CN1401766A - 将外源遗传物质高效导入活细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种向植物组织、器官或细胞中导入外源遗传物质的方法。具体地说是将活细胞、组织块或器官在高渗培养液中处理一段时间，再放到含外源遗传物质的普通培养液中，然后用微束激光进行穿刺。外源遗传物质立即从穿刺小孔进入细胞，小孔约3秒钟自然闭合。本发明的方法所适用的转化受体广泛，不受种属及基因型的限制；对细胞的损伤小，而且适当剂量的激光有刺激生长作用；可以准确地定位于细胞或细胞器，并且通过监视器可直接观察打孔部位；操作简便、重复性好。

Description

将外源遗传物质高效导入活细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种将外源遗传物质高效导入活细胞的方法，具体地说是将活细胞、组织块或器官在高渗培养液中处理一段时间(其关键技术是采用适宜的渗透剂与适宜的处理时间)，再放到含外源遗传物质的普通培养液中，形成细胞渗透压内高外低的梯度，然后立即用微束激光高频率脉冲穿刺(关键技术是激光微束最佳技术参数，如输出能量、波长、脉冲数等)，外源遗传物质立即从孔洞进入细胞，孔洞在短时间内闭合，使遗传物质保留在细胞内，并与其基因组整合。然后在筛选培养基中将转化体筛选出来。

背景技术

已建立的植物转化方法可分为农杆菌介导转化法及外源基因直接转化法。由于前者在单子叶植物中难以应用，而且依赖于组织培养再生技术，因此，近十年来发展了多种不依赖于农杆菌的直接转化法。这些方法是将纯化的重组质粒DNA导入植物细胞，以期获得转基因植物。在这种方法中，最早是用聚乙二醇(PEG)介导转化植物原生质体。由于原生质再生困难，又继续发展了一系列对组织和细胞的转化技术，最广泛采用的是基因枪法(particle gun)，又称微弹轰击法(microprojectilebombardment)，是一种将载有外源DNA的金属粒子经驱动后通过真空小室进入靶组织的一种转化技术。这种技术已得到广泛应用，已在30多个属的植物中获得转基因植物。此外，还有电激法(electroporation)，即借助于高压放电的脉冲使细胞形成可逆的微孔，并使外源DNA进入细胞。此外还有显微注射法(microinjection)，借助于显微注射器向细胞注入DNA，使细胞得到转化。这些方法都有成功的实例，近几年来新发展的方法有碳化硅(silicon carbide fiber)介导法，是用微米级的纤维丝经涡旋振荡对细胞穿刺，从而导入外源DNA。又如电泳法(electrophorsis)，是在一定电场强度下，由从负极向正极的DNA泳动动力将DNA导入受体组织中。这些方法简单易行，价格低廉，但技术的稳定性差，尚不够成熟，都依赖于组织培养再生技术。周光宇等1978年首先提出用作物总DNA通过花粉管通道对作物进行DNA片段的转化，随后国内许多育种单位开展了通过花粉管通道将DNA导入植物的研究。但这种技术，要求技术较高，重复性差，且只能在有性生殖的植物中应用。

激光微束穿刺法(laser microbeam puncture)直接导入外源基因的技术，过去曾有报道。激光是一种相干性很强的单色电磁射线，一定波长的激光经过显微聚焦可形成微米级光斑，其直径多在1μm左右，这种激光微束可引起细胞膜的可逆性穿孔，这种效应使得人们考虑用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺，从而导入外源DNA，这一设想首先在动物和人的细胞中进行研究，如Tsukakoshi^[1]等，1984年，用Nd-YAG激光器将Eco-gpt基因导入大鼠细胞，经Southern杂交分析，Eco-gpt基因得到了整合表达。Tao wen^[2]等1987年也用Nd-YAG激光器将培养的人纤维瘤细胞导入Neo基因，经Southern杂交分析，Neo基因也确证了整合表达。

在植物遗传转化方面，Weber^[3][4]等(1988)利用激光微束将荧光素标记pBR332导入离体油菜细胞中，观察到细胞中标记物的存在。此后，又进一步证实激光微束可定向地穿透细胞壁和质膜，并将外源基因定位导入细胞器。激光微束不仅可以瞄准一个欲导入外源DNA的目的细胞，而且还可定点地穿刺一个目的细胞器进行操作。此后，Greulich和Weber^[5](1992)用激光微束穿刺法将潮霉素抗性基因导入烟草，获得了两棵转基因植株，并证明该基因已整合到烟草基因组。

但是上述报道存在的问题是未提及转化成功的频率，未见技术上进一步优化和改进；而且未见有连续的报道，这表明作为一种转化方法尚未进行系统地研究，还不够成熟。如微束激光作为转化方法关键技术之一是高渗预处理，根据Weber最早报道(1990)在渗透压调节剂的选择上，只用山梨醇0.6-0.7mmol/L和10mmol/L Tris.Cl，pH7.2，以后激光转化研究中均沿用这种配方，Yamaguchi等(1994)用激光微束转化了多种观赏植物的花粉，将pBI121的质粒DNA(GUS，NPTII基因)导人凤仙花(Impatiens balsamina L.)和沃克凤仙花(Impatiens wallcrianaHook)，花粉用N_2-激光微束在0.3mol/L上述高渗溶液中进行激光穿刺，也只证明有GUS基因表达。我们研究表明，这一缓冲液配方对植物细胞活性的恢复和生活力的提高并无益处，处理材料容易褐变。在处理时间上以及外源遗传物质的处理浓度上等技术这些报道中也未做专门的优化试验。

