KR101804208B1 - 포름산 합성용 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스 및 이를 이용하여 포름산을 합성하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포름산 합성용 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) 및 이를 이용하여 포름산을 합성하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 쉬와넬라 오네이덴시스가 CO2 및 전극으로부터 생성된 전자로부터의 포름산의 합성에 처음으로 사용되었으며, LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원은 24시간의 반응 후 14.1 mM의 포름산을 생성할 수 있으며, 특히 푸마르산염 및 질산염을 포함하는 배지에서 혐기적 조건하에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원은 72시간 후 136.84 mM까지의 포름산이 생성할 수 있다. 또한, 최적 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 72시간의 반응 이내의 포름산 합성에 대한 평균 반응 속도는 3.8 mM. h-1.g-1습전지였다. 이 값은 이전 연구에서 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1에 의해 촉매된 것과 비교하여 9.6배 향상된 것으로, 쉬와넬라 오네이덴시스는 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있는 미생물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

포름산 합성용 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스 및 이를 이용하여 포름산을 합성하는 방법 {Shewanella oneidensis for synthesizing formic acid and the method of synthesizing formic acid by using same}
본 발명은 포름산 합성용 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis) 및 이를 이용하여 포름산을 합성하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있는 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스 및 상기 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포 생체 촉매에 의해 촉매된 CO2로부터 포름산을 전기화학적으로 합성하는 방법에 관과한 것이다.
이산화탄소는 주로 화석 연료의 연소로 생성된다. 산업화에 따른 에너지의 과다 사용으로 대기 중의 이산화탄소의 농도가 계속 증가하고 있고, 이산화탄소의 농도 증가는 지표면에 도달한 태양광이 반사되어 대기를 통하여 지구 밖으로 나가는 과정에서 이산화탄소 가스에 흡수되어 대기 온도를 상승시키는 현상, 온실 효과를 유발시키고 있다. 이러한 온난화는 기상이변, 생태계 변화, 해수면 상승 등의 지구적 규모의 피해를 유발하고 있다. 이에 전 세계적으로 지구 환경 보존에 대한 의식고조와 함께 이산화탄소의 발생량을 억제하거나 발생된 이산화탄소를 처리하거나 활용하기 위한 대책 방안 등이 강구되고 있다. 우리나라는 특히 화석 자원이 매우 적은데도 불구하고 에너지원의 80 % 이상을 석유를 중심으로 한 화석 연료에 의존하고 있어 이산화탄소의 처리 및 변환에 관한 기술 개발이 시급하다.
현재 이산화탄소를 변환시키는 방법으로는 화학적으로 메탄올, 연료 등으로 변환시키는 법과 생물학적으로 유기물로 변환시키는 방법 등이 활발히 연구되고 있다. 이 중에서 이소시트르산탈수소효소(Isocitrate Dehydrogenase), 피브르산 탈수소효소(Pyruvate Dehydrogenase), 포름산 탈수소효소(Formate Dehydrogenase), 메탄올 탈수소효소(Methanol Dehydrogenase)를 사용하여 이산화탄소를 환원시키는 방법들이 보고되었다. 이들 중에서 이산화탄소를 포름산으로 환원시키는 연구는 상당히 장래성이 있는 방법으로 알려져 있다.
한편, 상기 효소 중 이산화탄소를 포름산으로 환원시키는 포름산 탈수소효소는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)를 전자수용체로 사용하는 것(NAD 의존성)과 사용하지 않는 것(NAD 비의존성)이 존재한다. 이 중 NDA 비의존성 포름산 탈수소효소는 이산화탄소를 제거하는 활성은 매우 우수하나, 텅스텐이나 몰리브데넘과 같은 금속이온, 철-황 클러스터 및 셀레노시스테인과 같은 매우 예민한 작용기를 포함하고 있어(비특허문헌 8 참조) 산소에 극히 불안정하기 때문에 산업적으로 이용하기 어렵다.
그러므로, 이산화탄소를 포름산으로 전환하는 효소로는 NAD 의존성 포름산 탈수소효소, 그 중에서도 특히 캔디다 보이디니(Candidaboidinii)로부터 유래한 포름산 탈수소효소(CbFDH)가 가장 대표적으로 사용된다. 상기 캔디다 보이디니 유래 포름산 탈수소효소 역시 효소를 통한 환원 반응 과정에서 이산화탄소를 감소시키는 생촉매로서 역할을 하게 되는데, 그 활성이 중성에서 0.5mU/㎎로서 지극히 낮다는 한계가 있다.
