KR20030032951A - Ｎａｄ(ｐ)ｈ의 간접 전기화학적 재생을 포함하는 방법 - Google Patents

Ｎａｄ(ｐ)ｈ의 간접 전기화학적 재생을 포함하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 효소적 기질 반응, 즉, 예를 들어 모노옥시게나제에 의해 촉매 작용되는 반응에서 NAD(P)H를 간접 전기화학적으로 재생하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 환원성 산소 분리에 의해 생성된 NAD+를 동시에 전기화학적으로 환원하면서, 효소 2-히드록시비페닐-3-모노옥시게나제에 의해 촉매 작용되는 2,3-디히드록시페닐 유도체의 전기효소적 제조 방법에 관한 것이다.

Description

ＮＡＤ(Ｐ)Ｈ의 간접 전기화학적 재생을 포함하는 방법 {Method Comprising the Indirect Electrochemical Regeneration of NAD(P)H}
본 발명은, 예를 들면 산소의 효소-촉매작용 환원성 분해에서 발생된 NAD(P)+로부터 NAD(P)H를 간접 전기화학적으로 재생하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 전기화학적 재생 방법은 전기효소적, NAD(P)H-소비 전환, 특히 모노옥시게나제에 의한 기질의 산화성 효소적 전환의 영역에 적용될 수 있다. 본 발명은 특히 2,3-디히드록시페닐 유도체의 모노옥시게나제-촉매작용 제조를 위한 전기효소적 방법에 관한 것이다.
생촉매작용 반응은 실험실 내 유기합성 및 다양한 공업 분야 모두에 있어서 점점 더 중요해지고 있다. 특히, 효소적 전환은 통상적으로 높은 위치- 및 입체 선택성과 동시에 온화한 조건과 높은 수율을 갖기 때문에 이들은 합성 계획에 있어서 매력적인 수단이다. 다양한 방식으로 이미 사용되고 있는 가수분해 효소와는 대조적으로, 거울상 선택성 환원 및 화학-, 위치- 및 거울상 선택성 산화를 위해 산화환원 효소를 사용하는 것은 이들의 합성에 있어서의 막강한 잠재력에도 불구하고 아직 널리 보급되지 않았다. 이것은, 특히 현재까지 만족스럽게 해결되지 않은 효과적인 보인자 재생의 문제점 때문이다. 효소 커플링된 보인자 재생의 확립된 방법[1a,b, c, d]에 더하여, 전기화학적 방법이 현재 개발되었으며 NAD(P)+- 및 NAD(P)H-의존 효소에 적용되었다[2a, b, c]. 간접 전기화학적 보인자 재생의 이점은 프로듀서 효소만을 필요로 하므로, 종종 까다로운 이중-효소계의 최적화가 불필요하다는 것이다. 게다가, 보조기질도 생략될 수 있다.
모노옥시게나제는 합성에 있어서 매우 중요한데, 산소 작용기를 이의 기질내로 위치- 및 입체선택적으로 포함시킬 수 있기 때문이다. 이것을 수행하기 위해서는, 물이 형성되면서 O-O 결합이 환원성으로 분해되는 분자 산소가 필요하다[3a, b]. 모노옥시게나제의 본래의 보인자인 NADH 또는 NADPH는 이러한 목적을 위하여 필요한 환원 당량을 전달한다. 프로듀서 효소로서 모노옥시게나제를 사용하는 이전의 시험관 내 방법은 포르메이트 데히드로게나제[4a, b](NADH 또는 NADPH에 대하여) 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제[5](NADPH에 대하여)를 사용하는 효소 커플링된 보인자 재생을 기초로 한다.
레이파(Reipa) 등의 [10]은 시토크롬 CYP 101 모노옥시게나제(E.C.1.14.15.1)의 천연 산화환원 파트너인 푸티다레독신의 전기화학적 재생방법을 기술한다. 상기 방법에서는 푸티다레독신 환원에 적합한 특별한 안티몬-도핑된 산화 주석 전극을 사용하는 것이 제안되었다.
헬드(Held) 등의 [8]은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) JM 101(pHDT 461)의 전체 세포를 사용하는 3-페닐카테콜의 생촉매적 제조를 기술한다. 상기 재조합 미생물은 효소 2-히드록시비페닐 3-모노옥시게나제를 생산하도록 만들어졌다.이와 관련하여, 소비된 NADH의 전기화학적 재생은 필요하지 않은데, 왜냐하면 본래의 이. 콜리 세포의 효소계가 보인자를 재생하기 때문이다.
본 발명의 목적은, 예를 들면 모노옥시게나제와 관련하여 산소를 환원성 분해하면서 기질을 산화성 전환하는데 적합한, 무효소의 선택적이고 효율적인 간접 전기화학적 NAD(P)H 재생 방법을 개발하는 것이다. 또 하나의 목적은 NAD(P)H를 간접 전기화학적으로 재생하면서, 2,3-디히드록시페닐 화합물, 예컨대 2,3-디히드록시비페닐의 효소적, 모노옥시게나제-촉매작용 합성을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은
a) 하기 화학식 II의 모노히드록시페닐 화합물을 2-히드록시비페닐 3-모노옥시게나제(HbpA)(E.C.1.14.13.44)를 사용하여 NADH 및 산소의 존재하에 전환하고;
b) 형성된 NAD+를 NADH로 전기화학적으로 환원시키는 것을 포함하는 하기 화학식 I의 2,3-디히드록시페닐 유도체의 전기효소적 제조방법을 제공함으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있다는 것을 발견했다.
