CN1408372A - 一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclear polyhedrosis Virus)重组带有人白介素11基因,获得重组病毒,该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年8月6日,保藏编号为GMCC NO:0602,将该重组病毒接种家蚕细胞、幼虫、蛹进行表达,经分离纯化,冷冻干燥,制成注射和口服药物,经动物试验,均具有显著的增加小鼠血小板作用,成为一种制备增加血小板药物的新型方法,与现有技术相比,原料易得,生产成本低,治疗效果良好。
Description
技术领域
本发明涉及到通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备人白细胞介素(IL-11)的方法,本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产人白细胞介素(IL-11)制备抗血栓药物的方法。
背景技术
白细胞介素(IL-11)是哺乳动物造血微环境中来源于骨髓纤维母细胞的一种多功能细胞因子(Du等,1994)。它可以刺激IL-6依赖细胞株增殖,对于依赖于T细胞的B细胞抗体分泌具有刺激作用(Paul等,1992);与IL-3协同作用促进人及小鼠巨核细胞的形成与成熟,促进原始祖细胞的增殖,增加血小板数量,促进红细胞生成,诱导肝脏中急性期蛋白的分泌,作用于造血微环境,抑制脂肪的积累(Schibler等,1992;Du等,1997;Baumann等,1991;Killer等,1993)。人白细胞介素11(hIL-11)cDNA核苷酸序列含有597个核苷酸,预期编码199个氨基酸的多肽,前21个氨基酸为信号肽,成熟蛋白为178个氨基酸残基的活性蛋白。自1990年IL-11分子克隆成功以来,IL-11的基因结构及其生物学功能也相继得到阐明,并先后在哺乳动物细胞和大肠杆菌中进行表达(Kitts等,1993,刘蓓岭等,1996),但基本上为注射用药,生产成本高,市场上基本上没有口服剂型。家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)是真核表达系统,该技术自1983年Smith等首创以来,已有百种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》,1998,547-578),由于有家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用,家蚕表达的蛋白可以生产口服药物。
发明内容
为此,本发明采用家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus),分别在家蚕细胞,家蚕幼虫和蚕蛹中表达具有极高临床应用价值的人白介素11,制成注射和口服药物,通过动物试验,均具有显著的增加血小板作用。即本发明提供一种用蚕表用人白细胞介素11生产药物的方法,该药物具有显著的增加血小板的作用。
本发明提供了含有人白介素11的大肠杆菌质粒pUCIL-11,以人骨髓组织细胞mRNA为模板,通过RT-PCR扩增,在5’端引物引进Xho I酶切位点,在3’端引入BamHI位点,PCR产物经Klenow酶补平克隆进入pUC19的SmaI位点(宝灵曼公司),构建质粒pUCIL-11。
本发明还提供了含人白介素11基因的杆状病毒转移质粒pBacIL-11。从pUCIL-11质粒用XhoI和BamHI酶切,将目的片段连在同样被Xho I和Bgl II酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司),构建含人白介素11基因的杆状病毒转移质粒pBacIL-11(图1)。
本发明还提供了含人白细胞介素11基因的重组家蚕杆状病毒BmBacIL11。将转移质粒pBacIL-11与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN,进行8轮空斑筛选和Southern点杂交筛选含人白介素11基因的重组杆状病毒BmBacIL11,该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年8月6日,保藏编号为GMCC NO:0602。
本发明还提供了人白细胞介素11基因在家蚕细胞、五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBaclL11感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增,然后将扩增后的重组杆状病毒BmBac IL11注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内,分别取24、48、72、96、120小时的家蚕幼虫和蛹淋巴血,经5000rpm 5分钟离心后取上清,稀释10倍后加等体积的2×蛋白上样缓冲液,取20ul进行12%的SDS-PAGE分析。用考马斯亮蓝R250染色,结果见图2,结果在家蚕细胞培养上清和细胞样品、幼虫和蛹中血液样品中都能检测得到表达产物的条带,其分子量大小与天然hIL-11的分子量相符,约为19ku。