在叶绿体转化方面，Weber等(1988)将外源DNA通过激光微束穿刺导入叶绿体，所用叶绿体的高渗液，较为复杂，含山梨醇0.55mol/L。NaCl 83mmol/L、2-N-morpholin ojethanesalfonic acid.EDTA33mmol/L、KH₂PO₄ 0.87mmol/L、MgCl₂ 1.67mmol/L、和MnCl₂ 1.67mmol/L，pH值为6.1，叶绿体悬于高渗液中再放入质粒DNA，随之在30s之内进行激光穿刺，此后并未见进一步报道。因此，在国际上对激光微束导入外源基因，许多参数尚不够成熟。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物组织、器官或细胞中导入外源遗传物质的方法。

本发明提供了一种向植物组织、器官或细胞中导入外源遗传物质的方法，包括：

将植物组织、器官或细胞在高渗液中浸泡至质壁分离，其中，高渗液的渗透压在0.3-1mol/L之间，并且是在适合植物生长的培养基中使用选自蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、山梨醇、和果聚糖的糖醇类分子，选自包括脯氨酸和羟脯氨的氨基酸类及激素脱落酸(ABA)以及它们的混合物配制的；

将上述处理后的植物的组织、器官或细胞取出，除去其表面的高渗液，再放到含有外源遗传物质的普通培养液中，然后用激光脉冲打孔的方法使细胞壁快速穿孔，使外源遗传物质立即从孔洞进入细胞，其中，所述的含有外源遗传物质的培养基中外源物质的浓度为0.01μg/μl至1μg/μl，激光脉冲单位时间的脉冲数为60次-10⁴次/分钟；

将处理的细胞、组织或器官转入筛选培养基中使细胞再生，得到转化的植株。

本发明所涉及的外源遗传物质高效导入活细胞的方法，其关键技术是，将活细胞、组织或器官在高渗培养液中浸泡一定时间。用高渗液处理细胞、组织或器官时，高渗基质应该是对细胞无毒害作用的糖醇类分子，如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖及甘露醇、山梨醇、果聚糖；氨基酸类有脯氨酸或羟脯氨酸；激素可用脱落酸(ABA)。动物细胞为Na⁺、K⁺、Cl^-、HCO₃ ^-等，将渗透调节基质放入适当的含有机及无机成分的培养基中，不再加其它缓冲剂，如不再加Tris.Cl及磷酸缓冲液等，含有机及无机成分的培养基变可起到缓冲剂的作用。植物所用最适的培养基为MS^[8]、B5^[9]或N6^[10]培养基。用上述渗透调节剂调节渗透压时细胞自身的渗透压有所不同，要考虑到不同的植物种，各种植物自身的渗透压一般在0.25～0.65mol/L之间，所用的预处理高渗液多在0.3～1mol/L之间，处理时应使细胞内外压差超过0.05mol/L，这对外源DNA导入十分有利。预处理的时间范围是20分钟至4小时。细胞发生明显质壁分离应是可恢复的，也就是说胞质的体积减少到原来体积的80％时较为适宜，即可转入含外源遗传物质的普通培养基中，以形成渗透压内高外低的梯度。Cesarane^[7]等早在1979年就观察到细胞发生质壁分离的过程，但我们将这种生理现象与激光微束穿孔后外源遗传物质进入细胞的过程联系起来，便成为一种行之有效的细胞遗传转化的新技术。在高渗液处理后，将细胞、组织或器官表面的高渗液除去，再放到含有外源遗传物质的普通培养液中，将高渗基质溶液除去的方法，是将残留物吸去，可用滤纸或其它无毒材料吸附高渗液残留物，而决不要清洗，以免破坏了细胞渗透压内高外低的梯度。在激光微束穿孔后，细胞的渗透压梯度可使外源遗传物质进入细胞。导入活细胞的外源遗传物质主要是用分子克隆方法分离出的基因片段、完整基因、重组的质粒DNA、或染色体大片段等。外源遗传物质的浓度也是一个关键因素，不同外源遗传物质，处理时所用溶液浓度在0.01μg/μl至1μg/μl的范围。一定浓度的外源遗传物质溶液一定要淹没处理材料，以使穿孔的细胞及时吸入溶液。因而，溶液用量依材料大小及多少而定。用物理学方法具体地说就是一种微束激光穿刺法使细胞壁高频率、快速穿孔，在细胞渗透压的作用下，外源遗传物质立即从穿刺小孔进入细胞，在极短的时间内细胞的穿孔自然闭合，这样使进入细胞的遗传物质保存在细胞内。用二倍频或三倍频的激光微束，输出波长分别为530nm，或355nm，脉宽10-15ns；单位时间的脉冲数60次-10⁴次/分钟。现用的脉冲数为120-200/分钟。用微束激光穿刺法，每组织处理脉冲数的增加可显著提高外源基因整合表达的频率，如在一定范围内将每外植体处理脉冲数增加1倍，转化频率可提高50％-100％，可以预期，这一方法进一步优化后，导入外源基因的成功率将可能远远超过其它方法。在有些细胞中外源遗传物质与其基因组发生整合，从而完成转化过程。为了将转化的细胞筛选出来，必须将目的基因与筛选标记基因形成融合基因(如抗生素抗性基因，抗除草剂基因等)，然后，将处理的细胞、组织或器官，转入含有筛选剂的培养基中，使转化细胞增殖并再生，这样，表达目的基因转化体才能被筛选出来。此外，在外源遗传物质导入细胞后，还可以进行后高渗处理，其特征是，将导入的材料在MS、B5、或N6培养基中加入渗透调节剂，培养半天至3天，然后经过1周的恢复培养，再转入到含筛选剂的培养基中进行筛选，后高渗处理的原理是：在适宜的固体培养基中加入甘露醇与山梨醇(1∶1)0.6mol/l。使导入外源遗传物质的材料培养12小时至3天，从而使转化后受体细胞的细胞质变得浓厚，导入的微粒在细胞质浓度大的环境中分子的动能降低，布朗运动减缓，微粒穿出细胞的可能性降低。此外胞膜与胞质之间形成的空隙也阻碍微粒穿出细胞。因此会提高外源基因整合表达的成功率。