CO2의 포름산으로의 생체촉매적 환원은 환경적으로 유리한 반응 조건하에서 높은 선택성을 가지기 때문에 CO2의 극대화에 유망하고 환경적으로 유리한 접근법을 제공한다. CO2의 포름산으로의 생체촉매적 전환은 전-세포 생체 촉매(포름산 히드로겐리아제)를 사용하는 CO2의 수소화, 또는 환원력으로서 NADH 보조인자 또는 전극으로부터 생성된 전자와 함께 포름산 디히드로게나아제(즉, 분리된 효소 또는 전세포)에 의해 촉매된 CO2의 직접적인 환원을 통해 이루어질 수 있다.
비록 CO2의 수소화로부터 포름산의 효소적 합성이 많은 이점들(즉, 온화한 반응 조건뿐만 아니라 높은 반응 활성 및 선택성)을 나타낸다 할지라도, 이들 반응은 고도로 정제되고 상대적으로 비싼 수소 가스를 필요로 한다. 이러한 문제들은 안정성 문제뿐만 아니라 저장 및 수송에 대한 비용의 증가를 초래한다.
포름산의 저렴하고 안전한 생산을 위한 대안적 접근법은 전기화학 셀에서의 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1(M. extorquens AM1) 전-세포 생체 촉매에 의해 촉매된 CO2의 전기-생체촉매적 환원이다. 이 방법에서, 전극은 H2 또는 값비싼 NADH를 대신하여 환원제로서 작용한다. 그러나, M. 엑스토르켄스 AM1 전세포에 의해 촉매된 CO2 환원으로부터 포름산 합성의 전환은 상대적으로 느리다(즉, 60 mM의 포름산은 1.9 g 중량의 습전지에 의해 80 시간 촉매된 후 생성된다). 상기 언급한 반응 조건들에 대한 최적화 또는 더 나은 생체 촉매의 탐색은 CO2의 포름산으로의 전기-생체촉매적 환원의 응용에 있어서 아주 중요하다.
전자는 전극에서 FDHs의 활성 부위로 운반되기 때문에 포름산의 최종 전환에 중심적인 역할을 한다. 포름산 디히드로게나아제 뿐만 아니라 강력한 전자전달계도 가지는 미생물은 CO2의 전기-생체촉매적 환원으로부터의 포름산의 효율적 합성을 기대할 수 있다. 일반적인 미생물들 중 조건적 호기성 그람 음성 세균인 쉬와넬라 오네이덴시스(S. oneidensis)는 전자전달계(예를 들어, 시토크롬, 리덕타아제, 철-황 단백질 및 퀴논)에 대하여 잘 알려져 있다. 쉬와넬라 오네이덴시스는 전자계를 암호화하는 크고 다양한 유전자들을 가진다. 현저하게, 쉬와넬라 오네이덴시스는 어떤 다른 염기서열 분석된 생물체들(즉, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 대장균(E. coli) 및 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 각각 12개, 7개 및 32개의 c-타입 시토크롬을 가짐)보다 많은 39개의 c-타입 시토크롬을 가진다. 외막의 외표면에 노출되어 있는 지질 단백질인 두 개의 데카헴(decaheme) c-타입 시토크롬 MtrC(OmcB라 알려져 있음) 및 OmcA는 전극뿐만 아니라 금속 산화물에도 직접적으로 접촉할 수 있게 한다. 이러한 특성은 전자 공여체(즉, 전자 매개체 또는 금속 산화물의 환원된 형태) 또는 전극에서 세포로의 전자 이동을 가능하게 한다. 주목할 만한 전자전달계뿐만 아니라, 쉬와넬라 오네이덴시스는 또한 세 개의 주변세포질성(periplasmic) 포름산 디히드로게나아제를 가진다. 주변세포질에서 포름산 디히드로게나아제의 국소화(localization)는 세포 외 환경에서 효소로의 기질의 물질 이동을 가속화시킬 수 있다. 이러한 매력적인 특성들과 함께, 쉬와넬라 오네이덴시스는 전기-생체촉매적 방법을 통해 포름산의 효율적 합성을 위한 잠재적 후보물질이 될 수 있다.