상기 화학식들에서, R은 비치환, 일치환 또는 다치환 페닐, C1-6알킬, 할로겐 또는 CN이고;
R'는 H 또는 OH이다.
이러한 목적은 또한 산화성 기질의 NAD(P)H-소비 산화성 효소적 전환을 NAD(P)H 존재하에 그리고 바람직하게는 산소를 소비하면서 수행하고 기질 산화 도중에 형성된 NAD(P)+를 전기화학적으로 환원시켜서 NAD(P)H를 형성하는 것을 포함하는, 기질의 NAD(P)H-소비 산화성 효소적 전환에서의 NAD(P)H의 재생방법을 제공하는 것에 의해서도 달성된다. 예를 들면, NAD(P)H-의존 모노옥시게나제(부류 E.C.1.14.-.-)를 산화성 기질과 함께 NAD(P)H 및 산소 존재하에 배양하고 산소의 환원성 분해 및 기질 산화 도중에 형성된 NAD(P)+를 전기화학적으로 환원시켜서 NAD(P)H를 형성할 수도 있다.
본 발명에 의해 먼저, 산소를 소비하는, 예를 들면 모노옥시게나제 촉매 작용 반응 영역 내에서, NADH 또는 NADPH의 효소-비의존적 간접 전기화학적 재생이 가능하게 된다. 간접 전기화학적 보인자 재생으로 인하여, 연속적 기질 전환이 가능하다.
환원에 필요한 전자를 음극으로부터 산화된 보인자에 전달하는 적합한 산화환원 촉매를 통해 보인자가 재생된다면, NAD(P)H가 본 발명에 따라서 "간접" 전기화학적으로 재생되는 것이다.
제 1 국면에 있어서, 본 발명은
a) 하기 화학식 II의 모노히드록시페닐 화합물을 2-히드록시비페닐 3-모노옥시게나제(HbpA)(E.C.1.14.13.44)를 사용하여 NADH 및 산소 존재하에 전환하고;
b) 형성된 NAD+를 NADH로 전기화학적으로 환원시키는 것을 포함하는 하기 화학식 I의 2,3-디히드록시페닐 유도체의 전기효소적 제조 방법에 관한 것이다.
<화학식 I>
<화학식 II>
상기 화학식에서, R은 비치환 페닐 또는 예를 들면, 할로겐, 예컨대 F, Cl, Br 또는 I, CN 또는 OH, 특히 OH에 의해 일치환 또는 다치환된 페닐이고; C1-6-알킬, 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 t-부틸및 n-펜틸 또는 n-헥실과, 각각의 경우에 있어서 그의 분지쇄 동족체이며; 할로겐, 예를 들면 F, Cl, Br 또는 I이거나; 또는 CN이고; R'는 H 또는 OH이고, R'는 페닐 환의 2-히드록실기에 대하여 m 위치 또는 p 위치, 바람직하게는 p 위치이다.
바람직하게는, 음극성으로 제조될 수 있으며 재생될 수 있는 히드리도로듐 산화환원 촉매 존재하에 전기화학적 NAD+환원이 수행된다. 본 명세서에 있어서, 산화환원 촉매는 바람직하게는 Ag/AgCl(포화)에 대하여 측정된 -650 내지 -800mV 범위의 음극 전위(pH=6-9; T=20-60℃, 특히 약 20 내지 35℃, 예를 들면 약 30℃)에서 히드리도로듐 착물로 전기화학적으로 전환될 수 있는 가용성 로듐 착물이다.
HbpA-촉매작용 반응을 수행하기 위해서는, 특히 하기 화학식 III의 로듐 착물이 바람직하다.
[CpRh(III)(bpy)Cl]Cl
상기 화학식에서, Cp는 시클로펜타디에닐 또는 펜타메틸시클로펜타디에닐이고 bpy는 2,2'-비피리딜이고, 각각의 피리딜 환은 비치환 또는 공여기에 의해 일치환 또는 다치환, 특히 일치환되며, 공여기는 메틸, 메톡시 및 아세트아미도기로부터 선택된다. 바람직하게는, 각각의 피리딜 환은 4위치 또는 5위치에서 상기 치환기들 중 하나를 가질 수 있다. 특히, 동일한 공여기를 갖는 피리딜 환들이 치환된다.
HbpA 촉매작용이 관여되는 본 발명 방법의 범위내에서, 화학식 III의 로듐 촉매는 하기 화학식 IIIa의 히드리도로듐 착물로 음극성으로 환원될 수 있으며, 이히드리도로듐 착물은 NAD+를 환원시킬 수 있다.