我们经十年的努力，使激光微束穿刺法从研究阶段向实用化阶段迈进，已在小麦(Tritium aestivum L.)、百脉根(Lotus corniculatus L.)、八棱海棠(Malus micromalus Mak.)、油菜(Brassica napus L.)、棉花(Gossypium hirsutum L.)、马铃薯(Solanum tuberosum L.)等，涉及到六个科的植物得到了转基因植物的整合表达。由标记基因导入已转移到有用的目的基因导入，如棉花导入抗真菌病的双价基因(几丁质酶基因及β-1，3葡聚糖酶基因)，具有抗枯萎病及黄萎病的特性，已选育至第七代。油菜导入抗虫基因，显示了抗虫的特性，转化效率达2.2％。用幼胚、小孢子、子叶、子叶柄均获得了转基因植株。与其它转化方法相比激光微束穿刺法有许多优点：

1、在植物转化中，微束激光穿刺法的可用外植体种类十分广泛，不受基因型的限制，单子叶、双子叶植物均可采用，受体细胞可以是组织块或微器官，如幼胚、成熟胚、茎尖、叶片、叶柄、花粉等，还可以转化单细胞或悬浮细胞、愈伤组织等。与农杆菌方法相比较，农杆菌法的应用受到植物种属的限制，它对单子叶植物(如禾本科作物)的侵染能力很低，而对双子叶植物是一种有效的转化方法；激光微束穿刺法在有性生殖及无性繁殖植物中均可以采用，也不受繁殖方式的限制。而有些直接转化法如花粉管通道法则依赖于有性生殖过程。而且影响因子多，技术不易掌握，每一种植物转化方法都有较大的差异，都要有一个摸索和研究过程。

2、微束激光穿刺法对细胞损伤小，激光穿刺孔在1μm左右，其关闭与修复仅需几秒钟，细胞活性恢复快，许多报道表明激光照射本身对生物材料普遍有刺激作用，如适当剂量可使细胞的多种酶活化，并可使有丝分裂加快。与农杆菌转化法相比，农杆菌对植物外植体的伤害较大，如果农杆菌过多，会导致外植体的褐化死亡，而且培养基中除加筛选剂外，还需使用抗菌素以抑制细菌的生长，这样会引起细胞生活低下，降低转化细胞的再生能力；而激光微束法只需提取质粒DNA，直接应用激光导入细胞中，然后再转移到仅加筛选剂的筛选培养基上诱导再生，不存在细菌及抗菌素对植物细胞的伤害作用。

用基因枪法转化，近年来发展十分迅速，其优点除受体材料较广泛外，还有一枪可以产生多个靶位点，但是，用基因枪法转化往往使破碎细胞太多，且细胞中因含有金粉等异物，往往会降低细胞分裂频率。微束激光穿刺法却不存在这些问题。

3、用微束激光可以瞄准生长点部位打靶，进行生长点细胞的原位转化，使幼胚、成熟胚或幼芽点直接再生植株，不经过愈伤组织阶段。这样不仅减少体细胞无性变异，对一些体细胞诱导再生困难的物种也可以通用。在棉花抗虫转基因中就是用微束激光照棉籽的幼胚及成熟胚，使之直接发育成植株，然后选出抗虫转化体。而农杆菌法则必须经过体细胞诱导再生的过程，基因枪也难以准确对生长椎的分生细胞打靶。其它方法如电激法、显微注射法等均有诱导细胞再生的依赖性，不易再生的种便不能采用。

4、微束激光用显微镜聚焦后不仅可以瞄准靶细胞，还可定位瞄准细胞器，可以用于叶绿体等定位导入外源基因，且定位准确，重复性好。这与用其它转化方法相比，现有任何方法均是难以做到的，因此，对今后对叶绿体基因组转化是一个可选择的方法。

5、微束激光穿刺法也可用于动物细胞的转化，近年来动物转基因技术迅猛发展，动物细胞可以用显微注射法和电激法导入外源基因，但用微束激光穿刺法可能效率更高。可以预期，这一技术将在动物转基因中得到广泛的应用。

6、可能将微束激光穿刺转基因技术用于基因治疗，这一方法比较安全，可避免在转基因过程使用病毒载体带来的某些隐患(如所用的病毒载体来自小鼠白细胞RNA病毒、还有些是用DNA病毒载体，如腺病毒及疱疹病毒等，虽经改造，但尚不能排除拌发病毒感染的危险)。因此，有些基因治疗公司已宣布禁止使用病毒载体生产基因治疗的药物产品。再者病毒只能容纳小的片段，对于大片段的导入便受到限制。

参考文献

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10、朱至清，1975年，通过氮源比较式建立一种较好的花药培养基，中国科学，(2)，484-190

附图简要说明

图1显示激光细胞显微照射系统

图2显示植物表达载体pBBt9，其中，E：EcoRI；H：HindIII；B：BamHI；N：NcoI；S：SalI

图3显示激光转化获得转基因油菜.A：在选择培养基上子叶柄的再生芽；B：在选择培养基上的卡那霉素抗性芽；C：在生根培养基上的转基因油菜；D：在花盆中的转基因油菜

图4显示激光转化法获得的转基因植株生长正常

图5.微束激光转化获得转基因植株的PCR检测。M：DNA Marker；A：质粒pBBt9的扩增产物；B：非转基因植株的扩增产物；C-J：转基因植株的扩增产物

图6显示微束激光转化获得转基因植株的PCR Southern Blot检测。M：DNA Marker；A：阳性对照；B：阴性对照；C-J：转基因植株

图7显示激光转化获得转基因植株的Southern Blot检测。M：DNAMarker；1：pTBt9/EcoRI；2：非转基因植株DNA/EcoRI；3-9：转基因植株DNA/EcoRI