本发明还对人白介素11的的表达产物进行了生物活性的鉴定。B9-11细胞经RPMI1640培养液洗涤2次,用全培养液(RPMI 1640培养液含10%FBS)调整细胞浓度为5×107/L,每孔100μl,加入96孔培养板,分别加入不同稀释的IL-11标准品和待测表达样品,设B9-11细胞加全培养液做阴性对照。细胞置37℃、5%CO2下培养三天,在培养终止前4小时加浓度为5mg/ml的MTT溶液,每孔100μl,培养终止后轻轻弃上清,每孔加入酸化异丙醇100μl溶解甲簪颗粒。用酶标仪测定OD值,比色波长为570nm。结果显示,将50ul重组杆状病毒BmBacIL11感染BmN家蚕细胞感染后不同时间测培养上清中的IL11活性,在感染的第3天达到8×104 IU/106细胞。用BmBacIL11穿刺接种五龄家蚕幼虫和蛹体,于感染后不同时间收集蚕血淋巴,高速离心后测血淋巴中的IL11的活性,在感染的120小时血淋巴中的IL11活性达到5.2×105IU/ml,在感染120小时蛹血淋巴的IL11活性达到8.0×105IU/ml。
本发明还提供了在家蚕幼虫表达的人白介素11进行纯化。发病3天后收集家蚕细胞,发病5天后收集家蚕幼虫和蛹血清,先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分离,每次收集样品均经测活,确定其活性存在,进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化,获得纯度为99%的重组蛋白。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达人白介素11制成口服药物。在家蚕细胞、幼虫和蛹体表达人白介素11,经过过滤(100 KD超滤),30000rmp离心后经冷冻干燥后,以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明还对用家蚕幼虫和蚕蛹表达的人白介素11进行动物试验。取四周龄Balb/c小鼠(由浙江医学科学院动物中心提供),♀♂各80只,体重均在16-18g左右,腹腔注射抗血小板抗体(购自浙江医科大学平喘药教研室),剂量为3ml/kg,使小鼠血小板下降,腹腔注射抗血小板抗体24小时后开始给药,第一组每天每只注射0.5mg/kg纯化的人白介素11,每天给药一次,连续给药3天,第二组经口给药人白介素11口服药物,给药量为每20mg/kg,每天给药一次,连续给药7-10天,每天测定血小板变化(具体操作参照卫生部《新药临床前研究指导原则》),结果表明所给药物都具有明确的升血小板作用。
综合所述,本发明的优点如下:家蚕杆状病毒表达系统表达人白介素11具有表达效率高、表达后加工较完善等特点,因家蚕容易大量饲养、蚕体大,比其他昆虫杆状病毒表达系统具有更大的优越性,可以避免直接从动物体内纯化存在的操作烦琐、产率底、生产成本高等缺点,不会造成公害;家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫,可以低成本地大规模饲养;蚕体中有多种天然蛋白质保护剂,对表达产物有保护作用,使基因表达产物十分稳定;家蚕生产的蛋白可以口服,为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁,成为一条高效表达生产人IL-11的有效途径。
附图说明:图1:含人白介素11基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac IL-11(图注说明:3’FS/5’FS:苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子3’端/5’端旁侧序列;P:苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子;A(Polyhedin Poly A+signal)多角体蛋白基因聚腺苷酸化信号;M13 ori:M13噬菌体复制起始点;Amp:氨苄青霉素基因;ori:pUC复制起始点)图2:家蚕表达产物的SDS-PAGE分析图谱1、标准蛋白分子量标记;2.野生病毒感染的家蚕细胞;3.BmBacIL11感染的家蚕细胞;4.BmBacIL11感染的家蚕细胞上清;5.野生病毒感染的家蚕血淋巴;6、BmBacIL11感染的家蚕幼虫血淋巴7、BmBacIL11感染的蚕蛹血淋巴
具体实施方式
本发明通过以下实例作进一步阐述,但并不限制本发明的范围。实施例1、人白介素11基因大肠杆菌表达质粒的构建