양성자로서의 H와의
[CpRh(I)(bpy)H]Cl
또는
히드라이드 이온으로서의 H와의
[CpRh(III)(bpy)H]Cl
화학식 I의 디히드록시 화합물의 본 발명의 제조 방법은 바람직하게는 하기 조건하에서 수행된다:
a) 기질 농도(화학식 II의 화합물): 0.01 내지 50mM, 특히 0.1 내지 4mM;
b) NAD+농도: 0.01 내지 5mM, 특히 0.01 내지 0.5mM;
c) 로듐 착물 농도: 1μM 내지 5mM, 특히 5μM 내지 0.5mM;
d) HbpA 농도: 1 내지 5000U/l, 특히 10 내지 1000U/l;
e) FAD 농도: 0 내지 200μM, 특히 0 내지 20 또는 1 내지 20μM;
f) 카탈라제 농도: 0 내지 1x107U/l;
g) pH: 4 내지 9, 특히 6 내지 7.5
h) 온도: 10 내지 40℃, 특히 20 내지 35℃ 또는 약 30℃
i) 음극 전위: -600 내지 -900mV, 특히 -650 내지 -800mV
j) 산소 주입량: 20 내지 120cm3/(분ㆍl), 예를 들면 [11]에 기술된 바와 같이 불어 넣거나 특히 산소 투과성 막 또는 관을 통하여 기포가 없게 주입.
본 발명에 따라서 유용한 전극 시스템은, 예를 들면 [12] 및 [13]에 기술되어 있다. 적합한 음극/양극 쌍의 대표적인 비제한적 예는 다음과 같다: 탄소 음극/백금 양극, 예컨대 특히 원통형 탄소 음극(탄소 펠트, Sigraflex(등록상표))/백금 와이어 양극.
본 발명에 따라서 전환되는 화학식 II의 기질은 일반적으로 구할 수 있는 화합물이며 구입하거나 유기화학의 일반적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 언급할 수 있는 비제한적인 예는 다음과 같다:
2-히드록시-C1-6-알킬벤젠, 2-히드록시할로벤젠, 2-히드록시벤조니트릴 및 상기 벤젠 유도체의 2,5-디히드록시 동족체; 2-히드록시비페닐 및 폴리히드록실화 비페닐, 예를 들면 2,4-, 2,5- 또는 2,6-디히드록시비페닐; 2,n'-디히드록시비페닐(n'=2, 3 또는 4); 또는 2,n',m'-트리히드록시비페닐(n' 및 m'는 각각의 경우에 서로 상이하며, 2, 3 또는 4이다).
본 발명에 따라서 사용되는 산화환원 촉매는 바람직하게는 [CpRh(bpy)Cl]Cl 착물이다. 상기 착물의 제조는 일반적으로 공지되어 있으며 [14] 또는 [15]에 기술된 바와 같이 수행된다. 이것으로부터 -700mV(vs. Ag/AgClsat)에서의 전기화학적 환원 후에 형성된, 그렇지 않으면 포르메이트와 화학적으로 형성된 히드리도로듐 착물은 NAD(P)+를 효소-활성 1,4-NAD(P)H 형으로 신속하게 그리고 정량적으로 전환한다[2,6].
사용할 수 있는 효소로서 언급할 수 있는 대표적인 예는, 플라빈-의존 모노옥시게나제의 부류를 대표하는, P. 아젤라이카(P.azelaica)로부터의 2-히드록시비페닐 3-모노옥시게나제(HbpA, E.C.1.14.13.44)이며, 이것은 보인자로서 NADH를 필요로 한다[7]. 효소는 총 질량 256kDa의 호모테트라머이며 다수의 α-치환 페놀 유도체의 선택적 오르토-히드록실화를 촉매작용한다. 상기 반응을 화학적으로는 동등한 선택성으로 수행할 수 없다.
HbpA 반응의 원리
HbpA-촉매작용 반응은 바람직하게는 수성 반응 매질 중에서 수행되는데, 이의 pH는 전환과 전기화학적 과정에 부정적인 영향을 미치지 않은 일반적인 완충 물질, 예를 들면 HEPES, PIPES 및 특히 인산 칼륨 완충액 및 Tris/HCl 완충액으로 적합한 수치로 조정된다. 완충액 농도는 20mM 내지 0.2M, 특히 약 20 내지 50mM 범위이다. pH는 바람직하게는 약 6 내지 8, 특히 약 7.5로 조정된다.
반응 매질은 추가의 통상적인 첨가제, 예컨대 기질, 보인자, 예를 들면 FAD 또는 FMN, 사용되는 효소 등에 대한 가용화제를 함유할 수 있다.
산화-민감성 효소 시스템에 있어서, 항산화제의 사용이 적절하다면 바람직할 수 있다. 예를 들어, 방법이 효소 활성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 과산화수소의 형성을 야기한다면, 반응은 예를 들면 1ㆍ105U/l의 농도로 첨가된 카탈라제의 존재하에 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 기질의 NAD(P)H-소비 산화성 효소적 전환에 사용될 수 있고 산화성 기질의 NAD(P)H-소비 산화성 효소적 전환이 NAD(P)H의 존재하에 그리고 바람직하게는 산소가 소비되면서 수행되며 기질 산화 도중에 형성된 NAD(P)+가 전기화학적으로 환원되어 NAD(P)H가 형성되는 NAD(P)H의 전기화학적 재생 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 모노옥시게나제-촉매작용 반응의 영역 내에서 수행되기에 적합하다. 이와 관련하여, NAD(P)H-의존 모노옥시게나제(부류 E.C.1.14.-.-)를 산화성 기질과 NAD(P)H 및 산소 존재하에 배양하고, 산소의 환원성 분해 및 기질 산화 도중에 형성된 NAD(P)+를 전기화학적으로 환원하여 NAD(P)H가 형성된다.