图8显示部分T₁代转基因油菜的PCR扩增结果。M：DNA Marker；1-12：T1代转基因植株

图9显示T₁代转基因油菜的虫试。左：对照；右：T1代转基因植株

图10显示农杆菌介导法获得转基因油菜的PCR检测。M：DNA Marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3-9：转基因植株

实施例一、材料和方法1.植物材料

以甘蓝型油菜(Brassica napus)品种H165为转化受体材料，该品种是由中科院遗传所经济作物遗传工程实验室及其协作单位选育的优质高产“双低”(低芥酸、低硫苷)新品种。2.质粒与菌种

质粒pTBt9由本人构建，该质粒含有苏云金芽孢杆菌的3.5kb cry1Aa10杀虫晶体蛋白基因。3.酶和试剂

限制性内切酶、T₄连接酶和Taq DNA聚合酶均购自TaKaRa公司，“DIG DNA Labelling and Detection Kit”购自Boehringer Mannhein公司，其余均为国产或进口分析纯试剂。4.测试昆虫及来源

转基因油菜的抗虫试验所用的昆虫为二龄棉铃虫(Heliothis armigera)和二龄小菜蛾(Plutella xylostella)。棉铃虫由中国农科院植物保护研究所王武刚老师提供。小菜蛾由中国农业大学植物保护学院高希武老师提供。5.主要仪器

(1)激光仪是由中国科学院遗传研究所和重庆京渝激光生物研究所共同研制的Nd：YAG激光细胞显微照射系统(图1)。它能够发射4种波长的激光(一倍频，1.06μm；二倍频，0.53μm；三倍频，0.35μm；四倍频，0.26μm)。输出激光微束的脉宽及能量均可调，脉宽调节范围为10-15ns，输出能量调节范围为2-50mJ。激光仪引入一台相差显微镜，激光微束通过显微镜可聚焦到生物样品。另外，激光仪还配备有电视监视系统，可监视整个激光穿刺过程。

(2)PCR仪为美国Perkin Elmer公司生产的DNA Thermal cycler480。6.培养基

YEP：Yeast extract 10g/L+Tryptone 10g/L+NaCl 5g/L，pH7.0

MS：MS基本成分+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH5.8

MB6：MS+6-BA 6mg/L，pH5.8

MB1：MS+6-BA 1mg/L，pH5.8

MN：MS基本成分+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH5.87.质粒pBBt9大量制备

pBBt9含有抗虫基因cryIAa10，其质粒大量制备方法参照《Molecularcloning》(Sambrook等，1989)，所提取的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测纯度和浓度，并将浓度稀释至0.1μg/μl，以用于转化农杆菌和激光转化植物细胞。8.油菜转化受体的获得

将H165油菜种子用70％乙醇浸泡1min，然后在0.1％升汞中灭菌15min，无菌水冲洗3-5次，接种于MS培养基上，25℃-28℃下光照培养，4-5d后小心切取无菌苗的子叶柄(带有子叶)用作转化受体。9.激光微束穿刺法将cry1Aa10基因导入油菜

(1)穿刺前材料的高渗预处理：将作为转化受体的油菜子叶柄在高渗液(MB6+山梨醇0.25mol/L+甘露醇0.25mol/L)中浸泡25-30min，取出放于无菌滤纸上吸干，置于Rose小室中，每个Rose小室放子叶柄20个，加入80-100μl质粒DNA(0.1μg/μl)，使子叶柄充分浸于其中又不致于飘动，然后封闭小室。

(2)穿刺过程：将Rose小室倒置于显微镜载物台上，在40倍物镜下把子叶柄调到最清楚。选择三倍频激光微束，波长0.35μm，脉宽15ns，输出能量大于2mJ，光斑直径0.5-1.0μm，对准子叶柄基部进行激光穿刺。穿刺过程中不断移动载物台，使每个子叶柄均匀受到20-25个脉冲的穿刺，前后几批共处理子叶柄约360个。

(3)穿刺后转化植株的筛选：在无菌条件下打开Rose小室，将子叶柄用无菌水或MB6液体培养基冲洗后接种到不加抗生素的MB6分化培养基上培养4-5d，再转入含卡那霉素15mg/L的MB6培养基上使植株再生。一个月后将长出的卡那霉素抗性芽(丛)移到含卡那霉素20mg/L的MB1培养基上进行筛选，同时使不定芽得以伸长。然后将抗性芽(芽丛则分为单芽)再转入30mg/L卡那霉素的MB1培养基上，每3周继代一次，筛选两个月以上。最后将存活的抗性芽转入附加20mg/L卡那霉素的MN生根培养基诱导生根。

(4)试管苗的移栽：选择根系发育良好的植株移栽至盆土。移栽前先逐步揭开封口膜，使试管苗在培养瓶内锻炼3-5d，然后将试管苗放入水盆中，小心清除根系上附着的琼脂培养基，再放入10mg/L NAA水溶液中浸根30min。移栽后的头几天，注意罩上玻璃容器或塑料薄膜以保持湿度。依此方法，转化植株的移栽成活率可达90％以上。10.转基因油菜的分子生物学检测(1)植物总DNA的提取：主要参照傅荣昭等(1994)的方法。

A.取1g新鲜叶片，在研钵内加液氮研磨成粉末，转入50ml离心管中，加4ml2×CTAB提取液，轻轻混匀，65℃保温1h，间或轻轻摇动，使充分混匀。

B.加等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，室温下5000rpm离心15min。

C.取上清液，重复上一抽提步骤。

D.取上清液，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温放置15min。

E.室温下5000rpm离心15min。

F.去上清，核酸沉淀用70％乙醇冲洗一遍。

G.风干核酸沉淀，溶于50-100μl TE中。

H.取5μl DNA溶液，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量与浓度。(2)转基因植株的PCR检测