根据已发表的人白介素11基因序列设计引物(PNAS,1990,VOL87,7512),在5和3端分别设计XhoI和BamHI位点。上游引物为:5’GGGCTCGAGATGCCTGGGCCACCACCTGGC3’,下游引物为:5’GGGGATCCTCACAGCCGAGTCTTCAG3’,取人骨髓组织细胞,低温下磨碎,加入GIBCOBRL公司生产Trizol RNA提取液1ml,轻轻摇动10分钟后加入500μl氯仿(浙江迪耳药业有限公司),在室温下放置10分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,加入2倍体积的乙醇,混匀后,12000rpm离心10分钟,弃上清,加入反转录酶1000单位(GIBCOBRL公司)及4dNTP(GIBCOBRL公司)进行反转录,37℃,1小时,获得由mRNA反转录合成的cDNA。PCR扩增人白介素11基因。反应条件为预变性94℃10分钟,变性温度94℃45秒,延伸温度为72℃90秒,复性温度45℃60秒,循环30次,最后72℃延伸10分钟。将PCR产物经过低融点胶分离回收,加1ml饱和苯酚(pH8.0),65℃作用10分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,用苯酚再抽提一次。取上清加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),混合5分钟,12000rpm离心10分钟,取上清,加入2倍无水乙醇,混合均匀置-20℃,2小时后再用12000rpm离心10分钟,弃上清,用70%乙醇洗沉淀,12000rpm离心1分,弃上清,自然干燥,沉淀用20μlddH2O溶解置于-20℃冰箱。PCR产物经Klenow酶(GIBCOBRL公司)补平克隆进入经SmaI酶切(GIBCOBRL公司)的pUC19(宝灵曼公司)位点,构建质粒pUCIL-11,经测序证明其核苷酸序列完全正确。实施例2、人白细胞介素-11基因的昆虫杆状病毒转移质粒的构建
将重组质粒pUCIL-11用限制性内切酶XhoI和BamHI双酶切,得到加上了XhoI酶切位点的hIL-11 cDNA片段,定向插入到转移载体质粒pBacPAK8(CLONTECH公司)的Xho I和Bgl II两位点之间,构建含hIL-11基因的杆状病毒转移质粒pBacIL-11(图1)。实施例3、hIL-11基因的重组杆状病毒的获得
取5ul含人白介素11基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBacIL-11和和6ul野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染。取6ul Lipofectin(GIBCOBRL公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm Dish中的BmN细胞用无血清的TC-100(GIBCOBRL公司)培养基洗涤两次,并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物,27℃培养4-5天,收取上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35mm Dish中的BmN细胞,1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑,感染BmN细胞3-4天,保存上清,细胞用NaOH裂解用于Southern杂交,取阳性克隆的上清共进行8轮空斑筛选和Southern杂交筛选。取阳性克隆的上清感染Bm N细胞扩增。即可得到大量的含人白介素11基因的重组杆状病毒BmBacIL11,该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年8月6日,保藏编号为GMCC NO:0602。实施例4、人白介素11基因在家蚕细胞、幼虫和蛹中的表达
将50ul重组杆状病毒BmBacIL11感染BmN家蚕细胞,72小时后收集样品用于SDS-PAGE分析;取扩增的含人白介素11基因的重组杆状病毒注射到五龄家蚕(Bombyx mori)幼虫和蛹中,每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml),分别取24、48、72、96和120小时表达的家蚕淋巴和蛹血,5000rpm 5min离心后取上清,用PBS pH7.4稀释10倍后,加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris.HCl,4%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油),取20ul进行SDS-PAGE分析。结果表明如图2,结果在细胞培养上清和细胞样品、幼虫和蛹血液样品中都能检测得到表达产物的条带,其分子量大小与天然hIL-11的分子量相符,约为19ku。实施例5、蚕表达的人白介素11的活性测定