본 발명의 바람직한 변형에 따르면, 전기화학적 NAD(P)+환원은 음극성으로 생성될 수 있고 재생될 수 있는 바람직하게 가용성인 히드리도로듐 산화환원 촉매의 존재하에 수행된다.
본 발명의 NAD(P)H-재생 방법에 사용되는 산화환원 촉매는 바람직하게는 Ag/AgCl(포화)에 대하여 측정된 -650 내지 -800mV 범위의 음극 전위(pH=6-9; T=20-60℃, 특히 약 20 내지 35℃, 예를 들면 약 30℃)에서 히드리도로듐 착물로 전기화학적으로 전환될 수 있는 로듐 촉매이다.
본 발명의 NAD(P)H 재생 방법에 있어서, 바람직하게는 하기 화학식 III'의 로듐 착물이 사용될 수 있다.
[CpRh(III)(bpy)Cl]Cl
상기 화학식에서, Cp는 시클로펜타디에닐 또는 펜타메틸시클로펜타디에닐이고 bpy는 2,2'-비피리딜이고, 각각의 피리딜 환은 비치환 또는 공여기에 의해 일치환 또는 다치환, 특히 일치환되며, 공여기는 메틸, 메톡시 및 아세트아미드로부터 선택된다. 또한, 포함된 공여기는 예를 들면 PEG2000 내지 20000의 폴리에틸렌 글리콜로부터 유도된 라디칼일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 피리딜 환은 4위치 또는 5위치에 상기 치환기들 중 하나를 가질 수 있다. 특히, 동일한 공여기를 갖는 피리딜 환들이 치환된다.
화학식 III'의 로듐 착물은 하기 화학식 IIIa'의 히드리도로듐 착물로 음극성으로 환원된다.
양성자로서의 H와의
[CpRh(I)(bpy)H]Cl
또는
히드라이드 이온으로서의 H와의
[CpRh(III)(bpy)H]Cl
상기 화학식에서, Cp 및 bpy는 상기 화학식 III'에 대하여 정의한 바와 같은 의미를 가지며, 상기 히드리도로듐 착물은 NAD+를 환원시킬 수 있다.
본 발명의 NAD(P)H 재생 방법은 바람직하게는 하기 실험 조건에서 수행된다:
a) NAD(P)+농도: 0.01 내지 5mM, 특히 0.01 내지 0.5mM;
b) 로듐 착물 농도: 1μM 내지 5mM, 특히 5μM 내지 0.5mM;
c) 모노옥시게나제 농도: 1 내지 5000U/l, 특히 10 내지 1000U/l;
d) 보인자 농도(예컨대, FAD): 0 내지 200μM, 특히 0 내지 20 또는 1 내지 20μM;
e) 카탈라제 농도: 0 내지 1ㆍ107U/l;
f) pH: 4 내지 9, 특히 6 내지 7.5;
g) 온도: 10 내지 40℃, 특히 20 내지 35℃ 또는 약 30℃;
h) 음극 전위: -600 내지 -900mV, 특히 -650 내지 -800mV;
i) 산소 주입량: 20 내지 120cm3/(분ㆍl), 예를 들면 [11]에 기술된 바와 같이 불어 넣거나 특히 산소 투과성 막 또는 관을 통하여 기포가 없게 주입.
본 발명에 따라서 전환되는 기질은 일반적으로 구할 수 있는 화합물이고 구입하거나 유기화학의 일반적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따라서 사용되는 산화환원 촉매는 바람직하게는 [CpRh(bpy)Cl]Cl 착물이다. 상기 착물의 제조는 일반적으로 공지되어 있으며 [14] 또는 [15]에 기술된 바와 같이 수행된다. 이것으로부터 -700mV(vs. Ag/AgClsat.)에서의 전기화학적 환원 후에 형성된, 그렇지 않으면 포르메이트와 화학적으로 형성된 히드리도로듐 착물은 NAD(P)+를 효소-활성 1,4-NAD(P)H 형으로 신속하게 그리고 정량적으로 전환한다[2, 6].
반응은 바람직하게는 수성 반응 매질 중에서 수행되는데, 그의 pH는 전환과 전기화학적 과정에 부정적인 영향을 미치지 않은 일반적인 완충물질, 예를 들면 HEPES, PIPES 및 특히 인산 칼륨 완충액 및 Tris/HCl 완충액으로 적합하게 조정된다. 완충액 농도는 약 20mM 내지 0.2M, 특히 약 20 내지 50mM의 범위이다. pH는 바람직하게는 약 6 내지 8, 특히 약 7.5로 조정된다.