이에 본 발명자는 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있는 미생물을 발견하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 쉬와넬라 오네이덴시스가 음극으로부터 생성된 전자를 사용하여 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있다는 사실을 발견함으로서 본 발명을 완성하였다. 또한, 포름산 디히드로게나아제 및 전자 운반체 단백질의 고발현을 위한 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 조건의 최적화는 포름산 합성의 현저한 향상을 가져온다는 사실을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있는 미생물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 미생물을 이용하여 CO2로부터 포름산을 합성하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있는 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis)를 제공한다.
본 발명의 바람직한 하나의 구체적인 실시양태에 따르면, 본 발명에서는 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 LB 배지에서 호기적 조건으로 배양된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 하나의 구체적인 실시양태에 따르면, 본 발명에서는 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 푸마르산염, 질산염 또는 이들 모두가 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건을 배양된 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기한 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 상기 미생물 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis)를 이용하여 CO2로부터 포름산을 합성하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는, CO2 및 전극으로부터 생성된 전자로부터의 포름산의 합성에 쉬와넬라 오네이덴시스가 처음으로 사용되었다. LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원은 24시간의 반응 후 14.1 mM의 포름산을 생성할 수 있으며, 특히 푸마르산염 및 질산염을 포함하는 배지에서 혐기적 조건하에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원은 72시간 후 136.84 mM까지의 포름산이 생성할 수 있다. 또한, 최적 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 72시간의 반응 이내의 포름산 합성에 대한 평균 반응 속도는 3.8 mM. h-1.g-1습전지였다. 이 값은 이전 연구에서 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1에 의해 촉매된 것과 비교하여 9.6배 향상된 것이었다. 전극 크기, 습전지 중량 및 pH 조절과 같은 반응 조건의 최적화는 포름산 합성의 반응 속도 및 역가에 추가적인 향상을 가져올 것으로 예상된다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 pH 7.0에서, 전-세포 생체 촉매로서 LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원으로부터 HCOOH의 합성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 혐기 조건하에서 다양한 농도의 푸마르산염이 첨가된 LB 배지 및 20 mM의 DL-젖산염(LB-젖산염)에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포에 의해 촉매된 CO2환원으로부터 포름산의 합성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 혐기적 조건하에서 다양한 농도의 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지(40 mM의 푸마르산염 및 20 mM의 DL-젖산염이 첨가된 LB 배지)에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포에 의해 촉매된 CO2환원으로부터의 포름산 합성을 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 농도의 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지(즉, 40 mM의 푸마르산염 및 20 mM의 DL-젖산염이 첨가된 LB 배지)에서 혐기적 조건하에서의 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장을 나타낸 것이다.
본 발명에서 CO2로부터 포름산의 합성에 사용하는 미생물인 쉬와넬라 오네이덴시스(S. oneidensis)는 중금속 산화물(즉, MnO2,우라늄)의 해독뿐만 아니라 생물연료 전지(biofuel cell)에 대해서도 광범위하게 연구된 조건적 호기성 박테리아이다.
본 발명에서는, CO2 및 전극으로부터 생성된 전자로부터의 포름산의 합성에 쉬와넬라 오네이덴시스가 처음으로 사용된 것이다. 따라서, 본 발명에서는 전-세포 및 분리된 생체 촉매를 이용한 CO2의 포름산으로의 전기-생체촉매적 전환은 CO2격리를 위한 대안적 루트로서의 유용성을 보여주었다.
바람직하게, 본 발명에서는 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 LB 배지에서 pH 6.5 내지 7.5에서 호기적으로 배양된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에 따르면, LB 배지에서 pH 7.0에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스는 24시간 후 CO2를 14.1 mM의 중등 농도를 가진 포름산으로 전환하는 전-세포 생체 촉매로서의 능력을 나타내었다.
바람직하게, 본 발명에서는 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 푸마르산염이 바람직하게는 10 내지 40 mM의 농도로 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건을 배양된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에 따르면, 10, 20 및 40 mM의 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된지 33시간 후에 11.5, 35.9 및 52.9 mM의 포름산이 합성되었다.
바람직하게, 본 발명에서는 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 질산염이 바람직하게는 0.5 내지 1.5 mM의 농도로 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건을 배양된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에 따르면, 1 mM 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지(최적 LB-푸마르산염-질산염 배지)에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산 합성의 반응 속도는 질산염의 부재하에 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 것과 비교하여 현저하게 향상되었다.