IL-11标准品(宝灵曼公司)和待测样品均用RPMI 1640培养液稀释。B9-11细胞(苏州大学医学院)经RPMI 1640培养液洗涤2次,用全培养液(RPMI 1640培养液含10%FBS)调整细胞浓度为5×107/L,每孔100μl,加入96孔培养板,分别加入不同稀释的IL-11标准品和待测表达样品,每个稀释度设两个重复孔。设B9-11细胞加全培养液做阴性对照。细胞置37℃、5%CO2下培养三天,在培养终止前4小时加浓度为5mg/ml的MTT溶液,每孔100μl,培养终止后轻轻弃上清,每孔加入酸化异丙醇100μl溶解甲簪颗粒。用酶标仪测定OD值,比色波长为570nm。IL-11的活性单位以引起B9-11细胞最大增殖的50%作为一个国际单位。结果显示,将50ul重组杆状病毒BmBacIL11感染BmN家蚕细胞感染后不同时间测培养上清中的IL11活性,在感染的第3天达到8×104IU/106细胞。用BmBacIL11穿刺接种五龄家蚕幼虫和蛹体,于感染后不同时间收集蚕血淋巴,高速离心后测血淋巴中的IL11的活性,在感染的120小时血淋巴中的IL11活性达到5.2×105IU/ml,在感染120小时蛹血淋巴的IL11活性达到8.0×105IU/ml。实施例6、在家蚕细胞、幼虫和蛹中表达的人白介素11的纯化
用1万头五龄起蚕,每头人工接种重组病毒使之发病,在感染5天后收集家蚕幼虫和蛹血清蚕血清共5000ml;家蚕细胞发病3天后收集家蚕细胞,破摔。蚕血清和家蚕细胞破摔物先经5000rpm离心1小时,取上清在25000rpm离心30分钟,经硫酸铵沉淀后上SephadexG150柱分离,每次收集样品均经细胞测活,确定其活性存在,筛选活性峰。将过SephadexG150柱的活性部分混合后,上MonoQ柱,进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化,获得纯度为99%的重组蛋白。实例7、在家蚕幼虫和蛹中的表达的人白介素11口服药物的制备
在家蚕细胞、幼虫和蛹体(申请人自行饲养)表达人白介素11,经过过滤(100KD超滤),30000rmp离心后经冷冻干燥后,以家蚕蛹为填充料配制成口服药物。实例8、在家蚕表达的人白介素11的动物实验
取四周龄Balb/c小鼠(由浙江医学科学院动物中心提供),♀♂各80只,体重均在16-18g左右,腹腔注射抗血小板抗体(购自浙江医科大学平喘药教研室),剂量为3ml/kg,使小鼠血小板下降,腹腔注射抗血小板抗体24小时后开始给药,第一组每天每只注射0.5mg/kg(实例6中纯化的人白介素11),每天给药一次,连续给药3天,第二组经口给药人白介素11口服药物(实例7的口服药物),给药量为每20mg/kg,每天给药一次,连续给药7-10天,每天测定血小板变化(具体操作参照卫生部《新药临床前研究指导原则》),结果表明所给药物都具有明确的升血小板作用。
Claims (7)
1.一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于:通过基因工程方法获得重组的带白细胞介素(IL-11)基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒,该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存,地址在北京中关村,保藏日期为2001年8月6日,保藏编号为GMCC NO:0602,并用该病毒接种家蚕细胞、幼虫和蛹进行表达人白细胞介素11。
2.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于所述的基因工程方法获得重组的带白细胞介素(IL-11)基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒包括:人白细胞介素11基因的杆状病毒转移质粒pBac IL-11的构建是通过RT-PCR方法合成的人白细胞介素11基因片段,克隆进入经SmaI酶切的pUC19位点,将人白细胞介素11基因片段克隆进入转移载体pBacPAK-8中,获得的重组转移载体质粒pBac IL-11。
3.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于:所述的基因工程方法获得重组的带白细胞介素(IL-11)基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒包括:人白细胞介素11基因的重组家蚕杆状病毒BmBacIL11的构建是通过重组转移载体pBac IL-11 DNA与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞经8轮空斑筛选和Southern杂交斑筛选获得重组病毒BmBacIL11。
4.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于:所述的人白细胞介素11基因在家蚕细胞、幼虫和蛹中的表达是通过重组杆状病毒BmBacIL11感染家蚕细胞、五龄家蚕幼虫和蛹体表达产生。
5.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于:还包括分离,纯化家蚕表达的人白细胞介素11的步骤。
6.根据权利要求5所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于:还包括以家蚕为填充剂制备口服药物的步骤。
7.根据权利要求1所述的一种用蚕表达人白细胞介素11生产药物的方法,其特征在于:还包括将表达人白细胞介素11的家蚕幼虫和蛹经冷冻干燥后制成口服药物的步骤。
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