반응 매질은 추가의 통상적인 첨가제, 예컨대 기질, 보인자, 예를 들면 FAD 또는 FMN, 사용되는 효소 등에 대한 가용화제를 함유할 수 있다.
산화-민감성 효소 시스템에 있어서, 항산화제의 사용이 적합할 수 있다. 예를 들어, 방법이 효소 활성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 과산화수소의 형성을 야기한다면, 반응은 예를 들면 1ㆍ105U/l의 농도로 첨가된 카탈라제의 존재하에 수행될 수 있다.
본 발명의 NAD(P)H의 재생 방법은 바람직하게는 산화성 효소적 전환을 포함하는 하기 반응 유형에 사용될 수 있다:
a) 포화 또는 불포화 지방족 또는 방향족 탄소 원자의 산화, 특히 히드록실화, 에폭시드화 및 바에예르-빌리거(Baeyer-Villiger) 산화;
b) 황 또는 셀레늄 산화;
c) 질소 산화 또는 인 산화;
d) 할라이드의 산화.
반응 유형 a)의 비제한적인 예:
(1) 지방족 탄소의 히드록실화:
예를 들면, 제 JP 75/54957 호(다께다(Takeda))에 기술되어 있다.
(2) 시토크롬 P450 모노옥시게나제에 의해 촉매작용되는 장쇄 지방산의 ω-히드록실화; 예를 들면, 제 DE-A-199 35 115.5 호(바스프(BASF) AG)에 기술되어 있다.
(3) 알릴 또는 벤질 탄소의 히드록실화:
에이치. 프레쯔(H. Fretz), 더블유.디. 워곤(W.D. Woggon), 알. 보게스(R.Voges)의 문헌[Hel. Chim. Acta, 1989., 72, 391-400]
에이치. 엘. 홀랜드(H.L. Holland), 티. 에스. 마노하란(T.S. Manoharan), 에프. 슈바이쩌(F. Schweizer)의 문헌[Tetrahedron: Asymmetry, 1991, 2, 335-338]
(4) 에폭시드화:
에스. 더블유. 메이(S.W. May), 비. 제이. 아보트(B.J. Abbot)의 문헌[J. Biol. Chem. 1973, 248, 1725-1730]
(5) 바에예르-빌리거 산화:
로버츠(Roberts) 등의 문헌[J. Mol. Cat. B Enzymatic, 1998, 4, 111 ff]
(6) 헤테로방향족의 산화
각 경우는 시클로헥사논 모노옥시게나제에 의해 촉매 작용됨; 왈쉬, 씨.티.(Walsch, C.T.) 등의 문헌[Angew. Chem., 1988, 100, 242]; 및 로버츠 등의 문헌[J. Mol. Cat. B Enzymatic, 1998, 4, 111]에 기술되어 있음.
본 발명은 또한, 바람직하게는 산소-소비 산화 반응, 특히 모노옥시게나제 촉매작용 반응, 특히 상기한 유형의 산화 반응에 있어서 연속 또는 비연속 전기화학적 NAD(P)H의 재생을 위한, 상기 정의에 따른 산화환원 촉매의 용도에 관한 것이다.
최종적으로, 본 발명은 반응 챔버 중에 한 쌍의 전극 및 효소, 특히 모노옥시게나제, 기질, NAD(P)H 보인자 및 상기한 바와 같은 산화환원 촉매를 포함하는 단상성 또는 이상성 액체 반응 매질을 포함하며, 산화환원 당량(전자)을 산화환원 촉매에 전달하는데 적합한 전극 전위가 음극에 존재하는, 산소-소비, 특히 모노옥시게나제 촉매작용 전기효소적 반응을 연속적으로 또는 비연속적으로 수행하는 바이오리액터(bioreactor)에 관한 것이다.
적합한 유형의 바이오리액터는 [16] 및 [17]에 기술되어 있으며, 참고문헌으로 인용된다.
숙련인이라면 반응기 작동 및 공정 제어를 원하는 산화환원 반응의 특정 요구치로 조정할 수 있다. 단상성 또는 이상성 반응 매질은 반응 챔버의 격실로서 사용될 수 있다. 이상성 반응 시스템은, 예를 들면 수성 반응 매질 중에서 거의 용해되지 않거나 전혀 용해되지 않는 기질의 전환 및(또는) 생성물의 형성에 이롭다. 예를 들면, 기질을 유기 상으로 제공할 수 있다. 상기 기질은 수성 상내로 연속적으로 방출되고, 여기에서 전환되고, 형성되는 생성물은, 적절하다면 다시 유기 상으로 방출된다. 격실화는, 예를 들면 효소 반응 및 전극 반응을 공간적 및 시간적으로 분리할 수 있다. 바람직하게는 산소를 기체에 통과시킴으로써, 특히 예를 들면 리솜(Rissom)에 의해 [4b]에 기술된 바와 같이 기포가 없게 통과시킴으로써 도입하며, 상기 문헌은 참고문헌으로 인용된다.