A.PCR引物的设计：根据cry1Aa10基因编码区核心片段(EcoRI-F片段，第268-999bp)的碱基序列，设计并由上海生工公司合成了如下两个引物：

  P3：5’GCCATTTCTAGATTAGAAGG 3’

  P4：5’ATCCATAAGATGTGGTTGCC 3’P3取自cry1Aa10编码区第286-305位的碱基序列，P4取自cry1Aa10编码区第875-894碱基位置的互补序列，预期的PCR产物长度为609bp。

B.PCR反应：取以上制备的总DNA和引物P3、P4，按标准反应进行PCR扩增。具体反应液组成为：

10×Taq buffer                  2μl

        dNTPs(各2.5mmol/L)      2μl

        油菜DNA(0.05μg/μl)    1μl

        引物P3(10pmol/μl)      1μl

        引物P4(10pmol/μl)      1μl

        Taq酶(2.5U/μl)         1μl

        加D.D.H₂O              至20μl

        混匀后，表面覆盖一层石蜡油。具体扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃1min→57℃1min→72℃1min，共循环30次；最后72℃延伸10min。反应结束后，取10μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。(3)转基因植株的PCR Southern和基因组Southern Blot分析A.杂交探针的制备

a.PCR标记：本研究中所用的杂交探针是应用引物P3和P4从cry1Aa10扩增得到的609bp核苷酸序列，按Boehringer Mannheim公司的“ThePCR DIG Probe Synthesis Kit”进行标记，反应体系如下：

         质粒pTBt9(0.1μg/μl)              1μl

         10×PCR反应缓冲液                  5μl

         PCR DIG mixture                    5μl

         引物P3(10pmol/μl)                 2μl

         引物P4(10pmol/μl)                 2μl

         Taq酶(5U/μl)                      1μl

       灭菌水补足至总体积为            50μlPCR反应程序与(2)B中所述相同，同时设一对照，对照中除用2mmol/LdNTPs代替PCR DIG Mixture外，其余条件均一样。

b.标记浓度的估计：取5-10μl PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，比较标记扩增物与对照之间带型的差别，同时估计标记的效率。如果扩增的带型与对照相似，则证明扩增成功，根据电泳结果可估计标记探针的量。

c.探针的纯化：尽量去掉石蜡油，加入5μl 4mol/L的LiCl和150μl预冷的(-20℃)无水乙醇，充分混匀，至少在-20℃放置2h或-70℃放置30min以上。13,000g离心15min，去上清。冰预冷的70％乙醇洗沉淀，再13,000g离心5min去上清。充分吹干沉淀。溶于25μlTE(10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)，-20℃保存待用。B.Southern转膜

a.样品：PCR Southern的样品为PCR阳性反应产物；考虑到cry1Aa10中有一个732bp的EcoRI-F核心片段，对转基因油菜的基因组DNA(10μg)采用了EcoR I酶切，将酶解产物作为基因组Southern的样品。

b.琼脂糖凝胶电泳：取以上样品分别加入1.0％琼脂糖凝胶的点样孔内，在1×TAE电泳缓冲液中电泳。将电泳后的凝胶放入溴化乙锭(EB)中染色，紫外灯下检查电泳效果。

c.脱嘌呤：用双蒸水冲洗凝胶2次，加入0.25mol/L HCl脱嘌呤5-10min，一般不要超过10min。

d.变性：双蒸水冲洗一下，加入碱变性液(1.5mol/L NaCl，0.5mol/LNaOH)，置于脱色摇床上缓慢摇动，变性两次，每次15min。

e.中和：双蒸水冲洗，再加入中和液(3mol/L NaCl，0.5mol/L Tris.HCl，pH7.4)中和两次，各15min，置于脱色摇床上缓慢摇动。

f.转膜：双蒸水冲洗，将凝胶底面朝上放置在白瓷盘、玻璃板、三层滤纸搭建的滤纸桥上。白瓷盘内装有20×SSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L柠檬酸钠，pH7.0，高压灭菌)。在胶面上放一张同样大小的Hybond-N⁺尼龙膜(Amersham公司)，并盖上三张湿的同样大小的滤纸，逐层赶净滤纸桥与胶之间、胶与尼龙膜之间、膜与湿滤纸之间的气泡。并用石蜡膜(parafilm)封在胶的四周，以防吸印短路。最后压上一叠干滤纸、吸水纸及1kg左右的重物。

g.吸印20h后，取下尼龙膜，在2×SSC溶液中冲洗数分钟。

h.将膜置滤纸上室温晾干，并于80℃烤膜2h，以固定DNA。或者先将膜(含DNA面朝下)置于紫外透射仪上照射1-1.5min后，2×SSC溶液中洗一下，然后晾干。

i.保鲜膜包裹，-20℃保存待用或直接用于分子杂交。C.预杂交：在杂交盒中，放入待杂交的尼龙膜，并加入适量的(按20ml/100cm²计算)预热的DIG标准杂交液(5×SSC，0.1％N-lauroylsarcosine，0.02％SDS，10％封阻剂)，65℃保温至少30min，可长达2h以上。D.杂交：

a.探针变性：在100μl的杂交液中加入适量的探针(按杂交液终浓度5-25ng计算)，混匀，沸水中变性10min，并迅速置于冰水中冷却20min。

b.杂交：倒掉预杂交液，加入预热至65℃的适量杂交液和已变性的探针摇匀(加入杂交液的量要根据膜的大小而定，3.5ml杂交液足够用于10×10cm的膜)。封好杂交盒，65℃水浴锅中轻摇过夜，已利于杂交。E.杂交后的洗膜