바람직하게, 본 발명에서는 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 푸마르산염 및 질산염이 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건을 배양된 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구체적인 실시양태에 따르면, 푸마르산염 및 질산염이 첨가된 새롭게 최적화된 LB 배지에서 혐기적으로 배양된 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원 반응은 72시간 후 136.8 mM 이상의 포름산을 생산하였다. 72시간의 반응 기간 동안에 최적 배지에서 배양된 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산 합성의 평균 전환 속도는 3.8 mM.h-1.g-1습전지(wet-cell) 였고, 이는 기존의 연구에서 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1 (Methylobacterium extorquens AM1)에 의해 촉매된 것과 비교하여 9.6배 향상된 것이다.
한편, 본 발명에서는 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis)를 이용하여 CO2로부터 포름산을 합성하는 방법을 제공한다.
이하에서, 본 발명에 따른 내구성 및 강도가 향상된 조강 시멘트 콘크리트 조성물의 실시예들을 더욱 구체적으로 제시하며, 다음에 제시하는 실시예들에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
쉬와넬라 오네이덴시스(ATCC　700550TM) (S. oneidensis)는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다. 루리아 브로스(Luria broth, LB) 배지는 Duchefa Biochemie(2031 BH Haarlem, Netherlands)로부터 구입하였다. 포름산나트륨(표준물질로서), DL-젖산나트륨, 질산나트륨, 푸마르산나트륨, 메틸 비올로겐(MV) 및 다른 화학물질들은 Sigma Aldrich(St. Louis, Missouri, United States)로부터 구입하였다.
<실시예 1> 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 및 수집
쉬와넬라 오네이덴시스는 호기적 및 혐기적 조건하에서 성장시켰다. 먼저, 쉬와넬라 오네이덴시스(3 mL)를 LB 배지에서 200 rpm, 30℃에서 밤새 배양하였다. 호기적 성장을 위해, 상기 시드 배양물(3 mL)을 LB 배지(100 mL)에 접종하고, 24시간 동안 100 rpm, 30℃에서 배양하였다. 혐기적 성장을 위해, 상기 시드 배양물(6 mL)을 1L 플라스크의 LB 배지(200 mL)에 접종하고, OD600이 1.0에 도달할 때까지 200 rpm, 30℃에서 배양하고, 그 후 500 mL의 좁은 목 용기에 담긴 DL-젖산나트륨(20 mM)과 푸마르산나트륨(0~60 mM) 및/또는 질산나트륨(0~10 mM)이 첨가된 350 mL의 혐기적으로 제조된 LB 배지에 확대 배양물(140 mL)을 접종하고, 8시간 동안 100 rpm, 30℃에서 배양하였다. 원심분리(2분간 4℃에서 12,000 rpm)로 세포를 수집한 후, 200 mM 인산 완충액(pH = 7.0)으로 3번 세척하였다.
<실시예 2> 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포에 의해 촉매된 포름산의 전기-생체촉매적 합성
동판(즉, 1.5 cm X 2.0 cm) 및 Ag/AgCl 전극은 각각 음극에서의 작동(working) 전극 및 기준(reference) 전극으로 사용하는 한편, 코일 백금선은 양극에서 상대(counter) 전극으로 사용하였다. 양극에서 1 mM H2SO4의 전기분해로부터 생성된 양성자는 양성자 교환막(Nafion 115)을 통해 음극으로 공급되었다. MultiEmStat(PalmSens BV, Houten, The Netherlands) 및 멀티트레이스 소프트웨어 제어를 사용하는 정전위 제어 하에 실험을 수행하였다. 음극은 -0.75 대 Ag/AgCl 기준 전극에서 양극화되었다. 패러데이 효율 분석뿐만 아니라 시스템 제어를 위해 매 10초마다 전류를 기록하였다. 0.2 M 포타슘 인산 완충용액 (pH = 7.0)에 용해시킨 CO2 가스(1 ml/sec의 흐름 속도에서 99.999% 순도)로부터 음극 반응기에서 포름산 합성을 수행하였다. 최종 부피 10 mL이 되도록 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포(0.5 g의 습전지 중량) 및 전자 매개체로서 메틸 비올로겐(MV)(10 mM)을 상기 반응 용액에 첨가하였다. 상온(~25℃)에서 반응을 수행하고, 300 rpm으로 교반하였다.