하기에서 첨부된 도면을 참고로 하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다:
도 1은 동시에 NADH를 전기화학적으로 재생하면서 2,3-디히드록시비페닐을 형성하는 본 발명의 전기효소적 방법을 도식적으로 나타낸 것이며; 히드리도로듐(III) 산화환원 촉매가 음극에서 형성되고 재생된다. 히드라이드 이온의 NAD+로의 전달 및 NADH의 형성 후에, 상기 NADH가 모노옥시게나제를, 예를 들면 2-히드록시비페닐 3-모노옥시게나제의 보결분자단 FAD 기를 환원하여 활성 FADH2작용기가 형성된다. 효소의 상기 환원 형태는 기질, 예를 들면 2-히드록시비페닐의산화를 산소 존재하에 촉매작용하여 2,3-디히드록시비페닐이 형성된다.
도 2는 간접 전기화학적 재생에 의한 NADH의 형성에 대한 O2의 효과를 나타낸다(■는 가압 공기가 도입되지 않은 것을 나타내고; ０는 10cm3/분으로 가압 공기가 도입된 것을 나타낸다).
도 3은 히드라이드 산화의 가정된 메카니즘을 나타낸다.
도 4는 보인자가 간접 전기화학적으로 재생되면서 2,3-디히드록시비페닐이 형성되는 것에 대한 산소 함량의 효과를 나타낸다(０: 용액에 산소가 도입되지 않음; ■: 1시간 후에 산소 도입이 시작됨).
도 5는 히드리도로듐이 화학적으로 그리고 간접 전기화학적으로 형성될 때의 전환속도를 비교한 것이다(０: 환원제로서 포르메이트를 사용한 산화환원-촉매작용의 화학적 재생; ■: 간접 전기화학적 재생).
도 6은 교반기, 환 음극, 중심 양극, 기준 전극, 가압 공기의 반응 매질로의 공급기가 있는 반응 용기를 포함하는 적합한 배치 반응기를 도식적으로 나타낸다.
실시예 1: 2-히드록시비페닐의 2,3-디히드록시비페닐로의 전기효소적 산화
도 1에 따라, 전기효소적 전환을 도 6에 도식적으로 나타낸 배치 전해 전지 중에서 수행했다. 여기에서 사용된 음극은 원통형 탄소 펠트 전극이었다(체적 대략 27cm3). 투석 관이 있는 백금 상대 전극(배제 질량 10kDa)을 외장하여 분할 전지의 조건을 달성했다.
-750mV의 음극 전위를 Ag/AgClsat.관 전극에 대하여 조정했다. 산화된 보인자 NAD+(0.2mM), [Cp*Rh(bpy)Cl]2+(0.1mM), FAD(20μM), 카탈라제(250000U), HbpA(19U) 및 기질(2mM)을 100ml KPi 완충액(50mM, pH 7.5)에 용해시켰다. 전환을 T=30℃에서 5시간 동안 수행했다.
반응의 진행을 RP-18 컬럼에서 용출제로서 메탄올/물(0.1% H3PO4) 60:40을 사용하는 HPLC 크로마토그래피에 의해 모니터링했다.
실시예 2: 용해된 산소의 NADH 재생에 대한 효과
산소가 반응 순서의 일부이기 때문에, 용해된 산소의 시스템 성분에 대한 효과가 시험되어야 한다. 이것은 포르메이트와 화학적으로 형성된 히드리도로듐 착물 그리고 본 발명에 따라서 전기화학적으로 형성된 히드리도로듐 착물 모두에 의한 NADH 재생을 산소가 저해한다는 것을 보여주었다(도 2). 도 2로부터 명백한 바와 같이, 예를 들면 10cm3/분의 산소 주입량은 NADH 형성 속도를 1.1mmol/l.h로부터 0.27mmol/l.h로 저하시켰다. 15cm3/분의 주입량에서는, NADH의 형성은 더이상 검출되지 않았다. 그러나 산소 흐름의 중지 후에, NADH의 형성 속도는 그의 최적치를 거의 회복하기 때문에, 저해는 가역적이다. 마찬가지로, NADH 농도는 그의 최대치에 도달했다. 히드리도로듐 착물과 분자 산소와의 반응 생성물로서 과산화수소를 검출할 수 있었으며, 가능한 과산화수소의 형성을 도 3에 나타내었다. 또한, 적용된 전위에서 음극에서의 산소의 직접 환원에 의해서도 과산화수소가 형성되었다.그러므로 카탈라제가 효소 전환 도중에 과산화수소를 파괴하므로, 카탈라제를 첨가하는 것이 편리하다.
실시예 3: 산소 공급의 전환에 대한 효과
도 4의 결과는 외부 산소 공급이 없는 반응에서는, 전환이 단시간(개방 서클 및 충전된 스퀘어, 각각, 대략 1시간 까지)에 대략 20% 정도 저하되었다는 것을 보여준다. 1시간 후에 산소 공급(8cm3/분)이 시작되면, 전환 속도와 생성물 형성이 1.1mmol/1.h(202mg/1.h)까지 상승되었다. 이 경우에 조정기에 의해 산출된 턴오버 회수는 11h-1이었다. 히드리도로듐 착물을 포름산 나트륨을 사용하여 화학적으로 생성시킬 때에도 유사한 값이 달성되었다. 도 5는 연속 산소 주입량이 10cm3/분인 것을 제외하고는 상기한 바와 같은 조건하에서의, 간접 전기화학적 보인자 재생 및 포르메이트에 의한 산화환원-촉매작용 방법(c(NaHCO2)=160mM; 다른 조건은 동일)에 대한 전환속도를 보여준다. 생산성은 미리 최적화된 발효의 또는 효소 커플링된 NADH 재생의 시험관내 방법(390mg/l.h)[8]의 대략 50%이었다.