a.倒掉杂交液，室温下较大体积的2×SSC、0.1％SDS溶液中洗2次，每次5min。

b.65℃下，在洗膜液(0.5×SSC、0.1％SDS)中洗两次，每次15min，在此期间持续晃动。E.显色反应

a.洗后的杂交膜在马来酸缓冲液中(0.1mol/L马来酸、0.15mol/L NaCl，pH7.5)浸洗1-5min。

b.加入适量(1ml/cm²)1×封阻液(1％封阻剂溶于马来酸缓冲液中)，反应30min。

c.用1×封阻液稀释地高辛碱性磷酸酶偶联抗体(1∶10000)至75mU/ml。

d.将膜置于适量抗体溶液中(20ml可用于10×10cm²的膜)室温反应30min。

e.用冲洗缓冲液(马来酸缓冲液中再加入0.3％的Tween 20)洗膜2次，每次15min。

f.将膜转移至检测缓冲液中(0.1mol/L Tris.HCl，0.1mol/L NaCl，50mmol/L MgCl₂，pH9.5)平衡2-5min。

g.加入适量(0.1ml/cm²膜)新配制的显色液显色，此过程避光且不要晃动。显色液配制：45μl NBT(nitrion blue terazolium)和35μl BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)用显色缓冲液稀释至10ml，现用现配。

h.显色适当时间后，倒掉显色液，加入双蒸水或TE终止反应。

i.拍照、记录结果。11.转基因植株的抗虫性分析

取转基因植株的叶片放于10cm培养皿中进行虫试。每皿放入10头幼虫，两天更换一次叶片，同时以未转基因植株作对照。每个植株及对照各重复3次。在接虫后的第8天统计死活虫数，将存活的幼虫称重，并计算校正死亡率和存活幼虫的平均体重，记录叶片受害程度。12.T₁代转基因植株的分析

(1)抗卡那霉素活力检测：取转基因植株自交后代的种子(T₁代)，灭菌后在MS培养基上萌发，4-5天后切去无菌幼苗的根部，将无根苗插入含50mg/L卡那霉素的MN培养基，2周后更换一次培养基，4周后统计绿苗和白苗数，观察根和真叶生长情况。对照组也作同样处理。

(2)PCR检测：将部分T₁代转基因植株的种子播种于花盆，待植株长至七、八片叶子时，提取叶片DNA进行PCR扩增。

(3)抗虫检测：取PCR检测呈阳性的部分T₁代植株的中上部叶子，放入培养皿，每皿接入10头小菜蛾幼虫，一周后观察幼虫生长和叶片被食情况。二、结果与分析1.cry1Aa10基因植物表达载体

为了将cry1Aa10抗虫基因导入植物，将其构建到植物表达载体上。由于该载体带有双增强子的CaMV 35S启动子及TMV的“Ω”片段翻译增强序列，可介导外源基因在双子叶植物中高效表达。

经PCR实验，得到预期的扩增带，为重组质粒pBBt9(在大肠杆菌DH5a中)，其PCR鉴定结果如图3-3所示。利用激光微束穿刺法获得抗虫转基因油菜(1)转基因植株的筛选

油菜子叶柄被激光穿刺以后，放在含15mg/L卡那霉素的MB6培养基上，4-5天以后会发现子叶柄首先伸长生长，至原来的3-4倍。2周以后，大多数子叶柄的基部已见膨大，并带有少量愈伤。大约一个月以后，从部分子叶柄基部膨大处开始长出再生芽(图3，A)。其中大部分为白芽，少部分为绿芽。将这些绿芽转入20mg/L卡那霉素的新鲜筛选培养基上，经两次继代筛选，有一部分绿芽因白化而被淘汰，剩下的绿芽经统计，约占原来接种子叶柄总数(除去污染，大约320个)的5％左右。这部分绿芽经30mg/L卡那霉素连续筛选2个月以上，又有将近一半的绿芽被淘汰，最后只有8棵表现抗性稳定(图3，B)。将它们转入生根培养基后，都能被诱导生根并再生成完整植株(图3，C)。经移栽，已全部成活(图3，D)。这8棵植株在盆土中能正常生长并至开花结籽(图4)。(2)PCR和PCR Southern Blot检测

对转基因植株所作的PCR扩增结果表明，在所得的8株植株中，均能扩增出分子量为0.6kb的特异条带，而作为对照的非转基因植株则无这一条带(图5)。

用来自cry1Aa10的特异性探针与扩增的条带进行Southern Blot杂交，结果表明，有7株的扩增条带出现了明显的杂交信号(图6)。由此表明，这7株的PCR扩增产物为cry1Aa10的同源序列。(3)基因组Southern blot检测

用cry1Aa10核心片段(EcoRI-F片段)中的609bp核苷酸序列作探针，和经EcoRI消化的转基因植株DNA杂交，结果表明，在PCR Southern Blot阳性的7株植株中，都出现了0.7kb的杂交信号，阴性对照组则未出现此信号(图7)。这一结果说明了利用激光微束穿刺法，苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因已成功地转入油菜细胞中。如果按接种的外植体总数(除去污染)计算，激光微束穿刺法的转化频率为2.2％。(4)T₀代转基因植株的抗虫性分析

用二龄的小菜蛾和棉铃虫幼虫对Southern杂交呈阳性的7株转基因植株(分别命名为BT1～BT7)进行了抗虫测试。饲喂8天以后的结果表明，这7株转基因植株具有不同的抗虫效果(表3-1)，多数植株抗虫性与对照相比不够明显，其中只有BT2和BT7号植株抗虫性较好，两种幼虫在这些叶片上均取食较少，叶片受害最轻。幼虫的生长发育明显受阻，死亡率较高，存活的幼虫个体小，体重增长较慢。BT1、BT3、BT5和BT6号植株也具有一定的抗虫性，但与对照相比，幼虫死亡率的增加和体重的减少均不明显。而BT4号植株几乎没有表现出抗虫性。这些抗虫测定结果表明，杀虫蛋白毒素在多数的转基因植株中已得到表达，但表达量在不同的植株中存在很大差异。