합성된 포름산을 이동상으로서 5 mM H2SO4를 사용하는 HPLC(즉, 굴절률 검출기(Reflective Index detector, RID) 및 Rezex ROA-유기산 H+(8%) 컬럼을 구비한 애질런트 1200 시리즈)로 분석하였다. HPLC 분석을 위한 샘플을 제조하기 위하여, 15 μL의 H2SO4(0.6 mL/분)를 반응 샘플(150 μL)에 첨가한 후, 세포 펠릿을 제거하기 위하여 1분간 10,000 rpm에서 원심분리하였다. 0.2 μm의 친수성 필터로 브로스를 추가로 여과하였다. 각 분석에 대해 20 μL를 사용하였다.
<실시예 3> 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산의 합성
쉬와넬라 오네이덴시스가 음극 반응기에서 CO2로부터 포름산의 전기화학적 합성을 위한 전-세포 생체 촉매로서 작용할 수 있는지의 여부를 확인하기 위하여, LB 배지(1.0 g의 습전지 중량)에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스를 먼저 전-세포 생체 촉매로서 사용하였다. 다른 반응 조건들은 이전 연구에서 메틸로박테리움 엑스토르켄스에 의해 촉매된 동일한 반응에 대한 최적 조건들을 따랐다(즉, 1 ml/초의 흐름 속도를 가지는 CO2 퍼징 및 pH=7.0의 0.2 M 포타슘 인산 완충용액에 용해시킨 전자 매개체로서의 10 mM 메틸 비올로겐). LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스는 도 1에서와 같이 CO2를 포름산으로 전환할 수 있는 능력을 나타내었다. 대조군 실험(즉, 쉬와넬라 오네이덴시스 또는 메틸 비올로겐의 부재하에서)은 어떠한 검출 가능한 포름산도 생성하지 않았다. 이들 대조군 실험은 포름산이 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포 및 전자 매개체로서의 MV에 의해 촉매된 CO2로부터만 생성된다는 것을 확인시켜주었다. 도 1은 포름산이 16시간 내에 상대적으로 빠르게 생성된 후, 24시간 후 14.1 mM의 포화 농도로 점진적으로 증가됨을 보여주었다. 1.0 g의 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 본 연구에서의 20시간의 반응 후 포름산 형성의 역가는 동일한 반응 조건에서 1.3 g의 메틸로박테리움 엑스토르켄스에 의해 촉매된 대략 6.0 mM의 포름산의 값보다 2배 더 높은 12.6 mM이었다. 비록 LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산 합성에 대한 반응 속도는 처음 20시간 반응에서 메틸로박테리움 엑스토르켄스에 의해 촉매된 것과 비교하여 향상을 나타내었으나, 반응은 단지 24시간 후에 14.1 mM의 포화 농도에 이르렀다. LB 배지 또는 호기적 조건은 쉬와넬라 오네이덴시스의 포름산 디히드로게나아제의 과발현에는 적합하지 않을 수 있다. 포름산 형성의 반응 속도 및 역가를 더욱 높이기 위하여, 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 조건의 최적화를 하였으며, 이를 다음 섹션에 나타내었다.
도 1은 pH 7.0에서, 전-세포 생체 촉매로서 LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원으로부터 HCOOH의 합성을 나타낸 그래프이다.
<실시예 4> 포름산 합성을 위한 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 조건의 최적화
쉬와넬라 오네이덴시스의 유전체 서열은 쉬와넬라 오네이덴시스에 세 개의 포름산 디히드로게나아제(FDHs)(즉, 이들 FDHs를 암호화하는 유전자는 fdnGHI [SO_0101 to SO_0103], fdhA1B1C1 [SO_4508 to SO_4511], 및 fdhA2B2C2 [SO_4512 to SO_4515]이다)가 존재한다는 것을 보여주었다. 유전자 발현 프로파일은 쉬와넬라 오네이덴시스의 두 개의 포름산 디히드로게나아제(즉, 셀레노시스테인-의존적 및 시토크롬 b556-의존적 포름산 디히드로게나아제)에 대한 mRNA의 발현량(abundance)이 호기적 조건하에서 몇몇의 전자 수용체(즉, 푸마르산염 또는 질산염)의 부재하에서와 비교하여, 혐기적 조건하에서 이들 수용체의 존재하에 현저하게 증가되었음을 나타내었다. 게다가, 포름산 분해와 관련된 유전자들에 대한 mRNA 레벨은 변화되지 않았다. 즉, 혐기적 조건하에서 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 배지에서 전자 수용체로서 푸마르산염 또는 질산염의 존재는 FDHs의 과다발현에 유익할 것이다.
