39.6mM提升至170mM。培养过程中培养基中继续增加金属离子浓度从10μM到100μM并不能提升甲酸产量,推测5μM金属离子(Na2MoO4和Na2WO4)能够满足生物体合成金属辅酶因子的需要,并有效提升甲酸脱氢酶的催化活性。
实施例4、甲酸脱氢酶的表征
金属元素依赖的甲酸脱氢酶可以催化甲酸与CO2之间的可逆反应,为进一步深入认识关键FDH添加钨酸盐后的催化参数,我们分别以还原态甲基紫精作为电子供体,碳酸氢盐为CO2来源,在厌氧比色皿中对So_4513基因编码的甲酸脱氢酶进行表征测试。结果如图4显示,甲酸脱氢酶在CO2还原方向,最适pH为7.0,最高酶活温度为30℃,CO2还原酶活34.5U/mg。甲酸脱氢酶在甲酸氧化方向,最适pH为8.2,最适温度50℃,甲酸氧化酶活13.9U/mg。与已报道的FDH相比,该酶对CO2具有更高的亲和力,更偏向于CO2还原。
实施例5、调控与优化电子传递通路提升甲酸产量
希瓦氏菌中存在活跃的MtrCAB胞外电子传递通路,但这些电子通路在电催化还原CO2合成甲酸过程中是否促进电子向甲酸脱氢酶传递尚未报道。此外细胞周质空间存在氢化酶(HydAB)可能参与竞争来自于甲基紫精的电子,对甲酸合成造成不利。结果如图5所示,在添加钨酸钠条件下,分别将上述基因敲除测试发现,ΔmtrCAB菌株能够增加甲酸的产量,由原来的170mM增加至211mM,与野生型相比增加了12.4%,我们推测可能是MtrCAB阻碍了甲基紫精的到甲酸脱氢酶之间的穿梭。将hydAB基因敲除后,ΔhydAB对甲酸产量有一定幅度的提升,产量增加到197mM,增加了11.4%,因此我们推测甲基紫精的电子供给相对充分,HydAB生成氢气能力较弱导致。将二者同时敲除后,甲酸产量达到250mM。
以ΔmtrCΔhydAB为底盘菌株,我们利用不同强度的启动子调控目标基因So_4513蛋白表达,如图6所示。分别将p138,p102,p104,p110启动子敲入基因组So_4513基因前端,构建工程菌株进行电化学测试。
其中启动子的核苷酸序列如下:
p102(SEQ ID NO:1):GTTCTTGACGCGAGATCAGTTATAATGGATTATCCACTCGTTCCCGAGGAGCCCAGA;
p104(SEQ ID NO:2):TATGCGCGGTTTCTGTGAGTTATAATAGCGTGGCTTACTCTCGACGAGGAAAACGAC;
p110(SEQ ID NO:3):AGATTTCACCTTGTGGTGTGCTATAATCGTTTTACCGAGTTCTCACTAGGAAGGCCC G;
p138(SEQ ID NO:4):TTTTTTATGGCTTTCTTTGGTATAATACAGAGTGGGACATTCTGCAAGGAGAGATCC。
厌氧条件下这些启动子表达强度分别为p4513启动子表达强度的2-10倍。然而奇怪的是,在目标基因簇前添加稍强的启动子p102,p104,p110,均无法提升甲酸产量,反而降低了甲酸产量,其中原因尚未可知。更换稍弱启动子p138在一定程度是增加了甲酸产量达到了300mM左右,是目前已报导的生物电催化合成甲酸的最高水平。
Claims (10)
1.一种高效利用二氧化碳电合成甲酸的希瓦氏基因工程菌,其特征在于,在出发菌的基因组水平上敲除或弱化基因So_3920和基因S_3921以及基因簇So_1776-So_1778。
2.如权利要求1所述的希瓦氏基因工程菌,其特征在于,在出发菌中同时表达基因So_4513。
3.如权利要求2所述的希瓦氏基因工程菌,其特征在于,所述基因So_3920的GenBank登录号为:AAN56895.1,基因So_3921的GenBank登录号为:AAN56896.1;所述基因So_1776的GenBank登录号为:AAN54829.1;所述基因So_1777的GenBank登录号为:AAN54830.1;所述基因So_1778的GenBank登录号为:AAN54831.1;所述基因So_4513的GenBank登录号为:AAN57477.1。
4.如权利要求2所述的希瓦氏基因工程菌,其特征在于,使用不同表达强度的启动子替换基因工程菌中So_4513基因的自身启动子。
5.如权利要求4所述的希瓦氏基因工程菌,其特征在于,分别将p138,p102,p104或p110启动子敲入基因组So_4513基因前端以替换其自身启动子。
6.如权利要求1至5任一项所述希瓦氏基因工程菌在利用二氧化碳电合成甲酸的应用。
7.一种二氧化碳电合成甲酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
在阴极室添加如权利要求1至5任一项所述希瓦氏菌的菌体为全细胞催化剂,以铜片或碳布为工作电极,Ag/AgCl参比电极,甲基紫精MV 作为电子载体,同时阴极电解池以鼓入CO2,设置电压为-0.65至-0.85V vs Ag/AgCl,展开电合成甲酸。
8.如权利要求7所述的二氧化碳电合成甲酸的方法,其特征在于,甲基紫精MV的浓度1至10 mM。
9.如权利要求7所述的二氧化碳电合成甲酸的方法,其特征在于,如权利要求1至5任一项所述希瓦氏菌的菌体的培养过程添加Na2MoO4和/或Na2WO4 金属盐,更具体地,其培养过程中的培养基的配方为:10 g/L 蛋白胨,5 g/L 酵母提取物,5g/L NaCl,40 mM富马酸钠、20 mM DL-乳酸钠、1 mM KNO3、5 μM钨酸钠;培养条件为厌氧条件。
10.如权利要求9所述的二氧化碳电合成甲酸的方法,其特征在于,Na2MoO4和Na2WO4的添加量为1至100μM ,优选为5μM -10μM。
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