  表3-1.激光转化获得的转基因植株对小菜蛾和棉铃虫幼虫的抗性测定^*

      平均体重          校正死亡率(％)

                                            叶片被食程度

株号   (mg)

       a     b           a         b          a       b

CK     8.6   114.2       0         0          3       3

BT1    7.6   102.6       20        11         2       3

BT2    3.4   58.1        71        67         1       1

BT3    8.3   89.7        10        10         2       2

BT4    8.9   110.0       0         0          3       3

BT5    8.6   90.6        12        20         2       2

BT6    7.9   87.0        20        14         2       2

BT7    4.7   62.7        60        63         1       1

*CK为对照；a和b分别代表小菜蛾和棉铃虫；1，2和3代表叶片被食程度依次增加。(5)T₁代转基因植株的分析A.抗卡那霉素的能力：转基因油菜BT2和BT7在温室中能够开花结籽，但结荚数和每荚的籽粒数均比对照减少，所获得的籽粒有1/3是空瘪的或不饱满。我们选择了40多粒较为饱满的种子进行了卡那霉素抗性实验。我们首先对对照组的抗卡那霉素能力进行了测试，发现非转基因对照植株具有很强的抗卡那霉素能力。它们在30mg/L或40mg/L卡那霉素的MS培养基上都有一部分能够存活下来并保持绿色，只有在50mg/L卡那霉素的培养基上，才使对照植株几乎全部白化，只有个别为浅绿色苗。因此，在测试BT2和BT7后代植株的过程中使用了50mg/L卡那霉素。测试的结果表明，BT2和BT7的大部分T₁代植株都能在卡那霉素培养基上保持绿色并生根良好(有少数绿苗未生根)，其余的则成为白化苗，最后死亡(表3-2)。测试结果表明卡那霉素抗性已通过T₀代传递给T₁代，但在T₁代出现了分离，经统计分析，绿苗与白苗的分离比符合3∶1遗传规律。B.PCR扩增：对种植于花盆中的BT2和BT7转基因油菜T1代(分别是26株和30株)提取叶片DNA，进行了PCR分析。结果表明，能扩增出0.6kb预期条带的后代植株各占86％和79％，表明cry1Aa10基因已通过有性繁殖传递到后代中(图8)。

           表3-2.转基因植株T₁代的卡那霉素抗性能力

T1代的母本植                                 白苗数         x²测验

                    总苗数          绿苗数

    株号                                                    (df＝1)

    BT2               40              32        8           P＞0.05^*

    BT7               38              25        13          P＞0.05^*

    CK                40              0         40          -

*0.05为显著性水平。C.抗虫能力：对以上PCR扩增反应呈阳性的部分转基因植株进行了虫试，结果发现，T₁代的有的植株仍具较好的抗虫能力，8天后幼虫的死亡率可达30％-50％，未死亡的幼虫生长变慢，叶片被食较轻(图9)。有些植株能使害虫的生长受到抑制，但对害虫没有明显的致死效应。多数植株对幼虫的生长发育未见任何影响。这些初步的结果表明杀虫蛋白基因cry1Aa10不仅能够遗传给后代，而且在某些后代植株中仍能维持较高的表达水平。2.与农杆菌介导法获得转抗虫基因的油菜比较：(1)转基因植株的筛选

油菜子叶柄经农杆菌浸染，共培养2-3天后，放在含15mg/L卡那霉素的MB6分化培养基上。3周以后发现子叶柄基部开始膨大，比激光转化法晚一周左右。另外，有一部分子叶柄发生褐化，这些子叶柄经长期培养，始终未见有再生芽长出。大约5周以后，未褐化的子叶柄基部开始长出了再生芽，同激光转化法相似，这些再生芽大多为白芽，少数为绿芽。将绿色再生芽转入20mg/L卡那霉素的新鲜筛选培养基上，经两次继代筛选，只有11株仍然保持较高抗性。经统计，在20mg/L卡那霉素筛选培养基上，得到的绿色再生芽占接种子叶柄总数(除去污染后大约270个)的4％左右。将这11株绿色再生芽经30mg/L卡那霉素进一步筛选，最后得到了7株抗性稳定的再生芽。经生根培养和移栽，这7株全部成活，在盆土中生长旺盛(图3-11)。(2)转基因植株的PCR检测

对以上获得的7株卡那霉素强抗性植株提取基因组DNA，进行PCR检测，发现其中有5株能扩增出预期的0.6kb的特异条带(图10)，初步表明这5株为转基因植株。(3)基因组Southern Blot检测

用EcoRI酶切PCR阳性的5株油菜的基因组DNA，用来自cry1Aa10核心片段的609bp核苷酸序列作探针，Southern杂交的结果表明，这5棵植株均出现了0.7kb的杂交带。由此证明，cry1Aa10杀虫晶体蛋白基因已整合进这5棵植株的基因组DNA中。按最初接种的外植体数目(除去污染后270个子叶柄)计算，利用农杆菌介导法获得的转化频率约为1.9％。(4)转基因植株的抗虫性测试

用二龄小菜蛾对Southern杂交呈阳性的5株转基因植株(分别称为NBT1-NBT5)进行了虫试。饲喂8天以后的结果表明，这5株转基因植株的抗虫效果均不明显(表3-3)。幼虫从第二天开始大量进食，五天以后开始见到有个别幼虫死亡，八天后幼虫的死亡率在0％-20％，未死亡的幼虫体重比对照略有降低，实验组叶片被食程度与对照无大的差别。这些结果表明杀虫蛋白毒素在转基因植株中的表达量很低，只对幼虫造成了轻微影响。由于这些转基因植株没有对小菜蛾表现出明显抗性，本实验未继续进行棉铃虫的杀虫实验及后代的抗性观察。