<실시예 5> 푸마르산염의 효과 측정
포름산 합성에서 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 배지에서의 푸마르산염의 효과는 LB-젖산염 배지(즉, 전자 공여체로서 20 mM의 DL-젖산염이 첨가된 LB 배지)에의 다양한 농도의 푸마르산염(10 ~ 60 mM)의 첨가에 의해 수행되었다. 다양한 농도의 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스는 CO2로부터 포름산의 전기화학적 합성을 위한 전-세포 생체 촉매로서 사용하였다. 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 배지에의 푸마르산염의 첨가는 포름산의 합성에 긍정적인 영향을 주었다(도 2). 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 배지에서의 푸마르산염 농도의 증가(10 ~ 40 mM)는 해당 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포 생체 촉매에 의해 촉매된 포름산 형성의 반응 속도의 증가와 상관관계가 있다(즉, 각각 10, 20 및 40 mM의 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된지 33시간 후에 11.5, 35.9 및 52.9 mM의 포름산이 합성되었다). 60 mM의 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산의 합성에 대한 반응 속도는 40 mM의 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 것과 유사하였다. 다시 말해서, 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 배지에의 푸마르산염(40 mM)의 존재는 포름산의 합성에 있어서의 포화점에 거의 도달하였다.
도 2는 혐기 조건하에서 다양한 농도의 푸마르산염이 첨가된 LB 배지 및 20 mM의 DL-젖산염(LB-젖산염)에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포에 의해 촉매된 CO2환원으로부터 포름산의 합성을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, 40 mM의 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 첫 번째 24시간 반응 내에 포름산에 대한 평균 반응 속도는 LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 것보다 5.9배 빨랐다(즉, 각각 3.5 및 0.59 mM.h-1.g-1습전지). 중요하게는, 40 mM 푸마르산염이 첨가된 LB-젖산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산 형성의 역가는 LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매되고 일정하게 증가된 14.1 mM의 포화 농도를 능가하였다.
<실시예 6> 질산염과 푸마르산염의 효과 측정
질산염은 혐기적 조건하에서 쉬와넬라 오네이덴시스의 두 개의 포름산 디히드로게나아제 및 몇몇의 전자 운반체 단백질에 대한 mRNA의 발현량에 긍정적인 영향을 준다는 것을 발견하였다. 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장뿐만 아니라 최적의 LB-푸마르산염 배지(즉, 40 mM의 푸마르산염 및 20 mM의 DL-젖산염이 첨가된 LB 배지)에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산의 생성에 있어서, 상기 배지 내에서의 다양한 농도의 질산염의 효과를 연구하였다.
도 3은 혐기적 조건하에서 다양한 농도의 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지(40 mM의 푸마르산염 및 20 mM의 DL-젖산염이 첨가된 LB 배지)에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포에 의해 촉매된 CO2환원으로부터의 포름산 합성을 나타낸 것이다.
도 4는 다양한 농도의 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지(즉, 40 mM의 푸마르산염 및 20 mM의 DL-젖산염이 첨가된 LB 배지)에서 혐기적 조건하에서의 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장을 나타낸 것이다.
도 3에서 보듯이, 혐기적 조건하 쉬와넬라 오네이덴시스의 최적의 LB-푸마르산염 배지에서의 질산염의 존재는 해당 쉬와넬라 오네이덴시스 전-세포 생체 촉매에 의해 촉매된 포름산 합성에 강한 영향을 주었다. 1 mM 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지(최적 LB-푸마르산염-질산염 배지)에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산 합성의 반응 속도는 질산염의 부재하에 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 것과 비교하여 현저하게 향상되었다. 놀랍게도, 도 3에서, 72시간 후 1 mM의 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원으로부터 136.8 mM의 포름산이 생성되었다. 이 값은 각각 72시간 및 80시간 후 (최적의 LB-푸마르산염 배지에서 자란) 쉬와넬라 오네이덴시스 및 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1(1.9 g의 습전지 중량)에 의해 촉매된 63.7 및 60 mM의 값보다 훨씬 높았다. 1 mM의 질산염의 존재 및 부재하에 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 72시간의 반응 이내의 포름산 합성에 대한 평균 전환 속도는 각각 3.8 및 1.8 mM. h-1.g-1습전지였다. 이들 값은 이전의 연구에서 80시간 이내에 1.9 g의 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1에 의해 촉매된 CO2환원으로부터 얻어진 0.395 mM. h-1.g-1습전지의 값보다 9.6배 및 4.5배 컸다.