반응 속도는 음극에서의 히드리도로듐 착물의 형성에 의해 제한되는 것이 아니라 분자 산소와의 경쟁 반응에 의한 산화환원 촉매의 경쟁 저해에 의해 제한되는 것이다(도 4).
본 발명의 연속 전기효소적 방법에서는, 전체 시스템을 개별적인 모듈로 격실화함에 의해 간접 전기화학적 NADH 재생에 대한 용해된 산소의 부정적인 효과를용이하게 없앨 수 있었다. 공간적 및 시간적으로 전기화학적 단계 이후에, 효소 반응에 필수적인 산소를 계량 첨가함으로써 상기 산소의 NADH에 대한 효과를 최소화했다.
수행되는 배치 전해의 장기간 안정성은 무기포-자유 유동 통과 기체의 변성 작용을 줄여서 개선할 수 있다. 이것은 강한 전단력이 액체/기체 상 경계에서 나타나고 중간에 효소 변성을 야기하기 때문이다. 비교 실험은 HbpA가 30℃에서의 항온조절 및 교반(250분-1) 후에, 심지어는 12시간 후에도 그의 초기 활성의 85%이상을 여전히 가지고 있음을 보여줄 수 있었다. 가압 공기 공급이 시작되면, 상기 초기 활성이 공급 속도에 따라서 1시간 이내에 70%까지 감소된다. 효소-막 반응기[9]를 사용하면 프로듀서 효소를 이종 산소 주입의 부정적인 영향으로부터 보호할 수 있으므로 결과적으로 긴 공정 진행 시간을 달성할 수 있다. 특히, 이상성 반응의 이용 및 기질의 동일계 계량 첨가 및 카테콜 생성물의 추출로 효율적인 연속 공정이 가능하게 되었다.
본 발명에 따르면 먼저 NADH를 간접 전기화학적으로 재생시키면서 플라빈-의존 모노옥시게나제가 촉매작용하는 전환을 성공적으로 수행할 수 있다.
본 발명은 모노옥시게나제를 실험실 규모 및 공업적 사용 모두를 위하여 유기 합성에 포함시키는 것에 대한 기초를 세웠다. 상기 산화 효소의 부류는 합성에 있어서 매우 중요한데, 상기 효소가, 예를 들면 히드록실 작용기를 방향족 계 및 또한 비활성화 순수 탄화수소 내로 도입할 수 있기 때문이다. 이들은 또한 에폭시드를 형성하면서 산소를 헤테로원자 또는 이중결합 내로 도입할 수 있다. 또한, 이들은 바에예르-빌리거 산화를 촉매작용한다. 모든 경우에 있어서, 거울상적으로 순수한 생성물을 얻을 수 있다.
기초가 되는 전기화학적 NAD(P)H 재생 개념은 이전의 생체내 방법 또는 효소적 재생계를 이용하는 방법에 대한 효율적이고 간단하게 적용할 수 있는 대안이다. 산소 의존 모노옥시게나제의 전환 조건에서의 일반적인 적용성도 확인할 수 있었다.
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[7] 수스케, 더블유. 에이.(Suske, W. A.) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 1997, 272(39), 24257-242565]
[8] 헬드, 엠.(Held, M.) 등의 문헌[Biotechnol. Bioeng., 1999, 62(6), 641-648]
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[17] 브리엘벡, 비.(Brielbeck, B.) 등의 문헌[Biocatalysis, 1994, 10, 49]

Claims (18)

  1. a) 하기 화학식 II의 모노히드록시페닐 화합물을 2-히드록시비페닐 3-모노옥시게나제(HbpA)(E.C.1.14.13.44)를 사용하여 NADH 및 산소의 존재하에 전환하고;
    b) 형성된 NAD+를 NADH로 전기화학적으로 환원시키는 것을 포함하는 하기 화학식 I의 2,3-디히드록시페닐 유도체의 전기효소적 제조방법.
    <화학식 I>
    <화학식 II>
    상기 화학식들에서, R은 비치환, 일치환 또는 다치환 페닐, C1-6알킬, 할로겐 또는 CN이고;
    R'는 H 또는 OH이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 전기화학적 NAD+환원이 음극성으로 제조될 수 있고 재생될 수 있는 히드리도로듐 산화환원 촉매 존재하에 수행되는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 사용되는 산화환원 촉매가 Ag/AgCl(포화)(pH=6-9; T=20-30℃)에 대하여 측정된 -650 내지 -800mV 범위의 음극 전위에서 히드리도로듐 착물로 전기화학적으로 전환될 수 있는 로듐 착물인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 하기 화학식 III의 로듐 착물이 사용되는 방법.