  表3-3农杆菌介导法获得的转基因植株对小菜蛾的抗性实验

   株号                     NBT   NBT   NBT

              CK     NBT1                       NBT5

                            2     3     4

平均体重(mg)  9.1    8.2    8.7   8.7   7.6     8.9

校正死亡率

(％)          0      10     3     0     20      7三、讨论

本实验室从90年代初期开展激光微束的转化研究以来，对激光转化体系进行了大量探索，使该技术逐渐趋于成熟和完善。例如我们利用三倍频激光微束均取得了较好的实验结果；针对不同的质粒DNA浓度进行了比较研究，发现最佳浓度为0.1μg/μl；对高渗液的配方进行了改进，发现使用高渗培养液比使用Weber等人(1990)的高渗液对组织的损伤更小，取得了更好的实验结果。

并在激光穿刺方法上做了一些新的改进，不仅成功地将抗虫基因导入了油菜，而且进一步提高了激光微束穿刺法的转化效率，使激光微束穿刺法在油菜上的转化频率达到2.2％，已超过农杆菌介导法的转化频率(1.9％)。本研究在转化方法上所做的主要改进有以下几点：

1、高渗预处理之后不用MS液体培养基冲洗，改为在滤纸上稍加吸干，直接放于质粒溶液中进行激光穿刺。这种改进主要基于以下考虑：高渗预处理的目的是提高细胞内外的渗透压差，以促进外源DNA通过激光穿刺的小孔进入细胞内；同时还可以防止进入细胞的外源DNA及胞质的外漏。如果在高渗预处理之后用液体培养基进行冲洗，有可能破坏细胞内外渗透压的梯度，影响外源DNA的进入。我们将穿刺前的冲洗过程省掉，只进行穿刺后的冲洗，这样不仅有利于外源DNA进入细胞，而且有利于之后细胞尽快恢复正常生理活动以完成DNA重组过程。

2、增大Rose小室中质粒溶液的量。在以前的操作中，一般都在Rose小室中加入50μl的质粒DNA溶液。由于在Rose小室中放入的子叶柄数目较多，一般10-20个，我们发现50μl的质粒溶液不足于充分浸泡所有的子叶柄，况且在操作中小室的晃动很容易引起溶液流向一旁，使子叶柄不能接触到溶液，这样即使激光微束已在细胞上造成了穿孔，但由于子叶柄周围无质粒溶液可流入，势必影响到转化效率。在实验中我们将DNA溶液的量加大到80-100μl，能使所有的子叶柄充分浸于其中，但又不致于使子叶柄漂动。这可能是造成转化率提高的原因之一。

3、增加每个子叶柄的脉冲次数。油菜子叶柄基部的再生能力较强，但并非这个部位的每一个细胞都能再生。因此，扩大穿刺面积，提高受穿刺细胞的数目，无疑将会增加那些具有再生能力的细胞被转化的可能性。在油菜的转化中，每个子叶柄受到15个脉冲的穿刺转化材料为1.4，本实验提高了脉冲次数，在穿刺过程中不断挪动载物台，使每个子叶柄基部均匀受到20次以上的穿刺达到2.2％，获得了较好的结果。

4、在油菜的转化中使用了三倍频激光微束。在小麦、百脉根、棉花等植物的转化中，本实验室其它研究者均使用了三倍频激光微束，取得了较好的结果。考虑到三倍频(波长0.35μm)激光的热效应小，穿透力强，对细胞损伤小，细胞容易恢复等优越性，本实验采用三倍频激光微束对油菜进行转化，从而使转化频率得到了进一步提高。

Claims (9)

1、一种向植物组织、器官或细胞中导入外源遗传物质的方法，包括：

将植物组织、器官或细胞在高渗液中浸泡至质壁分离，其中，高渗液的渗透压在0.3-1mol/L之间，并且是在适合植物生长的培养基中使用选自蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘露醇、山梨醇、和果聚糖的糖醇类分子，选自包括脯氨酸和羟脯氨的氨基酸类，激素类，如脱落酸(ABA)以及它们的混合物配制的；

将上述处理后的植物的组织、器官或细胞取出，除去其表面的高渗液，再放到含有外源遗传物质的普通培养液中，然后用激光脉冲打孔的方法使细胞壁快速穿孔，使外源遗传物质立即从孔洞进入细胞，其中，所述的含有外源遗传物质的培养基中外源物质的浓度为0.01μg/μl至1μg/μl，激光脉冲单位时间的脉冲数为60次-10⁴次/分钟；

将处理的细胞、组织或器官转入筛选培养基中使细胞再生，得到转化的植株。

2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述的适合植物生长的培养基是MS、B5或N6培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在高渗液中浸泡的时间为20分钟至4小时。

4.按照权利要求1所述的方法，其中，细胞发生质壁分离后胞质的体积逐渐减小至原体积的80％。

5.按照权利要求1所述的方法，其中，在高渗液中浸泡的时间为30-50分钟。

6、根据权利要求1所述的方法，其中，所述的外源遗传物质是指分离的基因片段、完整基因、重组的质粒DNA、或染色体大片段。

7、根据权利要求1所述的方法，其中，外源遗传物质的浓度是0.1μg/μl。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的激光脉冲打孔是用三倍频或二倍频激光微束，激光微束输出波长为355nm或530nm，脉宽10-15ns。

9、根据权利要求1所述的方法，其中，在外源遗传物质导入细胞后将材料在加入了山梨醇和甘露醇(1∶1)0.4-0.6mol/L的MS、B5、或N6培养基中培养半天至3天，再转入到MS、B5、或N6培养基中培养，然后转入含筛选剂的培养基中进行筛选。

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