도 3 및 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 더 높은 농도의 질산염(5 mM 또는 10 mM)의 존재는 이들 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 포름산 합성뿐만 아니라 쉬와넬라 오네이덴시스의 성장 속도에도 크게 영향을 준다. 이는 질산염이 쉬와넬라 푸트레카시엔스 MR-1(Shewanella putrecaciens MR-1)(쉬와넬라 오네이덴시스 MR-1의 옛 명칭)에 강한 푸마르산염 주화성을 나타낸다는 것을 보여준다. 최적의 LB-푸마르산염 배지에서의 고농도의 질산염의 존재는 쉬와넬라 오네이덴시스의 포름산 디히드로게나아제의 발현 레벨뿐만 아니라 물질대사에도 부정적인 영향을 줄 수 있다.
도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 1 mM의 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원으로부터의 포름산의 역가는 72시간 후 136.8 mM의 최대 농도에 도달한 후, 96시간 후 125.5 mM로 약간 감소되었다. 아세토박테리움 우디(Acetobacterium woodii) 전-세포 생체 촉매에 의해 촉매된 CO2 및 H2의 수소화로부터의 포름산의 합성 또한 반응 pH 때문에 반응의 초기 단계에서 포화 농도에 도달하였다. 96시간 후 1 mM 질산염이 첨가된 최적의 LB-푸마르산염 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 반응 용액의 pH는 약 5.0으로 떨어졌다. 6.5 이하의 pH에서, MV 라디칼의 흡수 효율은 현저하게 감소되는 것으로 보고되었다. 72시간 및 96시간 동안 낮은 pH(~5.0)의 반응 용액은 MV의 불안정성 때문에 포름산의 역가의 감소의 원인이 될 것이다. pH 조절 시스템 또는 생성된 포름산의 흡착를 위한 음이온 교환수지를 통한 반응 동안의 반응 용액의 중성화는 포름산의 역가를 증가시키는데 유익할 것이다.
본 발명에서는, CO2 및 전극으로부터 생성된 전자로부터의 포름산의 합성에 쉬와넬라 오네이덴시스가 처음으로 사용되었다. LB 배지에서 호기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원은 24시간의 반응 후 14.1 mM의 포름산을 생성할 수 있으며, 특히 푸마르산염 및 질산염을 포함하는 배지에서 혐기적 조건하에서 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 CO2환원은 72시간 후 136.84 mM까지의 포름산이 생성할 수 있다. 또한, 최적 배지에서 혐기적으로 자란 쉬와넬라 오네이덴시스에 의해 촉매된 72시간의 반응 이내의 포름산 합성에 대한 평균 반응 속도는 3.8 mM. h-1.g-1습전지였다. 이 값은 이전 연구에서 메틸로박테리움 엑스토르켄스 AM1에 의해 촉매된 것과 비교하여 9.6배 향상된 것이었다. 따라서, 쉬와넬라 오네이덴시스는 CO2로부터 포름산을 합성할 수 있는 미생물로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (10)

  1. 쉬와넬라 오네이덴시스(Shewanella oneidensis)(ATCC　700550TM)를 이용하여 CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 쉬와넬라 오네이덴시스는 LB 배지에서 호기적 조건으로 배양된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 pH 6.5 내지 7.5의 조건에서 배양된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 푸마르산염이 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건에서 배양된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 LB 배지에 푸마르산염이 10 내지 40 mM의 농도로 포함된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 질산염이 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건에서 배양된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 LB 배지에 질산염이 0.5 내지 1.5 mM의 농도로 포함된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 쉬와넬라 오네이덴시스가 푸마르산 염 및 질산염이 포함된 LB 배지에서 혐기적 조건에서 배양된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 LB 배지에 푸마르산염이 10 내지 40 mM의 농도의 농도로 포함되고, 질산염이 0.5 내지 1.5 mM의 농도로 포함된 것임을 특징으로 하는, CO2로부터 포름산을 합성하는 방법.
  10. 삭제
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