    <화학식 III>
    [CpRh(III)(bpy)Cl]Cl
    상기 화학식에서, Cp는 시클로펜타디에닐 또는 펜타메틸시클로펜타디에닐이고
    bpy는 2,2'-비피리딜이고, 각각의 피리딜 환은 비치환이거나 공여기에 의해 일치환 또는 다치환된다.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 화학식 III의 로듐 착물이 음극성으로 환원되어 NAD+를 환원할 수 있는 하기 화학식 IIIa의 히드리도로듐 착물이 형성되는 방법.
    <화학식 IIIa>
    [CpRh(I)(bpy)H]Cl
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 조건에서 수행되는 방법.
    a) 기질 농도: 0.1 내지 4mM;
    b) NAD+농도: 0.01 내지 0.5mM;
    c) 로듐 착물 농도: 5μM 내지 0.5mM;
    d) HbpA 농도: 10 내지 1000U/l;
    e) FAD 농도: 0 내지 200μM;
    f) 카탈라제 농도: 0 내지 1ㆍ107U/l;
    g) pH: 6 내지 7.5
    h) 온도: 20 내지 30℃
    i) 음극 전위: -650 내지 -800mV
    j) 산소 주입량: 20 내지 120cm3/(분ㆍl)
  7. NAD(P)H 존재하에 산화성 기질의 NAD(P)H-소비 산화성 효소적 전환을 수행하고, 기질 산화 도중에 형성된 NAD(P)+를 전기화학적으로 NAD(P)H로 환원하는 것을 포함하는, 효소적으로 형성된 NAD(P)+로부터 NAD(P)H를 전기화학적으로 재생하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, NAD(P)H-의존 모노옥시게나제(부류 E.C.1.14.-.-)를 산화성 기질과 함께 NAD(P)H 및 산소 존재하에 배양하고, 산소의 환원성 분해 및 기질 산화 도중에 형성된 NAD(P)+를 NAD(P)H로 전기화학적으로 환원하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 전기화학적 NAD(P)+환원이 음극성으로 제조될 수 있고 재생될 수 있는 히드리도로듐 산화환원 촉매 존재하에 수행되는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 사용되는 산화환원 촉매가 Ag/AgCl(포화)(pH=6-9; T=20-35℃)에 대하여 측정된 -650 내지 -800mV 범위의 음극 전위에서 히드리도로듐 착물로 전기화학적으로 전환될 수 있는 로듐 촉매인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 하기 화학식 III의 로듐 착물이 사용되는 방법.
    <화학식 III>
    [CpRh(III)(bpy)Cl]Cl
    상기 화학식에서, Cp는 시클로펜타디에닐 또는 펜타메틸시클로펜타디에닐이고,
    bpy는 2,2'-비피리딜이고, 각각의 피리딜 환은 비치환이거나 공여기에 의해 일치환 또는 다치환된다.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 화학식 III의 로듐 착물이 음극성으로 환원되어 NAD+를 환원할 수 있는 하기 화학식 IIIa의 히드리도로듐 착물이 형성되는 방법.
    <화학식 IIIa>
    [CpRh(I)(bpy)H]Cl
  13. 제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 조건에서 수행되는 방법.
    a) NAD(P)+농도: 10μM 내지 0.5mM;
    b) 로듐 착물 농도: 5μM 내지 0.5mM;
    c) 모노옥시게나제 농도: 10 내지 1000U/l;
    d) FAD 농도: 0 내지 200μM;
    e) 카탈라제 농도: 0 내지 1ㆍ107U/l;
    f) pH: 5 내지 9
    g) 온도: 20 내지 35℃
    h) 음극 전위: -650 내지 -800mV
    i) 산소 주입량: 20 내지 120cm3/(분ㆍl)
  14. 제 7 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화성 효소적 전환이 하기 반응 유형 중 하나를 포함하는 방법.
    a) 포화 또는 불포화 지방족 또는 방향족 탄소 원자의 산화, 특히 히드록실화, 에폭시드화 및 바에예르-빌리거(Baeyer-Villiger) 산화;
    b) 황 또는 셀레늄 산화;
    c) 질소 산화 또는 인 산화;
    d) 할라이드의 산화.
  15. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 산화환원 촉매의 모노옥시게나제-촉매작용 산화 반응에서의 NAD(P)H의 연속 또는 비연속 전기화학적 재생을 위한 용도.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 산화 반응이 하기로부터 선택되는 것인 용도.
    a) 포화 또는 불포화 지방족 또는 방향족 탄소 원자의 산화, 특히 히드록실화, 에폭시드화 및 바에예르-빌리거 산화;
    b) 황 또는 셀레늄 산화;
    c) 질소 산화 또는 인 산화;
    d) 할라이드의 산화.
  17. 반응 챔버 중에 한 쌍의 전극 및 모노옥시게나제, 기질, NAD(P)H 보인자 및제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 산화환원 촉매를 포함하는 액체 반응 매질을 포함하며, 산화환원 당량(전자)을 산화환원 촉매에 전달하는데 적합한 전극 전위가 음극에 존재하는, 모노옥시게나제-촉매작용 전기효소적 반응을 연속 또는 비연속 방식으로 수행하는 바이오리액터(bioreacteor).
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 액체 반응 매질이 단상성 또는 이상성인 바이오리액터.
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